CN1090510A

CN1090510A - 干扰素-τ组成物及其用途

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Publication number: CN1090510A
Application number: CN93119213A
Authority: CN
Inventors: F·W·巴泽; H·M·约翰逊; C·H·庞泽; T·L·奥特; G·V·希克; K·今川
Original assignee: University of Florida; Women's Research Institute
Current assignee: University of Florida; Women's Research Institute
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-18
Publication date: 1994-08-10
Also published as: AU689450B2; EP1360962A2; EP1360962A3; TW391983B; JPH08505047A; KR950704489A; AU5444994A; KR100357768B1; WO1994010313A2; CA2148119A1; WO1994010313A3; TW585911B; EP0669981A1

Abstract

本发明描述了干扰素τ蛋白质和由其衍生的多肽的制备。公开了这些蛋白质和多肽的抗病毒和抗细胞增殖性质。本发明蛋白质的优点之一是当将其用于处理细胞时它们没有细胞毒性副作用。也描述了所述干扰素τ蛋白质的结构/功能的关连性。

Description

本发明系关于干扰素-τ组成物及其用途。参考文献如下：

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许多哺乳动物之胚膜（或滋养外胚层）会产生生化讯号以稳固并维持怀孕（Bazer，et al.，1983）。此类蛋白质之一，羊滋养层蛋白质1（oTP-1），被确认为低分子量的蛋白质，其系由怀孕第10至21日之间的绵羊胎体所分泌者（Wilson，et al.，1979;Bazer，et al.，1986）。蛋白质oTP-1显示能抑制子宫分泌前列腺素F₂-α，其能引起未怀孕绵羊之卵巢黄体进行生理上及内分泌学上的转变（Bazer，et al.，1986）。因此，oTP-1具有抗黄体溶解之生物活性。推测oTP-1之主要功能与怀孕之稳固有关。

随后发现oTP-1（ⅰ）呈现与多种生物之干扰素α（IFNα）之间有限的同质性（50-70%）（Imakawa，et，al.，1987），以及（ⅱ）其会结合至Ⅰ型干扰素受体（Stewart，et al.，1987）。除了与IFNα之间有部分相似之外，oTP-1有数种特性是以与IFNα区别，这些特性包括：oTP-1于繁殖生化学上之功能（其它干扰素并不知道有繁殖周期之生化调节上的任何功能），oTP-1之细胞来源-即滋养层细胞（IFNα乃源自淋巴细胞），oTP-1之分子大小-即172个氨基酸（IFNα通常约为166个氨基酸），及oTP-1甚难被病素诱生（IFNα可被病毒大量诱生）。国际干扰素学会承认oTP-1属于一类全新的干扰素，其已命名为干扰素-tau（IFNτ）。希腊字母τ表示滋养层。

干扰素被区分为两个不同组：Ⅰ型干扰素，包括IFNα，IFNβ，及IFNω（亦即IFNαⅡ）;以及Ⅱ型干扰素，以IFNγ为代表（根据DeMaeyer，et al.评论）。于人类，已鉴定出至少17种IFNα之非对偶基团，至少约2或3种的IFNβ之非对偶基因，及单一种的IFNγ基因。

IFNα显示能抑制多种型式的细胞增殖。IFNα之非对偶基因。至少约2或3种的IFNβ之非对偶基因，及单一种的IFNγ基因。

IFNα显示能抑制多种型式的细胞增殖。IFNα拮抗如毛状细胞白血病之类的血液学上恶性病尤其有效（Quesada，et al.，1984）。此外这些蛋白质亦显示有拮抗下列肿瘤之活性，例如多重骨髓瘤，Kappsi′s肉瘤，慢性源自骨髓之白血病，肾细胞肉瘤，膀胱肿瘤及卵巢癌（Bonnem，et al.，1984;Oldham，1985）。干扰素与干扰素受体在某些自体免疫及炎症性疾病上扮演的角色亦已被研究（Benoit，et al.，1993）。

IFNα拮抗多种类型之病毒感染亦有效（Finter，et al.，1991）。α-干扰素显示有拮抗人类乳突瘤病毒感染，B型肝炎，及C型肝炎感染之活性（Finter et al.，1991;Kashima，et al.，1988;Dusheiko，et al.，1986;Davis，et al.，1989）。然而，IFNα之有效性显然被其毒性限制;使用干扰素于肿瘤及病毒感染症之治疗上已导致严重的副作用例如发烧，发冷，厌食，失重及疲倦（Pontzer，et al.，1991;Oldham，1985）。这些副作用通常需要（ⅰ）干扰素剂量减少至会限制治疗有效性之水平，或（ⅱ）终止病患接受治疗。这种毒性降低了这些强力抗病毒及抗增殖蛋白质于衰弱性人类及动物疾病之治疗有效性。

本发明一方面包括抑制肿瘤细胞生长之方法。该方法中，令细胞与浓度为能有效抑制肿瘤生长之干扰素-τ（IFNτ）接触。IFNτ可得自多种来源，包括马，牛，猪，绵羊，大白鼠，小白鼠，免子及人类。两个具体实例包括如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示之IFNτ。许多肿瘤细胞可作为IFNτ抑制生长的标的，包括如下细胞但不受限于此：人类癌细胞及受类固醇影响的肿瘤细胞（例如，乳房肿瘤细胞）。

本发明亦涵括抑制细胞内病毒复制之方法。此方法中，令经病毒感染的细胞与浓度为能有效抑制细胞内病毒复制之干扰素τ接触。上述IFNτ分子亦可用于本发明之这类方法中。许多病毒于细胞内的复制可被抑制，这些病毒包括RNA病毒（例如猫白血病病毒，人类免疫缺乏病毒，或C型肝炎病毒）及DNA病毒（例如B型肝炎病毒）。

本发明之人类IFNτ分子亦可用于促进雌性哺乳动物受孕之方法中。此方法中，投服有效量为能有效促进雌性哺乳动物受孕之人类IFNτ，通常其置于药学上可接受之载剂中。这类人类IFNτ分子之范例有如SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：12所示之蛋白质序列。

本发明亦涵括一种经单离的核酸，其编码人类干扰素-τ。这类核酸分子之范例有SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：11。此外，本发明涵括表达人类IFNτ之表达载体。通常此表达载体包括（a）令有编码人类干扰素-τ之开放读译架构（open reading frame）的核酸;及（b）可令该开放读译架构于宿主细胞内表达之调节序列。此调节序列可包括用于主导或令IFNτ多肽分泌的序列：此种序列可为内源的（例如正常发现的IFNτ引导序列，参见SEQ ID NO：11）或外源的（例如酵母菌或细菌表达系统所辨识之分泌讯号）。表达载体中，调节序列亦可包括位于该核酸序列5′端之启动子区及与干扰素-τ编码序列同一架构内的ATG起始密码，以及位于该编码序列3′端之转译终止讯号与其后之转录终止讯号。此表达载体中的核酸可选自，举例而言，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：11。

另一具体实例中，本发明涵括经重组制备的人类干扰素-τ蛋白质。这种蛋白质之代表性序列之一示于SEQ ID NO：4。人类IFNτ亦可含有羧基端之延长（如SEQ ID NO：12所示之序列）。

本发明涵括重组产制干扰素-τ之方法。此方法中，将重组表达系统导入适当宿主细胞内，该表达系统含有一个具有编码人类干扰素-τ多肽之多核苷酸序列的开放读译架构（ORF），其中载体经设计以令该ORF于该宿主内表达。再于可造成ORF序列表达之条件下，培养该宿主。上述人类IFNτ序列为适当人类IFNτ多肽之范例。代表性之多核苷酸编码序列有SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：11。许多载体与其对应宿主可用于操作本发明之这类方法，包括，λgtll噬菌体载体与大肠杆菌细胞。其它宿主细胞包括酵母菌及昆虫细胞表达系统。

本发明另涵括用于表达干扰素-τ多肽的表达系统。通常这些系统包括能提供开放读译架构于经选定之表达载体中表达的宿主，以及含有开放读译架构（ORF）之经选定的表达载体，该ORF具有编码人类干扰素-τ多肽之多核苷酸序列。可用于这类表达系统的代表性序列有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20。

本发明亦涵括经单离的干扰素-τ多肽。这类多肽乃衍自干扰素-τ氨基酸编码序列且长度介于约15个至172个氨基酸之间。举例而言，这类多肽可选自如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4所示之序列。代表性由IFNτ衍生之多肽包括如下序列，但不受限于此：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：20。

另一具体实例中，本发明涵括阻断α-干扰素结合至具有α-干扰素受体之细胞的方法。此方法中，令该细胞与浓度为能够有效使得干扰素-τ结合至每一个α-干扰素受体的干扰素-τ多肽接触。再将具有结合在受体上之IFNτ多肽的细胞与α-干扰素（IFNα）接触。上述IFNτ多肽与由IFNτ衍生之多肽为可用于此方法之IFNτ多肽的范例。

此外，本发明涵括阻断干扰素-τ结合至具有干扰素-τ受体之细胞的方法。此方法中，令该细胞与由干扰素-τ衍生的多肽（例如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20）接触，其中多肽之浓度能有效使得该多肽结合至每一个干扰素-τ-受体。再将该细胞与干扰素-τ接触。

本发明亦涵括经纯化的抗体，其可与人类干扰素-τ免疫反应。此抗体可为多株抗体或单株抗体。代表性的IFNτ多肽抗原包括下列序列，但不受限于此：

SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：20。

本发明亦涵括下列物质：具有抗肿瘤（亦即抗增殖）活性之由干扰素-τ衍生的多肽;具有抗病毒活性之由干扰素-τ衍生的多肽;混合型α-干扰素分子，其中天然IFNα之毒性部分被源自IFNτ之相似序列置换。

当研读下文之本发明的详细说明并佐以图示之后，本发明之上述及其它目的与特征当能更充分理解。

图1表示OvIFNτ之合成型基因的核酸编码序列，该基因经设计以包含平均分布在整个编码序列的19个不同的限制酶位置。

图2表示用于制造编码OvIFNτ之合成型基因的选殖策略。

图3表示人类干扰素-τ基因与绵羊干扰素-τ基因之经推测的蛋白质序列之比较。有差异的氨基酸在核酸序列下方之线上，择一有改变的氨基酸标示。

图4表示证实OvIFNτ及IFNα两者皆能显著降低HL-60细胞生长之数据。

图5表示证实r HuIFNτ对细胞有毒性而OvIFNτ却不然的数据。此图中，三次重复试验的结果以存活%平均值±SD表示。

图6表示衍自IFNτ序列之多肽序列。

图7表示OvIFNτ序列之完整核酸及氨基酸序列。

图8表示当IFNτ用于处理周边血液单核细胞时，相对于IFNα为无细胞毒性之支持数据。

图9表示利用IFNτ处理人类皮肤之T细胞淋巴瘤细胞株，HUT78，之结果。

图10表示利用IFNτ处理人类T细胞淋巴瘤细胞株，H9，之结果。

图11A表示使用衍自OvIFNτ之多肽与完整OvIFNτ对于与FIV（猫免疫缺乏病毒）复制有关之肽抑制作用的数据。

图11B表示使用衍自OvIFNτ之多肽与完整OvIFNτ对于与HIV（人类免疫缺乏病毒）复制有关之肽抑制作用的数据。

图12表示证实利用衍自IFNτ肽抑制IFNτ之抗病毒活性的数据。

图13表示证实利用衍自IFNτ肽抑制OvIFNτ之抗病毒活性的数据。

图14表示证实利用衍自IFNτ肽抑制牛IFNα之抗病毒活性的数据。

图15表示证实利用衍自IFNτ多肽抑制人类IFNα之抗病毒活性的数据。

图16表示评估利用衍自IFNτ肽对牛IFNγ之抗病毒活性缺乏抑制作用的数据。

图17表示证实利用抗-衍自IFNτ肽之抗血清抑制IFNτ之抗病毒活性的数据。

图18表示证实利用抗-衍自IFNτ肽之抗血清抑制经放射标记之IFNτ结合至细胞的数据。

SEQ ID NO：1为编码绵羊干扰素-τ（OvIFNτ）之合成型基因的核苷酸序列。亦不经编码之氨基酸序列。

SEQ ID NO：2为成熟之OvIFNτ蛋白质之氨基酸序列。

SEQ ID NO：3为编码成熟人类干扰素-τ（HuIFNτ）蛋白质之合成型核苷酸序列。

SEQ ID NO：4为成熟HuIFNτ蛋白质之氨基酸序列。

SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：2之片段1-37的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6为SEQ ID NO：2之片段34-64的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7为SEQ ID NO：2之片段62-92的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8为SEQ ID NO：2之片段90-122的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9为SEQ ID NO：2之片段119-150的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10为SEQ ID NO：2之片段139-172的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11为具有引导序列之天然HuIFNτ基因之核苷酸序列。

SEQ ID NO：12为SEQ ID NO：11之经推测的氨基酸编码序列。

SEQ ID NO：13为根据本发明之25个核苷酸的合成型寡核苷酸。

SEQ ID NO：14为根据本发明之25个核苷酸的合成型寡核苷酸。

SEQ ID NO：15为SEQ ID NO：4之片段1-37的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16为SEQ ID NO：4之片段34-64的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17为SEQ ID NO：4之片段62-92的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18为SEQ ID NO：4之片段90-122的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19为SEQ ID NO：4之片段119-150的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20为SEQ ID NO：4之片段139-172的氨基酸序列。

本发明之详细说明

Ⅰ.定义

干扰素-τ表示干扰素蛋白质一族，其具有如下特征：（ⅰ）抗黄体溶解特性：（ⅱ）抗病毒特性;（ⅲ）抗细胞增殖特性;（ⅳ）与α-干扰素有45-68%之氨基酸同质性及相对于如SEQ ID NO：2所示序列有大于70%之氨基酸同质性。干扰素-τ可自多种如下所述之哺乳动物来源分离而得。

干扰素-τ多肽为衍自干扰素-τ氨基酸编码序列之具有约15至172个氨基酸的多肽，其中该15至172个氨基酸在天然干扰素-τ中是连续的。

Ⅱ.干扰素-τ之单离与鉴定

A.绵羊及牛之干扰素-τ

Ⅰ.干扰素-τ之编码序列

绵羊干扰素-τ（OvIFNτ）乃主要的胎体分泌性蛋白质，系由绵羊母体接纳之严格期间的胚胎之胚膜制造出来。成熟OvIFNτ之单离物为长度为172个氨基酸者（SEQ ID NO：2）。cDNA编码序列含有成熟蛋白质氨基端之额外的23个氨基酸（Imakwa，et al.，1987）。此OvIFNτ单离物之编码序列示于图7。

为了要单离OvIFNτ蛋白质，收集来自怀孕绵羊的胎体并于活体外培养在如先前所述之改良型最低必须培养基中（Godkin，et al.，1982）。胎体系收集自怀孕期之不同日，配种之第一天记录为第0日。基本上如Vallet，et al.，（1987）及Godkin，et al.，（1982）所述，自胎体培养基纯化IFNτ。

IFNτ之同源性乃藉由硫酸十二酯钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法评估（SDS-PAGE：Maniatis，et al.;Ausubel，et al.）。经纯化之IFNτ试样中蛋白质浓度的测定系采用双率可宁分析法（bicinchoninic（BCA）assay）（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL;Smith，et al.，1985）。

自牛单离出OvIFNτ的同源蛋白质（bIFNτ;Helmer，et al.，1987;Imakawa，et al.，1989）。OvIFNτ与BoIFNτ（ⅰ）于怀孕期之母体接纳过程中有相似作用，及（ⅱ）成熟蛋白质之间有高度之氨基酸及核苷酸序列之同源性。介于OvIFNτ与BoIFNτ之间的核酸同源性为，5′非编码区有76.3%，编码区有89.7%，及3′非编码区有91.9%。氨基酸序列之同源性为80.4%。

实例1说明OvIFNτ在繁殖上的作用。将不同浓度的OvIFNτ及重组型人类α-2-干扰素（rHuIFNα₂）灌入绵羊的子宫腔。评估子宫腔的生命期乃检测发情期之间的间隔，黄体酮（progesterone）分泌之维持，及前列腺素分泌之抑制情形（Hanson，et al.）。这些检测所得结果之比较证实，当施用100微克/天之IFNτ时，动情期之间的间隔可被显著延长，而当施用rHuIFNα时，无明显作用。这些数据支持结论，即IFNτ能显著影响动情周期之生化结果。

亦检测干扰素-τ于繁殖周期之不同阶段的抗病毒特性（实例2）。利用得自绵羊动情周期第12日至第16日之胎体建立胎体培养物。评估每份胎体培养物上清液的抗病毒活性。随著胎体发育之进展，培养物上清液有逐渐增加的抗病毒活性。

2.IFNτ之重组制备

利用细菌及酵母菌细胞制备重组IFNτ。利用OvFINτ之氨基酸编码序列来生成对应之DNA编码序列，其具有可在大肠杆菌中充分表达之密码用法（codon usage）（实例3）。利用依序添加寡核苷酸而将DNA编码序列合成式地构筑起来。利用如图2所示之限制酶水解及接合，将经选殖之寡核苷酸融合为单一的多核苷酸。多核苷酸之编码序列具有如SEQ ID NO：1所示之序列。

为使重组IFNτ表达，可将合成之编码序列置入多种细菌表达载体，例如，λgtll（Promega，Madison WI）：pGEX（Smith，et al.）：pNH载体（Stratagene，La Jolla CA）。将IFNτ合成多核苷酸殖（cloning）入经修饰的pIN Ⅲ omp-A表达载体，记载于实例3。IFNτ蛋白质之产制由添加IPTG诱导。利用超音波震荡或渗透分级分离，将可溶之重组IFNτ自细胞释出。

此蛋白质可用标准法进一步纯化，包括分子大小分级分离法（管柱层析或操作前之凝胶电泳）或亲和性层析法（例如使用抗-IFNτ抗体（固相支持物可购自Pharmacia 厂，Piscataway NJ）。蛋白质制剂亦可浓缩，例如使用过滤法（Amicon，Danvers，Mass）。

合成之IFNτ基因亦殖入酵母菌选殖载体pBS24up（实例4：Sabin，et al.，Ecker，et al.）。构筑合成连接子以令IFNτ编码序列与泛醌素（ubiquitin）编码序列于载体内进行同一架构（in-frame）之融合。形成的连接情形允许泛醌素序列于活体内自IFNτ序列切除。

令重组质体pBS24Ub-IFNτ转形酵母菌-啤酒酿母菌（S.cerevisiae）。培养经转形的酵母菌细胞，将其溶解且自细胞溶解物单离重组IFNτ（r-IFNτ）蛋白质。

利用放射免疫法将γ-IFNτ定量。进行经纯化之r-IFNτ的微定序。结果证实与天然IFNτ之前15个氨基酸序列一致。此结果亦证实泛醌素/IFNτ融合蛋白质于活体内可被正确处理。

藉此方法制得之重组IFNτ具有抗病毒活性，此活性与纯化自适用胎体之培养基的IFNτ之抗病毒活性类似。

操作本发明亦可使用其它酵母菌载体，包括具可调节表达之载体，但不受限于此（Hitzeman，et al.，;Rutter，et al.，;Oeda，et al.）。代表性之酵母菌转形作用之宿主为啤酒酿母菌，然其它适用于转形之酵母菌亦可使用（例如（Schizosaccharomyces pombe））。

编码IFNτ多肽之DNA可被殖入任何商品化的载体，以令该多肽于适合宿主系统内表达。这些系统包括上述的细菌及酵母菌表达系统，以及如下：杆状病毒表达系（Reilly，et al.;Beames，et al.;Clontech，Palo Alto CA）：及哺乳动物细胞表达系（Clontech，Palo Alto CA;Gibco-BRL，Gaithersburg MD）。这些重组多肽可以融合蛋白质或以天然蛋白质型式表达出现。多种特性可被安排在表达载体内，例如促使经表达序列分泌至培养基之引导序列。

通常经重组制备之多肽是由经溶解的细胞或培养基分离而得。可利用此技艺之习知方法进行纯化，包括盐类分级分离，离子交换层析，及亲和性层析。如前所述，亦可采用免疫亲和力层析，其使用基于IFNτ多肽所产制的抗体。

B.人类干扰素-τ

1.编码干扰素-τ蛋白质之人类基因组序列的鉴定及选殖

筛选DNA以寻找同源于干扰素-τ的序列（实例5）。鉴定出与OvIFN τ cDNA探针杂交的数种序列。随后分离出含有人类干扰素-τ之部分序列的数个纯系（实例6）。合成对应于OvIFN τ cDNA序列之2个合成的25个核苷酸之寡核苷酸（Imakawa，et al.，1987）。这些引子用于扩大反应，此反应使用衍自下列2个cDNA库的DNA：人类足孕之胎盘及人类足孕之滋养叶胞层（cytotrophoblast）。产生之经扩大DNA片段以电泳分开且单离含有IFN τ扩大产物之带（band）。令产物再次选殖且利用二去氧终止法定序经嵌入的扩大产物。

得自三个此类纯系之序列比较显示，单离物之间有高度的序列同源性，但此序列并非完全相同。此结果推测有人类干扰素-τ基因之多种变种的存在。

实例7 说明全长之人类IFN τ基因之单离。自周边血液之单核细胞（PBMCs）单离高分子量的DNA，并进行分子大小之分级分离。测试馏份有无IFN τ序列的存在，采用聚合酶链锁反应（polymerase chainreaction）：来自经测试有扩大反应之馏份的DNA分子可用来形成λgtll中之基因组库。

涂布该次基因组库并与OvIFN τcDNA探针杂交（实例7A）。鉴定出杂交至探针的近20个纯系。继代相常于正反应纯系之噬菌斑，藉使用OvIFN τ引子之扩大反应来单离及分析DNA。这20个噬菌斑中有6个噬菌斑产生正反应之PCR讯号。纯化源自这6个纯系之噬菌斑并将嵌入DNA定序。这6个纯系中之一的嵌入物被用来作为随后筛检步骤之杂交探针。

利用上述之杂交探针筛检源自λgtll次基因组库之重组噬菌体（实例7B）。单离出3个显示正杂交讯号的纯系并将嵌入物定序。获得的核酸序列资料如SEQ ID NO：11所示，而推测之蛋白质编码序列如SEQ ID NO：12所示。推测之成熟蛋白质之编码序列如SEQ ID NO：4所示。

人类干扰素-τ基因（SEQ ID NO：4）与绵羊干扰素-τ基因之推测的蛋白质序列的比较（图3）氨基酸层次上之序列同源性及差异性。

如SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：11所示之人类IFN τ序列及自其衍生之引子与探针，可用来作为探针以测定其它含有人类IFN τ编码序列及伪基因（pseudogenes）之单离物。此外，可能有至少一种IFN τ蛋白质之异型（isolate）及至少一种编码序列。根据本发明揭示方法，可令操作本发明之特定核酸探针和能与本案IFN τ多肽反应的抗体用于单离哺乳动物中未经鉴定的干扰素-τ之变种，这些哺乳动物包括山羊，马，乳牛，阉牛，绵羊，大白鼠，小白鼠，兔子，猴子及人类，但不受限于此。

2.于人类组织中干扰素-τ表达情形的鉴定

利用对OvIFN τ cDNA探针之杂交反应，分析人类胎盘cDNA库及绵羊cDNA库（实例8）。此DNA杂交分析结果显示人类cDNA库所得之IFNτ-讯号约为绵羊cDNA库所得讯号之1/100。OvIFN τ cDNA占有约0.4%之绵羊cDNA库。因此，对OvIFN τ探针呈反应的人类cDNA的量显然是低的，至少在足孕之胎盘中是如此，因该cDNA库是由胎盘生成的。

亦分析人类足孕胎盘及羊膜细胞中HuIFN τ mRNA之存在情形。结果显示人类IFN τ mRNA存在于胎儿与胎盘之间的合并处。羊膜细胞亦表达相当于OvIFN τ引子及人类探针的信号，可推知IFN τ mRNA之表达不受足孕胎盘之限制。

此外，将RT-RCR分析法应用在单离自成人淋巴细胞之总细胞RNA，以便测HuIFN τ之存在情形：结果显示IFN τ mRNA存在淋巴细胞中。

亦使用定位杂交法（in situ hybridization）检测人类组织中干扰素-τ之表达情形（实例9）。检测得自4个健康，不同足孕期及首三个月之人类胎盘的组织切片。此分析法使用了衍自OvIFN τ cDNA序列之cDNA探针（实例9B）。定位杂交法乃使用反意（anti-sense）RNA探针进行。三项个别实验中，所有足孕及首三个月之胎盘组织皆可见特异的杂交反应。

首三个月之胎盘绒毛（由外层的融合细胞滋养层，底层之滋养里胞层及具有多种类型间叶细胞之中心基质区所组成）之滋养叶胞层细胞中呈现IFN τ之最高转录水平。较不强但可测得的转录水平见于融合细胞滋养层与间叶细胞。类似的转录表达之结果亦于足孕组织之胎盘绒毛中被证实，但讯号检测水平较低。首三个月之绒毛外滋养层呈现最高讯号量且当其位于母体血液间隔处时染色呈正反应。

Howatson，et al.，（1988）注明IFN α于首三个月及足孕组织之绒毛膜绒毛的融合细胞滋养层中产制。Paulesu，et al.，（1991）亦观察到绒毛外滋养层与融合细胞滋养层之IFN α，于首三个月胎盘组织中之反应性比源自足孕组织者更强且更广泛。这些研究员使用拮抗人类IFN α亚型所诱生的抗体，但无任何人发现绒毛之滋养叶胞层有任何IFN α。

目前结果证实人类IFN τ基因在被绒毛外滋养层细胞占据之早期胎盘组织中大量表达，且在绒毛之融合细胞滋养层，滋养层及多种间质细胞中亦有表达。这些结果证明可测出人类怀孕期组织有IFN τ转录，且首三个月胎盘之绒毛的融合细胞滋养层及绒毛外滋养层有IFN τ表达。

C.干扰素-τ之抗病毒特性

它评估IFN τ拮抗多种病毒之抗病毒特性，包括RNA及DNA病毒。经纯化至均质之OvIFN τ的相对特异活性于抗病毒分析法中评估（实例10）。IFN τ具有比r BoIFN α或r BoIFN γ更高之特异抗病毒活性（实例10，表3）。

本发明优点之一乃IFN τ具有强的抗病毒活性，伴随有限的细胞毒性作用。测试高度纯化之OvIFN τ对于接触过AIDS及人类AzDS之逆转录病毒之周边血液淋巴细胞的抗逆转录病毒作用及细胞毒性作用（Bazer，F.W.，et al.，1987）。此豆状病毒（lentivirus）对猫造成慢性似AIDS的症状，故为研究人类AIDS之模型（Pederson，et al.，1987）。检视两种病毒之任一者于周边血液淋巴细胞（PBL）之复制情形，系根据经过一段时间之培养物上清液中的逆转录酶（RT）活性。

欲测定IFN τ拮抗FIV及HIV之抗病毒活性，可测定经IFN τ处理之经FIV-及HIV-感染之猫及人类PBL培养物中的依赖RNA之DNA聚合酶的RT活性（实例11）。当细胞培养时有IFN τ的存在，FIV之复制情形会降低至约为对照数值的1/3。OvIFN τ的添加会产生逆转录酶（RT）活性之快速且由剂量决定之降低情形（实例11，表4）。IFN τ之浓度低至0.62ng/ml时仍可抑制病毒复制，而对于RT-活性有较大作用之更高浓度（40ng/ml），对细胞无毒性作用。此结果显示，当细胞培养时有OvIFN τ的存在，与对照数值比较之猫免疫缺乏病毒之复制情形显著降低了。

IFNτ显然对逆转录病毒之宿主细胞无细胞毒性作用。当IFNτ以每毫升40微毫克之浓度存在培养基中时，上述结论亦为真。此浓度之IFNγ相当于约8，000抗病毒单位之α-干扰素，当根据Pontzer，et al.（1988）所述测定IFNτ对于保护Madin Darby牛肾细胞免于被水泡口炎病毒（Vesicular stomatitis virus）溶解之活性。

亦测试IFNτ拮抗HIV于人类细胞内复制之活性。令经过HIV感染之人类周边淋巴细胞以不同浓度的IFNτ处理（实施12）。评估周边血液淋巴细胞中HIV之复制情形系根据一段时间内之培养上清液的逆转录酶活性。一个浓度范围内之IFNτ能产生显著的抗-HIV作用（实例12，表5）。仅培养6日，10ng/ml浓度就能造成RT活性降低50%。500ng/ml浓度造成10日内之RT活性降低90%。此外，无任何细胞毒性作用之证据显示与IFNτ之施用有关（实例12，表5）。

此外，评估IFNτ拮抗HIV之抗病毒作用，系在HIV感染之际，以不同量的重组IFNτ或重组人类IFNα2处理人类PBMC细胞（实例18）。此测试所得数据（实例18，表12）支技一结论，即相近浓度时，IFNα与IFNτ皆能有效降低HIV于人类淋巴细胞内复制。然而，以IFNα2处理的细胞会造成细胞毒性，而未见这类细胞毒性出现在使用IFNτ处理者，即使使用浓度高出许多之IFNτ。

没有PBL时，FIV及HIV逆转录酶本身皆不受TFNτ之影响。故抗病毒活性并非针对病毒之RT直接作用所造成的。

干扰素-τ亦发现可抑制肝细胞中之B型肝炎病毒DNA复制（实例18）。利用被B型肝炎病毒（HBV）转感的衍自肝细胞之人类细胞，以测试IFNτ之抗病毒作用。令细胞以一浓度范围内的IFNα及IFNτ处理。与无干扰素之对照组比较，IFNα及IFNτ皆减少近2倍倍之DNA复制。

为了要证明干扰素之作用是特异针对感染性病毒而非作用在一般细胞代谢所致的结果，测定肝细胞中IFNα与IFNτ对肝特异之mRNA产制的影响（实例18）。藉杂交分析测定两种肝细胞特异之蛋白质，Apo E与Apo Al。当IFNα及IFNτ浓度高至40，000单位/毫升时，两种肝特异之mRNA无任一者出现mRNA产制的减少。此外，此分析中未见使用IFNτ者有肝细胞毒性之证据。

这些结果显示IFNτ是有效拮抗种类广泛之病毒的抗病毒剂，这些病毒包括RNA及DNA病毒。IFNτ超过其它如IFNα之干扰素的一项优点为，使用IFNτ的疗法不会与任何细胞毒性有关。

D.IFNτ抗增殖特性

IFNτ对细胞生长之作用亦予测定。一分析法中，种用集落抑制法（Colony inhibition assay）测定抗一细胞生长之活性（实例13）。以低细胞密度涂布人类羊膜（WISH）或MDBK细胞于培养血上，以形成源自单一细胞之集落。令干扰素稀释物加至三个重复的孔洞（well）并培养培养皿以令集落形成。这些测定可见IFNτ抑制集落的大小与数目。IFNτ抑制人类细胞株（WISH）之细胞增殖，比人类IFNα有效。IFNτ之抗增殖活性是由剂量决定的。

高浓度的IFNτ会终断增殖，但细胞存活情形未受损害。根据使用流动式细胞计数法之细胞周期分析，可知IFNτ显然会抑制细胞发展至S期。这些结果证明IFNτ具抗增殖活性。且强调出其具有低细胞毒性。

亦研究IFNτ对大白鼠及牛细胞株之抗增殖作用（实例14）。利用³H-胸腺嘧啶摄入之速率来评估细胞增殖之速率。所得数据证明，IFN显著降低每一测试细胞株之细胞增殖的速率（实例14，表7）。

进一步以一系列人类肿瘤细胞株测试IFNτ之抗增殖活性与缺乏细胞毒性（实例15）。多种人类肿瘤细胞株乃选自用于测试抗肿瘤剂之NIH筛检法的标准细胞株（Pontzer，C.H.，et al.，（1991））。至少测试一种选自每一个主要肿瘤类别的细胞株。

下列细胞株系得自美国菌种保存中心（12301 Parklawn Dr.，Rockville MD 20852）：

NCI-H460 人类肝大细胞癌;

DLD-1 人类结肠腺癌;

SK-MEL-28 人类恶性黑色素瘤;

ACHN 人类肾腺癌;

HL-60 人类前骨髓细胞性白血病;

H9 人类T细胞淋巴瘤;

HUT78 人类皮肤T细胞淋巴瘤;及

MCF7 人类乳腺癌。

如上所述，评估抗增殖活性乃藉由测定³H-胸腺嘧啶被摄入经过IFNτ处理之细胞的速率。处理组间之显著差异性乃根据Scheffe′sF-测试的误差分析而予评估。藉流动式细胞计数法进行细胞周期之分析。

IFNτ对MCF 7（乳腺癌）增殖之抑制结果的测试，证明IFNτ以剂量决定之方式降低MCF 7.之增殖。使用10，000单位/毫升IFNτ者发现³H-胸腺嘧啶减少50%（实例15，表8）。该细胞先前曾发现对抗-雌激素处理不具反应。

使用HL-60（人类前骨髓细胞白血病）细胞经营IFNτ与IFNα之抗增殖作用的比较。使用前骨髓细胞白血病HL-60之结果为这类FINτ与人类IFNα比较所得结果的代表性者（实例15）。两种IFN之浓度低至100单位/毫升仍可产生显著的（＞60%）之生长抑制作用。IFN的量增加更可降低肿瘤细胞的增殖（图4）。高剂量的IFNα，而非IFNτ，有细胞毒性（图5）。细胞存活情形被IFNα降低约80%。相反地，当IFNτ使用10，000单位/毫升时，近100%经IFNτ处理的细胞仍然存活。因此，虽然两种干扰素皆可抑制增殖，但是只有IFNτ无细胞毒性。无毒性提供用于活体治疗之IFNτ有此优点。

以IFNτ处理人类皮肤T细胞淋巴瘤，HUT 78，呈现与HL-60类似的反应（实例15，图9）。OvIFNτ与rHuIFNα皆降低HUT 78细胞之生长，而IFNα则被证实对细胞存活有不利的影响。

T细胞淋巴瘤H9比上述肿瘤细胞株对IFNα之抗增殖作用不敏感。虽然IFNα对H9细胞无毒性，但所测试之任何浓度下的IFNα皆无法明显抑制细胞分裂（实例15，图10）。相反地，可见IFNτ减少约60%之H9生长。因此，只有oIFNτ是此类T细胞淋巴瘤之有效生长抑制剂。

对于其它三种肿瘤细胞株（NCI-H460，DLD-1及SK-MEL-28）IFNτ及IFNα同样是有效的抗肿瘤剂。对于黑色素瘤，SK-MEL-28，IFNα造成的增殖抑制情形附带13%存活率的减少，然而IFNτ不具毒性。绝大多数被测试的肿瘤中，IFNτ作为拮抗人类肿瘤之抗肿瘤剂的功效与IFNα相等或更佳。

IFNτ具有拮抗人类肿瘤之抗增殖活性且无细胞毒性，其作用如人类IFNα一般强或更强。临床试验IFNα 2s显示其为有效之抗肿瘤剂（Dianzani，F.，1992;Krown，1987）。IFNτ作为治疗物之一项治疗优点为其排除了使用高剂量IFNα s所发现的毒性作用。

IFNτ之其它应用有拮抗如Kaposi′s，癌之类的肿瘤（该癌与HIV感染有关），其中IFNτ之抗肿瘤作用与IFNτ抑制逆转录病毒生长之作用加在一起。

干扰素-τ疗法之活体功效于小白鼠系统进行测试（实例16）。B16-F10是小白鼠可移植之先天肿瘤，选用此肿瘤是因为其具有肺部转移之高度迹象（Poste，et，al.，1981）。导入此肿瘤细胞后3天，开始干扰素治疗。活体投服IFNτ显著降低B16-F10肺部肿瘤。因此，IFNτ显然在活体外及活体内皆可作为有效的抗肿瘤剂。

Ⅲ.干扰素-τ多肽片段，蛋白质模型及蛋白质修饰。

如本说明书教示之IFNτ活性的变化，其强度及缺乏细胞毒性，显示对此新颖的干扰素有结构/功能分析之重要性，负责oIFNτ功能之结构基础已被检测，其系使用对应至完整OvIFNτ序列之6个重叠的合成肽（图6）。衍自绵羊IFNτ序列之对应多肽如SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：20所示。代表氨基酸1-37，62-92及139-172的3个肽已发现可抑制IFNτ抗病毒活性（实例17）。该肽浓度为300μm及更高时，是有效的竞争者。

IFNτ之C-终端肽，OvIFNτ（139-172），及内部肽OvIFNτ（62-92），能抑制IFNτ及r Bo IFNα_Ⅱ之抗病毒活性至相同程度，但是N-终端肽OvIFNτ（1-37）在抑制OvIFNτ之抗病毒活性上更有效。剂量-反应数据显示IFNτ（62-92）及IFNτ（139-172）抑制IFNτ之抗病活性至相同程度。阻断IFNτ抗病毒活性的上述肽亦可阻断重组牛IFNα（rBoIFN α）之抗病毒活性，重组牛IFNγ不受此类肽的影响。这两种IFNτ肽可代表IFNτ与多种IFNα s之共同受体结合区。

两个合成肽OTFNτ（1-37）及oIFNτ（139-172）亦能阻断oIFNτ之抗-FIV与抗-HIV活性（实例17;图11A及11B）。虽然这两种肽皆阻断FIV之RT活性，但显然只有C-终端肽，oIFNτ（139-172），可作为猫细胞株（Fc9）之水疱口炎病毒活性的有效抑制剂。

集合上述数据可知，Ⅰ型干扰素之C-终端区可结合至Ⅰ型干扰素受体之共同位置，而N-终端区可能涉及独特功能之诱发。此结果显示IFNτ干扰素分子之不同区可用于取代干扰素α分子之不同区。例如，干扰素α分子中负责增强细胞毒性之区域，相对于IFNτ处理，可被鉴定，其系藉由衍自IFNτ之多肽区取代干扰素α分子之区域。进行这类取代反应可利用合成基因（见下文）之操作，该基因编码经选定的IFNτ及干扰素α分子，加上本文说明的功能性分析法（例如，抗病毒，抗增殖及细胞毒性分析法）。

拮抗IFNτ肽之多株抗-肽抗血清，亦得到如前所述之多肽抑制研究的类似结果。直接对抗相同三区域（OvIFNτ（1-37），IFNτ（62-92）及IFNτ（139-172）的抗体会阻断oIFNτ之功能，证实了这三个区域在抗病毒活性上的重要性（实例17）。虽然这些肽可结合至干扰素受体，但其本身不会引起或参与细胞内之似干扰素作用。

IFNτ之抗增殖活性（实例17，表11）包括此分子之另一区域，因为IFNτ（119-150）是oIFNτ诱发之细胞增殖降低作用的最有效抑制剂。此结果显示主要负责细胞生长抑制作用的分子区是IFNτ（119-150）区。IFNτ分子之此区可单独或融合至其它蛋白质（例如干扰素α），以作为抗肿瘤剂。

最后，¹²⁵Ⅰ-OvIFNτ对于MDBK细胞上其受体的结合情形可被阻断，其利用拮抗6种肽中4种肽之抗血清;此4个多肽代表OvIFNτ之氨基醇1-37，62-92，119-150及139-172。此结果反映出这些区域的多重结合区以及这些区域的功能性特征。由于IFNτ不同区域引发不同功能，选定氨基酸之修饰作用可能可产生具选择性之生物活性的类IFNτ干扰素。

上述数据证明合成肽之鉴定，此合成肽具有oIFNτ蛋白质上四个不连续的位置，其涉及受体交互作用及生物活性。为了要说明这些区域的结构上关连性，进行IFNτ之三度空间结构之模型构筑。三度空间模型将可用于阐明现有数据及设计未来之结构/功能之研究。

将全长重组OvIFNτ之园二色性（circular dichroism，CD）组合至IFNβ（已知三度空间构造之蛋白质（Senta，et al，1992）），则构筑了OvIFNτ之模型。此模型最引人注意的特征是IFNτ自然分类至具4个螺旋状之束状小区的一类蛋白质。IFNτ之CD光谱获自AVIV 60 S，极光分光计（spectropolarimeter）。使用2种不同方法进行二级构造之判断，Perczel，et al.，（1991）之冰点测定法（algorithm）及W.C.Johnson，Jr.（1992）之可变选择法。

光谱之二级结构判断指出70-75%之α螺旋（以波长最小在222及208nm及最大在190nm鉴定）。可变选择之冰点测定法判断此分子的剩下部分是20%β层及10%转折。Chang法判断剩下部分是30%随意的圈捲。IFNτ及IFNβ序列之冰点测定法呈现两分子间之同源性，尤其是在IFNβ之已知螺旋结构的区域。IFNτ之序列分析亦发现推测螺旋区具有无极性之周期性，由四个螺旋之束状小区表示。

做模型的最后步骤是将IFNβ碳骨架之IFNβ X-射线结晶像相等物应用在IFNτ序列。如上鉴定之IFNτ的官能活性区位在分子的一侧且发现呈紧密的空间紧临性。此结果与IFNτ之多重结合位置吻合，其与Ⅰ型IFN受体同时交互反应。

三度空间模型化资料加上前述之功能资料，提供将序列变化导入IFNτ特定区之能力，以生成选定功能之增进（例如，抗病毒或抗细胞增殖）或将具选定功能之区域取代入其它干扰素分子（例如，抗病毒，抗肿瘤或降低细胞毒性）。

表达OvIFNτ之合成基因的构筑记载于实例3。简言之，利用大肠杆菌之最佳密码用法而反向转译保留的人氨基酸序列。设计此序列以包含分布构筑体全长之20个不同的限制酶位置。此540个碱基对之合成基因序列可分成11个审核等酸片段。合成各别片段，并将其单股或双股殖入pTZ 19R，pTZ 18R，或pBluescript，扩大及融合之。再将合成的oIFNτ构筑体殖入经修饰之pIN-Ⅲ-omp A表达载体以于细菌内表现，亦殖入酵母菌表达载体。已设计出类似经构筑的人类IFNτ合成基因（SEQ ID NO：3），并已于酵母菌细胞内表达。

OvIFNτ合成基因于酵母菌中表达（实例4）可令重组IFNτ于啤酒酿母菌中过度生产：大量（100 毫克/升）之重组IFNτ可自溶解之酵母菌萃取物纯化，利用连续离子交换及分子筛滤层析。以此方式纯化的重组IFNτ具有类似天然OvIFNτ之强抗病毒活性（2至3×10⁸单位/毫克）。

合成之基因构筑体有利于导入突变，以可能促进抗肿瘤（抗细胞增殖）及抗病毒活性。此外，负责不同功能之分子个别区域可进行不同功能之分别操作。举例而言，已构筑2种缺失突变种，OvIFNτ（1-155）及OvIFNτ（1-166），以检测IFNτ分子中羰基端序列的功用。

其它突变型IFNτ分子已被构筑以鉴定严格负责抗增殖活性的残基。举例而言，特别残基，Tyr 123在IFNα之抗细胞增殖活性上有关连（McInnes，et al.，1989）。

IFNτ中，Tyr 123之相等物包含在肽OvIFNτ（119-150）：此多肽抑制OvIFNτ与人类IFNα之抗增殖活性。将Tyr 123转换或保留取代（Trp）及非保留取代（Asp）的突变作用已产生，亦产生具有此残基缺失之突变序列。编码Tyr 123之密码位在Ssp Ⅰ位置内，此位置之剔除可用于筛检。如本文所载，评估这些突变型IFNτ之抗增殖活性。

可制造合成肽，其相当于本发明之IFNτ多肽。合成肽可被商业合成或使用此技艺中的标准方法及仪器（Applied Biosystems，Foster City CA）制备。

易言之，编码肽之寡核苷酸序列可利用寡核苷酸合成之标准方法直接合成，或者，若为大编码序列时，利用一系列的选殖步骤合成，包括相当于编码序列之多重寡核苷酸片段的前后排列（Crea;Yoshio et al.;Eaton et al.）。藉标准重组步骤可表达寡核苷酸之编码序列（Maniatis et al.;Ausubel et al.）。

Ⅳ.与干扰素-τ反应的抗体

含有被融合至谷胱甘肽-S-转移酶（Sj 26）蛋白质之本发明多肽抗原的融合蛋白质利用pGEX-GLI载体系统可于大肠杆菌JM 101细胞中表达。此融合Sj 26蛋白质可十分轻易地利用谷胱甘肽受质之亲和性层析法单离出来（Smith）。IFNτ蛋白质之表达与部分纯化描述于实例20，且可应用在任何其它可溶性物质，包括由本发明所示序列编码的多肽。

不溶性GST（Sj 26）融合蛋白质可利用制备式凝胶电泳法纯化。

或者，IFN τ-β-半乳糖苷酶融合蛋白质可如实例19所载而予单离。

本发明亦包括表达载体，例如上述之λ gt 11或p GEX载体，其含有IFNτ编码序列及可令编码区于适当宿主内表达之表达控制元件。此控制元件通常包括启动子，转译起始密码，转译及转录终止序列，及用于将嵌入物导入载体之嵌入位置。

编码所欲多肽DNA可被殖入任何载体（如上所述），以造成多肽于适当宿主系统中表达。这些重组多肽可被表达为融合蛋白质或天然蛋白质。许多特性可被安排在表达载体内，例如，引导序列，其促使经表达序列被分泌至培养基中。重组制备的IFNτ及自其衍生的多肽通常是由经溶解的细胞或培养基单离而得。可利用此技艺习知之方法进行纯化，包括盐类分级分离，离子交换层析及亲和性层析。亦可使用免疫亲和性层析法，其利用拮抗选定IFNτ抗原而生成的抗体。

本发明另一方面包括拮抗本发明多肽之特异抗体。通常欲制备抗体，宿主动物，例如兔子，以经纯化之抗原或融合蛋白质抗原免疫。混合型或融合型蛋白质可利用许多衍自其它蛋白质之编码序列产制，例如β-半乳糖苷酶或谷胱甘肽-S-转移酶。于适当时间间隔后，收集宿主血清或血浆，测试此血清之特异拮抗该抗原的抗体。实例20说明兔子血清抗体之制备，该抗体能特异地拮抗Sj 26/IFNτ混合型蛋白质中之IFNτ抗原。这些技术可应用在所有的IFNτ分子及自其衍生之多肽。

可获得经免疫动物之γ-球蛋白馏份或Ig G抗体，举例而言，系利用饱和的硫酸铵或DEAE Sephadex，或习于此艺之士所知之制造多株抗体之技术。

纯化蛋白质或融合蛋白质可用来产制单株抗体。由经选定多肽抗原免疫之动物取出脾脏或淋巴细胞，并令其无限增殖（im mortalized），或利用熟悉此艺之士习知的方法制备融合瘤（Harlow，et al.）。可自周边血液试样单离淋巴细胞。伊斯汀-巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）可用来使得人类淋巴细胞无限繁殖，或可使用融合参与者以制造融合瘤。

筛选由无限繁殖化细胞分泌的抗体，以测定分泌所欲特异性之抗体的纯系，例如利用ELISA或西方吸渍法（Ausubel et al.）。

多肽之抗原区通常相当小，传统上是7至10个氨基酸之长度。更小片段已鉴定为抗原区。如上所载鉴定干扰素-τ之多肽抗原。制成之DNA编码区域可被重组表达为融合蛋白质或单离的多肽。

此外，部分氨基酸序列可被便利地化学合成（Appied Biosystems，Foster city CA）。由这些方法中任一者获得的抗原可直接用于产制抗体或被偶合在适合载剂分子之上。许多这类载剂是此技艺中习知的且已被商品化（例如，Pierce，Rockford IL）。

与IFNτ反应的抗体是有用的，例如，用于分析结构/功能之关连性。

V.用途

A.繁殖方面

虽然根据结构，及其有效抗病毒特性，IFNτ具有IFNτ一族的某些相似性，但是IFNα s不具有IFNτ相关之繁殖上的特性。同样地，重组牛IFNγ与IFNτ比较时，对于发情间期具极少或无作用（Davis，et al.，1992）。

因此，虽然IFNτ相对于其它干扰素有某些结构上的相似性，其具有本身之独特性质：例如显著影响动情周期之生化趋势的能力。

本发明之人类IFNτ可用助孕及延长雌性哺乳动物黄体生命期之方法中，如Hansen et al之总论，在此并予参考。人类IFNτ对于人类治疗特别有用，因为使用如此一个相同物种的蛋白质较不可能有潜在之抗原反应。

B.抗病毒特性

IFNτ之抗病毒特性有广泛的治疗性应用，而无通常与IFNα s有关之毒性作用。虽然培养基有IFNτ的存在会抑制猫免疫缺乏病毒之逆转录酶活性（实例11），此并非由于IFNτ对FIV的直接作用。更精确地说，IFNτ显然诱使宿主细胞产生对病毒之逆转录酶有抑制的因子。

发现IFNτ具有其抗病毒活性且对细胞无不利作用：无发现细胞毒性作用是由于服用IFNτ之证据。IFNτ缺乏细胞毒性使得IFNτ作为活体治疗剂极具价值。缺乏细胞毒性使得IFNτ与绝大多数其它习知抗病毒剂及所有其它习知的干扰素区隔出来。

含有本发明IFNτ化合物之配方可用来抑制病毒复制。

C.抗细胞增殖特性

IFNτ呈现有效的抗细胞活性。IFNτ亦可用于抑制细胞生长且无目前已知之其它干扰素相关的不良副作用。含有本发明之IFNτ化合物之配方可用来抑制，预防或减缓肿瘤的生长。

某些肿瘤的发育决定于雌激素的调节。用于支持本发明之实验显示IFNτ可抑制雌激素结合至其受体。因此，IFNτ可用来治疗或预防依赖雌激素的肿瘤。

D.干扰素结合至受体的干扰

IFNτ显示与受体分子上的数个位置有交互反应，且这些区域单独或组合会对IFNτ之个别功能有不同的影响。

本发明多肽对于干扰素结合至干扰素受体之选择性抑制作用有效。详言之，如本文所载，某些揭示之多肽会选择性地抑制IFNτ之抗病毒活性，而带它多肽抑制抗增殖活性。这些肽的组合可用来抑制两种活性。除了结合至干扰素受体及阻断IFNτ活性的益处之外，这些肽本身不引起抗病素或抗增殖活性。

因此，这类多肽可用来作为免疫调节分子，当需要预防由干扰素分子引发之免疫反应时。这些肽可用来作为免疫抑制剂，举例而言，用于预防对抗组织移植物之干扰素调节的免疫反应。其它由干扰素调节的免疫反应亦可被阻断，例如α干扰素之细胞毒性作用。

E.药学组成物

根据习知方法，IFNτ蛋白质可被调配以制备药学上有效的组成物。含有干扰素或类干扰素之化合物的配方早有记载（例如，Martin，1976）。大致上，本发明之组成物将调配为有效剂量的IFNτ与合适载剂结合，以利于该组成物之有效服用。

用于这些疗法的组成物亦可呈现多种型式。举例而言，包括锭片，药凡，药粉，液态溶液或悬浮液，脂性小体，栓剂，注射用及灌流用之溶液。较佳形式决定于意欲的投服及治疗应用的方式。此组成物较好亦包括习知之药学上可接受的载剂及佐剂，其为熟悉此艺之士所习知的。较好，本发明的组成物为单位剂量形式且可经常施用至病患，每日一次或一次以上。

IFNτ或相关多肽可以任何药学上可接受之剂型施用至病患，包括静脉内，肌内，病变处内，或皮下注射。更精确的说，用于其它干扰素化合物之组成物及方法可用来输送这些化合物。

本发明化合物之一项主要优点是IFNτ蛋白质之极低细胞毒性。因为这种低细胞毒性，IFNτ有可能以大于其它干扰素化合物（例如，IFNα）一般使用的浓度来施用。因此，施用IFNτ之速率可自约5×10⁴至20×10⁶单位/日提高至500×10⁶单位/日或更高。于一较佳的具体实例，剂量约为10⁶单位/日。高剂量较好用于全身注射。当然，应体认本发明组成物及方法可与其它疗法组合使用。

一些发生病患情况有改善，若有必要，施用维持剂量。然后，用药剂量或频率或两者可减低至经改善状况可被维持的水平，以症状为参数。当症状已减轻至所欲水平时，应终止冶疗。然而病患可能需要基于任何病症后发之间歇性治疗。

本发明组成物可经由标准步骤施用，以治疗多种癌症及病毒性疾病，包括先前其它干扰素已显示具有活性的疾病。举例而言，参见Finter et al.（1991）;Dianzani，et al.（1992）;Francis，et al.（1992）及美国专利案第4，885，166及4，975，276号。然而如上所述，本发明组成物具有独特性质及优点，包括其治疗这些病状且不具毒性之能力。

F.皮肤失调之治疗

皮肤失调可于病变处内使用IFNτ处理，其中配方及剂量将根据施用方法及欲治疗之病变处的范围大小及严重性。较佳方法包括皮内及皮下注射。可多次注射至大病变区，单一病患皮肤上的数个病变处可同时处理。施药计划可由熟悉此艺之士决定。设计为维持性释放的配方可减少施药的频率。

G.全身性治疗

全身性疗法基本上与所有应用一致。可多次静脉内或皮下施药，且于治疗用之可植入的方法中，设计为维持释放的配方特别有用。亦可使用植入式皮下输药器，贮药器，或帮浦（Pumps）来处理病患。

H.局部治疗

使用本发明IFNτ多肽之局部疗法对于治疗特定器官内的肿瘤有效。治疗可并用动脉内输液。异管可被手术式或血管式植入，以直接治疗受害器官。皮下输液器连接至导管可用于慢性治疗，或者可植入式，可再充填式的帮浦亦可使用。

本发明其它具体实例乃IFNτ蛋白质作为天然杀手（NK）细胞之活化剂的用途。

下列实例系用于说明本发明，绝非用来限定本发明。

材料和方法

限制核酸内切酶，T4 DNA接合酶，T4多核苷酸激酶，Taq DNA聚合酶，及小牛肠磷酸酶乃购自New England Biolabs（Beverly，MA）或Promega Biotech（Madison，WI）：这些试剂根据制造厂商之指示使用。进行定序反应，使用“SEQUENASE DNA Ⅱ”定序套组（United States Biochemical Corporation，Cleveland OH）。免疫吸渍及其它试剂购自Sigma Chemical Co.（St.Louis，MO）或Fisher Scientific（Needham，MA）。硝化纤维滤纸购自Schleicher and Schuell（Keene，NH）。

合成之寡核苷酸连接子与引子系使用商品化之自动式寡核苷酸合成仪制备（例如，ABI 380 B-02型之DNA合成仪（Applied Biosystems，Foster City，CA））。或者，可购买由客户设计的合成型寡核苷酸，例如，购自Synthetic Genetics厂（San Diego，CA）。cDNA合成试剂与随意引导之标记套组可购自Boehringer-Mannheim Biochemical（BMB，Indianapolis，IN）。

编码多肽之寡核苷酸可利用寡核苷酸合成标准法直接合成，或者，当其为大的编码序列时，藉由一系列选殖步骤来合成，包括相当于编码序列之多重寡核苷酸片段的前后排列（Crea;Yoshio et al.;Eaton et al.）。寡核苷酸编码序列可根据标准重组步骤而予表达（Maniatis et al.，Ausubel et al.）。

或者，根据活体外技术直接合成肽（Applied Biosystems，Foster City CA）。

根据标准法进行涉及多株及单株抗体操作之一般运作，包括自血清纯化抗体（Harlow et al.）。Pierce厂（Rockford，IL）是许多抗体试剂之供应处。

重组人类IFNα（r HuIFN α）及rBoIFNγ购自Genentech Inc.（South San Francisco，CA）。重组人类IFNα之参考制剂（r HuIFN α）得自国家卫生处（NIH）：rHuIFNα可自Lee Bimolecular购得（San Diego，CA）。

所有组织培养基，血清及用于本发明之IFNs不含有内毒素，系根据使用敏感量为0.07ng/ml之Limulus阿米巴样细胞溶解物（洽询Cape Cod，Woods Hole，MA）之分析法测定。

用于测定抗体之一般ELISA步骤

令聚苯乙烯96孔洞测试盘Immulon Ⅱ（PGC）涂覆含有5微克/毫升抗原（每孔洞100微升）之0.1M的碳酸盐/重碳酸盐缓冲液，pH9.5。以保鲜膜封盘并置于4℃一液。

抽取盘内液并使用300微升之10% NGS阻断（block），且于37℃静置1小时。

以PBS 0.5%“TWEEN-20”洗涤试盘5次。

抗血清稀释于0.1M PBS，pH 7.2。将抗血清（0.1毫升）之所欲稀释液加入每一孔洞，并静置试盘于37℃，1小时。再以PBS 0.5%“TWEEN-20”洗涤试盘5次。

将经辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）共轭之山羊抗人类血清（Cappel）稀释1/5000于PBS。令0.1毫升该溶液加至每一孔洞。静置试盘于37℃历30分钟，再以PBS洗涤5次。

添加至试盘前才制备Sigma ABTS（受质）。

此试剂由50毫升之0.05M柠檬酸，pH 4.2，0.078毫升之30%过氧化氢溶液及15毫克ABTS组成。将0.1毫升受质加入每一孔洞，再静置30分钟于室温中，以添加0.05毫升之5% SDS（w/v）终止反应。测定410nm之相对吸光度。

实例1

IFNτ之繁殖上功用及抗病毒活性

测定干扰素-τ对于黄体生命期之作用。

以表1所示浓度的IFNτ灌注入绵羊黄体。以相似浓度灌注重组人类IFNα（rHuIFN α）。此外，亦包括未受处理的对照组动物。评估黄体之生命期系根据发情间期之测定，黄体酮分泌之维持，及前列腺素分泌之抑制（Hanson，et al.）。

表1

干扰素对繁殖生理之作用

干扰素处理发情间期(天数)

对照组 17.3

100微克/天 16.0

rHuIFNa 200微克/天 16.0

2000微克/天 19.0

OvIFNτ 100微克/天 27.2

对照组动物与接受OvIFN τ之动物的发情间期比较，证明当IFNτ投用100微克/天时，间期有显著延长。另一方面，对照组动物与接受重组人类IFNα之动物的发情间期比较，证明rHuIFNα具无意义的作用。

这些结果显示干扰表-τ具有显著影响动情周期之生化趋势的能力。

实例2

干扰素-τ在繁殖周期不同阶段上的抗病毒特性

建立胚体培养物，其利用得自动情周期第12至16日之绵羊。使用细胞病变作用分析法评估得自每一胚体培养物上清液之抗病毒活性（Familetti，et al.，1981）。简言之，将IFNτ或其它IFNs稀释物与Madin-Darby牛肾细胞（MDBK）培养16-18小时于37℃。培养后，于细胞病变作用分析法中测定病毒复制之抑制情形，其使用水疱性口炎病毒（VSV）作为攻毒病毒。

相对于被VSV感染之未治疗的MDBK细胞（对照组试盘），一个抗病毒单位造成单层细胞之破坏50%。

进一步评估特异活性，其使用正常绵羊之纤维母细胞。（Shnf）于斑抑制法（Langford，et al.，1981）。测定每一时间点上之三组试样的最低值，每一试样重复三次分析。示于表2的结果以平均值单位/毫升表示。

表2

胚体培养物，脲囊液及羊膜腔液之IFNτ抗病毒活性

日数试样单位/毫升

10 9 <3

12 5 34

胚体培养物

13 6 4.5×10³

14 3 7.7×10³

16 12 2.0×10⁶

60 3 1.4×10³

尿囊液 100 4 11

表2(续)

胚体培养物,脲囊液及羊膜腔液之IFNτ抗病毒活性

日数试样单位/毫升

尿囊液 140 3 <3

60 3 22

羊膜腔液 100 4 <3

培养上清液有逐渐增加的抗病毒活性，其与胚体之发育渐进有关（表2）。

实例3

IFN τ于细菌内表达

将OvIFN τ之氨基酸编码序列（Imakawa，et al.，1987）用来生成具有于大肠杆菌可达最佳表达之密码用法的对应DNA编码序列。将连接子序列加至5′及3′端，以利于细菌表达载体之选殖。设计此核苷酸序列以包含分布整个编码序列之19个不同的限制酶位置（图1）。

将此核苷酸序列分成大小范围在33至75个碱基的11个寡核苷酸片段。11个寡核苷酸片段皆由380-B双管柱之DNA合成仪（Applied Biosystems）合成，且将其单股或双股殖入下列载体之一：“pBLUESCRIPT⁺（KS）”（Stratagene，LaJolla，CA），pTZ18R（Pharmacia，Piscataway，NJ），或pTZ19R（Pharmacia，Piscataway，NJ）选殖载体。

令载体转形大肠杆菌K株“XL1-BLUE”（recAl end Al gyr A96 thi hsdR17（r^- _k，m_k+）SupE44 re lAl λ-（lac），｛F′，ProAB，lac

Z△M15，Tn10（tet^R｝），其系购自stratagene厂（LaJolla，CA）。令经转形细胞生长在添加安比西林（Ampicillin）（50微克/毫升）之L肉汁。寡核苷酸之选殖及融合系利用标准重组DNA技术进行。

以适当限制酶切割选殖载体以利嵌入合成之寡核苷酸。以小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理载体以除去终端之磷酸根。磷酸化寡核苷酸且以单股或双股分子型式殖入适合载体，其利用T4 DNA接合酶。当单股型式被殖入选殖载体时，使用DNA聚合酶及所有4种去氧核糖核苷酸来完成第二股。

为了要进行双股选殖，首先将寡核苷酸与其合成之互补股粘合，然后接合至选殖载体。再将大肠杆菌K12之SB221株或NM522株转形，并利用接合反应。当涉及甲基化反应敏感之Stu I及Cla I限制酶位置时，使用大肠杆菌GM119株进行选殖。选殖过程的每一阶段，进行经单离DNA之限制酶分析。

将经选殖之寡核苷酸融入单一多核苷酸，系利用图2标明之限制酶水解及接合。含有寡核苷酸的片段通常在低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳式分子大小分级分离之后被单离出来（Maniatis，et al.，Sambrook，et al.;Ausubel，et al.，）。制得的IFN τ多核苷酸编码序列分布在位置16至531：具172个氨基酸之编码序列。

最后的多核苷酸之核苷酸序列系根据DNA定序予以证实，其使用二去氧链终止法。

将全长的StuI/Sst I片段（540个碱基对;图2）殖入经修饰的pIN Ⅲomp-A表达载体且将其转形至大肠杆菌之胜任SB221株。为达IFNτ蛋白质表达之目的，令具有表达载体的细胞生长在含安比西林之L-肉汁中，达OD（550nm）为0.1至1，使用IPTG诱发3小时且藉离心法收集产物。可溶性重组IFNτ自细胞释出，系使用超音波或渗透式分级分离。

实例4

IFN τ于酵母菌中表达

实例3 合成之合成型IFN τ基因在其5′端紧接Stu Ⅰ限制酶位置且在3′端聚接Sac Ⅰ限制酶位置。

A.合成型IFNτ基因之单离

2个寡核苷酸引子（SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14）被用来将连接子附著至合成型IFN τ基因，其使用聚合酶链反应。位在5′端之连接子使得合成型IFN τ基因之安置呈现酵母菌选殖载体pBS24Ub内存在的泛醌素编码序列之正确译读。此连接子亦构筑泛醌素-IFNτ连接区，其于活体内可使得泛醌素序列与IFN τ序列分离。5′寡核苷酸亦编码SacⅡ限制核酸内切酶切割位置。3′寡核苷酸含有StuI切割位置。

根据碱水解法，自大肠杆菌“XLI-BLUE”株单离具有合成IFN τ基因之载体（实例3）。经单离的载体稀释500倍于10mM Tris，pH8.0/lmM DETA/10 mM NaCl。PCR反应于100微升体积中进行，其使用Taq DNA聚合酶及引子SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：13。经扩大产物以Stu Ⅰ及Sac Ⅱ水解。将这些经水解的片段接合至“pBLUE SCRIPT+（KS）”之Sac Ⅱ与Sma Ⅰ位置。

产生的质体命名为pBSY-IFNτ。此DNA序列利用双股DNA作为模板而被确认。

B.表达质体之构筑

使用Sac Ⅱ及Eco RV水解质体pBSY-IFNτ，并单离含有合成IFNτ基因之片段。以Sal Ⅰ水解酵母菌表达载体pBS 24 Ub（Sabin，et al.;Ecker，et al.）。使T4 DNA聚合酶以生成钝端。使用酚并以萃取载体DNA并以乙醇沉淀（Sambrook，et al.，1989）。经回收之直线状质体以Sac Ⅲ水解，藉琼脂糖凝胶电泳纯化并将其接合至由pBSY-IFNτ单离的SacⅡ-EcoRV片段上。所生成的重组质体命名为pBS24Ub-IFNτ。

令重组质体pBS24 Ub-IFNτ转形大肠体菌。单离含有IFN τ嵌入物之重组纯系并藉由限制酶分析法鉴定之。源自含有IFN τ编码序列之纯系的质体DNA系用于啤酒酿母菌之转形作用（Rothstein，1986）。将转形混合物涂布在不含尿嘧啶之培养基上且于30℃培养3-5天。再将菌落划痕且维持在无尿嘧啶及白氨酸之培养基（Rothstein，1986）。

C.表达试验

为了进行小规模的表达，自不含尿嘧啶及白氨酸之培养盘，挑出含有pBS24 Ub-IFNτ之啤酒酿母菌AB 116的单一个菌落，且令其生长于30℃之YEP培养基中（1%酵母菌萃取物，2%胨）。诱发状态时，其含有1%葡萄糖。或者在非诱发状态时，其含有8%葡萄糖。回收细胞溶解物并用于SDS-PAGE，凝胶含15%聚丙烯酰胺，0.4%双聚丙烯酰胺（Sambrook，et al.，1989）。经分级分离的蛋白质藉考马斯蓝染色法显现为可见的。

藉使用拮抗绵羊IFN τ之多株抗血清之免疫吸渍法，将重组IFN τ特异地显见在经分级分离之细胞萃取物电转移的“NY TRAN”纸上（Rothstein，1986）。

为了进行大规模的表达，令pBS24-IFN τ生长24小时于30℃，含8%葡萄糖之5×尿嘧啶及不含白氨酸之培养基中。再将此培养物稀释100倍于含8%葡萄糖之YEP培养基中。再将此培养物稀释100倍于含1%葡萄糖之YEP培养基中，再培养24-36小时。

藉离心收集细胞，于50mM Tris，pH7.6/1mM EDTA中洗涤且悬浮在含1mM PMSF之洗涤缓冲液中。利用珠子撞击器（Biospec Products，Bartlesville，OK）溶解细胞。令溶解物旋转离心43，000×g，历20分钟。回收悬浮液部分且用于进行如下所述之纯化过程。

D.源自酵母菌细胞溶解物之r-IFN τ的纯化

将悬浮液馈至1×10公分之DEAE管柱上，以10mM Tris，pH8.0清洗。停驻的蛋白质以300毫升，0至0.5M NaCl梯度之10mM Tris，pH8.0溶离。收集3毫升各流份。令含有重组体（r-IFNτ之流份17-26的10微升试样，进行于15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上之电泳分离并以考马氏蓝染色法显见蛋白质。

流份18、19和20含有最大量之r-IFN τ。这些流份分别装在1.5×90厘米Sephadex S-200柱上，各蛋白质被解析成两个峰。将每一个蛋白质峰的各等份（25μl）在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，用Coomassie染色法显示各蛋白质。

混合含r-IFN τ之经纯化的流份且藉放射免疫法定量r-IFN（Vallet，et al.，1988）。利用Lowry蛋白质法测定总蛋白质浓度（Lowry，et al.，1951）。

经纯化之r-IFN τ的微量定序证明首15个氨基酸与天然IFN τ相同，证实泛醌素/r-IFNτ融合蛋白质在活体内被正确地处理。

纯纯化之r-IFN τ呈现每毫克蛋白质具有2至3×10⁸个单位之抗病毒活性（n＝3次重复试盘），此类似于由适用胚体之培养基纯化之IFN τ的抗病毒活性（2×10⁸单位/毫克）。

实例5

人类高分子量DNA之南方吸渍分析

收集源自健康捐血者之人类静脉血试样于经肝素处理的试管中并单离周边血液淋巴球，其藉使用Ficoll-Isopaque梯度（1.077克/毫升）（Sigma Chemical Co.）之密度梯度离心法。高分子量（HMW）之DNA单离自这些细胞（Sambrook，et al.，1989）。

使用限制核酸内切酶Hind Ⅲ或Pst Ⅰ（Promega）水解2份10微克之HMW DNA试样，于37℃历2小时，再令DNA片段电泳分离于0.8%琼脂糖凝胶（Bio-Rad，Richmond，CA），于75伏特历8小时。令DNA片段转移至尼龙膜上（IBI-International Biotechnologies，Inc.，NewHaven，CT）。烘烤膜于80℃历2小时且静置于42℃之如下预杂交溶液中，历4小时：5×SSC（1×SSC为0.15M NaCl及0.15M柠檬酸钠），50%体积/体积之甲酰胺，0.6%（重量/体积）SDS，0.5%（重量/体积）脱脂奶粉，20mM Tris-HCl（pH7.5），4 mM EDTA，及0.5毫克/毫升单股之鲱精子DNA（Promega）。

再将滤纸静置于杂交溶液中，于42℃历18小时，杂交溶液包括：5×SSC（1×SSC是0.15M NaCl及0.15M柠檬酸钠），20%体积/体积甲酰胺，0.6%（重量/体积）SDS，0.5%（重量/体积）脱脂奶粉，20mM Tris-HCl（pH7.5），4mM EDTA，及2×10⁸cpm/毫升³²p-标记之OvIFN τcDNA（Imakawa，et al.，1987）。洗涤滤纸于42℃历15分钟，使用2×SSC及0.1%（重量/体积）SDS，并将滤纸置于X-射线底片上（XAR，Eastman Kodak，Rochester，NY），于-80℃曝光48小时，并用增强感光幕。

自动放射显影结果显示一杂交讯号，其位于经Pst Ⅰ水解之DNA的3.4碱基对处及经HindⅢ水解之DNA的较小片段（≈13.0碱基对）。这些结果显示有互补OvIFN τ cDNA探针之人类序列的存在。

实例6

利用PCR单离人类IFN cDNA之部分序列

合成2个合成寡核苷酸（每一个具25个核苷酸），其分别对应至OvIFN τ cDNA之序列231至255（包含在SEQ ID NO：13）及序列566至590（包含在SEQ ID NO：14）（相对于cap位置之编号，Imakawa，et al.，1987）。这些引子分别含有限制核酸内切酶Pst Ⅰ及EcoRI之切割位置。SEQ ID NO：14经修饰以含有EcoRI位置，其由位置569开始。

自下列两种近1×10⁵个斑形成单位（pfu）之cDNA库单离DNA：人类足孕胎盘（Clontech，Inc.，Palo Alto，CA）及人类足孕滋养叶胚层（Dr.J.F.Strauss，宾州大学，philadelphia PA）。将该DNA用于聚合酶链锁反应（PCR）扩大法（Mullis;Mullis，et al.;Pekin Elmer Cetus Corp.Norwalk CT）。扩大反应进行30次循环（45℃，1分钟;72℃，2分钟;94℃，1分钟）（温度循环器及试剂，Perkin Elmer Cetus），其使用引子SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：13。

令扩大产物以电泳分离（100伏特，于1.5%琼脂糖凝胶（Bio-Rad））且将其转移至尼龙膜上（IBI）。令该膜于80℃烘烤2小时且如上所述与³²P-标记之OvIFN τ cDNA预杂交及杂交。于5×SSC/0.1%（重量/体积）SDS中洗涤该膜5分钟，于42℃，及以2×SSC/0.1%（重量/体积）SDS洗涤2分钟，于42℃。再于-80℃曝光至“XAR”（Eastman Kodak）之X-射线底片，历时24小时，并用增强感光幕。测定杂交至经标记之探针DNA的扩大产物。

如上所述再次进行pCR。以限制核酸内切酶EcoRI及PstI（Promega）水解经扩大的产物，于37℃历90分钟。如上所述将生成的DNA片段电泳分离且将含有IFN τ扩大产物之带自凝胶切出。利电溶离法回收DNA片段，将其再次选殖至经EcoRI/Pst Ⅰ水解之去磷酸化的质体pUC19中并藉氯化钙法（Sambrook et al.，1989）转形至大肠杆菌JM101株（Promega）。单离质体且使用二去氧终止法将经嵌入之扩大产物定序（Sanger，et al.，1977;“SEQUENASE”反应剂，United States Biochemical，Cleveland，OH）。测定核苷酸序列且这些序列及推定的氨基酸序列与其它IFN序列之比较系利用DNA Star软体（Madison，WI）进行。

这些纯系之序列比较显示有三种不同纯系：源自人类胎盘库，即纯系15（306个碱基对）及纯系21（315个碱基对），这2个纯系嵌入物之核苷酸序列有95%同源性;或源自滋养叶胞层库纯系CTB35（301个碱基对），此纯系相对于纯系15及纯系21分别有95%及98%之同源性。

实例7

全长人类IFN τ基因之单离

以限制核酸内切酶EcoRI水解10毫克之PBMC HMW DNA且令其进行于0.8%琼脂糖凝胶上之电泳分离。将含有分子大小介于1.5至10仟碱基对（kb）之间的DNA片段之一系列试样（例如1.5至2.5仟碱基对，2.5至3仟碱基对），自凝胶切出。将这些DNA电溶离及纯化。如上所述，使用OvIFN τ引子扩大每一个DNA试样。将产生正PCR讯号之任何试样的DNA分子殖入λgtll（次基因组λgtll库）。

A.含有互补于OvIFN τ之序列之纯系的PCR鉴定

再将λgtll涂覆以形成噬菌斑，并使用³²P-标记之OvIFN τ cDNA探针进行噬斑揿起杂交法。近20个杂交至探针的纯系被鉴定。

杂交至探针的噬菌斑进一步以PCR分析，其使用如上所述之OvIFN τ引子。将产生正PCR讯号的6个噬菌斑纯化。单离源自这些纯系之噬菌体DNA并以EcoRI限制核酸内切酶水解之。将DNA嵌入物再次选殖至pUC19载体中且根据二去氧核苷酸定序法测定其核苷酸序列。

B.含有互补至PCR-正反应之噬菌斑的纯系之杂交鉴定法

令源自λgtll次基因组库之重组噬菌体增殖于大肠杆菌Y1080，并以约20，000噬菌斑/150毫米培养皿之密度涂覆大肠杆菌Y1090。于培养皿上方置放复印用之硝化纤维膜，其再与³²P-标记之探针杂交，该探针系源自上述单离之6个人类IFN τ cDNA纯系。产生正杂交讯号之三个纯系进一步筛选及纯化。单离噬菌体DNA，以EcoRI水解，再次选殖至pUC19载体中且定序之。这三个纯系得到相对至cap位置之超过800个碱基的序列资料（纯化以正反两方向序列）。核苷酸序列资料如SEQ ID NO：1所示且推测之蛋白质编码序列如SEQ ID NO：12所示。此基因之推测成熟蛋白质序列（SEQ ID NO：12）相对于OvIFN τ之推测蛋白质序列的比较示于图3。

实例8

藉RT-PCR分析HuIFN τ mRNA之存在

利用如上所述之OvIFN τ cDNA探针的杂交法，分析由第15-16天胚体所构筑的人类胎盘cDNA库及绵羊cDNA库。令cDNA于琼脂糖凝胶上进行分子大小之分级分离且将其转移至滤纸（Maniatis，et al.;Sambrook，et al.）。使用OvIFN τ探针之南方吸渍分析示源自人类cDNA库之自动放射显影的讯号是利用OvIFN τ cDNA库所得讯号的约1/100。

分析人类足孕胎盘及羊膜细胞（26周，2百万个细胞）之HuIFN τ mRNA的存在，其利用逆转录酶-PCR（RT-PCR）法（Clontech Laboratories，Palo Alto CA）。将单离自人类胎盘，羊膜细胞及绵羊胚体单离之总细胞RNA（tcRNA）反式转录，其使用引子SEQ ID NO：13。再将引子SEQ ID NO：12加入反应物且进行聚合酶链锁反应达40次循环。令PCR产物于琼脂糖凝胶上进行分子大小分级分离并将其转移至滤纸上。使用³²P-标记之OvIFN τ及HuIFN τ cDNAs杂交滤纸上的DNA。这些分析的结果证明人类IFN τ mRNA存在于胚期胎盘之附属部分。羊膜细胞亦表达对应至OvIFN τ引子及人类引子的讯号。

此外，为了侦测HuIFN τ之存在，应用RT-PCR分析法至由成人淋巴细胞单离之tc RNA。光密度分析结果显示，IFNτ mRNA显然存在淋巴细胞中。

实例9

定位杂交法（In Situ Hybridization）

A.组织

检测半连续5-μ厚之经石腊包埋之切片的玻璃片，其得自4组健康，不同之足孕及首三个月之人类胎盘。

B.cRNA探针之制备

由单离自OvIFN τ扩大库的cDNA纯系中，再次选殖对应至OvIFN τ cDNA碱基＃77-736的片段至转录载体，pBS（New England Biolabs（碱基＃1是cap位置;OvIFN cDNA之开放读译架构是碱基＃81-665;图7）。单离得数个pBS纯系，再次选殖，且定序其核苷酸。由此纯系，使用限制核酸内切酶Nla Ⅳ及EcoRI切出3′片段（碱基＃425-736）且将其再次殖入转录载体pBS。此载体命名为pBS/OvIFN τ。

将pBS/OvIFN τ质体直线化后，藉活体外转录法合成反意（Antisense）cDNA探针（Sambrook，et al.，1989），其使用T7 RNA聚合酶（Stratagene）。将微量³H-CTP（NEN-DuPont，Cambridge，MA）用于转录反应。使用digoxigenin标记之dUTP（Bochringer-Mannheim，Indianapolis，IN）被摄入cRNA且经由TCA沉淀法及闪烁计数法测定产物量。

C.杂交反应

根据Lawrence，et al.（1985）所载，进行使用反意RNA探针之定位杂交法，其中有如下的更改处。令经去石腊及含水之切片于室温下预先水化合10分钟，于含有5mM MgCl₂之经磷酸盐缓冲之生理食盐水（PBS）。含切片中的核酸于65℃变性10分钟，于50%甲酰胺/2×SSC（1×SSC是0.15M NaCl及0.15M柠檬酸钠）。静置切片于37℃一夜，使用含0.3微克/毫升经digoxigenin标记之cRNA探针的杂交混合液（30微升/玻璃片），再洗涤30分钟，于37℃之50甲酰胺/1×SSC中。最后一次洗涤进行30分钟，于室温下，1×SSC及0.1×SSC中。阻断切片30分钟，其使用0.5%Triton X-100（Sigma）及0.5%脱脂奶粉。

测定杂交讯号，其使用共轭至碱性磷酸酶之经纯化的绵羊抗dioxigenin Fab片段（Boehringer-Mannheim）。除去未结合的抗体后，加入硝基蓝四唑（nitroblue tetrazolium）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐受质（Promega）及雷瓦米若（levamisole（Bector Laboratories，Burlingame，CA），经由比色性受质的生成，进行讯号测定。该组织于甲基绿（Sigma）中对比染色，脱水，及包埋。

作为对照组，部分组织切片以100微克/毫升之胰RNase A（Sigma）预处理30分钟于37℃。RNase在玻璃片上被钝化，其使用400单位之RNase抑制剂（Promega）。再令玻璃片于含有6.4μ/ml PBS/MgCl₂的250毫升PBS/5 mM MgCl₂中洗涤两次。于另一对照试验中，用t RNA（Sigma）代digoxigenin探针。

观察三组个别实验中所有足孕及首三个月胎盘组织之特异杂交情形，其使用不同的OvIFN τ cRNA探针浓度及阻断试剂。

首三个月三胎盘绒毛系由外层的融合细胞滋养层，底层之滋养叶胞层，及具有多种型式间质细胞的中心间质区所组成，其呈现IFN τ之最高转录水平于滋养叶胞层细胞中。较不强但可测得之水平呈现在融合细胞滋养层及间质细胞。相似的转录表达情形亦显示在足孕组织之胎盘绒毛中，但讯号测定水平低。首三个月之绒毛外滋养层呈现讯号最高量且可被染色，其出现在母体血液交换处。

实例10

IFN τ之抗病毒活性

于抗病毒分析法中评估纯化至均质之OvIFN τ的相对特异活性。基本上如上述实例2所述，进行抗病毒分析。抗病毒分析法所得之特异活性系以抗病毒单位/毫克蛋白质来表示，其使用Madin-Darby牛肾（MOBK）细胞或绵羊正常纤维母细胞（Shnf）。同时分析所有试样以排除各分析组间的差异。结果示于表3，其为4组测定之平均，其中标准误差低于平均值之10%。

表3

IFNτ及习知IFNs之抗病毒活性

IFN τ比rBoIFNα或rBoIFNγ之特异活性高（表3）。rHuIFNα之NIH标准制剂有类似的特异活性，然而rHuIFNα之商品化制剂呈现低的特异抗病毒活性。使用牛或绵羊细胞皆证实可比较之相对抗病毒活性。

实例11

IFN τ之抗逆转录病毒活性及细胞毒性作用

对于暴露至猫免疫缺乏逆转录病毒之猫周边血液淋巴细胞，测试高度纯化之OvIFN τ的抗逆转录病毒及细胞毒性作用。此豆状病毒（lentivirus）产生猫的慢性类AIDS的症状，是研究人类AIDS的模型（Pederson，et al.，1987）。周边血液淋巴细胞内病毒的复制情形，系根据一段时间内培养上清液中的逆转录酶活性予以检视。这些方法所得数据，示于表4。

表4

OvIFNτ对于FIV复制之作用

OvIFN τ的添加，产生快速，剂量决定性增加之逆转录酶（RT）活性（表4）。浓度如0.62微毫克/毫升一般低之IFN τ可抑制病毒复制，而对RT活性有更大作用之较高浓度（40微毫克/毫升）对细胞却无毒性作用。此结果显示当细胞与OvIFN τ一起培养时，猫免疫缺乏病毒之复制与对照组数值比较，显著地被降低了。

IFN τ显然对于有逆转录病毒驻留的细胞不具有细胞毒性。甚至当IFN τ以每毫升培养基含40微克的浓度存在时，此亦为真确的。

实例12

IFN τ对于经HIV感染之人类周边淋巴细胞的作用

亦测试IFN τ对于拮抗人类细胞中HIV感染的活性。令业经HIV（Crow，et al.，）感染的人类周边血液淋巴细胞，以不同浓度的OvIFN τ处理。检视周边血液淋巴细胞内HIV之复制情形系根据一段时间内培养上清液中的逆转录酶活性。测定逆转录酶活性基本上系根据Hoffman，et al之方法。这些方法测得的数据示于表5中。

表5

OvIFNτ对于人类周边血液淋巴细胞中HIV复制之作用

如表5所示，OvIFNτ之浓度产生显著的抗病毒作用。只有10微毫克/毫升的浓度，即能造成RT活性超过50%之降低，其仅处理6日。浓度为500微毫克/毫升造成处理10日内之RT活性有90%降低。

经一范围浓度之IFNτ处理3至13日后的周边血液淋巴细胞之存活率，系根据锥蓝质（trgpan blue）排出情形而予评估。存活率分析之结果示于表6。

表6

OvIFN τ对于经HIV感染之人类周边淋巴细胞存活率的作用

示于表6之数据显示，无任何细胞毒性作用是由于IFN τ之施用所造成的迹象。

实例13

细胞生长之抑制作用

亦测定IFN τ对于细胞生长之作用。使用集落抑制法测定抗细胞生长活性。将低密度的人类羊膜（WISH）或MDBK细胞涂覆于培养皿，以形成源自单一细胞之集落。令细胞以200或400个细胞/孔洞之浓度，培养在24孔洞试盘中，于补充2%胎牛血清（FBS）及必须与非必须氨基酸的HMEM中。加入不同稀释度之干扰素至重复三次的孔洞中，且令试盘培养8小时以使集落形成。集落系经结晶紫染色后而为可见的，并计数之。细胞周期分析系使用含0.5%“耗竭（spent）”培养基之HMEM进行额处的7天。不经同期化，即使用WISH细胞。

为了检测IFN τ活性，令细胞再平置于6孔洞培养盘，其浓度为2.5×10⁵细胞/孔洞，于含10%FBS之HMEM中。加入不同稀释度之IFN τ，单独或与其它肽组合，以达终体积为1毫升。培养盘于37℃，5%CO₂中培养12，15，18，24或48小时。以胰蛋白酶处理细胞，低速离心收集细胞及洗涤之。令细胞团块吸渍至干，且将核染色液加入每一试管，该核染色液含有5毫克丙锭碘（propidium iodide），0.3毫升NP40及0.1克柠檬酸钠，于100毫升蒸馏水中。试管静置于室温中。10分钟后，每管加入250微升之RNase（500单位/毫升，于1.12%柠檬酸钠中），再静置20分钟。经过44微米筛孔过滤细胞核，于FACStar（Becton Pickinson，Mountain View，CA）上分析，其使用DNA Star 2.0软体。

细胞生长法中利用牛上皮细胞株，MDBK，及人类羊膜细胞株，WISH，之集落形成，可知OvIFN τ抑制集落的大小及数目。绵羊OvIFN τ比人类IFN α对人类细胞株有效;因此，其在物种间活性十分强。其活性系由剂量决定，增殖之抑制情形可见于低至1单位/毫升之浓度。高达50，000单位/毫升之浓度（抗病毒活性单位/毫升）会终止增殖，然细胞存活率不受损。

细胞周期分析系藉由测定经丙锭碘染色之WISH细胞之流动式细胞计数器，结果显示OvIFN τ处理后48小时，于G2/M期有细胞之增加比例。故IFN τ显然可抑制细胞发展至S期。绵羊IFN τ抗增殖作用可见于培养开始后12小时之早，且维持6日。

上述结果证明IFN τ具有抗增殖作用以及低细胞毒性。

实例14

IFN τ之其它抗增殖作用

研究OvIFNτ对于大白鼠细胞株及牛细胞株之抗增殖作用。H-胸腺嘧啶之摄入速率被用来评估细胞增殖的速率。

将大白鼠（Mt Br7.c5）或牛肾（MDBK）细胞种于不含酚红之DME-F12培养基中，此培养基另添加3%经葡聚糖涂覆之煤处理的控制处理血清替代品2（CPSR2，Sigma），及经葡聚糖涂覆之煤处理的胎牛血清（FBS）。接触约15-18小时后，以不含血清之DME-F12培养基洗涤细胞一次。该培养基置换为不含酚红的DME-F12培养基，其另添加3%经处理之CPSR2，1%经处理之FBS（“3/1”培养基）或置换为含不同抗病毒活性单位之OvIFN τ的3/1培养基（实例2），该单位之测定系如干扰素对水疱性口炎病毒之攻毒法测定者。

含有类似稀释度之缓冲液（未稀释之培养基＝10mM Tris，330 mM NaCl，[TS]）的培养基用于对照组，其中OvIFN τ溶于该缓冲液中。

于处理后约48小时，令细胞脉冲标记³H-胸腺嘧啶历2小时，藉闪烁记数器测定可被三氯乙酸（TCA）沉淀之被摄入的记数物。每组处理包括三次重复。OvIFN τ处理之平均值与含有可比较稀释度之载剂TS缓冲液的试样比较。这些试验的结果示于表7。

表7

³H-胸腺嘧啶之摄入情形

由表7可知，OvIFN对每一种测试的细胞株显著地降低细胞增殖的速率（根据胸嘧啶摄入情形）。

实例15

IFN τ对于人类肿瘤细胞株之抗增殖作用

评估OvIFN τ对人类肿瘤细胞株之抗增殖活性，其系根据测定³H-胸腺嘧啶摄入经OvIFN τ处理之细胞的速率。

为了试验生长于悬浮液的肿瘤细胞株，将1毫升细胞静置于24孔洞之培养盘中，浓度为2.5-5×10⁵细胞/孔洞。三次重复的孔洞接受适合培养基，100，1，000或10，000单位/毫升之OvIFN τ或相等抗病毒浓度之rHuIFNα 2A（Lee Biomolecular）。培养48小时后，计算细胞器且根据锥蓝排出情形评估存活率。

将1毫升附着性肿瘤细胞株置于6孔洞培养盘，其浓度为2.5×10⁵细胞/孔洞。其接受如上所述之干扰素处理，但于计数前，以胰蛋白酶处理。

藉误差分析及接着Scheffe′s F-测试，评估处理组之间的有意义差异。藉使用丙锭碘之流动式细胞计数器进行细胞周期之分析。

A.乳腺癌细胞

得自对数生长期培养物之人类MCF7乳腺癌细胞种入无酚红之DME-F12培养基中，其中添加有经3%葡聚糖涂覆之活性炭处理的CPSR及经5%葡聚糖涂覆之FBS。接触约15-18小时后，以不含血清之DME-F12培养基洗涤细胞一次。令培养基置换为不含酚红之DME-F12培养基，其添加有3%经处理之CPSR2，1%经处理之FBS（“3/1”培养基）或添加抗病毒活性单位指定数目之OvIFN τ的3/1培养基，该单位系如测定干扰素之水疱性口炎病毒攻毒法所测定者。含有类似之缓冲液稀释度被用来作对照（未稀释缓冲液＝10mM Tris，30mM NaCl[TS]）。于处理后约48小时，以³H-胸腺嘧啶脉冲标记细胞历2小时。

藉闪烁记数法测定三氯乙酸（TCA）沉淀之经摄入的记数。每处理处包括3次重复。令OvIFN τ之平均值与含有可比较稀释度之载剂TS缓冲液的试样比较。这些分析结果示于表8。

表8

³H-胸腺嘧啶之摄入情形

由表2所示结果而知，OvIFNτ实质上可降低³H-胸腺嘧啶于人类癌细胞株内之摄入速率。此证明OvIFN τ于抑制肿瘤细胞增殖的效力，特别是乳癌细胞增殖。

B.人类前骨髓细胞白血病

OvIFN τ及IFN α之抗增殖作用的比较，系利用HL-60（人类白血病）细胞进行（Foa，et al.;Todd，et al.），此基本上与上述用于MDBK细胞者相似。oIFNτ与rHuIFNα皆抑制HL-60细胞增殖。三组重复试验任一者之结果以生长降低百分比之平均值±SD表示于图4。图4表示，OvIFNτ及IFNα皆能够显著地降低HL-60细胞之生长。每一化合物之生长降低情形超过每一测试浓度之60%。于10，000单位/毫升时，IFNα之毒性造成低于25%之细胞依然存活。相反地，当OvIFN τ使用10，000单位/毫升时，近100%细胞依然存活。

图5所示数据证明rHuIFNα有细胞毒性。图中，三组重复试验任一者之结果以存活百分比平均值±SD表示。

C.人类皮肤T细胞淋巴瘤

当以IFN τ处理皮肤T细胞淋巴瘤时，HUT78，反应类似HL-60（图9）。OvIFN τ与rHuIFNα皆降低HUT细胞之生长，但10，000单位/毫升之rHuIFNα减少细胞数低于原先置放者（5×10⁵）。此显示细胞存活率降低至约60%。

细胞周期分析（藉细胞流动式细胞计数器进行）显示以两种干扰素处理48小时之细胞周期中G2/M期的细胞有被增加比例（表10）。表10中，三组重复试验之任一者的结果以细胞周期之任一期的细胞百分比来表示。分析每一试样处理10，000单位者。

此结果似乎是由于细胞周期中细胞的较慢进展。以10，000单位/毫升rHuIFNα处理之试样中，出现高百分比之具低进展及由死细胞鉴定之高侧散布的现象。此与增殖试验所得数据一致，其中只有oIFNτ抑制HUT78增殖且无毒性。

表10

HUT 78细胞周期之分析

D.人类T细胞淋巴瘤

T细胞淋巴瘤细胞株H9对于IFNs之抗增殖作用的敏感度仅轻微略低于上述肿瘤细胞株。三组重复试验任一者之结果以图10之生长降低百分比之平均值±SD来表示。rHuIFNα对H9细胞无毒性时，无法显著抑制任何测定浓度之细胞分裂。相反地，可见oIFN τ抑制H9之生长达约60%（图10）。因此，只有oIFNτ是T细胞淋巴瘤之有效生长抑制剂。

上述结果证明IFN τ之抗增殖作用以及其低细胞毒性。

实例16

利用OvIFN τ之初步活体内治疗

将三组C 57B1/6小白鼠，每组4只，经尾静脉提供2.5×10⁴的B16-F10细胞：B16-F10是同期化之小白鼠可移植之肿瘤，其系因为其有肺转移之高度迹象而被选用（Poste，et al.，1981）。干扰素治疗在导入肿瘤细胞3日后开始。每一只小白鼠接受100微升之PBS，含1×10⁵单位之OvIFN τ的PBS，或含1×10⁵单位之重组鼠类IFNα（MuIFNα），每日经静脉内注射，连续三日。

在第21日牺牲小白鼠且将肺保存在10%经缓冲的福尔马林中。在对照组小白鼠（PBS），经OvIFN τ处理之小白鼠，及经MuIFNα处理三小白鼠之间比较肺转移之频率。这些活体内施用之结果证实，oIFN τ显著地减少B16-F10肺部肿瘤。这些结果支持IFN τ作为活体内有效抗肿瘤剂的用途。

实例17

IFN τ肽片段之竞争性结合

A.基于IFN τ之肽类阻断IFN τ及IFN α抗病毒活性的能力

合成对应至完整IFN τ序列（图6）之重叠的合成肽。计算平均水合值（Hydropathicity value），系藉由将每一个氨基酸之水合值总值除以每一序列中氨基酸之总数。水合值系根据Kyte，et al.（1892）计算。

这些肽有几乎相同的分子量，但整体亲水性则有轻微差异。除了此项差异之外，所有肽皆为抗原，其系由具有大于1∶3，000 ELISA评估之力价的兔子抗血清的生成而被证实（Harlow，et al）。

肽乃用于抑制OvIFN τ及rBoIFNα之抗病毒活性（实例2）。此分析之结果示于图12：1mM之N-及C-端肽皆能有效阻断OvIFN τ之抗病毒活性，其使用MDBK细胞。代表胺基酸62-92之第三肽亦降低IFN τ之抗病毒活性（7.0%抑制作用）。肽OvIFN τ（119-150）显示最低之抑制活性。OvIFN τ（36-64）及（90-122）肽不具抑制活性。

OvIFN τ抗病毒活性之肽抑制作用亦如下述所示检测。令单层Madin-Darby牛肾细胞与40单位/毫升之OvIFN τ培养，有或无不同浓度之OvIFN τ肽（参见图13）。图13中之结果以对照组抗病毒活性之百分比表示：亦即，不含有任何竞争肽。数据表示为6组重复试验之平均值。此数据证明OvIFN τ（1-37），（62-92），（119-150），及（139-172）之抑制作用与10^-3M及3×10^-3M之OvIFN τ（34-64）及（90-122）有显著不同。于10^-3M时，OvIFNτ（139-172）与所有其它肽有显著不同。显著性之评估系根据误差之分析及接着使用Scheffe′s F测试，P＜0.05。因此，OvIFNτ（1-37），（62-92），（119-150），及（139-172）可代表IFN τ之受体结合区，特别是（139-172）。

OvIFN τ肽对于抑制牛IFN α（BoIFNα）抗病毒活性的能力乃根据如下所示测定。令单层Madin-Darby牛肾细胞与40单位/毫升之牛IFN α培养，有或无不同浓度之OvIFN τ肽。结果示于图14且以不含OvIFN τ肽之对照组抗病毒活性的百分比表示。所示数据为4组重复试验之平均值。此果显示OvIFN τ（62-92），（119-150），及（139-172）所造成的抑制作用与10^-3M之OvIFN τ（1-37），（34-64）及（90-122）有显著差异。于3×10^-3M时，OvIFNτ（139-172）与OvIFNτ（1-37），（34-64）及（90-122）有显著不同。显著性之评估系根据误差分析及后续之Scheffe′s F测试，P＜0.05。因此，OvIFNτ（62-92），（119-150），及（139-172）可代表IFN τ及牛IFN α之共同受体结合区，特别是（139-172）。

亦测定OvIFN τ肽对人类IFN α抗病毒活性的肽抑制作用。令单层的Madin Derby牛肾细胞与40单位/毫升人类IFN α培养，有或无不同浓度的OvIFN τ肽。结果以不含OvIFN τ肽之对照组抗病毒活性之百分比表示。数据示于图15，其为了组重复试验之平均值。于10^-3M时，OvIFNτ（139-172）与所有其它肽有显著不同。显著性之评估系根据误差分析及后续之Scheffe′s F测试，P＜0.05。因此，OvIFNτ（139-172）可代表IFN τ及不同IFN α（s）之共同受体结合区。

上述OvIFN τ肽显示对于IFN γ之抗病毒活性无作用。牛IFN γ抗病毒活性之肽抑制作用评估如下。令单层Madin Darby牛肾细胞与40单位/毫升牛IFN-γ培养，有或无不同浓度之OvIFN τ肽。结果以不含OvIFN τ肽之对照组抗病毒活性之百分比来比。数据示于图16，其为3组重复试验之平均。当根据误差分析及后续P＜0.05之Scheffe′s F测试之评估可知，肽间无显著差异。

2个合成肽OvIFN τ（1-37）及OvIFN τ（139-172）亦能阻断OvIFN τ之抗-FIV及抗-HIV之活性。检视历经14天期之经FIV感染之FET-1细胞（1×10⁶/毫升）及经HIV感染之HPBL（1×10⁶/毫升）中的逆转录酶（RT）活性（实例12及13）。对照组培养物不接受OvIFN τ。OvIFN τ之浓度用100微毫克/毫升，肽浓度用200μM。代表性试验所得数据以cpm/毫升培养上清液表示且图11A，代表经FIV感染之细胞，图11B，代表经HIV感染之细胞。OvIFN τ之N-及C-端皆显示涉及其抗-逆转录病毒之活性。虽然两种肽皆阻断FIV之RT活性，但只有C端肽，OvIFNτ（139-172），是作用在猫细胞株，Fc9，的水疱性口炎病毒活性之有效抑制剂。故I型IFNs之C-端区可结合至I型IFN受体之上共同位置，然C-端区可涉入独特功能的激发。

B.抗-肽之血清

亦测定抗肽之抗血清抑制OvIFN τ抗病毒活性的能力。OvIFN τ抗病毒活性之抗肽之抗血清的抑制作用评估如下。令单层MDBK细胞与20单位/毫升之OvIFN τ培养，其中含1∶30稀释之免疫前血清或拮抗如上所述任一OvIFN τ肽之抗血清。图17中，重复试验所得数据，系以相对于适合之免疫前血清之抗肽抗血清所产生之OvIFN τ抗病毒性活性之抑制百分比的平均值±标准误差表示。显著差异性系根据误差分析及后续P＜0.05之Scheffe′s F测试予以评估。与抗病毒活性之肽抑制作用一致，含有对OvIFN τ（1-37），OvIFNτ（62-92），及OvIFN τ（139-172）免疫反应之抗体的血清，亦为OvIFN τ抗病毒活性之最有效的抑制剂，其含有直接拮抗N-端及C-端肽之抗体者最为有效。

相同血清亦用于测试此抗体对于IFN τ结合至其受体的作用。

IFN τ结合分析法进行如下。令5微克IFN τ碘化2分钟，其使用含500 μCi之Na¹²⁵I（15mCi/微克;Amersham Corporation，Arlington Heights，IL）之25微升的0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.4，以及10微升之氯氨-T（chloramine-T）（5毫克/毫升）（Griggs，et al.，1992）。经碘化蛋白质之特异活性为137μCi/微克。为了进行结合分析，令单层MDBK细胞以副甲醛固定并以5%脱脂奶粉阻断。令细胞与含有¹²⁵I-IFN τ之磷酸盐缓冲之生理食盐水，其中含1%BSA，共置于4℃历2小时，有或无1∶30稀释度之血清，其含有拮抗IFN τ肽之抗体，或为合适之免疫前抗体。评估特异结合，系藉由与100倍莫耳数之未标记IFN τ的共置培养。36%之特异结合系根据与500 nM未标记之IFN τ的竞争情形予以测定。举例而言，总结合计数为6850±133，100倍莫耳量之OvIFN τ产生4398±158计数每分钟。培养后，清洗单层细胞三次，以1%硫酸十二酯钠溶解并计算放射活性。三组重复试验所得数据示于图18，其为相对于合适免疫前血清之抗肽抗血清所产生之OvIFN τ特异结合情形之抑制百分比的平均值±标准误差。显著差异性系根据误差分析及后续之Scheffe′s F测试予以评估。

相同血清（含有对OvIFN τ（1-37），OvIFNτ（62-92），及OvIFN τ（139-172）免疫反应之抗体）是¹²⁵I-IFN τ结合至MDBK细胞上其受体之最有效抑制剂。缺乏与其它衍自IFN τ肽免疫反应之血清的作用，与抗OvIFN τ之力价无关，因为每一血清具相对于三组抑制血清之拮抗其预期肽之相等力价或更高力价：常使用ELISA对每一血清评估拮抗完整OvIFN τ分子之血清反应性时，得到类似结果。

这些肽虽然似乎结合至干扰素受体，其本身并不引起及参与细胞内之类干扰素作用。

C.抗增殖活性

IFN τ之抗增殖活性的功能重要位置亦予测定，其使用合成肽（表11）。如上所述测定细胞之增殖，其使用MDBK细胞。试验1及2中培养5×10⁵细胞/孔洞之MDBK细胞及试验3中培养10×10⁵细胞/孔洞，并单独处理培养基，浓度为300单位/毫升之IFN τ及1 mM之肽类，历48小时。计算三组重复试验中任一者之重复孔洞。为了统计分析，根据只处理培养基者正规化数据且根据误差分析及后续最小显著差异性多重比较测试（P＞0.05）予以评估。

表11

IFN τ抗增殖活性之肽抑制情形

当MDBK细胞的增殖情形评估历经2日期，细胞数大致增加2倍且有大于95%之存活率。添加300单位/毫升之OvIFN τ完全排除细胞增殖，但不减少细胞存活率。绵羊IFN τ（119-150）是IFN τ抗增殖活性之最有效抑制剂。

抗IFN τ（119-150）之抗血清可抑制OvIFN τ结合至受体，其亦显示OvIFN τ之抗增殖作用。数种其它肽，尤其是IFN τ（139-172），亦显示OvIFN τ之抗增殖作用，但作用较小。

实例18

IFN τ之细胞及抗病毒作用的其它分析

A.HIV之抗病毒作用

评估IFN τ拮抗HIV之抗病毒作用，系藉由人类PBMC细胞以不同量之重组绵羊IFN τ（r-OvIFNτ）或重组人类IFN α2处理，于使用HIV感染之际。试验过程中皆有药物存在。于第7日及第14日，测定p24之产制（利用ELISA（Wang，et al.，1988，1989）且将其比较无药之对照组。分析结果示于表12。

表12

这些试验之数据支持一结论，亦即，于相当低浓度时，IFNα及IFN τ可有效降低HIV于人类淋巴细胞内之增殖-于相近浓度。

B.于PBMC′s之活体外细胞毒性试验

将人类PBMC′s以5×10⁵细胞/毫升浓度种殖。于第0日时，以3微克/毫升PHA刺激细胞，处理细胞，其使用200微升/孔洞之重组人类IFN α 2A（浓度为10，100，1，000及10，000单位/毫升）及IFN τ（浓度为2.6，26，260，2，600，26，000，260，000及2，600，000单位/毫升）（每一浓度有4组重复，其使用96孔洞平底试盘）。对照组培养物不接受干扰素。接种4日后，令细胞脉冲标记9小时之³H-胸腺嘧啶，1μ Ci/孔洞。回收细胞且测定经标记胸腺嘧啶摄入DNA之情形（图8）。

测定任何浓度IFN τ之胸腺嘧啶摄入情形，未见任何细胞毒性。然而，rHuIFN α2在10，000单位/毫升浓度时，对细胞有毒性。

C.肝细胞内B型肝炎病毒DNA复制之抑制

所用细胞株，HepG2-T14，为人类细胞，其系衍自经B型肝炎病毒（HBV）转感之肝细胞。此细胞株半稳定地产制HBV病毒：一段时间后，细胞株产制HBV细胞内DNA及分泌病毒皆减少。为了使HBV DNA及病毒之生长最大化，令细胞预处理deAZA-C（5-氮杂胞嘧啶核苷;Miyoshi，et al.，）以诱发病毒的生成。处理持续2-3日且诱发量是两个比较因子之一。

再令细胞以IFN α及IFN τ处理，浓度为0;5，000;10，000;20，000及40，000单位/毫升。

所有不同量之IFN α或IFN τ皆减少DNA产制，其根据对无药对照组比较之2个因子之一。

D.肝细胞内肝特定之讯号RNA产制的抑制

判定肝细胞株HepG2-T14（如上所述）中IFN α及IFN τ对于肝特异之mRNA产制的作用。令细胞与浓度为每毫升0;5，000;10，000;20，000及40，000单位之IFN α及IFN τ共置培养。利用杂交分析法测定转译肝细胞特定蛋白质ApoE及ApoAl的讯号RNAs（Sambrook，et al.;Maniatis，et al.，），其使用对此两种mRNA特异的探针（Shoulders，et al.，及Wallis，et al.）。

对于使用高达40，000单位之IFN α或IFN τ之ApoE或ApoAl的mRNA产制，未见mRNA制备有减少。此结果显示，前述试验中病毒DNA复制之减少不是由于IFNs对于细胞家管活性上之作用;反倒是，此减少情形似乎是由于病毒于宿主细胞内复制之特异抑制作用。

实例19

干扰素-τ融合蛋白质之单离

共轭有抗珠粒半乳糖酶之Sepharose 4B珠粒，购自Promega厂。装填此珠粒至2毫升管柱中且充分洗涤，利用含0.02%叠氮化钠之经磷酸盐缓冲的生理食盐水及10毫升TX缓冲液（10mM Tris缓冲液，pH7.4，1%去蛋白质素（aprotinin）。

将IFN τ编码序列（例如，图7）殖入λgt ll之多连接子位置。将IFN τ编码序列置于λgtll中具有N-端β-半乳糖酶编码序列之同一架构内。感染有gtll/IFNτ之溶原素（lysogen）用于接种500毫升之NZYDT肉汁。令培养物培养在32℃，至O.D.为约0.2至0.4，再快速置于43℃之43℃水浴中15分钟，以诱生gtll肽之合成，且再于37℃培养1小时。藉离心使细胞呈团块，悬浮于10毫升溶解缓冲液（10mM Tris，pH7.4），其含有2%“TRITON X-100”及使用前才加入的1%去蛋白质素。

令悬浮细胞于液态氮中冷冻，再将其解冻，造成实质上完全之细胞溶解。令溶解物以DNase Ⅰ处理以水解细菌及噬菌体DNA，此乃藉溶解物中逐渐丧失之粘度为凭。藉离心除去非可溶之物质。

将澄明化之溶解物质馈至Sepharose管柱上，封闭管柱末端，且将管柱置于旋转式摇荡器，于室温中2小时且于4℃16小时。装妥管柱后，以10毫升TX缓冲液洗涤之。溶离经融合的蛋白质系使用0.1M碳酸盐/重碳酸盐缓冲液，pH10。传统上，令14毫升之溶离缓冲液通过管柱，融合蛋白质在首4-6毫升之溶离物中被溶离出来。

令含有溶离蛋白质之溶离物于“CENTRICON-30”管（Amicon，Danvers，Mass.）中浓缩。令最终蛋白质浓缩物悬浮在，举例而言，400微升之PBS缓冲液中。蛋白质纯度藉SDS-PAGE分析。

为了制备多株抗体，将经纯化之融合蛋白质于皮下注射至兔子中。于第0及21日注射近1毫克之融合蛋白质，且兔子血清传统上在第6及8周时收集。

实例20

抗-IFNτ抗体之制备

A.谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质之表现

令IFN τ编码序列（例如图7）殖入pGEX载体（Boyer，et，al.;Frangioni，et al.;Guam，et al.;Hakes，et al.;Smith，et al.，1988）。修饰pGEX载体（Smith，et al.），利用嵌入与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白质（GST…sj26编码序列）同一架构之凝血素切割序列。此载体命名为pGEXthr。IFN τ编码序列置放在sj26-凝血素编码序列之同一架构（Guam，et al.;Hakes，et al.）。IFN τ编码序列嵌入物可被生成，其藉由使用对嵌入物专一的PCR引子之聚合酶连锁反应。

将IFN τ片段接合至直线化的pGEXthr载体。将接合混合物转形至大肠杆菌且筛选出对安比西林有抗性的菌落。自抗安比西林之菌落单离质体并利用限制酶水解反应分析，以鉴定含有IFN τ嵌入物之纯系（载体盒名为pGEXthr-IFN τ）。

令大肠杆菌XL-I Blue株被pGEXthr-IFN τ转形且于37℃令其生长一夜。自任意挑取的菌落制备DNA。传统上嵌入之编码序列的存在以下列方法确认：（ⅰ）限制酶水解与图化，（ⅱ）使用经标记之IFN τ探针杂交筛选（亦即南方吸渍分析），或（ⅲ）直接DNA序列分析。

B.融合蛋白质之部分纯化

令pGEXthr-IFN τ生长一夜。将过夜培养物以含有安比西林之LB培养基稀释1∶10，且令其生长1小时于37℃。或者，隔夜培养物稀释1∶100且令其在添加IPTG（异丙基硫-β-半乳糖苷）之有生长至OD为0.5-1.0。加入IPTG（GIBCO-BRL，Gaithersburg MD）至终浓度为0.2-0.5mM，以诱发蛋白质表达，共置反应传统上持续2-5小时，较好为3.5小时。

藉离心回收细菌细胞且悬浮在1/100培养物体积之MTPBS（150 mMNaCl，16mM Na₂HPO₄，4 mM NaH₂PO₄）。以溶解酶溶解细胞，超音波震荡或法氏压挤，并藉离心将溶解物之细胞碎屑清除。

分析一等份之悬浮物，其得自由含有pGEXthr-IFN τ之细胞组成之经IPTG诱发的培养物，及一等份悬浮物，其得自只含pGEXthr-载体之经IPTG诱发的培养物，其使用如前所述之SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及后续之西方吸渍来完成。

若有必要，可使用超过滤法浓缩萃取物，举例而言，如使用“CENTRICON10”过滤器。

或者，融合蛋白质可由谷胱甘肽琼脂糖亲和性管柱上部分纯化，如Smith，et al详载。此方法中，令100毫升培养物生长一夜。培养物稀释至1公升且令细胞生长在37℃，再1小时。回收细胞并使用超音波震荡器溶解细胞。将细胞碎屑团块化具将澄清之溶解物馈至谷胱甘肽“SEPHAROSE”管柱上。以数个管柱体积洗涤管柱。融合蛋质与被还原的谷胱甘肽自亲和性管柱溶离，并将融合蛋白质透析。IFN τ可自混合型蛋白质释出，藉凝血原之处理。混合型蛋白质之sj26及IFN τ片段可再利用分子大小分级分离法，于管柱或于凝胶上分开。

或者，混合型蛋白之IFN τ部分利用凝血素之处理自管柱释出（Guan，et al.;Hakes，et al.）。

C.拮抗融合蛋白质之抗体

将经纯化之sj26/IFNτ融合蛋白质于Freund′s佐剂中，皮下注射至兔子。于第0日及第21日注射约1毫克之融合蛋白质，传统上在第6及8周收集兔子血清。第二只兔子以得自对照组细菌溶解物之经纯化的sj26蛋白质而予类似免疫。

制备得自下列细菌培养物之微量溶解物：（1）被含有IFN τ嵌入物之pGEXthr及pGEXthr感染之KM392细胞;及（2）被含有IFN τ嵌入物之λgt ll感染之细胞。藉SDS-PAGE分级分离微量溶解物及商品化之β-半乳糖酶，且将带（bands）转移至硝化纤维膜以进行西方吸渍（Sambrook，et al.;Ausubel，et al.）。

归纳预期之结果，得自对照组（sj26）免子之血清，与每一个sj26及Sj26融合蛋白质抗原免疫反应。得自经sj26/IFNτ融合蛋白质免疫之动物血清，与所有sj-26及含有IFN τ编码序列之β-gal融合蛋白质反应，显示具有与IFN τ抗原之特异免疫反应。无任一血清是预期可与β-半乳糖酶免疫反应者。

将抗-IFNτ抗体纯化，其存在于以sj26/IFNτ免疫之动物的血清中，纯化系使用亲和性层析法（使用被固定之重组制备的IFN τ作为配位体，基本上如实例12中所述用于抗-β-半乳糖酶抗体者）。

虽然本发明已利用针对特定方法及具体实例之参考资料予以说明，但不偏离本发明所作之不同修饰及变化将可接受。

序列目录

（1）一般资料

（ⅰ）申请人：Bazer，Fuller W.

Johnson，Howard M.

Pontzer，Carol H.

Ott，Troy L.

Van Heeke，Gino

Imakawa，Kazuhito

（ⅱ）发明名称：干扰素Tau组成物及其用途

（ⅲ）序列总数：20

（ⅳ）负责地址：

（A）ADDRESSEE：Law Offices of Peter J.Dehlinger

（B）STREET：350 Cambridge Ave.，Suite 300

（C）CITY：Palo Alto

（D）STATE：CA

（E）COUNTRY：USA

（F）ZIP：94306

（V）电脑可读型：

（A）MEDIUM TYPE：Floppy disk

（B）COMPUTER：IBM PC compatible

（C）OPERATING SYSTEM：PC/DOS/MS-DOS

（D）SOFTWARE：PatentIn Release ＃1.0，

Version ＃1.25

（ⅵ）目前申请资料：

（A）申请案号：

（B）申请日：

（C）分类：

（ⅶ）先前申请资料：

（A）申请案号：US 07/318，050

（B）申请日：02-MAR-1989

（ⅶ）先前申请资料：

（A）申请案号：US 07/847，741

（B）申请日：09-MAR-1992

（ⅷ）律师/代理人资料：

（A）NAME：Fabian，Gary R.

（B）REGISTRATION NUMBER：33，875

（C）REFERENCE/DOCKET NUMBER：5600-0001

（ⅸ）电传资料：

（A）TELEPHONE：415-324-0880

（B）TELEFAX：415-324-0960

（2）SEQ ID NO：1之资料

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：518个碱基对

（B）种类：核酸

（C）股型：双股

（D）拓扑学：环状

（ⅱ）分子型：DNA

（ⅲ）臆测型：无

（ⅳ）反意：无

（ⅵ）最初来源：

（A）生物体：绵羊

（B）亚种：家畜

（D）发育阶段：囊胚（胚胞）

（F）组织型：胚膜

（G）细胞型：单核之胚膜细胞

（ⅶ）立即来源：

（B）CLONE：oTP-1a

（ⅷ）POSITION IN GENOME：

（C）单位：碱基对

（ⅸ）特性：

（A）名称/关键字：CDS

（B）座落：1..518

（ⅹ）发表资料：

（A）作者：Ott，Troy L

（B）文献名称：Cloning and Expression in

Saccharomyces cerevisiae of a

Synthetic Gene for the Type I

Trophoblast Interferon Ovine

Trophoblast Protein-1：Purification

and Antiviral Activity

（C）期刊：J.Interferon Res.

（D）册：11

（F）页：357-364

（G）日期：1991

（K）SEQ ID NO：1之相关残基：由1至518（xi）序列说明：SEQ ID NO：1：

（2）SEQ ID NO：2之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：172个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：2：

（2）SEQ ID NO：3之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：516个碱基对

（B）种类：核酸

（C）股型：单股

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：cDNA

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：3：

（2）SEQ ID NO：4之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：172个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（C）股型：单股

（D）拓扑学：直线型

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：4：

（2）SEQ ID NO：5之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：5：

（2）SEQ ID NO：6之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：31个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：6：

（2）SEQ ID NO：7之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：31个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：7：

（2）SEQ ID NO：8之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：33个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅰ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：8：

（2）SEQ ID NO：9之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：32个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：9：

（2）SEQ ID NO：10之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：34个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：10：

（2）SEQ ID NO：11之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：588个碱基对

（B）种类：核酸

（C）股型：双股

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：DNA（基因组的）

（ⅲ）臆测型：无

（iv）最初来源：

（C）个体单离物：人类干扰素Tua之编码序列

（ix）特性：

（A）名称/关键字：CDS

（B）座落：1..588

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：11：

（2）SEQ ID NO：12资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：195个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：12：

（2）SEQ ID NO：13之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：25个碱基对

（B）种类：核酸

（C）股型：单股

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：cDNA（合成型）

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：13：

CCTGTCTGCA GGACAGAAAA GACTT 25

（2）SEQ ID NO：14之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：25个碱基对

（B）种类：核酸

（C）股型：单股

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：DNA（合成型）

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：14：

TCTGAATTCT GACGATTTCC CAGGC 25

（2）SEQ ID NO：15之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：37个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：肽

（ⅲ）臆测型：无

（ⅵ）最初来源：

（C）个体单离物：人类Tau-IFN，片段1-37之氨基酸序列

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：15：

（2）SEQ ID NO：16之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：31个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：肽

（ⅲ）臆测型：无

（ⅵ）最初来源：

（C）个体单离物：人类Tau-IFN，片段34-64之氨基酸序列

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：16：

（2）SEQ ID NO：17之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：31个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：肽

（ⅲ）臆测型：无

（ⅵ）最初来源：

（C）个体单离物：人类Tua-IFN，片段62-92之氨基酸序列

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：17：

（2）SEQ ID NO：18之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：33个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：肽

（ⅲ）臆测型：无

（ⅵ）最初来源：

（C）个体单离物：人类Tua-IFN，片段90-122之氨基酸序列

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：18：

（2）SEQ ID NO：19之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：32个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：肽

（ⅲ）臆测型：无

（ⅵ）最初来源：

（C）个体单离物：人类Tua-IFN，片段119-150之氨基酸序列

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：19：

（2）SEQ ID NO：20之资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：34个氨基酸

（B）种类：氨基酸

（D）拓扑学：直线型

（ⅱ）分子型：肽

（ⅲ）臆测型：无

（ⅵ）最初来源：

（C）个体单离物：人类Tua-IFN，片段139-172之氨基酸序列

（ⅹⅰ）序列说明：SEQ ID NO：20：

Claims

1、干扰素τ在制造用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。

2、如权利要求1的应用，其中所述干扰素τ从选自由马、牛、猪、绵羊、大白鼠、小白鼠、兔子和人类组成的一组哺乳动物中获得。

3、如权利要求1的应用，其中干扰素τ具有选自由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4组成的一组的序列。

4、如权利要求1的应用，其中干扰素τ具有如SEQ ID NO：4所示的序列。

5、如权利要求1的应用，其中肿瘤细胞是人类癌细胞。

6、如权利要求1的应用，其中肿瘤细胞是受类固醇影响的肿瘤细胞。

7、如权利要求1的应用，其中肿瘤细胞是乳房肿瘤细胞。

8、一种抑制肿瘤细胞生长之药学组成物，包含有效剂量之人类干扰素-τ及其药学上可接受的载剂。

9、如权利要求8之组成物，其中该干扰素-τ具有如SEQ ID NO：4所示序列。

10、干扰素τ在制造用于抑制细胞中病毒复制的药物中的应用。

11、如权利要求10的应用，其中所述干扰素τ从由马、牛、猪、绵羊、大白鼠、小白鼠、兔子和人类组成的一组哺乳动物中获得。

12、如权利要求10的应用，其中干扰素τ具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列。

13、如权利要求10的应用，其中所述病毒复制涉及RNA病毒。

14、如权利要求11的应用，其中所述病毒选自由猫白血病病毒、人类免疫缺乏病毒和C型肝炎病毒组成的一组病毒。

15、如权利要求10的应用，其中所述病毒复制涉及B型肝炎病毒。

16、一种抑制细胞内病毒复制之药学组成物，包含有效剂量之人类干扰表-τ及其药学上可接受的载剂。

17、如权利要求16之组成物，其中该干扰素-τ具有如SEQ ID NO：4所示之蛋白质序列。

18、一种促进哺乳雌性动物怀孕之药学组成物，包括有效哺乳动物怀孕促进量之人类干扰素-τ及其药学上可接受之载剂。

19、如权利要求18之组成物，其中该干扰素-τ具有如SEQ IDNO：4所示蛋白质序列。

20、一种经单离之核酸，其编码人类干扰素-τ。

21、如权利要求20之核酸，其中该核酸分子具有如SEQ ID NO：11所示序列。

22、如权利要求20之核酸，其中该核酸分子具有如SEQ ID NO：3所示序列。

23、一种表达载体，其包括

（a）含有编码人类干扰素-τ之开放读译架构之核酸;及

（b）于宿主细胞有效表达该开放读译架构之调节序列。

24、如权利要求23之表达载体，其中该调节序列包括该核酸序列5′端之启动子区及与干扰素-τ编码序列同一架构之ATG起始密码，以及该编码序列3′端之转译终止讯号及随后之转录终止讯号。

25、如权利要求23之表达载体，其中该核酸包含在选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：11之序列中。

26、一种重组制备之人类干扰素-τ蛋白质。

27、如权利要求26之重组制备之蛋白质，其包括如SEQ ID NO：4所示序列。

28、如权利要求27之重组制备之蛋白质，其进一步包括羧基端之延伸，其中该蛋白质具有如SEQ ID NO：12所示序列。

29、一种重组制备干扰素-τ之方法，包括：

将重组表达系统导入合适宿主细胞，该重组表面系统含有开放读译架构（ORF），其具有编码人类干扰素-τ多肽之多核甘酸序列，其中该载体经设计以表达该ORF于该宿主，及

在造成该ORF序列表达之条件下，培养该宿主。

30、如权利要求29之方法，其中该干扰素-τ多肽具有如SEQ ID NO：4所示序列。

31、如权利要求29之方法，其中该表达载体是λgtll噬菌体载体且宿主细胞是大肠杆菌。

32、如权利要求29之方法，其中该多核甘酸序列具有如SEQ ID NO：3所示序列。

33、如权利要求29之方法，其中该宿主细胞是酵母菌。

34、如权利要求29之方法，其中该宿主细胞是昆虫细胞。

35、如权利要求29之方法，其中该多肽具有如SEQ ID NO：4所示序列，且该多核甘酸序列具有如SEQ ID NO：11所示序列。

36、一种用于表达干扰素-τ多肽之表达系统，包括

能提供开放读译架构于经选定之表达载体内表达的宿主，及

经选定之表达载体，其含有开放读译架构（ORF），该ORF具有编码人类干扰素-τ多肽之多核甘酸序列。

37、如权利要求36之表达系统，其中该多肽系选自如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：20。

38、如权利要求26之表达系统，其中该多肽系具有SEQ ID NO：4所示序列之多肽。

39、一种经单离之干扰素-τ多肽，其中该多肽系（ⅰ）衍自干扰素-τ氨基酸编码序列，及（ⅱ）长度介于15至172个氨基酸之间。

40、如权利要求39之多肽，其中该干扰素-τ序列系选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

41、如权利要求39之多肽，其中该多肽系选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：10。

42、如权利要求39之多肽，其中该多肽系选自SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20。

43、一种活体外阻断α-干扰素结合至具α-干扰素受体之细胞的方法，包括令细胞与干扰素-τ多肽接触，该干扰素-τ多肽之浓度为能有效使得该多肽结合至每一个α-干扰素受体者，及

令具有该多肽结合至该受体之细胞，与α-干扰素接触。

44、如权利要求43之方法，其中该干扰素-τ多肽系选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10。

45、如权利要求43之方法，其中该干扰素-τ多肽系选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20。

46、一种活体外阻断干扰素-τ结合至具有干扰素-τ受体之细胞的方法，包括令细胞与干扰素-τ多肽接触，该干扰素-τ多肽系选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20，其中该多肽之浓度为能有效使得该多肽结合至每一个干扰素-τ受体者，及

令具有干扰素-τ多肽及结合至该受体之细胞，与干扰素-τ接触。

47、一种经纯化之抗体，其与人类干扰素-τ免疫反应。

48、如权利要求47之抗体，其为多株抗体。

49、如权利要求47之抗体，其为单株抗体。

50、如权利要求47之抗体，其中该抗体与选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20之多肽反应。

51、一种用于阻断α-干扰素结合至具α-干扰素受体之细胞的药学组成物，包括干扰素-τ多肽及其药学上可接受之载剂。

52、如权利要求51之组成物，其中该干扰素-τ多肽系选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10，

53、如权利要求51之组成物，其中该干扰素-τ多肽系选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20，

54、一种用于阻断干扰素-τ结合至具干扰素-τ受体之细胞的药学组成物，包括选自SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20之干扰素-τ多肽及其药学上可接受之载剂。