TW585911B - Ovine and bovine interferon TAU, compositions thereof and pharmaceutical uses thereof - Google Patents

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Carol Hanlon Pontzer
Troy Lee Ott
Heeke Gino Van
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（1 ) 發明範疇 本發明係關於牛及羊干擾素-r，其組成物及其醫藥 用途。 參考文獻
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Young, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA M_： 1194 (1983). 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---I--^--丨！ 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -10 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____Β7____ 五、發明說明（8 ) 發明背暑 許多哺乳動物之胚膜（或滋養外胚層）會產生生化訊 號以穩固並維持懷孕（Bazer, et al., 1 983 )。此類蛋白 質之一，羊滋養層蛋白質1 (oTP — 1)，被確認爲低 分子量的蛋白質，其係由懷孕第1 〇至2 1日之間的綿羊 胎體所分泌者（Wilson, et al·, 1979; Bazer, et al., 1 986 )。蛋白質ο T P - 1顯示能抑制子宮分泌前列腺素 F2 - α，其能引起未懷孕綿羊之卵巢黃體進行生理上及 內分泌學上的轉變（Bazer, et al., 1 986 )。因此， o TP - 1具有抗黃體溶解之生物活性。推測〇 TP — 1 之主要功能與懷孕之穩固有關。 隨後發現〇 TP - 1 ( i )呈現與多種生物之干擾素 α ( I FNa)之間有限的同質性（50 — 70%) (Imakawa, et al·, 1 987 )，以及（ϋ )其會結合至 I 型 干擾素受體（Stewart, et al·, 1987)。除了與 I F Ν α 之間有部份相似之外，ο Τ Ρ - 1有數種特性是以與 IFNa區別，這些特性包括：〇ΤΡ-1於繁殖生化學 上之功能（其它干擾素並不知道有繁殖週期之生化調節上 的任何功能），ο Τ Ρ - 1之細胞來源......即滋養層細胞 (I FNa乃源自淋巴細胞），〇ΤΡ - 1之分子大小… …即1 7 2個胺基酸（I FNa通常約爲1 6 6個胺基酸 )，及oTP_l甚難被病毒誘生（IFNa可被病毒大 量誘生）。國際干擾素學會承認〇ΤΡ-1屬於一類全新 的干擾素，其已命名爲干擾素一 t a u ( I F N r )。希 本纸張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（9 ) 臘字母r表示滋養層。 干擾素被區分爲兩個不同組：I型干擾素，包括 IFNa，IFN)S，及 IFNo(亦即 IFNan)； 以及Π型干擾素，以I FNr爲代表（根據DeMaeyer, etal.評論）。於人類，己鑑定出至少17種IFNa之 非對偶基因，至少約2或3種的I FNy3之非對偶基因， 及單一種的IFN 7基因。 I FNa顯示能抑制多種型式的細胞增殖。I FNa 拮抗如毛狀細胞白血病之類的血液學上惡性病尤其有效（ Quesada, et al., 1 984 )。此外這些蛋白質亦顯示有拮抗 下列腫瘤之活性，例如多重骨髓瘤，Kaposi’ s肉瘤，慢性 源自骨髓之白血病，腎細胞肉瘤，膀胱腫瘤及卵巢癌（ Bonnem, et al., 1 984; Oldham, 1 985 )。干擾素與干擾 素受體在某些自體免疫及炎症性疾病上扮演的角色亦已被 研究（Benoit, et al·, 1 9 9 3 )。 I F Ν α拮抗多種類型之病毒感染亦有效（Finter, et al., 1991) 。α -干擾素顯示有拮抗人類乳突瘤病毒 感染，Β型肝炎，及C型肝炎感染之活性（Finter et al .,1991; Kashima, et al., 1988; Dusheiko, et al., 1986; Davis, etal., 1989)。然而，I FNa 之有效 性顯然被其毒性限制：使用干擾素於腫瘤及病毒感染症之 治療上已導致嚴重的副作用，例如發燒，發冷，厭食，失 重及疲倦（Pontzer, et al·, 1991; Oldham, 1 9 85 )。 這些副作用通常需要（i )干擾素劑量減少至會限制治療 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ------------•褒--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -12 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 Α7 Β7 五、發明說明（10 ) 有效性之水平，或（ϋ )終止病患接受治療。這種毒性降 低了這些強力抗病毒及抗增殖蛋白質於衰弱性人類及動物 疾病之治療有效性。 發明簡述 本發明一方面包括抑制腫瘤細胞生長之方法。該方法 中，令細胞與濃度爲能有效抑制腫瘤生長之干擾素- r ( IFNr)接觸。IFNr可得自多種來源，包括馬，牛 ，豬，綿羊，大白鼠，小白鼠，兔子及人類。兩個具體實 例包括如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO :4所示之I FNr。許多腫瘤細胞可作爲I FNr抑制 生長的標的，包括如下細胞但不受限於此：人類癌細胞及 受類固醇影響的腫瘤細胞（例如，乳房腫瘤細胞）。 本發明亦涵括抑制細胞內病毒複製之方法。此方法中 ，令經病毒感染的細胞與濃度爲能有效抑制細胞內病毒複 製之干擾素r接觸。上述IFNr分子亦可用於本發明之 這類方法中。許多病毒於細胞內的複製可被抑制，這些病 毒包括RNA病毒（例如貓白血病病毒，人類免疫不全病 毒，或C型肝炎病毒）及DNA病毒（例如B型肝炎病毒 )° 本發明之人類I F N r分子亦可用於促進雌性哺乳動 物受孕之方法中。此方法中，投服劑量爲能有效促進雌性 哺乳動物受孕之人類I FNr，通常其置於藥學上可接受 之載劑中。這類人類I FN τ分子之範例有如 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A:丨規格（210 X 297公釐） ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -13 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（11 ) SEQ ID N〇：4 及 SEQ ID N0:12 所 示之蛋白質序列。 本發明亦涵括一種經單離的核酸，其編碼人類干擾素 一 r。這類核酸分子之範例有SEQ ID NO : 3及 SEQ ID NO:11。此外，本發明涵括表現人類 I FN r之表現載體。通常此表現載體包括（a )令有編 碼人類干擾素- r之開放讀譯架構 (open reading frame )的核酸；及（b )可令該開放讀譯架構於宿主細胞內表 現之調節序列。此調節序列可包括用於主導或令I FNr 多肽分泌的序列：此種序列可爲內源的（例如正常發現的 IFNr引導序列，參見SEQ ID NO:11)或 外源的（例如酵母菌或細菌表現系統所辨識之分泌訊號） 。表現載體中，調節序列亦可包括位於該核酸序列5 /端 之啓動子區及與干擾素- r編碼序列同一架構內的ATG 起始密碼，以及位於該編碼序列3 >端之轉譯終止訊號與 其後之轉錄終止訊號。此表現載體中的核酸可選自，舉例 而言，SEQ ID N0:1，SEQ ID NO: 3 及 SEQ ID N0:11。 另一具體實例中，本發明涵括經重組製備的人類干擾 素一 r蛋白質。這種蛋白質之代表性序列之一示於 SEQ ID N0:4。人類IFNr亦可含有羧基端 之延長（如SEQ ID NO:12所示之序列）。 本發明涵括重組產製干擾素- r之方法。此方法中， 將重組表現系統導入適當宿主細胞內，該表現系統含有一 本紙張兄度適用中國國家標準（CNS)/V!規格（210 X 297公f ) -----1-----•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -14 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制私 585911 A7 B7 五、發明說明（I2 ) 個具有編碼人類干擾素- r多肽之多核苷酸序列的開放讀 譯架構（ORF)，其中載體經設計以令該ORF於該宿 主內表現。再於可造成ORF序列表現之條件下，培養該 宿主。上述人類I FNr序列爲適當人類I FNr多肽之
範例。代表性之多核苷酸編碼序列有SEQ ID NO :3及SEQ ID NO:11。許多載體與其對應宿 主可用於操作本發明之這類方法，包括，λ g t 1 1噬菌 體載體與大腸桿菌細胞。其它宿主細胞包括酵母菌及昆蟲 細胞表現系統。 本發明另涵括用於表現干擾素- r多肽的表現系統。 通常這些系統包括能提供開放讀譯架構於經選定之表現載 體中表現的宿主，以及含有開放讀譯架構（ORF)之經 選定的表現載體，該ORF具有編碼人類干擾素- r多肽 之多核苷酸序列。可用於這類表現系統的代表性序列有 SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16，SEQ ID N 0 ： 1 7 ，SEQ ID N0:18，SEQ ID NO: 19 及 SEQ ID NO:20〇 本發明亦涵括經單離的干擾素- r多肽。這類多肽乃 衍自干擾素- τ胺基酸編碼序列且長度介於約1 5個至 1 7 2個胺基酸之間。舉例而言，這類多肽可選自如 SEQ ID N0:2及SEQ ID N0:4所示
之序列。代表性由I F N r衍生之多肽包括如下序列，但 不受限於此：SEQ ID N0:5，SEQ ID 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） '' 一 15 - ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 __B7 N 〇 ： 7 % S E Q I D N 0 • 1 0 S E Q I D N 0 ： 1 5 S E Q I D Ν 0 ： 1 7 及 S E Q I D N 0 : 2 0 〇 另 一 具 體 實 例 中 9 本 發 明 涵 括 阻 斷 a — 干 擾 素 結 合 至 具 有 a — 干 擾 素 受 體 之 細 胞 的 方 法 〇 此 方 法 中 > 令 該 細 胞 與 濃 度 爲 能 夠 有 效 使 得 干 擾 素 一 X 結 合 至 每 一 個 a 一 干 擾 素 受 體 rUz. 的 干 擾 素 — τ 多肽 接 觸 〇 再 將 具 有 結 合 在 受 體 ruz. 上 之 I F N X 多肽 的 細 胞 與 a — 干 擾 素 ( I F N a ) 接 觸 〇 上 述 I F Ν τ 多 肽與 由 I F N τ 衍 生 之 多肽 爲 可 用 於 此 方 法 之 I F Ν τ 多肽 的 範 例 0 此 外 本 發 明 涵 括 阻 斷 干 擾 素 — τ 結 合 至 具 有 干 擾 素 — X 受 體 WsjL 之 細 胞 的 方 法 〇 此 方 法 中 > 令 該 細 胞 與 由 干 擾 素 — X 衍 生 的 多 肽 ( 例 如 S E Q I D N 0 ： 5 9 S E Q I D N 0 ； 7 9 S Ε Q I D Ν 0 ： 1 0 > S E Q I D N 0 ： 1 5 ， S E Q I D Ν 0 : 1 7 或 S E Q I D N 0 ； 2 0 ) 接 jhm 觸 ， 其 中 多 肽 之 濃 度 能 有 效 使 得 該 多 肽 結 合 至 每 一 個 干 擾 素 — τ — 受 體 0 再 將 該 細 胞 與 干 擾 素 一 τ 接 觸 〇 本 發 明 亦 涵 括 經 純 化 的 抗 JHA 體 > 其 可 與 人 類 干 擾 素 一 X 免 疫 反 應 〇 此 抗 體 可 爲 多 株 抗 體 或 單 株 抗 體 rJai 〇 代 表 性 的 I F Ν τ 多 肽 抗 原 包括 下 列 序 列 贅 但 不 受 限 於 此 : S Ε Q I D N 0 : 4 9 S Ε Q I D N 0 : 1 5 > S Ε Q I D N 〇 : 1 7 及 S Ε Q I D N 0 : 2 0 A7 五、發明說明（I3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)/VI規格（210 X 297公釐） -16 - 585911 A7 B7 五、發明說明（14 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明亦涵括下列物質：具有抗腫瘤（亦即抗增殖） 活性之由干擾素- r衍生的多肽；具有抗病毒活性之由干 擾素_ r衍生的多肽；混合型α -干擾素分子，其中天然 I F Ν α之毒性部份被源自I F N r之相似序列置換。 當研讀下文之本發明的詳細說明並佐以圖示之後，本 發明之上述及其它目的與特徵當能更充分理解。 圖式概述 圖1表示Ον I FNr之合成型基因的核酸編碼序列，該 基因經設計以包含平均分佈在整個編碼序列的19個 不同的限制酶位置。 圖2表示用於製造編碼Ον I FNr之合成型基因的選殖 策略。 圖3表示人類干擾素- r基因與綿羊干擾素- r基因之經 推測的蛋白質序列之比較。有差異的胺基酸在核酸序 列下方之線上，擇一有改變的胺基酸標示。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 圖4表示證實Ον I FNr及I FNa兩者皆能顯著降低 HL — 6 0細胞生長之數據。 圖5表示證實r Hu I FNr對細胞有毒性而 Ον I FNr卻不然的數據。此圖中，三次重複試驗 的結果以存活％平均值土 S D表示。 圖6表示衍自I F N r序列之多肽序列。 圖7表示Ον I FNr序列之完整核酸及胺基酸序列。 圖8表示當I FN r用於處理周邊血液單核細胞時，相對 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 17 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7__ 五、發明說明（l5 ) 於IFNa爲無細胞毒性之支持數據。 圖9表示利用I FN r處理人類皮膚之T細胞淋巴瘤細胞 株，HUT 78，之結果。 圖1 0表示利用I FNr處理人類T細胞淋巴瘤細胞株， Η 9，之結果。 圖1 1 Α表示使用衍自Ον I FNr之多肽與完整 Ον I FNr對於與F I V (貓免疫不全病毒） 複製有關之肽抑制作用的數據。 圖1 1 B表示使用衍自Ον I FNr之多肽與完整 Ον I FNr對於與Η I V (人類免疫不全病毒 )複製有關之肽抑制作用的數據。 圖1 2表示證實利用衍自I F N r肽抑制I F N r之抗病 毒活性的數據。 圖1 3表示證實利用衍自I FNr肽抑制Ον I FNr之 抗病毒活性的數據。 圖1 4表示證實利用衍自I FNr肽抑制牛I FNa之抗 病毒活性的數據。 圖1 5表示證實利用衍自I FNr多肽抑制人類I FNa 之抗病毒活性的數據。 圖16表示評估利用衍自IFNr肽對牛IFNr之抗病 毒活性缺乏抑制作用的數據。 圖1 7表示證實利用抗一衍自I F Ν τ肽之抗血清抑制 I F N r之抗病毒活性的數據。 圖1 8表示證實利用抗一衍自I F Ν τ肽之抗血清抑制經 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公 ------------•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -18 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 五、發明說明（16 ) 放射標記之IFNr結合至細胞的數據。 序列之概述 SEQ ID N0:1爲編碼綿羊干擾素一r( Ον I FNr )之合成型基因的核苷酸序列。 亦不經編碼之胺基酸序列。 SEQ ID 1^0:2爲成熟之〇711?1^1蛋白 質之胺基酸序列。 SEQ ID NO : 3爲編碼成熟人類干擾素一 Γ (Hu I FN r )蛋白質之合成型核苷酸序列。 SEQ ID N0:4爲成熟HuIFNr蛋白質 之胺基酸序列。 SEQ ID N0:5 爲 SEQ ID Ν Ο ： 2 之片段1一37的胺基酸序列。 SEQ ID NO:6 爲 SEQ ID NO :2 之片段3 4 — 6 4的胺基酸序列。 SEQ ID N0:7 爲 SEQ ID Ν Ο ： 2 之片段62—92的胺基酸序列。 SEQ ID NO:8 爲 SEQ ID Ν Ο ： 2 之片段9 0 - 1 2 2的胺基酸序列。 SEQ ID NO:9 爲 SEQ ID Ν Ο ： 2 之片段119一150的胺基酸序列。 SEQ ID NO:1〇 爲 SEQ ID NO: 2之片段1 3 9 — 1 72的胺基酸序列。 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I-----：---11 -1111111^.--1----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585911 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 五、發明說明（17 ) S E Q I H u I F N r 基 S E Q I 1 1之經推測的 S E Q I 苷酸的合成型寡 S E Q I 替酸的合成型寡 S E Q I 4之片段1 一 3 S E Q I 4之片段3 4 — S E Q I 4之片段6 2 — S E Q I 4之片段9 0 — D N 0 : 1 1爲具有引導序列之天然 因之核苷酸序列。 D N0:12 爲 SEQ ID NO: 胺基酸編碼序列。 D NO:13爲根據本發明之25個核 核替酸。 D NO:14爲根據本發明之25個核 核苷酸。 D N0:15 爲 SEQ ID NO: 7的胺基酸序列。 D NO:16 爲 SEQ ID NO: 6 4的胺基酸序列。 D NO:17 爲 SEQ ID NO: 9 2的胺基酸序列。 D N0:18 爲 SEQ ID NO: 1 2 2的胺基酸序列。 D NO:19 爲 SEQ ID NO: SEQ 4之片段119_150的胺基酸序列 S E Q ID 4之片段1 3 9 — 1 7 2的胺基酸序列。 NO:20 爲 SEQ ID NO: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之詳細說明 I ·定義 干擾素- r表示干擾素蛋白質一族，其具有如下特徵 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 一 20 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（18 ) :(i)抗黃體溶解特性；（ϋ)抗病毒特性；（ffi)抗 細胞增殖特性；（iv)與α -干擾素有4 5 — 6 8%之胺 基酸同質性及相對於如S E Q ID N 0 : 2所示序列 有大於7 0%之胺基酸同質性。干擾素一 r可自多種如下 所述之哺乳動物來源分離而得。 干擾素- τ多肽爲衍自干擾素- r胺基酸編碼序列之 具有約1 5至1 7 2個胺基酸的多肽，其中該1 5至 1 7 2個胺基酸在天然干擾素- r中是連續的。 Π ·干擾素一 τ之單離與鑑定 A ·綿羊及牛之干擾素- τ 1 ·干擾素- τ之編碼序列 綿羊干擾素一 r (OvIFNr)乃主要的胎體分泌 性蛋白質，係由綿羊母體接納之嚴格期間的胚胎之胚膜製 造出來。成熟Ον I FNr之單離物爲長度爲1 72個胺 基酸者（SEQ ID N0:2) °cDNA編碼序列 含有成熟蛋白質氨基端之額外的2 3個胺基酸（Imakwa, etal., 1987)。此〇v I FNr單離物之編碼序列示於 圖7 〇 爲了要單離Ον I FNr蛋白質，收集來自懷孕綿羊 的胎體並於活體外培養在如先前所述之改良型最低必須培 養基中（God kin, etal., 1982)。胎體係收集自懷孕期 之不同日，配種之第一天記錄爲第0日。基本上如Valle -t，et al., (1987)及 Godkin, et al·，（1982)所述，自 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----I------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 21 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制r< 585911 Α7 _ Β7 五、發明說明（19 ) 胎體培養基純化I FNtt。 Ϊ F Ν τ之同源性乃藉由硫酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝 膠電泳法評估（SDS-PAGE，Maniatis, et al·; Ausubel, etal·)。經純化之IFNr試樣中蛋白質濃度的測定係 採用雙率可寧分析法（bicinchoninic (BCA) assay)( Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Smith, et al., 1985)。 自牛單離出Ον I FNr的同源蛋白質（b I FNr ’ Helmer, et al·, 1987; Imakawa, et al·, 1989)。 〇v I FNr與Bo I FNr ( i )於懷孕期之母體接納 過程中有相似作用，及（ii)成熟蛋白質之間有高度之胺 基酸及核苷酸序列之同源性。介於Ον I FNr與 I FNr之間的核酸同源性爲，5 >非編碼區有 76 · 3%，編碼區有89 · 7%，及非編碼區有 9 1 · 9 %。胺基酸序列之同源性爲8 0 · 4 %。 實例1說明Ον I FNr在繁殖上的作用。將不同濃 度的Ον I FNr及重組型人類α - 2 —干擾素（ r Hu I FNa2 )灌入綿羊的子宮腔。評估子宫腔的生 命期乃檢測發情期之間的間隔，黃體酮（progesterone) 分泌之維持，及前列腺素分泌之抑制情形（Hanson，et al.)。這些檢測所得結果之比較證實，當施用1 〇 〇微克 /天之IFNr時，動情期之間的間隔可被顯著延長，而 當施用r Hu I FN α時，無明顯作用。這些數據支持一 結論，即I FN 7：能顯著影響動情週期之生化結果。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----—------•裝--------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -22 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 — B7 五、發明說明（2〇 ) 亦檢測干擾素- r於繁殖週期之不同階段的抗病毒特 性（實例2 )。利用得自綿羊動情週期第1 2日至第1 6 曰之胎體建立胎體培養物。評估每份胎體培養物上清液的 抗病毒活性。隨著胎體發育之進展，培養物上清液有逐漸 增加的抗病毒活性。 2·IFNr之重組製備 利用細菌及酵母菌細胞製備重組I F Ν τ。利用 Ον I FNr之胺基酸編碼序列來生成對應之DNA編碼 序列，其具有可在大腸桿菌中充分表現之密碼用法（c〇d-on usage )(實例3 )。利用依序添加寡核苷酸而將 D NA編碼序列合成式地構築起來。利用如圖2所示之限 制酶水解及接合，將經選殖之寡核苷酸融合爲單一的多核 苷酸。多核苷酸之編碼序列具有如SEQ ID NO: 1所示之序列。 爲使重組I FN r表現，可將合成之編碼序列置入多 種細菌表現載體，例如，Ag t 1 1 (Promega, Madiso -n WI) ; PGEX (Smith, et al·); pNH 載體（31:卜 atagene, LaJollaCA)。將IFNr合成多核苷酸殖入 經修飾的P I Nm omp - A表現載體，記載於實例3 。：[FNr蛋白質之產製由添加IPTG誘導。利用超音 波震盪或滲透分級分離，將可溶之重組I FN τ自細胞釋 此蛋白質可用標準法進一步純化，包括分子大小分級 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ------：------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（21 ) 分離法（管柱層析或操作前之凝膠電泳）或親和性層析法 (例如使用抗一 I FN r抗體（固相支持物可購自Pharm-acia廠，Piscataway NJ))。蛋白質製劑亦可濃縮，例 如使用過濾法（Amicon, Danvers, Mass)。 合成之I F N r碁因亦殖入酵母菌選殖載體 pBS24up (實例 4 ;Sabin, etal·,; Ecker, et al·)。構築合成連接子以令I FNr編碼序列與泛醌素 (ubiquitin)編碼序列於載體內進行同一架構（ i η- f r am )之融合。形成的連接情形允許泛醌素序列於活體內自 I F N r序列切除。 令重組質體pBS24ub-IFNr轉形酵母菌— 啤酒釀母菌（S. cerevisiae)。培養經轉形的酵母菌細 胞，將其溶解且自細胞溶解物單離重組IFNr (r -I F N r )蛋白質。 利用放射免疫法將r - I F N 7：定量。進行經純化之 r_IFNr的微定序。結果證實與天然IFNr之前 1 5個胺基酸序列一致。此結果亦證實泛醌素/ I F N r 融合蛋白質於活體內可被正確處理。 ^ 藉此方法製得之重組IFNr具有抗病毒活性，此活 性與純化自適用胎體之培養基的I FN r之抗病毒活性類 操作本發明亦可使用其它酵母菌載體，包括具可調節 表現之載體，但不受限於此（Hitzeman, et al.,; Rutter, et al·,; Oeda, et al.) 。 代表性之酵母菌轉形作 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------：------農--------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -24 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（22 ) 用之宿主爲啤酒釀母菌，然其它適用於轉形之酵母菌亦可 使用（例如（Schizosaccharomyces poinbe))。 編碼IFNr多肽之DNA可被殖入任何商品化的載 體，以令該多肽於適合宿主系統內表現。這些系統包括上 述的細菌及酵母菌表現系統，以及如下：杆狀病毒表現系 (Reilly, e t a 1. ; Beames, e t a 1. ; C 1 on tech, Palo Alto CA);及哺乳動物細胞表現系（Clontech, Palo Alto CA; Gibco-BRL, Gaithersburg MD)。這些重組多 肽可以融合蛋白質或以天然蛋白質型式表現出現。多種特 性可被安排在表現載體內，例如促使經表現序列分泌至培 養基之引導序列。 通常經重組製備之多肽是由經溶解的細胞或培養基分 離而得。可利用此技藝之習知方法進行純化，包括鹽類分 級分離，離子交換層析，及親和性層析。如前所述，亦可 採用免疫親和力層析，其使用基於I FN r多肽所產製的 抗體。 B ·人類干擾素一 τ 1 ·編碼干擾素- τ蛋白質之人類某因組序列的鑑定及選 篩選D ΝΑ以尋找同源於干擾素一 r的序列（實例5 )。鑑定出與OvIFNr cDNA探針雜交的數種序 列。隨後分離出含有人類干擾素一 r之部份序列的數個純 系（實例6)。合成對應於OvIFNr cDNA序列 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------：------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -25 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 585911 A7 B7 五、發明說明（23 ) 之2個合成的2 5個核苷酸之寡核苷酸（Imakawa, et a-1., 1987)。這些引子用於擴大反應，此反應使用衍自下 列2個cDNA庫的DNA:人類足孕之胎盤及人類足孕 之滋養葉胞層（cytotrophoblast)。產生之經擴大D N A 片段以電泳分開且單離含有I F N r擴大產物之帶（band )。令產物再次選殖且利用二去氧終止法定序經嵌入的擴 大產物。 得自三個此類純系之序列比較顯示，單離物之間有高 度的序列同源性，但此序列並非完全相同。此結果推測有 人類干擾素- r基因之多種變種的存在。 實例7說明全長之人類I FNr基因之單離。自週邊 血液之單核細胞（PBMC s )單離高分子量的DNA， 並進行分子大小之分級分離。測試流份有無I F N r序列 的存在，採用聚合酶鏈鎖反應（polymerase chain reac-tion):來自經測試有擴大反應之流份的DNA分子可用 來形成Ag t 1 1中之次基因組庫。 塗佈該次基因組庫並與Ον I FNr cDNA探針 雜交（實例7 A )。鑑定出雜交至探針的近20個純系。 繼代相常於正反應純系之噬菌斑，藉使用〇v I FNr引 子之擴大反應來單離及分析DNA。這2 0個噬菌斑中有 6個噬菌斑產生正反應之P CR訊號。純化源自這6個純 系之噬菌斑並將嵌入D NA定序。這6個純系中之一的嵌 入物被用來作爲隨後篩檢步驟之雜交探針。 利用上述之雜交探針篩檢源自λ g t 1 1次基因組庫 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -------------装--------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁} -26 - 585911 A7 B7 五、發明說明（24 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 之重組噬菌體（實例7 B)。單離出3個顯示正雜交訊號 的純系並將嵌入物定序。獲得的核酸序列資料如 SEQ ID NO:11所示，而推測之蛋白質編碼序 列如S E Q ID N 0 : 1 2所示。推測之成熟蛋白質 之編碼序列如SEQ ID N0:4所示。 人類干擾素一r基因（SEQ ID N0:4)與 綿羊干擾素- τ基因之推測的蛋白質序列的比較（圖3 ) 胺基酸層次上之序列同源性及差異性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如 SEQ ID N0:12 及 SEQ ID NO :1 1所示之人類I FNz*序列及自其衍生之引子與探針 ，可用來作爲探針以測定其它含有人類I F Ν τ編碼序列 及偽基因（pseudogenes)之單離物。此外，同一生物種， 可能有至少一種I FN r蛋白質之異型（isolate)及至 少一種編碼序列。根據本發明揭示方法，可令操作本發明 之特定核酸探針和能與本案I F N r多肽反應的抗體用於 單離哺乳動物中未經鑑定的干擾素- r之變種，這些哺乳 動物包括山羊，馬，乳牛，閹牛，綿羊，大白鼠，小白鼠 ，兔子，猴子及人類，但不受限於此。 2 ·利用人類組織中干擾素- τ表現情形的鑑定 利用對Ον I FNr cDNA探針之雜交反應，分 析人類胎盤cDNA庫及綿羊cDNA庫（實例8)。此 DNA雜交分析結果顯示人類cDNA庫所得之IFNr 一訊號約爲綿羊c DNA庫所得訊號之1/1 0 0。 本紙張叉度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 一 27 - 585911 A7 B7 五、發明說明（25 ) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 〇 v I F Ν τ cDNA佔有約〇 · 4%之綿羊cDNA 庫。因此，對Ον I FNr探針呈反應的人類cDNA的 量顯然是低的，至少在足孕之胎盤中是如此，因該 cDNA庫是由胎盤生成的。 亦分析人類足孕胎盤及羊膜細胞中H u I F N r mRNA之存在情形。結果顯示人類I FNr m R N A 存在於胎兒與胎盤之間的合併處。羊膜細胞亦表現相當於 〇v I FNr引子及人類探針的訊信，可推知I FNr mRNA之表現不受足孕胎盤之限制。 此外，將RT - RCR分析法應用在單離自成人淋巴 細胞之總細胞R N A，以偵測H u I F N r之存在情形： 結果顯示IFNr mRNA存在淋巴細胞中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 亦使用定位雜交法（in situ hybridization)檢測 人類組織中干擾素- r之表現情形（實例9 )。檢測得自 4個健康，不同足孕期及首三個月之人類胎盤的組織切片 。此分析法使用了衍自Ον I FNr cDNA序列之 cDNA探針（實例9B)。定位雜交法乃使用反意（ anti-sense) RN A探針進行。三項個別實驗中，所有足 孕及首三個月之胎盤組織皆可見特異的雜交反應。 首三個月之胎盤絨毛（由外層的融合細胞滋養層，底 層之滋養葉胞層及具有多種類型間葉細胞之中心基質區所 組成）之滋養葉胞層細胞中呈現I FNz:之最高轉錄水平 。較不強但可測得的轉錄水平見於融合細胞滋養層與間葉 細胞。類似的轉錄表現之結果亦於足孕組織之胎盤絨毛中 一 28 _ 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（26 ) 被證實，但訊號偵測水平較低。首三個月之絨毛外滋養層 呈現最高訊號量且當其位於母體血液間隔處時染色呈正反 應。
Howatson, etal·，（1988)註明 IFNa 於首三個月 及足孕組織之絨色膜絨毛的融合細胞滋養層中產製。？311-lesu, et al., (1991)亦觀察到絨毛外滋養層與融合細胞 滋養層之I F Ν α，於首三個月胎盤組織中之反應性比源 自足孕組織者更強且更廣泛。這些研究員使用拮抗人類 I F N r亞型所誘生的抗體，但無任何人發現絨毛之滋養 葉胞層有任何I FNa ^ 目前結果證實人類I F N r基因在被絨毛外滋養層細 胞佔據之早期胎盤組織中大量表現，且在絨毛之融合細胞 滋養層，滋養層及多種間質細胞中亦有表現。這些結果證 明可測出人類懷孕期組織有IFNr轉錄，且首三個月胎 盤之絨毛的融合細胞滋養層及絨毛外滋養層有I F N r表 現。 C .壬擾素- τ之抗病毒特性 已評估I FN r拮抗多種病毒之抗病毒特性，包括 RNA及DNA病毒。經純化至均質之Ον I FNr的相 對特異活性於抗病毒分析法中評估（實例10)。 I FNz:具有比rBo I FNa或rBo I FNr更高之 特異抗病毒活性（實例10，表3)。 本發明優點之一乃I F N r具有強的抗病毒活性，伴 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -------.------裝--------訂-----1--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -29 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（27 ) 隨有限的細胞毒性作用。測試高度純化之0 v I F N r對 於接觸過A I D S及人類A I D S之逆轉錄病毒之週邊血 液淋巴細胞的抗逆轉錄病毒作用及細胞毒性作用（Bazer·， F.W·，et al (1987)。此豆狀病毒（lentivirus)對貓造 成慢性似A I DS的症狀，故爲研究人類A I DS之模型 (Pederson, et al·, 1987) ^檢視兩種病毒之任一者於 周邊血液淋巴細胞（P B L )之複製情形，係根據經過一 段時間之培養物上清液中的逆轉錄酶（R T )活性。 欲測定I FN r拮抗F I V及Η I V之抗病毒活性， 可測定經I FNr處理之經F I V -及Η I V —感染之貓 及人類P B L培養物中的依賴RNA之DNA聚合酶的 R Τ活性（實例1 1 )。當細胞培養時有I F N r的存在 ，F I V之複製情形會降低至約爲對照數值的1/3。 0 v I F N r的添加會產生逆轉錄酶（R T )活性之快速 且由劑量決定之降低情形（實例11 ，表4) 。IFNr 之濃度低至0·62ng/mi時仍可抑制病毒複製，而 對於RT —活性有較大作用之更高濃度（4 0 n g/m义 )，對細胞無毒性作用。此結果顯示，當細胞培養時有 Ον I FNr的存在，與對照數值比較之貓免疫不全病毒 之複製情形顯著降低了。 I F Ν τ顯然對逆轉錄病毒之宿主細胞無細胞毒性作 用。當I F Ν τ以每毫升4 0微毫克之濃度存在培養基中 時’上述結論亦爲真。此濃度之I FN r相當於約 8，0 0 0抗病毒單位之α —干擾素，當根據Pontzer, 本紙張汶度適用中國國家標準（CNS)/V丨規格（210 X 297公釐） 一 30 - -----I-----•裝--------訂---------^_w (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（28 ) et al· ( 1 988 )所述測定 I F N r 對於保護 Madin-Darby 牛腎細胞免於被水泡口炎病毒（vesicular stomatitis v i r u s )溶解之活性。 亦測試I F N r拮抗Η I V於人類細胞內複製之活性 。令經過Η I V感染之人類週邊淋巴細胞以不同濃度的 I FNr處理（實例1 2)。評估周邊血液淋巴細胞中 Η I V之複製情形係根據一段時間內之培養上清液的逆轉 錄酶活性。一個濃度範圍內之IFNr能產生顯著的抗一 HIV作用（實例12，表5)。僅培養6日，10ng /mj?濃度就能造成RT活性降低50%。500ng/ mj?濃度造成1 0日內之RT活性降低9 0%。此外，無 任何細胞毒性作用之證據顯示與I F N r之施用有關（實 例1 2，表5 )。 此外，評估I FN r拮抗Η I V之抗病毒作用，係在 Η I V感染之際，以不同量的重組I F N r或重組人類 I FNa2處理人類PBMC細胞（實例1 8)。此測試 所得數據（實例1 8，表1 2)支技一結論’即相近濃度 時，IFNa與IFNr皆能有效降低HIV於人類淋巴 細胞內複製。然而，以I FNa2處理的細胞會造成細胞 毒性，而未見這類細胞毒性出現在使用I FN τ處理者， 即使使用濃度高出許多之I FN r。 沒有PB L時，F I V及Η I V逆轉錄酶本身皆不受 IFNr之影響。故抗病毒活性並非針對病毒之RT直接 作用所造成的。 本紙張反度適用中國國家標準（CNS)AO見格（210 X 297公釐) ~ ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 585911 A7 B7 五、發明說明（29 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 干擾素- r亦發現可抑制肝細胞中之B型肝炎病毒 DNA複製（實例18)。利用被B型肝炎病毒（HBV )轉感的衍自肝細胞之人類細胞，以測試I F Ν τ之抗病 毒作用。令細胞以一濃度範圍內的I FNa及I FNr處 理。與無干擾素之對照組比較，IFNa與IFNr皆減 少近2倍之DNA複製。 爲了要證明干擾素之作用是特異針對感染性病毒而非 作用在一般細胞代謝所致的結果，測定肝細細胞中 I FNa與I FNr對肝特異之mRNA產製的影響（實 例1 8 )。藉雜交分析測定兩種肝細胞特異之蛋白質， Α ρ ο E 與 Apo A1。當 IFNa 或 IFNzr 濃度 高至40，0 0 0單位/毫升時，兩種肝特異之mRNA 無任一者出現mRNA產製的減少。此外，此分析中未見 使用IFNr者有肝細胞毒性之證據。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 這些結果顯示I F N 7：是有效拮抗種類廣泛之病毒的 抗病毒劑，這些病毒包括RNA及DNA病毒。IFNz* 超過其它如IFNa之干擾素的一項優點爲，使用 I F N r療法不會與任何細胞毒性有關。 D·IFNr之抗增殖特性 I F N r對細胞生長之作用亦予測定。一分析法中， 利用集落抑制法（colong inhibition assay)測定抗一 細胞生長之活性（實例1 3 )。以低細胞密度塗佈人類羊 膜（WI SH)或MDBK細胞於培養皿上，以形成源自 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A;丨規格（210 X 297公釐) 一 32 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（3〇 ) 單一細胞之集落。令干擾素稀釋物加至三個重複的孔洞（ we 1 1 )並培養培養盤以令集落形成。這些測定可見 I F N r抑制集落的大小與數目。I F N r抑制人類細胞 株（WI SH)之細胞增殖，比人類I FNa有效。 I F N r之抗增殖活性是由劑量決定的。高濃度的 I F Ν τ會終斷增殖，但細胞存活情形未受損害。根據使 用流動式細胞計數法之細胞週期分析，可知I F N r顯然 會抑制細胞，發展至S期。這些細果證明IFNr具抗增 殖活性，且強調出其具有低細胞毒性。 亦研究I FNz·對大白鼠及牛細胞株之抗增殖作用（ 實例1 4 )。利用3 Η -胸腺嘧啶攝入之速率來評估細胞 增殖之速率。所得數據證明I F N r顯示降低每一測試細 胞株之細胞增殖的速率（實例14,表7)。 進一步以一系列人類腫瘤細胞株測試I F N r之增殖 活性與缺乏細胞毒性（實例1 5 )。多種人類腫瘤細胞株 乃選自用於測試抗腫瘤劑之Ν I Η篩檢法的標準細胞株（ Pontzer, C.H., et al., (1991))。至少測試一種選自 每一個主要腫瘤類別的細胞株。 下列細胞株係得自美國菌種保持中心（1 2 3 0 1 Park卜 awn Dr. , Rockville MD 2 0 8 5 2 ) NCI—H460 人類肝大細胞癌； DLD—1 人類結腸腺癌； SK—MEL-28 人類惡性黑色素瘤； ACHN 人類腎腺癌； 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝---------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -33 - 五、發明說明（31 ) H L — 6 0 Η 9 HUT 78 M C F 7 如上所述 啶被攝入經過 585911 A7 B7 人類前骨髓細胞性白血病； 人類T細胞淋巴瘤； 人類皮膚T細胞淋巴瘤；及 人類乳腺癌。 評估抗增殖活性乃藉由測定3H -胸腺嘧 F N r處理之細胞的速率。處理組間之顯 著差異性乃根據Schef fe’ s F -測試的誤差分析而予評估 。藉流動式細胞計數法進行細胞週期之分析。 I F N r對M C F 7 (乳腺癌）增殖之抑制結果的測 試，證明I FN r以劑量決定之方式降低MF C 7之增殖 。使用1 0，000單位/毫升I FNr者發現3H —胸 腺嘧啶減少5 0 % (實例1 5，表8 )。該細胞先前曾發 現對抗一動情素處理不具反應。 使用HL — 9 0 (人類前骨髓細胞血白病）細胞經營 I FNr與I FNa之抗增殖作用的比較。使用前骨髓細 胞白血病HL—60之結果爲這類IFNr與人類 I F Ν α比較所得結果的代表性（實例1 5 )。兩種 I FN之濃度低至1 〇 〇單位/毫升仍可產生顯著的（ >6 0%)之生長抑制作用。I FN的量增加更可降低腫 瘤細胞的增殖（圖4)。高劑量的IFNa，而非 I F N r，有細胞毒性（圖5 )。細胞存活情形被 IFNa降低約80%。相反地，當IFNr使用 10，000單位/毫升時，近100%經I FNr處理 的細胞仍然存活。因此，雖然兩種干擾素皆可抑制增殖， 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A·丨規格（210 X 297公釐） -----I---------I---- 訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 -34 - 585911 A7 - B7 五、發明說明（32 ) ia是只有I F N r無細胞毒性。無毒性提供用於活體治療 之IFNr有此優點。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
以I FNr處理人類皮膚T細胞淋巴瘤，HUT 78，呈現與HL — 60類似的反應（實例15，圖9) °〇vIFNt:與 rHuIFNr 皆降低 HUT 78 細 胞之生長，而I F Ν α則被證實對細胞存活有不利的影響 〇 Τ細胞淋巴瘤Η 9比上述腫瘤細胞株對I F Να之抗 增殖作用不敏感。雖然IFNa對Η9細胞無毒性，但所 測試之任何濃度下的I F Ν α皆無法明顯抑制細胞分裂（ 實例15，圖10)。相反地，可見IFNr減少約60 %2H9生長。因此，只有ο I FNr是此類T細胞淋巴 瘤之有效生長抑制劑。 對於其它三種腫瘤細胞株（NC I - H4 6 0， DLD—1 及 SK - MEL-28) ，IFNr 及 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制仅 I FNa同樣是有效的抗腫瘤劑。對於黑色素瘤，SK — MEL — 28，IFNa造成的增殖抑制情形附帶13% 存活率的減少，然而I FNr不具毒性。絕大多數被測試 的腫瘤中，I FNr作爲拮抗人類腫瘤之抗腫瘤劑的功效 與IFNa相等或更佳。 I F N r具有拮抗人類腫瘤之抗增殖活性且無細胞毒 性，其作用如人類I F N a —般強或更強。臨床試驗 I F N a 2 s顯τκ其爲有效之抗腫瘤劑（Dianzani, F., 1992; Krown, 1987) 。I FNr作爲治療物之一項治療 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） " 一 35 - 585911 A7 B7 五、發明說明（33 ) 優點爲其排除了使用高劑量I F N a s所發現的毒性作用 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I F N r之其他應用有拮抗如Kaposi’s癌之類的腫瘤 (該癌與HIV感染有關），其中IFNr之抗腫瘤作用 與I F N 7：可抑制逆轉錄病毒生長之作用加在一起。 干擾素- r療法之活動功效於小白鼠系統進行測試（ 實例16) °B16 — F10是小白鼠可移植之先天腫瘤 ’選用此腫瘤是因爲其具有肺部轉移之高度跡象（Poste, et al., 1981)。導入此腫瘤細胞後3天，開始干擾素治 療。活體投服I FNr顯著降低B 1 6 - F 1 〇肺部腫瘤 °因此，I FN r顯然在活體外及活體內皆可作爲有效的 抗腫瘤劑。 K ·壬擾素一τ多肽片段，蛋白質模型及蛋白質修飾 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 如本說明書教示之I F N r活性的變化，其強度及缺 令細胞毒性，顯示對此新穎的干擾素有結構/功能分析之 重要性。負毒0 I F N 7：功能之結構基礎已被檢測，其係 使用對應至完整Ον I FNr序列之6個重疊的合成肽（ 圖6 )。衍自綿羊I F N r序列之對應多肽如S E Q ID N0:15 至 SEQ ID NO:20 所示。代 表胺基酸1一 37，62 - 92及139 — 172的3個 肽已發現可抑制I F N 7：之抗病毒活性（實例1 7 )。該 肽濃度爲3 0 0 //m及更高時，是有效的競爭者。 IFNr之C-終端肽，OvIFNr (139— 本紙張<度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210>< 297公釐） -36 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 _____B7 五、發明說明（34 ) 172)，及內部肽OvIFNr (62—92)，能抑 制I F N r及r Β ο I F N r : ϊ之抗病毒活性至相同程度 ，但是N-終端肽OvIFNr (1-37)在抑制 〇v I FNr之抗病毒活性上更有效。劑量一反應數據顯 示 iFNr (62 — 92)及 IFNr (139-172 )抑制I F N r之抗病毒活性至相同程度。阻斷I F Ν τ 抗病毒活性的上述肽亦可阻斷重組牛I F Ν α ( rBo I FNr)之抗病毒活性；重組牛I FNr不受此 類肽的影響。這兩種IFNr肽可代表IFNr與多種 iFNas之共同受體結合區。 兩個合成肽oIFNr (1-37)及oIFNr ( 1 39 — 172)亦能阻斷ο I FNr之抗—F I V與抗 一 HIV活性（實例17;圖11A及11B)。雖然這 兩種肽皆阻斷F I V之R T活性，但顯然只有C 一終端肽 ，oIFNr (139-172)，可作爲貓細胞株（ F c 9 )之水疱口炎病毒活性的有效抑制劑。 集合上述數據可知，I型干擾素之C -終端區可結合 至I型干擾素受體之共同位置，而N -終端區可能涉及獨 特功能之誘發。此結果顯示IFNr干擾素分子之不同區 可用於取代干擾素α分子之不同區。例如，干擾素α分子 中負責增強細胞毒性之區域，相對於I F N r處理，可被 鑑定，其係藉由衍自I FN r之多肽區取代干擾素α分子 之區域。進行這類取代反應可利用合成基因（見下文）之 操作’該基因編碼經選定的I F N r及干擾素α分子，加 本紙張瓦度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -37 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 _ B7 五、發明說明（35 ) 上本文說明的功能性分析法（例如，抗病毒，抗增殖及細 胞毒性分析法）。 拮抗I F N r肽之多株抗一肽抗血清，亦得到如前所 述之多肽抑制研究的類似結果。直接對抗相同三區域（ OvIFNt (1-37)，IFNr (62- 92)及 IFNr (139 — 172))的抗體會阻斷 oIFNz： 之功能，證實了這三個區域在抗病活性上的重要性（實例 17)。雖然這些肽顯然可結合至干擾素受體，但其本身 不會引起或參與細胞內之似干擾素作用。 I FN r之抗增殖活性（實例1 7，表1 1 )包括此 分子之另一區域，因爲IFNr (119 — 150)是 〇 I F N r —誘發之細胞增殖降低作用的最有效抑制劑。 此結果顯示主要負責細胞生長抑制作用的分子區是 IFNr (119-150)區。IFNr分子之此區可 單獨或融合至其它蛋白質（例如干擾素α)，以作爲抗腫 瘤劑。 最後，125Ι _0ν I FNr對於MDBK細胞上其 受體的結合情形可被阻斷，其利用拮抗6種肽中4種肽之 抗血清；此4個多肽代表Ον I FNr之胺基酸1 — 37 ，62-92，119 — 150 及 139 — 172。此結 果反映出這些區域的多重結合區以及這些區域的功能性特 徵。由於IFNr之不同區域引發不同功能，選定胺基酸 之修飾作用可能可產生具選擇性之生物活性的類I F N r 干擾素。 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -38 - 585911 A7 _B7___ 五、發明說明（36 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述數據證明合成肽之鑑定，此合成肽具有 ο I FN r蛋白質上四個不連續的位置，其涉及受體交互 作用及生物活性。爲了要說明區域的結構上關連性，進行 IFNr之三度空間結構之模型構築。三度空間模型將可 用於闡明現有數據及設計未來之結構/功能之研究。 將全長重組Ον I FN z：之圓二色性（circular di-chroism，C D )組合至I F N (已知三度空間構造之 蛋白質（Senda, et al., 1992))，則構築了 Ον I FNr之模型。此模型最引人注意的特徵是， I F N r自然分類至具4個螺旋狀之束狀小區的一類蛋白 質。I FNr之CD光譜獲自AVIV 60 S極光分光 計（spectropolarimeter)。使用2種不同方法進行三級 構造之判斷^ Perczel, et al., (1991)之冰點測定法（ algorithm)及 W.C· Johnson, Jr· ( 1 9 9 2 )之可變選擇法 〇 經濟部智慈財產局員工消費合作社印制衣 光譜之二次結構判斷指出7 0 - 7 5%之α螺旋（以 波長最小在2 2 2及2 0 8 nm及最大在1 9 0 nm鑑定 )。可變選擇之冰點測定法判斷此分子的剩下部份是2 0 %冷層及1 0%轉折。Chang法判斷剩下部份是3 0 %隨 意的圈捲。I FNr及IFNyS序列之點測定法呈現兩分 子間之同源性，尤其是在I FN^之已知螺旋結構的區域 。I F Ν τ之序列分析亦發現推測螺旋區具有無極性之週 期性，由四個螺旋之束狀小區表示。 做模型的最後步驟是將IFN3碳骨架之IFN冷 本纸張尸、度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) -39 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 B7 五、發明說明（37 ) X —射線結晶像相等物應用在I F N r序列。如上鑑定之 I F N 7：的官能活性區位在分子的一側且發現呈緊密的空 間緊臨性。此結果與I FN r之多重結合位置吻合，其與 I型IFN受體同時交互反應。 三度空間模型化資料加上前述之功能資料，提供將序 列變化導入I F N r特定區之能力，以生成選定功能之增 進（例如，抗病毒或抗細胞增殖）或將具選定功能之區域 取代入其它干擾素分子（例如，抗病毒，抗腫瘤或降低細 胞毒性）。 表現Ον I FN 7：之合成基因的構築記載於實例3。 簡言之，利用大腸桿菌之最佳密碼用法而反向轉譯保留的 胺基酸序列。設計此序列以包含分佈構築體全長之2 0個 不同的限制酶位置。此5 4 0個鹼基對之合成基因序列可 分成1 1個寡核苷酸片段。合成各別片段，並將其單股或 雙股殖入 pTZ 19R，pTZ 18R，或 PBluesc-ript，擴大及融合之。再將合成的ο I FNr構築體殖入 經修飾之P I N — ΠΙ — ompA表現載體以於細菌內表現 ，亦殖入酵母菌表現載體。已設計出類似經構築的人類 IFNr合成基因（SEQ ID N 0 ： 3 )，並已於 酵母菌細胞內表現。 Ον I FNr合成基因於酵母菌中表現（實例4)可 令重組I FN r於啤酒釀母菌中過度生產：大量（1 〇 〇 毫克/公升）之重組IFNr可自溶解之酵母菌萃取物純 化，利用連續離子交換及分子篩濾層析。以此方式純化的 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 一 40 - ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制仅 A7 B7_____ 五、發明說明（38 ) 重組I FN r具有類似天然Ον I FNr之強抗病毒活性 (2至3X108單位/毫克）。 合成之基因構築體有利於導入突變，以可能促進抗腫 瘤（抗細胞增殖）及抗病毒活性。此外，負責不同功能之 分子個別區域可進行不同功能之分別構作。舉例而言，已 構築2種缺失突變種，OvIFNr (1—155)及 OvIFNr (1-166)，以檢測IFNr分子中羰 基端序列的功用。 其它突變型I F N r分子已被構築以鑑定嚴格負責抗 增殖活性的殘基。舉例而言，特別殘基，T y r 123 在I FNa之抗細胞增殖活性上有關連（Mclnnes, et al • , 1 9 8 9 ) 0 I FNr中，Ty r 123之相等物包含在肽 OvIFNr (119-150):此多肽抑制 〇v I FNr與人類I FNa之抗增殖活性。將Ty r 1 2 3轉換成保留取代（T r p)及非保留取代（A s p )的突變作用已產生，亦產生具有此殘基缺失之突變序列 。編碼Ty r 123之密碼位在Ssp I位置內；此位 置之剔除可用於篩檢。如本文所載，評估這些突變型 I F N r之抗增殖活性。 可製造合成肽，其相當於本發明之I FN r多肽。合 成肽可被商業合成或使用此技藝中的標準方法及儀器（八一 ρ ρ 1 i e d B i 〇 s y s t e m s, F 〇 s t e r C i t y C A )製備。 易言之，編碼肽之寡核苷酸序列可利用寡核苷酸合成 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)/V1規格（210 x 297公釐） 一 41 一 ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印刺农 A7 _ B7__ 五、發明說明（39 ) 之標準方法直接合成，或者，若爲大編碼序列時，利用一 系列的選殖步驟合成，包括相當於編碼序列之多重寡核苷 酸片酸的前後排列（Crea; Yoshio et al.; Eaton et a-1.)。藉標準重組步驟可表現寡核苷酸之編碼序列（Man-iatis et a 1. , Ausubel et a 1. ) ° IV .與干擾素- τ反應的杭體 、贪有被融合至穀胱甘肽—S -轉移酶（S j 2 6 )蛋 j質之本發明多肽抗原的融合蛋白質，利用pGEX — GLI載體系統，可於大腸桿菌JM101細胞中表現。 此融合S j 2 6蛋白質可十分輕易地利用榖胱甘肽受質之 親和性層析法單離出來（Smith) 。IFNr蛋白質之表 現與部份純化描述於例2 0，且可應用在任何其它可溶 性物質，包括由本發明所示序列編碼的多肽。 不溶性GST (Sj 26)融合蛋白質可利用製備式 凝膠電泳法純化。 或者，—半乳糖苷酶融合蛋白質可如實 例1 9所載而予單離。 本發明亦包括表現載體，例如上述之λ g t 1 1或 PGEX載體，其含有IFNr編碼序列及可令編碼區於 適當宿主內表現之表現控制元件。此控制元件通常包括啓 動子，轉譯起始密碼，轉譯及轉錄終止序列，及用於將嵌 入物導入載體之嵌入位置。 編碼所欲多肽之DNA可被殖入任何載體（如上所述 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 一 42 - ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 585911 A7 __ B7 五、發明說明（4〇 ) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) )’以造成多肽於適當宿主系統中表現。這些重組多肽可 被表現爲融合蛋白質或天然蛋白質。許多特性可被安排在 表現載體內，例如，引導序列，其促使經表現序列被分泌 至培養基中。重組製備的I F N r及自其衍生的多肽通常 是由經溶解的細胞或培養基單離而得。可利用此技藝習知 之方法進行純化，包括鹽類分級分離，離子交換層析及親 和性層析。亦可使用免疫親和性層析法，其利用拮抗選定 IFNr抗原而生成的抗體。 本發明另一方面包括拮抗本發明多肽之特異抗體。通 常欲製備抗體，宿主動物，例如兔子，以經純化之抗原或 融合蛋白質抗原免疫。混合型或融合型蛋白質可利用許多 衍自其它蛋白質之編碼序列產製，例如Θ -半乳糖苷酶或 穀胱甘肽- S -轉移酶。於適當時間間隔後，收集宿血清 或血漿，測試此血清之特異拮抗該抗原的抗體。實例2 0 說明兔子血清抗體之製備，該抗體能特異地拮抗S j 2 6 /1FNr混合型蛋白質中之IFNr抗原。這些技術可 應用在所有的IFNr分子及自其衍生之多肽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 可獲得經免疫動物之7 -球蛋白流份或I g G抗體， 舉例而言，係利用飽合的硫酸銨或DEAE Sephadex，或習 於此藝之士所知之製造多株抗體之技術。 純化蛋白質或融合蛋白質可用來產製單株抗體。由經 選定多肽抗原免疫之動物取出胰臟或淋巴細胞，並令其無 限增殖（immortalized)，或利用熟悉此藝之士習知的方 法製備融合瘤（Harlow, et al.)。可自周邊血液試樣單 冢紙張尸、度適用中國國家標準（CNSM4規格（210>< 297公釐） -43 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（41 ) 離淋巴細胞。伊斯汀—巴爾病毒（Epste in-Barr virus， E BV)可用來使得人類淋巴細胞無限繁殖，或可使用融 合參與者以製造融合瘤。 篩選由無限繁殖化細胞分泌的抗體，以測定分泌所欲 特異性之抗體的純系，例如利用E L I SA或西方吸漬法 (Ausube1 et a 1. ) ° 多肽之抗原區通常相當小，傳統上是7至1 0個胺基 酸之長度。更小片段已鑑定爲抗原區。如上所載鑑定干擾 素- r之多肽抗原。製成之DNA編碼區域可被重組表現 爲融合蛋白質或單離的多肽。 此外，部份胺基酸序列可被便利地化學合成（App 1 i -ed Biosystems, Foster City CA)。由這些方法中任一者 獲得的抗原可直接用於產製抗體或被偶合在適合載劑分子 之上。許多這類載劑是此技藝中習知的且已被商品化（例 如，Pierce, Rockford IL)。 與I FN r反應的抗體是有用的，例如，用於分析結 構/功能之關連性。 V ·用途 A ·繁殖方面 雖然根據結構及其有效抗病毒性特性，I F Ν τ具有 I FNa —族的某些相似性，但是I FNa s不具有 I FNr相關之繁殖上的特性。同樣地，重組牛I FNr 與I F N r比較時，對於發情間期具極少或無作用（Dav- 本纸張汶度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ------------•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -44 ~ 585911 A7 B7 五、發明說明（42 ) is,etal.，1992)° (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 因此，雖然I F N r相對於其它干擾素有某些結構上 的相似性，其具有本身之獨特性質：例如顯著影響動情週 期之生化趨勢的能力。 本發明之人類I FNr可用於助孕及延長雌性哺乳動 物黃體生命期之方法中，如Hansen et al之總論，在此併 予參考。人類I FNr對於人類治療特別有用，因爲使用 如此一個相同物種的蛋白質較不可能有潛在之抗原反應。 B ·抗病毒特性 I F N r之抗病毒特性有廣泛的治療性應用，然無常 與I FNr s有關之毒性作用。雖然培養基有I FNr的 存在會抑制貓免疫不全病毒之逆轉錄酶活性（實例1 1 ) ，此並非由於I FN 對F I V的直接作用。更精確地說 ，I F N r顯然誘使宿主細胞產生對病毒之逆轉錄酶有抑 制的因子。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發現I F Ν τ具有其抗病毒活性對細胞無不利作用： 無發現細胞毒性作用是由於服用I F N r之證據。 IFNr缺乏細胞毒性使得IFNr作爲活體治療劑極具 價值。缺乏細胞毒性使得I F N r可與絕大多數其它習知 抗病毒劑及所有其它習知的干擾素區隔出來。 含有本發明I F N r化合物之配方可用來抑制病毒複 製。 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 B7 五、發明說明（43 ) c .抗細胞增殖特件 I FNr呈現有效的抗細胞活性^ I FNr亦可用於 抑制細胞生長且無目前已知之其它干擾素相關的不良副作 用。含有本發明之IFNr化合物之配方可用來抑制，預 防或減緩腫瘤的生長。 某些腫瘤的發育決定於動情素的調節。用於支持本發 明之實驗顯示I F N 7：可抑制動情素結合至其受體。因此 ，IFNr可用來治療或預防依賴動情素的腫瘤。 D .干擾素結合至受體的干摄 I F Ν τ顯示與受體分子上的數個位置有交互反應， 且這些區域單獨或組合會對I F Ν 7：之個別功能有不同的 影響。 本發明多肽對於干擾素結合至干擾素受體之選擇性抑 制作用有效。詳言之，如本文所載，某些揭示之多肽會選 擇性地抑制I F N r之抗病毒活性，而其它多肽抑制抗增 殖活性。這些肽的組合可用來抑制兩種活性。除了結合至 干擾素受體及阻斷I F Ν τ活性的益處之外，這些肽本身 不引起抗病毒或抗增殖活性。 因此，這類多肽可用來作爲免疫調節分子，當需要預 防由干擾素分子引發之免疫反應時。這些肽可用來作爲免 疫抑制劑，舉例而言，用於預防對抗組織移植物之干擾素 調節的免疫反應。其它由干擾素調節的免疫反應亦可被阻 斷，例如α干擾素之細胞毒性作用。 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) ------------•裝--------訂---------MW (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -46 - 585911 A7 B7 五、發明說明（44 ) E ·藥學組成物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據習知方法，I F N r蛋白質可被調配以製備藥學 上有效的組成物。含有干擾素或類干擾素之化合物的配方 早有記載（例如，Martin, 1976)。大致上，本發明之組 成物將調配爲有效劑量的I F N r與合適劑結合，以利於 該組成物之有效服用。 用於這些療法的組成物亦可呈現多種型式。舉例而言 ，包括錠片，藥丸，藥粉，液態溶液或懸浮液，脂性小體 ，栓劑，注射用及灌流用之溶液。較佳形式決定於意欲的 投服及治療應用的方式。此組成物較好亦包括習知之藥學 上可接受的載劑及佐劑，其爲熟悉此藝之士所習知的。較 好，本發明的組成物爲單位劑量形式且可經常施用至病患 ，每日一次或一次以上。 I F N r或相關多肽可以任何藥學上可接受之劑型施 用至病患，包括靜脈內，肌內，病變處內，或皮下注射。 更精確的說，用於其它干擾素化合物之組成物及方法可用 來輸送這些化合物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 本發明化合物之一項主要優點是IFNr蛋白質之極 低細胞毒性。因爲這種低細胞毒性，I F N r有可能以大 於其它干擾素化合物（例如，I FNa) —般使用的濃度 來施用。因此，施用I FNr之速率可自約5x 1 04至 20X106單位/日提高至500X106單位/日或 更高。於一較佳的目體實例，劑量約爲1 〇β單位/曰。 高劑量較好用於全身注射。當然，應體認本發明組成物及 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -47 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（45 ) 方法可與其它療法組合使用。 一旦發生病患情況有改善，若有必要，施用維持劑量 ^然後，用藥劑量或頻率或兩者可減低至經改善狀況可被 維持的水平，以症狀爲參數。當症狀已減輕至所欲水平時 ’應終止治療。然而病患可能需要基於任何病症復發之間 歇性治療。 本發明組成物可經由標準步驟施用，以治療多種癌症 及病毒性疾病，包括先前其它干擾素已顯示具有活性的疾 病。舉例而言，參見 Finter et al. (1991); Dianzani, et al. ( 1 9 9 2 ); Francis, et al. ( 1 9 9 2 )及美國專利案 第 4，885，166 及 4，975，276 號。然而如 i：所述，本發明組成物具有獨特性質及優點，包括其治療 這些病症且不具毒性之能力。 F .皮膚失調之治療 皮膚失調可於病變處內使用I FN r處理，其中配方 及劑量將根據施用方法及欲治療之病變處的範圍大小及嚴 重性。較佳方法包括皮內及皮下注射。可多次注射至大病 變區，單一病患皮膚上的數個病變處可同時處理。施藥計 劃可由熟悉此藝之士決定。設計爲維持性釋放的配方可減 少施藥的頻率。 G ·全身性治療 全身性療法基本上與所有應用一致。可多次靜脈內或 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -48 - 585911 A7 ________B7_ 五、發明說明（46 ) 皮下施藥，且於治療用之可植入的方法中，設計爲維持釋 放的配方特別有用。亦可使用植入式皮下輸藥器，貯藥器 ’或幫浦來處理病患。 H ·局部治瘠 使用本發明I F N I：多肽之局部療法對於治療特定器 官內的腫瘤有效。治療可併用動脈內輸液。導管可被手術 式或血管式植入，以直接治療受害器官。皮下輸液器連接 至導管可用於慢性治療，或者可植入式，可再充填式的幫 浦亦可使用。 本發明其它具體實例乃I F N r蛋白質作爲天然殺手 (N K )細胞之活化劑的用途。 下列實例係用於說明本發明，絕非用來限定本發明。 材料和方法 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 f 合 作 社 印 製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 限制核酸內切酶，T4 DNA接合酶，T4多核苷酸激 酶，Taq DNA聚合酶，及小牛腸磷酸酶乃購自New England Biolabs (Beverly, MA) Proraega Biotech (Ma-dison，WI):這些試劑根據製造廠商之指示使用。進行 定序反應，使用’ SEQUENASE D Ν Α Π "定序套組（United States Biochemical Corporation, Cleveland OH) 。免疫吸漬法及其它試劑購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)或Fisher Scientific ( Needham, MA)。硝 化纖維濾紙購自 Schleicher and Schuell( Keene，NH) 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)/V!規格（210 x 297公釐） 一 49 一 585911 A7 B7 五、發明說明（47 ) 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 合成之寡核苷酸連接子與引子係使用商品化之自動式 寡核苷酸合成儀製備（例如，AB I 380B - 02型 之 DN A 合成儀（Applied Biosystems，Foster City, CA))。或者，可購買由客戶設計的合成型寡核苷酸，例如 ’購自 Synthetic Genetics廠（San Diego, CA)。 c D N A合成試劑與隨意引導之標記套組可購自Boeh ringer - Mannheim Biochemical ( BMB, Indianapolis, IN) o 編碼多肽之寡核苷酸可利用寡核苷酸合成標準法直接 合成，或者，當其爲大的編碼序列時，藉由一系列選殖步 驟來合成，包括相對於編碼序列之多重寡核苷酸片段的前 後排列（Crea; Yoshio et al·; Eaton et al·)。寡核甘 酸編碼序列可根據標準重組步驟而予表現（Maniatis et al·; Ausubel et a 1. ) 0 或者，根據活體外技術直接合成肽（Applied Biosystems, Foster City CA) 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 根據標準法進行涉及多株及單株抗體操作之一般運作 ，包括自血清純化抗體（Harlow et al·) 。Pierce廠（ Rockford, IL)是許多抗體試劑之供應處。 重組人類I FNa (rHu I FNr)及 rBo I FNr 購自 Genentech Inc· (South San Franc-isco, CA)。重組人類IFNa之參考製劑（ rHuIFNr)得自國家衛生處（NIH)： 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)Ai丨規格（210 X 297公餐^ -50 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 585911 A7 B7 五、發明說明（48 ) r H u I F N r 可自 Lee Biomolecular購得（San Dieg0 CA) 0 所有組織培養基，血清及用於本發明之I FN s不含 有內毒素，係根據使用敏感量爲0 · 0 7n g/mj?之 Limulus阿米巴樣細胞溶解物（洽詢Cape Cod, Woods II、 o le，ΜΑ)之分析法測定。 用於測定抗體之一段EL I SA步驟 令聚苯乙烯9 6孔洞測試盤1111111111〇1'11(?0〇)塗 覆含有5微克/毫升抗原（每孔洞1 0 0微升）之0 . 1 Μ的碳酸鹽/重碳酸鹽緩衝液，pH9 · 5。以保鮮膜封 盤並置於4 °C 一夜。 抽取盤內液並使用3 0 0微升之1 0%NGS阻斷（ block)，且於3 7 °C靜置1小時。 以 PBS 0 · 5%、TWEEN - 20"洗滌試盤 5次。 抗血清稀釋於0 · 1M PBS，pH7 · 2。將抗 血清（0 · 1毫升）之所欲稀釋液加入每一孔洞，並靜置 試盤於37 1，1小時。再以PBS 0.5%" TWEEN-20"洗滌試盤5次。 將經薙菜過氧化酶（HR P )共軛之山羊抗人類血清 (Cappel )稀釋1/5000於PBS。令0 · 1毫升該 溶液加至每一孔洞。靜置試盤於3 7 °C，歷3 0分鐘，再 以P B S洗滌5次。 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------^-----1 -----—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -51 585911 A7 _ B7__ 五、發明說明（49 ) 添加至試盤前才製備Sigma ABTS (受質）。 此試劑由50毫升之0 · 05M檸檬酸，pH4 · 2 ，0 · 078毫升之30%過氧化氫溶液及1 5毫克 ABTS組成。將0 · 1毫升受質加入每一孔洞，再靜置 30分鐘於室溫中，以添加〇 · 05毫升之5%SDS ( w/v)終止反應。測定4 1 0 nm之相對吸光度。 實例1 I F Ν τ之繁殖上功用及抗病毒活件 測定干擾素- τ*對於黃體生命期之作用。 以表1所示濃度的I F N r灌注入綿羊黃體。以相似 濃度灌注重組人類IFNa(rHuIFNr)。此外， 亦包括未受處理的對照組動物。評估黃體之生命期係根據 發情間期之測定，黃體酮分泌之維持，及前列腺素分泌之 抑制（Hanson, et al·)。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 52 - 585911 A7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（50 )
Μ_L 干擾素對繁殖牛理之作用 干擾素 處 理 發情間期（天數） 對照組 — 17. 3 100微克/天 16. 0 r H u I F Ν τ 2 0 0微克/天 16. 0 2 0 0 0微克/天 19. 0 0 ν I F N r 100微克/天 27. 2 對照組動物與接受Ον I FNr之動物的發期間期比 較，證明當I FNr投用1〇〇微克/天時，間期有顯著 延長。另一方面，對照組動物與接受重組人類I FNa之 動物的發情間期比較，證明r Hu I FNr具無意義的作 用。 這些結果顯示干擾素- r具有顯著影響動情週期之生 化趨勢的能力。 實例2 干擾素- τ在繁殖週期不同階段上的抗病毒特性 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)/V1規格（210 x 297公釐） ------------•裳--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -53 - 585911 A7 B7 五、發明說明（5!) 建立胚體培養物，其利用得自動情週期第1 2至1 6 日之綿羊。使用細胞病變作用分析法評估得自每一胚體培 養物上清液之抗病毒活性（Familett，et al·, 1981)。 簡言之，將IFNr或其它IFNs之稀釋物與Madin-D-arby牛腎細胞（M D B K )培養1 6 — 1 8小時於3 7 °C 。培養後，於細胞病變作用分析法中測定病毒複製之抑制 情形，其使用水疱性口炎病毒（VSV)作爲攻毒病毒。 相對於被V S V感染之未治療的MD B K細胞（對照 組試盤），一個抗病毒單位造成單層細胞之破壞50%進 一步評估特異活性，其使用正常綿羊之纖維母細胞（Shnf )於斑抑制法（Langford, et a 1.，1981 )。測定每一時 間點上之三組試樣的最低值，每一試樣重複三次分析。示 於表2的結果以平均值單位/毫升表示。 ------1 I I I--丨―！| 訂-丨——----- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 一 54 - 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585911 A7 B7 五、發明說明（52 ) 表 2 胚體培養物，尿酸液及羊膜腔液之I F N r抗病毒活性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 日數 試樣 單位/毫升 10 9 <3 12 5 34 胚體培養物 13 6 4. 5 X 103 14 3 7. 7 X 103 16 12 2. 0 X 106 60 3 1. 4 X 103 尿酸液 100 4 11 140 3 <3 羊膜腔液 60 3 22 100 4 <3 ------------•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -55 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印rfe'J衣 585911 A7 B7 五、發明說明（53 ) 培養上清液有逐漸增加的抗病毒活性，其與胚體之發 育漸進有關（表2 )。 實例3 IFNr於細菌內表現 將Ον I FNr之胺基酸編碼序列（Imakawa, et a-1.，1 987 )用來生成具有於大腸桿菌可達最佳表現之密碼 用法的對應DNA編碼序列。將連接子序列加至5/及 3 /端，以刊於細菌表現載體之選殖。設計此核苷酸序列 以包含分佈整個編碼序列之1 9個不同的限制酶位置（圖 1 ) ° 將此核苷酸序列分子大小範圍在3 3至7 5個鹼基對 的11個寡核苷酸片段。11個寡核苷酸片段皆由280 一 B雙管柱之DNA合成儀（Applied Biosystems)合成 ，且將其單股或雙股殖入下列載體之一 ’pBLUESCRIPT+( KS)〃 （ Stratagene, LaJolla, CA) ， p T Z 1 8 R ( P h a r m a c i a，P i s c a t a w a y, N J )，或 pTZ19R ( P h a r-macia, Piscataway, NJ)選殖載體。 令載體轉形大腸桿菌K株>XL 1-BLUE"( recAl e n d A 1 g y r A 9 6 thi hsdR17(rK-，mK+)supE44 relAl λ —（lac) ，{F'，proAB， lacQZAM15，Tnl〇(tetR})，其係購自 Stratagene廠（LaJolla，CA)。令經轉形細胞生長在添 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^-----I 裝 -------訂------11 (請先閱讀背面之注咅3事項再填寫本頁) -56 - 585911 A7 B7 五、發明說明（54 ) 加安比西林（Ampicillin) (150微克/毫升）之L肉 汁。寡核苷酸之選殖及融合係利用標準重組DNA技術進 行。 以適當限制酶切割選殖載體以利嵌入合成之寡核苷酸 。以小牛腸碱性磷酸酶（c I P )處理載體以除去終端之 磷酸根。磷酸化寡核苷酸且以單股或雙股分子型式殖入適 合載體，其利用T4 DNA接合酶。當單股型式被殖入 選殖載體時，使用DNA聚合酶及所有4種去氧核糖核苷 酸來完成第二股。 爲了要進行雙股選殖，首先將寡核苷酸與其合成之互 補股黏合，然後接合至選殖載體。再將大腸桿菌K 1 2之 S B 2 2 1株或NM5 2 2株轉形，並利用接合反應。當 涉及甲基化反應敏感之S t u I及Cj^ a I限制酶位置時 ，使用大腸桿菌GM 1 1 9株進行選殖。選殖過程的每一 階段，進行經單離D N A之限制酶分析。 將經選殖之寡核苷酸融入單一多核苷酸，係利用圖2 標明之限制酶水解及接合。含有寡核苷酸的片段通常在低 熔點瓊脂糖凝膠上進行電泳式分子大小分級分離之後被單 離出來（M a n i a t i s, e t a 1 · ; S a m b r ο 〇 k, e t a 1 · ; A u s u b -el, etal.)。製得的IFNr多核苷酸編碼序列分佈在 位置16至531 :具172個胺基酸之編碼序列。 最後的多核苷酸之核苷酸序列係根據D N A定序予以 證實，其使用二去氧鏈終止法。 將全長的S t u I/S s t I片段（540個鹼基對 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 57 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 冒裝--------訂---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（55 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ;圖2)殖入經修飾的pi N rn 〇mp - A表現載體且 將其轉形至大腸桿菌之勝任SB22 1株。爲達I FNr 蛋白質表現之目的，令具有表現載體的細胞生長在含安比 西林之L —肉汁中，達OD (5 50nm)爲〇 · 1至1 ，使用I P T G誘發3小時且藉離心法收集產物。可溶性 重組I F N r自細胞釋出，係使用超音波或滲透式分級分 離。 實例4 I FNr於酵母菌中表現 實例3合成之合成型I FNr基因在其5 >端緊接 S t u I限制酶位置且在3 >端緊接S a c I限制酶位置 A ·合成型I FNr基因之單離 經濟部智慧財產局員工消費合作社印糾枝 2個寡核苷酸引子（SEQ ID NO: 13及 SEQ ID NO: 14)被用來將連接子附著至合成 型I FNz*基因，其使用聚合酶連錄反應。位在5 >端之 連接子使得合成型I F N r基因之安置呈現酵母菌選殖載 體p B S 2 4Ub內存在的冷醌素編碼序列之正確譯讀。 此連接子亦構築泛醌素- I F N r連接區，其於活體內可 使得泛醌素序列與I F N 2：序列分離。5 >寡核苷酸亦編 碼S a c Π限制核酸內切酶切割位置。3 /寡核苷酸含有 S t u I切割位置。 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 58 _ 585911 A7 B7 五、發明說明（56) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據鹼水解法，自大楊桿菌>XL I - BLUE 〃株 單離具有合成IFNr基因之載體（實例3)。經單離的 載體稀釋500倍於10mM Tr i s，pH8 . 0/ 1 m M EDTA/1 OmM NaC 又。PCR 反應於 1 00微升體積中進行，其使用Ta d DNA聚合酶及 引子 SEQ ID NO： 12/SEQ ID NO: 1 3。經擴大產物以S t u I及S a c Π水解。將這些經 水解的片段接合至’PBLUESCRIPT+ (KS)"之S a c Π與 S m a I位置。 產生的質體命名爲pBSY— I FNr。此DNA序 列利用雙股D N A作爲模板而被確認。 B ·表現質體之構築 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 使用Sa cn及EcoRV水解質體pBSY — IFNr ，並單離含有合成IFNr基因之片段。以 Sa又I水解酵母菌表現載體pBS24Ub (Sabin, etal.; Ecker, etal·)。使 T4 DNA 聚合酶以生 成鈍端。使用酚萃取載體DNA並以乙醇沈澱（Sambrook ,etal., 1989)。經回收之直線狀質體以S a cn水解 ，藉瓊脂糖凝膠電泳純化並將其接合至由P B SY -I FNr單離的Sa cn — Ec oRV片段上。所生成的 重組質體命名爲pBS24Ub— IFNr。 令重組質體pBS24Ub - I FNr轉形大腸桿菌 。單離含有I F Ν τ嵌入物之重組純系並藉由限制酶分析 本纸張Κ度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ 2犯公f 1 -59 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 __ B7 五、發明說明（57 ) 法鑑定之。源自含有IFNr編碼序列之純化系的質體 DNA係用於啤酒釀母菌之轉形作用（Rothstein, 1986 )°將轉形混合物塗佈在不含尿嘧啶之培養基上且於30 °c培養3 - 5天。再將菌落劃痕且維持在無尿嘧啶及白氣 培養基（Rothstein, 1 98 6 )。 C ·表現試驗 爲了進行小規模的表現，自不含尿嘧啶及白氨酸之培 養盤，挑出含有pBS24Ub - IFNr之啤酒釀母菌 AB 1 1 6的單一個菌落，且令其生長於3 0°C之YE P 培養基中（1%酵母菌萃取物，2%腺），誘發狀態時， 其含有1 %葡萄糖，或者在非誘發狀態時，其含有8%葡 萄糖。回收細胞溶解物並用於SDS - PAGE，凝膠含 1 5%聚丙烯醯胺，〇 · 4%雙聚丙烯醯胺（Sambrook, etal., 1 9 8 9 )。經分級分離的蛋白質藉考馬斯藍染色法 顯現爲可見的。 藉使用拮抗綿羊I F N r之多株抗血清之免疫吸漬法 ，將重組I F N r特異地顯見在經分級分離之細胞萃取物 電轉移的 >NYTRAN〃 紙上（Rothstein, 1 9 8 6 )。 爲了進行大規模的表現，令P B S 2 4 U b — I FNr生長24小時於30°C，含8%葡萄糖之5X尿 嘧啶及不含白氨酸之培養基中。再將此培養物稀釋1 〇 〇 倍於含8 %葡萄糖之Y E P培養基中。再將此培養物稀釋 1 0 0倍於含1%葡萄糖之YEP培養基中，再培養2 4 本雒張厂、度適用中國國家標準（CNSM4規格（210>< 297公釐） 一 60 - -----I-----Φ 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（58 ) 一 3 6小時。 藉離心集細胞，於50mM Tr i s，pH7 . 6 / 1 m M EDTA中洗滌且懸浮在含ImM PMSF 之洗滌緩衝液中。利用珠子撞撃器（ B i ospec Products, Bartlesville, OK)溶解細胞。令溶解物旋轉離心 43，OOOxg，歷20分鐘。回收懸浮液部份且用於 進行如下所述之純化過程。 D ·源自酵母菌細胞溶解物之r 一 I FN τ的純化 將懸浮液饋至1 X 1 0公分之DEAE管柱上，以 1 0 m M Tr i s ，ρΗ8 · 0清洗。停駐的蛋白質以 300毫升，0至0 · 5Μ NaCj?梯度之l〇mM Tr i s ，pH8 · 0溶離。收集3毫升流份。令含有重 組體（r_ I FNr)之流份1 7 — 26的1 0微升試樣 ，進行於1 5%SDS -聚丙烯醯胺凝膠上之電泳分離並 以考馬氏藍染色法顯見蛋白質。 混合含r - I F Ν τ之純純化的流份且藉放射免疫法 定量 r — I F N (Vallet，et al·，1988)。利用 L 〇 w r y 蛋白質法測定總蛋白質濃度（Lowry, et al.，1951)。 經純化之r 一 I FN r的微量定序證明首i 5個胺基 酸與天然I FNr相同，證實泛醌素/r 一 I FNr融合 蛋白質在活體內被正確地處理。 經純化之r 一 I FN r呈現每毫克蛋白質具有2至3 X108個單位之抗病毒活性（n = 3次重複試盤），此 本紙張泛度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -----I-----•裝--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -61 - 585911 A7 B7____ 五、發明說明（59 ) 類似於由適用胚體之培養基純化之I F N 7：的抗病毒活性 (2xl〇8單位/毫克）。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例5 人類高分子量D NA之南方吸瀆分析 收集源自健康捐血者之人類靜脈血試樣於經肝素處理 的試管中並單離周邊血液淋巴球，其藉使用Ficol卜Isop-aque 梯度（1 · 0 7 7 毫克 / 毫升）（Sigma Chemical Co.)之密度梯度離心法。高分子量（HMW)之DNA 單離自這些細胞（Sambrook, et al·, 1989)。 使用限制核酸內切酶Hindu Pst I ( prome -ga)水解2份10微克之HMW DNA試樣，於37 °C 歷2小時，再令DNA片段電泳分離於〇·8%瓊脂糖凝 膠（Bio-Rad, Richmond, CA)，於 7 5 伏特歷 8 小時。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制β 令D N A片段轉移至尼龍膜上（IBI-Internat i ona 1 Bio-technologies, Inc·, New Haven, CT)。烘烤膜於 8 0 °C歷2小時且靜置於4 2 °C之如下預雜交溶液中，歷4小 時：5XSSC (lxSSC 爲 〇· 15M NaC 芡及 0 · 1 5M檸檬酸鈉），50%體積/體積之甲醯胺， 0 · 6% (重量/體積）SDS，〇 · 5% (重量/體積 )脫脂奶粉，20mM Tr i s— HCj^ (pH7 · 5 )，4mM EDTA，及〇 · 5毫克/毫升單股之緋精 子DNA (Promega)。 再將濾紙靜置於雜交溶液中，於4 2 °C歷1 8小時， 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -62 - 585911 A7 — —____B7____ 五、發明說明（6〇 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 雜交溶液包括：5XSSC (lxssc是〇 · 15M NaCj?及〇 · 15M檸檬酸鈉），20 %體積/體積甲 醯胺，0 · 6% (重量/體積）SDS，〇 · 5% (重量 / 體積）脫脂奶粉，20mM Tr i s— HCj^ (pH 7 · 5 ) ，4mM EDTA，及 2xl〇8 cpm /毫 升 32P—標記之 OvIFNr c D N A ( Imakawa, et al·，1987)。洗滌濾紙於4 2 °C歷15分鐘，使用2 x SSC及〇 · 1% (重量/體積）SDS，並將濾紙置於 X -射線底片上（X A R，Eastman Kodak, Rochester， NY)，於一 80 °C曝光48小時，併用增強感光幕。 自動放射顯影結果顯示一雜交訊號，其位於經 P s t I水解之DNA的3 · 4鹼基對處及經H i ndlE 水解之DNA的較小片段〇3 · 0鹼基對）。這些結果 顯示有互補Ον I FNr cDNA探針之人類序列的存 在。 實例6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 利用PCR單離人類IFN cDNA之部 合成2個合成寡核苷酸（每一個具2 5個核@酸）’ 其分別對應至Ον I FNr cDNA之序列23 1至 255 (包含在SEQ ID NO: 13)及序列 566 至 590(包含在 SEQ ID N 0 : 1 4 )( 相對於c a p位置之編號，Imakawa, et al·，1 9 8 7 ) °
I些引子分別含有限制核酸內切酶P s t I及E c g ：R 木紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -63 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 585911 A7 B7 五、發明說明（ei ) 之切割位置。SEQ ID NO:14被修飾以含有 EcoRI位置，其由位置569開始。 自下列兩種近1 X 1 〇5個斑形成單位（p f u)之 c DNA庫單離DNA :人類足孕胎盤（Cion tech, lnc. ,Palo Alto, CA)及人類足孕滋養葉胚層（Dr. J.F. St-rauss,賓州大學，Philadelphia PA)。將該 DNA 用於 聚合酶鏈鎖反應（P CR)擴大法（Mullis; Mullis, et al. ; Pekin Elmer Cetus Corp. Norwalk CT)。擴大反應 進行30次循環（45 °C，1分鐘；72 °C，2分鐘； 94 °C，1分鐘）（溫度循環器及試劑，perkin Elmer Cetus)，其使用引子 SEQ ID NO： 12/ SEQ ID N0:13o 令擴大產物以電泳分離（100伏特，於1 . 5%瓊 脂糖凝膠（B i 〇 — Ra d)且將其轉移至尼龍膜上（ IBI)。令該膜於8 0°C烘烤2小時如上所述與32P — 標記之Ον I FNr cDNA預雜交及雜交。於5x SCC/0 · 1% (重量/體積）SDS中洗滌該膜5分 鐘，於42°C，及以2XSSC/0 · 1% (重量/體積 )SDS洗滌2分鐘，於42°C。再於一 80°C曝光至、 X A （Eastman Kodak)之 X —射線底片，歷 2 4 小 時，併用增強感光幕。測定雜交至經標記之探針D N A的 擴大產物。 如上所述再次進行P C R。以限制核酸內切酶 E c oR I及P s t I (Promega)水解經擴大的產物， 本纸張泛度適用中國國家標準（CNS)A:丨規格（210 x 297公釐） ------------·裝-----—訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 64 _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（62 ) 於3 7 °C歷9 0分鐘。如上所述將生成的DNA片段電泳 分離且將含有I F N r擴大產物之帶自凝膠切出。利電溶 離法回收DNA片段，將其再次選殖至經E c 〇 R I / P s t I水解之去磷酸化的質體pUC 1 9中並藉氯化齡 法（Sambrook, et al., 1 989 )轉形至大腸桿菌 JM101株（Promega)。單離質體且使用二去氧終止 法將經嵌入之擴大產物定序（Sanger, et al.，1 977; ^ SEQUENASE^ 反應劑，United States Biochemical, Cleveland，OH)。測定核苷酸序列且這些序列及推定的 胺基酸序列與其它I F N序列之比較係利用D N A Star 軟體（Madison, WI)。 這些純系之序列比較顯示有三種不同純系：源自人類 胎盤庫，即純系1 5 (306個鹼基對）及純系2 1 ( 3 15個鹼基對），這2個純系嵌入物之核苷酸序列有 95%同源性；或源自滋養葉胞層庫純系CTB 3 5 ( 3 0 1個鹼基對），此純系相對於純系15及純系21分 別有9 5 %及9 8 %之同源性。 實例7 全長人類IFNr基因之單離 以限制核酸內切酶E c 〇 R I水解1 〇毫克之 PBMC Η M W DNA且令其進行於〇 · 8%瓊脂糖 凝膠上之電泳分離。將含有分子大小介於1·5至10仟 鹼基對之間的DNA片段之一系列試樣（例如1 . 5至 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 65 - 585911 A7 _____B7___ 五、發明說明（63 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 · 5仟鹼基對，2 · 5至3鹼基對），自凝膠切出。將 這些DNA電溶離及純化。如上所述，使用Ον I FNr 引子擴大每一個D ΝΑ試樣。將產生正P C R訊號之任何 試樣的DNA分子殖入Agtll (次基因組Agtll 庫）。 A ·含有互補於Ον I FNr之序列之純系的PCR鑑定 再將λ g t 1 1塗覆以形成噬菌斑，並使用32P —標 記之Ον I FNr cDNA探針進行噬菌斑掀起雜交法 °近2 0個雜交至探針的純系被鑑定。 雜交至探針的噬菌斑進一步以P C R分析，其使用如 上所述之Ον I FNr引子。將產生PCR訊號的6個噬 菌斑純化。單離源自這些純系之噬菌體DNA並以 E c oR I限制核酸內切酶水解之。將DNA嵌入物再次 選殖至p U C 1 9載體中且根據二去氧核替酸定序法測定 其核苷酸序列。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 B ·含有互補至P C R -正反應之噬菌斑的純系之雜交鑑 定法 令源自λ g t 1 1次基因組庫之重組噬菌體增殖於大 腸桿菌Y1 080，並以約20，000噬菌斑/150 毫米培養皿之密度塗覆大腸桿菌Y1090。於培養皿上 方置放複印用之硝化纖維膜，其再與32P -標記之探針雜 交，該探針係源自上述單離之6個人類I FN r 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -66 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（64) c D N A純系。產生正雜交訊號之三個純系進一步篩選及 純化。單離噬菌體DNA，以Ec oRI水解，再次選殖 至p U C 1 9載體中且定序之。這三個純系得到相對至 c a p位置之超過8 0 0個鹼基的序列資料（純系以正反 兩方向序列）。核苷酸序列資料如SEQ ID NO: 1 1所示且推測之蛋白質編碼序列如S E Q ID NO :12所示。此基因之推測成熟蛋白質序列（SEQ ID NO : 12)相對於Ον I FNr之推測蛋白質序 列的比較示於圖3。 實例8 藉RT - PCR分析Hu I FNr mRNA之存在 利用如上所述之Ον I FNr cDNA探針的雜交 法，分析由第1 5 — 1 6天胚體所構築的人類胎盤 c DNA庫及綿羊c DNA庫。令c DNA於瓊脂糖凝膠 上進行分子大小之分級分離且將其轉移至濾紙（Man i at i -s，et al· ; Sambrook，et al·)。使用 〇 v I F N τ 探 針之南方吸漬分析顯示源自人類c DNA庫之自動放射顯 影的訊號是利用Ον I FNr。cDNA庫所得訊號的約 1/10 0。 分析人類是孕胎盤及羊膜細胞（2 6週，2百萬個細 胞）之Hu I FNr mRNA的存在，其利用逆轉錄酶 —PCR (RT—PCR)法（Clontech Laboratories, Palo Alto CA)。將單離自人類胎盤，羊膜細胞及綿羊胚 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -67 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（65 ) 體單離之總細胞RNA ( t cRNA)反式轉錄，其使用 引子SEQ ID 1^0:13。再將引子5£〇 ID NO : 1 2加入反應物且進行聚合酶鏈鎖反應達4 0次循 環。令P C R產物於瓊脂糖凝膠上進行分子大小分級分離 並將其轉移至濾紙上。使用32 P—標記之Ον I FNt:及 H u I F N r cDNAs雜交濾紙上的DNA。這些分 析的結果證明人類I FN r mRNA存在於胚期胎盤之 附屬部份。羊膜細胞亦表現對應至Ον I FNr引子及人 類引子的訊號。 此外，爲了偵測Hu I FNr之存在，應用RT — P CR分析法至由成人淋巴細胞單離之t c RNA。光密 度分析結果顯示，IFNr mRNA顯然存在淋巴細胞 中〇 實例9 定位雜交法(In Situ Hvbridiztion) A ·組織 檢測半連續5 - /z厚之經石蠟包埋之切片的玻璃片， 其得自4組健康，不同之足孕及首三個月之人類胎盤。 B·cRNA探針之製備 由單離自Ον I FNr擴大庫的cDNA純系中，再 次選殖對應至Ον I FNr cDNA鹼基#77-736的片段至轉錄載體，pBS (New England Biola- 本紙張尸、度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 68 - ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 一 _B7__ 五、發明說明（66 ) bs)(鹼基 #1 是 cap 位置；OvIFNr cDNA 之間放讀譯架構是鹼基#81—665;圖7)。單離得 數個p B S純系，再次選殖，且定序其核苷酸。由此純系 ，使用限制核酸內切酶Nj? alV及E c oR I切出3 /片 段（鹼基# 4 2 5 - 7 3 6 )且將其再次殖入轉錄載體 PBS。此載體命名爲pBS/Ov I FNr。 將pBS/Ov I FNr質體直線化後，藉活體外轉 錄法合成反意（Antisense) c R N A 探針（Sambrook, et al., 1989)，其使用 T7 RNA 聚合酶（stratagene )。將微量 3H-CTP (NEN — Dupont, Cambridge， MA)用於轉錄反應。使用digoxigenin標記之d U T P ( Boehr i nger-Mannhe i m, Indianapolis, IN)被攝入 c RNA且經由TCA沈澱法及閃爍計數法測定產物量。 C .雜交反應 根據Lawrence, et al. (1985)所載，進行使用反意 RNA探針之定位雜交法，其中有如下的更改處。令經去 石蠟及含水之切片於室溫下預先水合化1 0分鐘，於含有 5 m M MgC 12之經磷酸鹽緩衝之生理食鹽水（ PBS)。令切片中的核酸於65 °C變性10分鐘，於 50% 甲醯胺/2XSSC (1XSSC 是 0 · 15M NaCj?及0.015M檸檬酸鈉）。靜置切片於37°C 一夜，使用含0 · 3微克/毫升經digoxigenin標記之 cRNA探針的雜交混合液（30微升/玻璃片），再洗 ^紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 ' ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 A7 B7 五、發明說明（67 ) 滌30分鐘，於37°C之50甲醯胺/ lxssc中。最 後一次洗滌進行30分鐘，於室溫下，1XSSC及 0 · 1XSSC中。阻斷切片30分鐘，其使用0 · 5%
Triton X — 1 0 0 (Sigma)及 0 · 5 % 脫脂奶粉。 測定雜交訊號，其使用共軛至碱性磷酸酶之經純化的 綿羊抗dioxigenin Fab片段（Boehringer-Mannheim)。 除去未結合的抗體後，加入硝基藍四嗤（11丨1：1：〇1)1116 161：-razolium) / 5—溴一4一氯一 3-¾丨跺基一磷酸鹽受質 (Promega)及雷瓦米若（levamisole (Bector Laborat-ories, Burlingame, CA)，經由比色性受質的生成，進 行訊號測定。該組織於甲基綠（S i gma )中對比染色，脫 水，及包埋。 作爲對照組，部份組織切片以1 〇 〇微克/毫升之胰 R N ase A (Sigma)預處理 3 0 分鐘於 3 7°C。R N ase 在玻璃片上被鈍化，其使用4 0 0單位之R N ase抑制劑 (Promega)。再令玻璃片於含有6 · 4 ///m芡 PBS /MgC又2的250毫升PBS/5mM MgC义2 中洗滌兩次。於另一對照試驗中，用tRNA (Sigma) 代 digoxigenin探針。 觀察三組個別實驗中所有足孕及首三個月胎盤組織之 特異雜交情形，其使用不同的〇vIFNr cRNA探 針濃度及阻斷試劑。 首三個月之胎盤絨毛係由外層的融合細胞滋養層，底 層之滋養葉胞層，及具多種型式間細胞的中心間質區所組 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------；------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 70 - 585911 A7 ___ B7 五、發明說明（68 ) 成’其呈現I FN r之最高轉錄水平於滋養葉胞層細胞中 °較不強但可測得之水平呈現在融合細胞滋養層及間質細 胞。相似的轉錄表現情形亦顯示在足孕組織之胎盤絨毛中 ’但訊號測定水平低。首三個月之絨毛外滋養層呈現訊號 最高量且可被染色，其出現在母體血液交換處。 實例1 0 I F N r之抗病毒活性 於抗病毒分析法中評估純化至均質之Ον I FNr的 相對特異活性。基本上如上述實例2所述，進行抗病毒分 析。抗病毒分析法所得之特異活性係以抗病毒單位/毫克 蛋白質來表示，其使用Mad in-Darby牛腎（MD B K )細 胞或綿羊正常纖維母細胞（Shnf )。同時分析所有試樣以 排除各分析組間的差異。結果示於表3，其爲4組測定之 平均，其中標準誤差低於平均值之1 〇%。 ------；------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ 585911 五 A7 B7 、發明說明（69 ) S_3_ 丄F Ν τ及習知I F N s之抗病毒活性 ---— 特異活性 M D B K S h n f 0 ν I F N r 一 一 2 X 108 3 X 108 r B 〇 I F Ν α ——— 6 X 107 1 X 107 r Β 〇 I F N r 4. 5 X 106 3X 106 Ν I H rHuIFNa 2. 2 X 10s 2. 2 x 108 r H u I F Ν α 2. 9 X 105 4. 3 x 1 05 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) |裝--------訂---- # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I FNr 比 rBo I FNa 或 rBo I FNr 之特異 活性高（表3) 。rHu I FNa之Ν I Η標準製劑有類 似的特異活性，然而r H u I F N r之商品化製劑呈現低 的特異抗病毒活性。使用牛或綿羊細胞皆證實可比較之相 對抗病毒活性。 實例1 1 I F Ν τ之抗逆轉錄病毒活性及細胞毒件作用 本纸張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -72 - 585911 A7 B7_ 五、發明說明（7〇 ) 對於暴露至貓免疫不全逆轉錄病毒之貓週邊血液淋巴 細胞，測試高度純化之Ον I FNr的抗逆轉錄病毒及細 胞毒性作用。此豆狀病毒（lent i virus)產生貓的慢性類 A I DS的症狀，是研究人類A I DS的模型（Pederson ，etal., 1 987 )。周邊血液淋巴細胞內病毒的複製情形 ，係根據一段時間內培養上清液中的逆轉錄酶活性予以檢 視。這些方法所得數據示於表4。 ------：------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 本紙張尸、度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -73 - 585911 A7 B7 五、發明說明（71 ) 表_4_ 0 v I F Ν τ對於F I V複製之作用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I F N r濃度 (微毫克/毫升） RT (活性） 試驗1 取樣曰 第2曰 第5日 第8日 第12日 第15日 0.0 93,908 363,042 289,874 171,185 125,400 0.62 77,243 179,842 172,100 218,281 73,039 1.25 94,587 101,873 122,216 71,916 50,038 2.50 63,676 72,320 140,783 75,001 36,105 5.00 69,348 82,928 90,737 49,546 36,299 試驗2 取樣日 第2曰 第5曰 第8曰 第13曰 第17曰 0.0 210,569 305,048 279,556 500,634 611,542 2.5 121,082 106,815 108,882 201,676 195,356 5.0 223,975 185,579 108,114 175,196 173,881 10.0 167,425 113,631 125,131 131,649 129,364 20.0 204,879 80,399 59,458 78,277 72,179 40.0 133,768 54,905 31,606 72,580 53,493 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) I 裝--------訂--------- 585911 B7 五、發明說明（72 ) 0 v I F N r的添加，產生快速，劑量決定性增加之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 逆轉錄酶（RT)活性（表4)。濃度如0.62微毫克 /毫升一般低之I F N 7：可抑制病毒複製，而對RT活性 有更大作用之較高濃度（4 0微毫克/毫升）對細胞卻無 毒性作用。此結果顯示當細胞與Ον I FN r —起培養時 ，貓免疫不全病毒之複製與對照組數值比較，顯著地被降 低了。 1 F Ν τ顯然對於有逆轉錄病毒駐留的細胞不具有細 胞毒性。甚至當I FNr以每毫升培養基含40微克的濃 度存在時，此亦爲真確的。 實例1 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I F N r對於經Η I V感染之人類周邊淋巴細胞的作用 亦測試I FNr對於拮抗人類細胞中Η I V感染的活 性。令業經Η I V ( Crow, et al.)感染的人類周邊血液 淋巴細胞，以不同濃度的Ον I FNr處理。檢視周邊血 液淋巴細胞內Η I V之複製情形係根據一段時間內培養上 清液中的逆轉錄酶活性。測定逆轉錄酶活性基本上係根據 Hof f man, et al之方法。這些方法測得的數據示於表5。 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -75 - 585911 A7 B7 五、發明說明（73 ) S_5_ Ον I FNr對於人類周邊血液淋巴細胞中Η I V 複製之作用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制仅 I F N r 濃 度 (毫微克 /毫升） R T活性 第6日 第10日 cpra/m 1 % 降低 cpm/ml % 降低 0 4,214 -- 25,994 -- 10 2,046 51 9,883 62 50 1,794 57 4,962 81 100 1,770 58 3,012 88 500 1,686 60 2,670 90 1000 1,499 64 2,971 89 如表5所示，Ον I FNr之濃度產生顯著的抗病毒 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -76 - 585911 A7 __________ B7 五、發明說明（74 ) 作用。只有1 0微毫克/毫升的濃度，即能造成r T活性 超過5 0%之降低，其僅處理6日。濃度爲5 〇 〇微毫克 /毫升造成處理1 〇日內之RT活性有9 0%降低。 經一範圍之I FN r處理3至1 3日後的周邊血液淋 巴細胞之存活率，係根據錐藍質（tryparl blue)排出情 形而予評估。存活率分析之結果示於表6。 ------^------裝--------訂---------^一^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制拆 本纸張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -77 - 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I F N r 濃度 (毫微克/毫升） 存活細胞/毫升X 1 05 第3日 第6曰 第13曰 0 16. 0 7.5 5. 3 10 13. 0 7. 5 6. 0 50 13. 〇 11.5 9. 0 100 15.0 8. 5 9. 5 500 16.5 12. 0 11.0 1000 21.9 9. 5 8.5 585911 A7 --B7 、發明說明（75 ) S_ 】.F Ν τ—於經_ Η I V感染之人類周邊淋R細 豆存活率的作1 示於表6之數據顯示，無任何細胞毒性作用是由於 FNr之施用所造成的跡象。 本纸張汶度適用中國國家標準（CNS)A4規格(21〇T^7公爱） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -78 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（76 ) 實例1 3 細胞生長之抑制作用 亦測定I F N r對於細胞生長之作用。使用集落抑制 法測定抗細胞生長活性。將低密度的人類羊膜（W I S Η )或MD Β Κ細胞塗覆於培養皿，以形成源自單一細胞之 集落。令細胞以2 0 0或4 0 0個細胞/孔洞之濃度，培 養在24孔洞試盤中，於補充2%胎牛血清（FBS)及 必須與非必須胺基酸的ΗΜΕΜ中。加入不同稀釋度之干 擾素至重複三次的孔洞中，且令試盤培養8小時以使集落 形成。集落係經結晶紫染色後而爲可見的，並計數之。細 胞週期分析係使用含0 · 5% ’耗竭（spent)"培養基之 HMEM進行額外的7天。不經周期化，即使用WI SH 細胞。 爲了檢測I F N 7：活性，令細胞再平置於6孔洞培養 盤，其濃度爲2 · 5xl 05細胞/孔洞，於含10% FBS之HMEM中。加入不同稀釋度之IFNr ，單獨 或與其它肽組合，以達終體積爲1毫升。培養盤於3 7 °C ，5%C02 中培養 12，15，18，24 或 48 小時 。以胰蛋白酶處理細胞，低速離心收集細胞及洗滌之。令 細胞團塊吸漬至乾，且將核染色液加入每一試管，該核染 色液含有5毫克丙旋碘（propidium iodide) ，0 · 3毫 升NP40及0 · 1克檸檬酸鈉，於100毫升蒸餾水中 。試管靜置於室溫中。10分鐘後，每管加入250微升 之RNase(500單位/毫升，於1 · 12%檸檬酸鈉 ^纸張义度適用中國國家標準（CNS)/V丨規格（210 X 297公釐） ’ 一 79 - ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 585911 A7 B7 五、發明說明（77) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中），再靜置20分鐘。經過44微米篩孔過濾細胞核， 於FACStar (Becton Dickinson, Moutain View, CA)上 分析，其使用DNA Star 2 · 0軟體。 細胞生長法中利用牛上皮細胞株，MDBK，及人類 羊膜細胞株，WI SH，之集落形成，可知Ον I FNr 抑制集落的大小及數目。綿羊Ο v I F N r比人類 I F N α對人類細胞株有效；因此，其在物種間活性十分 強。其活性係由劑量決定，增殖之抑制情形可見於低至1 單位/毫升之濃度。高達50，000單位/毫升之濃度 (抗病毒活性單位/毫升）會終止增殖，然細胞存活率不 受損。 細胞週期分析係藉由測定經丙錠碘染色之W I S Η細 胞之流動式細胞計數器，結果顯示Ον I FNr處理後 4 8小時，於G2/M期有細胞之增加比例。故I FN r 顯然可抑制細胞發展至S期。綿羊IFNr抗增殖作用可 見於培養開始後1 2小時之早，且維持6日。 上述結果證明I F N r具有抗增殖作用以及低細胞毒 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 性。 實例1 4 I FNr之其它抗增殖作用 研究Ον I FNr對於大白鼠細胞株及牛細胞株之抗 增殖作用。3H -胸腺嘧啶之攝入速率被用來評估細胞增 殖的速率。 一 80 - 本紙張Κ度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585911 A7 B7 五、發明說明（78 ) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 將大白鼠（MtBr7 ec5)或牛腎（MDBK) 細胞種於不含酚紅之DME - F 1 2培養基中，此培養基 另添加3 %經葡聚糖塗覆之煤處理的控制處理血清替代品 2 (CPSR 2，Sigma)，及經葡聚糖塗覆之煤處理 的胎牛血清（FBS)。接觸約15 — 18小時後，以不 含血清之DME-F12培養基洗滌細胞一次。該培養基 置換爲不含酚紅的DME - F 1 2培養基，其另添加3% 經處理之CPSR2 ，1%經處理之FBS ( 、3/1" 培養基）或，置換爲含不同抗病毒活性單位之 0 v I F N r的3 / 1培養基（實例2 )，該單位之測定 係如干擾素對水疱性口炎病毒之攻毒法測定者。 含有類似稀釋度之緩衝液（未稀釋之培養基=1 〇 m M Tris，330mM NaCj?，〔TS〕）的 培養基用於對照組，其中Ον I FN r溶於該緩衝液中。 於處理後約4 8小時，令細胞脈衝標記3 Η —胸腺嘧 啶歷2小時，藉閃爍記數器測定可被三氯乙酸（T C A ) 沈澱之被攝入的記數物。每組處理包括三次重複。
經濟部智慧財產局員工消費合作社印Tfe'JK 0 v I F N r處理之平均值與含有可比較稀釋度之載劑 T S緩衝液的試樣比較。這些試驗的結果示於表7。 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2.10 X 297公釐） _ 81 - 585911 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（79 ) m__7_ 3 Η -胸腺嘧啶之攝入情形 處理 3 H -胸嘧啶攝入情形 之降低百分比 試驗 l:MtBr7 . c 5 (大白鼠） 3/1 — 1 〇3 u Ον I F N r /7 m 1 0( + 12) 1:5 0 0 0 T S — 1 〇4 u 0 v I F N r / m 1 2 4 1:5 0 0 T S — 105 u 0 v I F N r / m 1 8 7 ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 82 - 585911 A7 B7 五、發明說明（) 試驗2 : M D B K 3/1 — 103 u Ον I F N r / m 1 7 4 1:5 0 0 0 T S — 1 〇4 u 0 ν I F N r / m 1 8 3 1:5 0 0 T S — 1 〇5 u 0 ν I F N r / m 1 8 3 ------------•裳--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 由表7可知，Ον I FNr每一種測試的細胞株顯著 地降低細胞增殖的速率（根據胸嘧啶攝入情形）。 實例1 5 I F Ν τ對於人類腫瘤細胞株之抗增殖作用 評估Ο ν I F N r對人類腫瘤細胞株之抗增殖活性， 其係根據測定3 Η —胸腺嘧啶攝入經0 ν I F N r處理之 細胞的速率。 一 83 - 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 585911 A7 B7 五、發明說明（si ) 爲了試驗生長於懸浮液的腫瘤細胞株，將1毫升細胞 靜置於24孔洞之培養盤中，濃度爲2·5—5X105 細胞/孔洞。三次重複的孔洞接受適合培養基，100 ’ 1 ，000或10，000單位/毫升之OvIFNr或 相等抗病毒濃度之rHu I FNa2A (Lee Biomolecu-1 ar )。培養4 8小時後，計算細胞器且根據錐藍排出情 形評估存活率。 將1毫升附著性腫瘤細胞株置於6孔洞培養盤，其濃 度爲2 · 5X105細胞/孔洞。其接受如上所述之干擾 素處理，但於計數前，以胰蛋白酶處理。 藉誤差分析及接著Scheffe’s F -測試，評估處理組 之間的有意義差異。藉使用丙錠碘之流動式細胞計數器進 行細胞週期之分析。 A .乳腺癌細朐 得自對數生長期培養物之人類MC F 7乳腺癌細胞種 入無酚紅之DME — F 1 2培養基中，其中添加有經3% 葡聚糖塗覆之煤處理的C P S R及經5 %葡聚糖塗覆之 FBS。接觸約1 5 - 1 8小時後，以不含血清之DME - F 1 2培養基洗滌細胞一次。令培養基置換爲不含酌紅 之DME — F 1 2培養基，其添加有3%經處理之 CPSR2，1%經處理之FBS ( 、3/1"培養基） 或添加抗病毒活性單位指定數目之Ον I FNr的3/i 培養基，該單位係如測定干擾素之水疱性口炎病毒攻毒法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------\------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ~ 84 - 585911 A7 _B7 五、發明說明（82 ) 所測定者。含有類似之緩衝液稀釋度被用來作對照（未稀 釋緩衝液=10mM Tris，30mM N a C ^ [ T S〕）。於處理後約4 8小時，以3 Η —胸腺嘧啶脈衝 標記細胞歷2小時。 藉閃爍記數法測定三氯乙酸（T C A )沈澱之經攝入 的記數。每處理處包括3次重複。令Ον I FNr之平均 值與含有可比較稀釋度之載劑T S緩衝液的試樣比較。這 些分析結果示於表8。 ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -85 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（83 ) 表 8 3 Η —胸腺嘧啶之攝入情形 處 理 3 H -胸腺嘧啶攝入情 形之降低百分比 人類M G F 7 3/1 — 103 u Ον I F N r / m 1 3 5 1:5 0 0 0 T S — 104 u 0 v I F N r / m 1 5 3 1:5 0 0 T S — 105 u 0 v I F N r / m 1 7 0 由表2所示結果而知，Ον I FNr實質上可降低 3H -胸腺嘧啶於人類癌細胞株內之攝入速率。此證明 〇v I FNr於抑制腫瘤細胞增殖的效力，特別是乳癌細 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 86 - ------：------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585911 A7 B7 五、發明說明（84 ) 胞增殖。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B ·人類前骨髓細胞白血病 Ον I FNr及I FNa之抗增殖作用的比較，係利 用HL — 6 0 (人類白血病）細胞進行（Foa, et al·;
Todd, etal.)，此基本上與上述用於MDBK細胞者相 似。ο I FNr與rHu I FNa皆抑制HL - 60細胞 增殖。三組重複試驗任一者之結果以生長降低百分比之平 均值土 SD表示於圖4。圖4表示，Ον I FNz及 I FNa皆能夠顯著地降低HL — 60細胞之生長。每一 化合物之生長降低情形超過每一測試濃度之6 0 %。於 1 0，000單位/毫升時，I FNa之毒性造成低於 25%之細胞依然存活。相反地，當〇vIFNr使用 1〇，〇〇〇單位/毫升時，近100%細胞依然存活。 圖5所示數據證明rHuIFNa有細胞毒性。圖中 ，三組重複試驗任一者之結果以存活百分比平均值± S D 表示。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制^ C·人類皮膚T細胞淋巴瘤 當以I FNr處理皮膚T細胞淋巴瘤時，HUT 78，反應類似HL — 60(圖9) «OvIFNr與 rHuIFNa皆降低HUT細胞之生長，但 1 0，000單位/毫升之rHu I FNa減少細胞數低 於原先置放者（5X105 )。此顯示細胞存活率降低至 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -87 - 585911 A7 B7 五、發明說明（85 ) 約 6 0 % 〇 細胞週期分析（藉細胞流動式細胞計數器進行）顯示 以兩種干擾素處理4 8小時之細胞週期中G 2/M期的細 胞有被增加比例（表10)。表10中，三組重複試驗之 任一者的結果以細胞週期之任一期的細胞百分比來表示。 分析每一試樣處理10，0 0 0單位者。 此結果似乎是由於細胞週期中細胞的較慢進展。以 1 0，000單位/毫升rHu I FNa處理之試樣中， 出現高百分比之具低進展及由死細胞鑑定之高側散佈的現 象。此與增殖試驗所得數據一致，其中只有〇IFNr抑 制H U T 7 8增殖且無毒性。 ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)/U規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 585911 A7 B7 五、發明說明（86 ) 表10· HUT 78細胞週期之分析 處理 G0/G1 S G2/M 培養基 44.43 49.94 5. 61 100 oIFN τ 44. 35 47. 45 8. 20 100 rHuIFNa 40. 01 57. 53 2. 45 1, 0 0 0 oIFN r 41. 29 50. 50 8. 21 1, 0 0 0 rHuIFN a 41.73 44.91 13.36 1 0, 0 0 0 oIFN r 42.79 42.61 14.60 1 0, 0 0 0 rHuIFN a 18.01 71. 31 10. 67 (細胞死亡） D ·人類T細胞淋巴瘤 T細胞淋巴瘤細胞株H9對於IFNs之抗增殖作用 的敏感度僅輕微略低於上述腫瘤細胞株。三組重複試驗任 一者之結果以圖1 0之生長降低百分之平均值土 S D來表 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A:1規格（210 X 297公釐） ------：------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -89 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 B7 五、發明說明（87 ) 示。rHu I FNa對H9細胞無毒性時，無法顯著抑制 任何測定濃度之細胞分裂。相反地，可見ο I F N r抑制 H9之生長達約60% (圖10)。因此，只有 ο I FNr是T細胞淋巴瘤之有效生長抑制劑。 上述結果證明IFNr之抗增殖作用以及其低細胞毒 性。 實例1 6 利用0 v I F Ν τ之初步活體內治療 將三組C 5 7 Β 1 / 6小白鼠，每組4隻，經尾靜脈 提供 2 · 5Χ104 的 B16-F10 細胞：Β16 — F 1 〇是周期化之小白鼠可移植之腫瘤，其係因爲其有肺 轉移之局度跡象而被選用（Poste, et al., 1981)。干 擾素治療在導入腫瘤細胞3日後開始。每一隻小白鼠接受 100微升之PBS，含1X105單位之OvIFNr 的PBS，或含1X105單位之重組鼠類I FNa ( Mu I FNa)，每日經靜脈內注射，連續三曰。 在第2 1日犧牲小白鼠且將肺保存在1 0%經緩衝的 福馬林中。在對照組小白鼠（P B S )，經0 v I F N z· 處理之小白鼠，及經M u I F Ν α處理之小白鼠之間比較 肺轉移之頻率。這些活體內施用之結果證實，〇 I FNr 顯著地Β 1 6 - F 1 〇肺部腫瘤。這些結果支持I FN r 作爲活體內有效抗腫瘤劑的用途。 本紙張瓦度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -90 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印利^ A7 _B7 ____ 五、發明說明（88 ) 實例1 7 IFNr肽片段之競爭性結合 A ·某於I FNr之肽類阻斷I FNr及I FN — α抗病 毒活件的能力 合成對應至完整I FNr序列（圖6)之重疊的合成 肽。計算平均水合值（hydropathicity value)，係藉由 將每一個胺基酸之水合值總值除以每一序列中胺基酸之總 數。水合值係根據Kyte, et al ( 1 982 )計算。 這些肽有幾乎相同的分子量，但整體親水性則有輕微 差異。除了此項差異之外，所有肽皆爲抗原，其係由具有 大於1 : 3，000 EL I SA評估之力價的兔子抗血 清的生成而被證實（Harlow, et al)。 肽乃用於抑制Ον I FNr及rBo I FNa之抗病 毒活性（實例2)。此分析之結果示於圖12 : ImM之 N -及C 一端肽皆能有效阻斷Ον I FNr之抗病毒活性 性，其使用MDBK細胞。代表胺基酸6 2 — 9 2之第三 肽亦降低I F N r之抗病毒活性（7 0 %抑制作用）。肽 0 v I F N 7： ( 1 1 9 — 1 5 0 )顯示最低之抑制活性。 OvIFNr (36-64)及（90-122)肽不具 抑制活性。 0 v I F N r抗病毒活性之肽抑制作用亦如下述所示 檢測。令單層Mad in-Darby牛腎細胞與4 0單位/毫升之 Ον I FNr培養，有或無不同濃度之〇v I FNr肽（ 參見圖1 3 )。圖1 3中之結果以對照組抗病毒活性之百 才、紙張汶度適用中國國家標準（CNS)/V丨規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 91 一 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（89 ) 分比表示：亦即，不含有任何競爭肽。數據表示爲6組重 複試驗之平均值。此數據證明〇vIFNr (1—37) ，（62 - 92) ，（119-150)，及（139 - 1 7 2 )之抑制作用與1 0_3M及3 X 1 0—3M之 〇¥1?1^7(34 — 64)及（9〇-122)有顯著 不同。於 10—3M 時，OvIFNr (139 — 172) 與所有其它肽有顯著不同。顯著性之評估係根據誤差之分 析及接著使用Scheffe’s F測試，p<〇 · 05。因此， 0 v I F N r (1 一 37) ，( 6 2 - 9 2 ) ，(119 —150)，及（139 -172)可代表 IFNr 之受 體結合區，特別是（139 — 172)。 〇v I FNr肽對於抑制牛I FNa (Bo I FNa )抗病毒活性的能力乃根據如下所示測定。令單層Mad i η-Darby牛腎細胞與4 0單位/毫升之牛I FNa培養，有 或無不同濃度之Ον I FNr肽。結果示於圖1 4且以不 含Ον I FNr肽之對照組抗病毒活性的百分比表示。所 示數據爲4組重複試驗之平均值。此結果顯示 OvIFNr (62-92) ，（119 — 150)，及 (1 3 9 — 1 7 2)所造成的抑制作用與1 0 _3 Μ之 OvIFNr (1-37) ， （34 — 64)及（90 — 1 2 2)有顯著差異。於3xl 0-3M時，Ον I FNr (139 — 172)與 OvIFNr (1-37)，（ 34 - 64)及（90 — 122)有顯著不同。顯著性之 評估係根據誤差分析及後續之Scheffe’s F測試， 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 92 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 585911 A7 B7 五、發明說明（9〇 ) Ρ<0·05。因此，〇vIFNr(62 — 92)，（ 119 — 150) ’及（139 - 172)可代表 I FN r及牛I FNa之共同受體結合區，特別是（ 1 3 9 — 1 7 2 )。 亦測定Ο v I F N r肽對人類I F Ν α抗病毒活性的 肽抑制作用。令單層的Mad in Darby牛腎細胞與4 0單位 /毫升人類I FNa培養，有或無不同濃度的 Ον I FNr肽。結果以不含Ον I FNr肽之對照組抗 病毒活性之百分比表示。數據示於圖1 5，其爲3組重複 試驗之平均值。於10—3M時，OvIFNr (139 — 1 7 2 )與所有其它肽有顯著不同。顯著性之評估係根據 誤差分析及後續之Scheffe’s F測試，p<〇 · 〇 5。因 此，OvIFNr (139 — 172)可代表1?1^7：及 不同IFNa (s)之共同受體結合區。 上述Ον I FNr肽顯示對於I FNr之抗病毒活性 無作用。牛I F N r抗病毒活性之肽抑制作用評估如下。 令單層Madin Darby牛腎細胞與4 0單位/毫升牛I F N 一 7培養，有或無不同濃度之Ον I FNr肽。結果以不 含Ον I FNr肽之對照組抗病毒活性之百分比表示。數 據示於圖16，其爲3組重複試驗之平均。當根據誤差分 析及後續p<0 · 05之Schef fe’s F測試之評估可知， 肽間無顯著差異。 2個合成肽OvIFNz* (1 — 37)及 OvIFNr (139-172)亦能阻斷OvIFNr 本纸張汶度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------•裝--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -93 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____B7 五、發明說明（91 ) 之抗〜F I V及抗一 Η I V之活性。檢視歷經1 4天期之 經FIV感染之FET-1細胞（lxl〇e/毫升）及 經Hiv感染之HPBL (1χΐ〇β/毫升）中的逆轉 錄酶（R Τ )活性（實例1 2及1 3 )。對照組培養物不 接受Ον I FNr。〇ν I FNr之濃度用1 〇〇微毫克 /毫升，肽濃度用2 〇 〇 。代表性試驗所得數據以
c pm/毫升培養上清液表示且圖1 1 A，代表經F I V 感染之細胞，圖1 1 B ’代表經Η I V感染之細胞。 〇νIFNr之Ν—及C一端皆顯示涉及其抗一逆轉錄病 毒之活性。雖然兩種肽皆阻斷F I V之R T活性，但只有 C端肽，OvIFNr (139-172)，是作用在貓 細胞株，F c 9，的水疱性口炎病毒活性之有效抑制劑。 故I型I FNs之C 一端區可結合至I型I FN受體上之 共同位置，然C -端區可涉入獨特功能的激發。 B .抗一 flic之血清 亦測定抗肽之抗血清抑制〇 v I F N r抗病毒活性的 能力。0 v I F N r抗病毒活性之抗肽之抗血清的抑制作 用評估如下。令單層MD B K細胞與2 0單位/毫升之 Ον I FNr培養，其中含有1 : 30稀釋之免疫前血清 或拮抗如上所述任一 Ον I FNt:肽之抗血清。圖17中 ，重複試驗所得數據，係以相對於適合之免疫前血清之抗 肽抗血清所產生之0 v I F N r抗病毒活性之抑制百分比 的平均值±標準誤差表示。顯著差異性係根據誤差分析及 本紙張汶度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -94 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___Β7 五、發明說明（92 ) 後續P<〇 · 0 5之Scheffe，s F測試予以評估。與抗病 毒活性之肽抑制作用一致，含有對0 v I F N r ( 1 - 3 7) » 0 v I F N r (62 - 92)，及 OvIFNr (139—172)免疫反應之抗體的血清，亦爲 〇v I FNr抗病毒活性之最有效的抑制劑，其含有直接 拮抗N -端及C -端肽之抗體者最爲有效。 相同血清亦用於測試此抗體對於I F N 7：結合至其受 體的作用。 I FNr結合分析法進行如下。令5微克I FNr碘 化2分鐘，其使用含500#Ci之Na125I (15 m C i /微克；Amersham Corporation, Arlington Hei -ghts, IL)之2 5微升的0 · 5M磷酸鉀緩衝液，pH 7.4,以及 10 微升之氯氨一 T( chloramine— T )( 5毫克/毫升）（Griggs, etal., 1992)。經碘化蛋白 質之特異活性爲1 3 7//C i /微克。爲了進行結合分析 ，令單層MD B K細胞以副甲醛固定並以5%脫脂奶粉阻 斷。令細胞與含有1251 - I FNr之磷酸鹽緩衝之生理 食鹽水，其中含1%B SA，共置於4°C歷2小時，有或 無1:30稀釋度之血清，其含有拮抗IFNr肽之抗體 ，或爲合適之免疫前抗體。評估特異結合，係藉由與 1 00倍莫耳數之未標記I FNr的共置培養。3 6%之 特異結合係根據與5 0 0 nM未標記之I FN r的競爭情 形予以測定。舉例而言，總結合計數爲6 8 5 0 ± 1 3 3 ，：L00倍莫耳量之OvIFNr產生4398 ±158 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)/V丨規格（210 X 297公釐1 一 95 - ------^------裝--------訂—I------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585911 A7 B7 五、發明說明（93 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 計數每分鐘。培養液，清洗單層細胞三次，以1 %硫酸十 二酯鈉溶解並計算放射活性。三組重複試驗所得數據示於 圖1 8，其爲相對於合適免疫前血清之抗肽抗血清所產生 之0 v I F N r特異結合情形之抑制百分比的平均值土標 準誤差。顯著差異性係根據誤差分析及後續之Scheffe’s F測試予以評估。 相同血清（含有對OvIFNr(l — 37)， OvIFNr (62-92)，及 OvIFNr(139 —1 72)免疫反應之抗體）最1251 - I FNr結合至 MD B K細胞上其受體之最有效抑制劑。缺乏與其它衍自 I FNr肽免疫反應之血清的作用，與抗Ον I FNr之 力價無關，因爲每一血清具相對於三組抑制血清之桔抗其 預期肽之相等力價或更高力價：常使用E L I SA對每一 血清評估拮抗完整Ον I FN r分子之血清反應性時，得 到類似結果。 這些肽雖然似乎結合至干擾素受體，其本身並不引起 及參與細胞內之類干擾素作用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π C ·抗增殖活件 I F N r之抗增殖活性的功能重要位置亦予測定，其 使用合成肽（表1 1 )。如上所述測定細胞之增殖，其使 用MDBK細胞。試驗1及2中培養5X105細胞/孔 洞之MDBK細胞及試驗3中培養1 Ox 1 05細胞/孔 洞，並處理僅培養基，濃度爲3 0 0單位/毫升之 本纸張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -96 - 585911 A7 _B7 五、發明說明（94 ) IFNr及ImM之肽類，歷48小時。計算三組重複試 驗中任一者之重複孔洞。爲了統計分析，根據只處理培養 基者正規化數據且根據誤差分析及後續最小顯著差異性多 重比較測試（p > 0 · 0 5 )予以評估。 ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張瓦度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 97 - 585911 A7 B7 五、發明說明（95 表11 I F Ν τ抗增殖活性;^太抑制情形 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 處理 試驗1 試驗2 試驗3 細胞計數 存活率 細胞計數 存活率 細胞計數 存活率 只有培養基 9.8X105 99% 13. ΟΧΙΟ5 96% 27.3Χ105 97% IFNr 5.0X105 98% 5. 6ΧΙΟ5 97% 8.3Χ105 97% IFNr+IFNr(l-37) 6.3X105 100% 10.6Χ105 98% 13.4Χ105 100% IFNr + IFNr (34-64) 5.3X105 96% 6.9Χ105 95% 16.0Χ105 98% IFNr + IFNr (62-92) 6.5X105 97% 9.2Χ105 93% 8.9Χ105 96% IFNr + IFNr (90-122) 5. 9ΧΙΟ5 100% 11.ΟΧΙΟ5 97% 19.6Χ105 98% IFNr+IFNT (119-150) 8.4Χ105 100% 13.2Χ105 96% 31.8Χ105 90% IFNr+IFNT (139-172) 5. IX105 100% 12.7Χ105 98% 18.9Χ105 98% ------^--------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)/V丨規格（210 x 297公釐） -98 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（96 ) 當MD B K細胞之增殖情形評估歷經2日期，細胞數 大致增加2倍且有大於9 5%之存活率。添加3 0 0單位 /毫升之Ον I FNi:完全排除細胞增殖，但不減少細胞 存活率。綿羊IFNr (119 — 150)是IFNr抗 增殖活性之最有效抑制劑。 抗IFNr (119-150)之抗血清可抑制 Ον I FNr結合至受體，其亦顯示Ον I FNr之抗增 殖作用。數種其它肽，尤其是IFNr (139—172 )，亦顯示〇 v I F N r之抗增殖作用，但作用較小。 實例1 8 I F Ν τ之細胞及抗病毒作用的其它分析 A·HIV之抗病毒作用 評估I FNr拮抗Η I V之抗病毒作用，係藉由人類 PBMC細胞以不同量之重組綿羊I FNr ( r — Ον I FNr )或重組人類I FNa2處理，於使用 Η I V感染之際。試驗過程中皆有藥物存在。於第7曰及 第1 4日，測定Ρ 2 4之產製（利用E L I S A ( Wang， etal., 1988, 1989)且將其比較無藥之對照組。分析結 果示於表1 2。 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ------^--------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -99 - 585911 A7 B7 五、發明說明（97 ) 1 2 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 藥物單位量/孔洞 第7日之 抑制百分比 第4日之 抑制百分比 IFNa IFNr 10 26 58%, 48% 48%, 45% 91%, 91% 88%, 59% 100 260 68%, 74% 58%, 51% 94%, 91% 82%, 70% 1，000 2, 600 89%, 86% 65%, 68% 97%, 93% 87%, 79% 10,000 90%, 86% 99%, 99¾ 26,000 77%, 85¾ 77%, 96% 260,000 85%, 84% 96%, 86% 2,600,000 74%, 77% 89%, 88% 這些試驗之數據支持一結論，亦即，於相當低濃度時 ，IFNa及IFNr可有效降低HIV於人類淋巴細胞 內之增殖--於相近濃度。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) |裝--------訂---- # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSUV1規格（210 X 297公釐） 一 100 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 --------- 五、發明說明（98 ) B · IP B M C > s之活體外細胞毒件試驗 將人類PBMC > s以5 X 1 05細胞/毫升濃度種 於第0時，以3微克/毫升ΡΗΑ刺激細胞。處理細 胞’其使用2 0 0微升/孔洞之重組人類I FNa 2Α ( 濃度爲 10，100，1，〇〇〇 及 10，000 單位 / 毫升）及IFNr (濃度爲2 · 6，26，260， 2 ’6〇〇，26，000，260，000，及 2 ’ 600，000單位/毫升）（每一濃度有4組重複 ’其使用96孔洞平底試盤）。對照組培養物不接受干擾 素。接種4日後，令細胞脈衝標記9小時之3H -胸腺嘧 11定’ 1 V C i /孔洞。回收細胞且測定經標記胸腺嘧啶攝 入DNA之情形（圖8)。 測定任何濃度I F N r之胸腺嘧啶攝入情形，未見任 何細胞毒性。然而，rHu I FNa2在10，〇〇〇單 位/毫升濃度時，對細胞有毒性。 C .肝細胞內B型肝炎病毒D NA複製之抑制 所用細胞株，HepG2 — T14，爲人類細胞，其 係衍自經B型肝炎病毒（HBV)轉感之肝細胞。此細胞 株半穩定地產製HBV病毒：一段時間後，細胞株產製 HB V細胞內DNA及分泌病毒皆減少。爲了使HB V DNA及病毒之生長最大化，令細胞預處理d EA ZA — C (5 —氮雜胞嘧啶核苷；Miyoshi, et al.)以誘發病 毒的生成。處理持續2 - 3日且誘發量是兩個比較因子之 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -101 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（99 ) -〇 再令細胞以I FNa及I FNr處理，濃度爲0， 5，000，10，000，20，000 及 40，000單位/毫升。 所有不同量之IFNa或IFNr皆減少DNA產製 ，其根據對無藥對照組比較之2個因子之一。 D .肝細胞內肝特定之訊號D N A產製的抑制 測定肝細胞株H e p G 2 — T 1 4 (如上所述）中 IFNa及IFNr對於肝特異之mRNA產製的作用。 令細胞與濃度爲每毫升0，5，000，1 0，000， 20，000 及 40，000 單位之 IFNa 及 IFNr 共置培養。利用雜交分析法測定轉譯肝細胞特定蛋白質 Αρο Ε 及 Αρο Α1 的訊號 RNAs (Sambrook，et al·; Maniatis, etal.)，其使用對此兩種mRNA特 異的探針（Shoulders, et al.,及 Wallis，et al·)。 對於使用高達40，000單位之I FNa或 IFNr之Αρο E或Αρο Α1的mRNA產製， 未見mRNA製備有減少。此結果顯示，前述試驗中病毒 DNA複製之減少不是由於IFNs對於細胞家管活性上 之作用；反倒是，此減少情形似乎是由於病毒於宿主細胞 內複製之特異抑制作用。 實例1 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------：------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -102 - 585911 A7 _ —_B7_—一 五、發明說明（100) 千擾素一 τ融合蛋ή質之單離 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 共軛有抗珠粒半乳糖酶之Sepharose 4 Β珠粒，購自 Promega廠。裝填此珠粒至2毫升管柱中且充分洗滌，利 用含〇 · 0 2%疊氮化鈉之經磷酸鹽緩衝的生理食鹽水及 10毫升TX緩衝液（10mM Tr i s緩衝液，pH 7·4，1% 去蛋白質素（aprotinin)。 將I FNr編碼序列（例如，圖7)殖入Ag t 1 1 之多連接子位置。將I FNr編碼序列置於Ag t 1 1中 具有N -端A -半乳糖酶編碼序列之同一架構內。感染有 gtll/lFNr之溶原素（lysogen)用於接種 5 0 0毫升之NZYDT肉汁。令培養物培養在3 2°C， 至〇 · D爲約〇 · 2至0 · 4，再快速置於43°C之43 °C水浴中1 5分鐘，以誘生g t 1 1肽之合成，且再於 3 7 °C培養1小時。藉離心使細胞呈團塊，懸浮於1 0毫 升溶解緩衝液（10mM Tris，pH7.4)，其 含有2% ’TRITON Χ-10(Τ及使用前才加入的1%去蛋白 質素。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 令懸浮細胞於液態氮中冷凍，再將其解凍，造成實質 上完全之細胞溶解。令溶解物以D N ase I處理以水解細 菌及噬菌體DNA，此乃藉溶解物中逐漸喪失之黏度爲憑 。藉離心除去非可溶之物質。 將澄明化之溶解物質饋至Sepharose管柱上，封閉管 柱末端，且將管柱置於旋轉式搖盪器，於室溫中2小時且 於4 °C，16小時，裝妥管柱後，以10毫升TX緩衝液 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -103 - 585911 經濟部智慈財產局員工消費合作社印制衣 A7 ________B7 五、發明說明（101) 洗滌之。溶離經融合的蛋白質係使用〇 · 1 Μ碳酸鹽/重 碳酸鹽緩衝液，pHl 〇。傳統上，令1 4毫升之溶離緩 衝液通過管柱，融合蛋白質在首4 - 6毫升之溶離物中被 溶離出來。 令含有溶離蛋白質之溶離物於>CENTRICON-30〃管（ Amicon，Danvers, Mass·)中濃縮。令最終蛋白質濃縮物 懸浮在，舉例而言，400微升之PBS緩衝液中。蛋白 質純度藉SDS-PAGE分析。 爲了製備多株抗體，將經純化之融合蛋白質於皮下注 射至兔子中。於第0及2 1日注射近1毫克之融合蛋白質 ’且兔子血清傳統上在第6及8週時收集。 實例2 0 抗一 IFNt:抗體之製備 A ·穀胱甘肽一 S —轉移酶融合蛋白質之表現 令I FNr編碼序列（例如，圖7)殖入pGEX載 體（Boyer, et a 1. ; Frangioni, et a 1. ; Guan, e t a 1. ;Hakes, et al·; Smith, et al·, 1988)。修飾 p G E X載體（Smith, et al.)，利用嵌入與穀胱甘肽 一 S —轉移酶蛋白質（GST — 一 s j 26編碼序列）同 一架構之凝血素切割序列。此載體命名爲PGEX t h r 。：[FNr編碼序列置放在s j 2 6 -凝血素編碼序列之 同一架構（Guan, et al·; Hakes, et al·) 。I F N r 編碼序列嵌入物可被生成，其藉由使用對嵌入物專一的 ^紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------Φ裝--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -104 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制私 A7 ____B7_ 五、發明說明（l〇2) P c R引子之聚合酶連鎖反應。 將I FN r片段接合至直線化的pGEX t h r載體 °將接合混合物轉形至大腸桿菌且篩選出對安比西林有抗 性的菌落。自抗安比西林之菌落單離質體並利用限制酶水 解反應分析，以鑑定含有I FN r嵌入物之純系（載體命 名爲 pGEXthr — IFNr)。 令大腸桿菌XL — I Blue株被pGEXthr-Ϊ F N r轉形且於3 7 °C令其生長一夜。自任意挑取的菌 落製備D N A。傳統上，嵌入之編碼序列的存在以下列方 法確認：（i )限制酶水解輿圖化，（ϋ )使用經標記之 IFNr探針雜交篩選（亦即南方吸漬分析），或（ίϋ). 直接D N A序列分析。 B .融^合蛋白質之部份純化 令pGEX t h r - I FNr生長一夜。將過夜培養 物以含有安比西林之LB培養基稀釋1 : 1 〇，且令其生 長1小時於37 °C。或者，隔夜培養物稀釋1 : 1〇〇且 令其在添加I PTG (異丙基硫- Θ -半乳糖苷）之前生 長至 0D 爲 〇 · 5 — 1 · 〇。加入 I PTG (GIBC0-BRL, Gaithersburg MD)至終濃度爲 〇 · 2 — 〇 · 5mM，以 誘發蛋白質表現，共置反應傳統上持續2 一 5小時，較好 3 · 5小時。
藉離心回收細菌細胞且懸浮在1 / 1 〇 〇培養物體積 之 MTPBS (150mM NaCj? * 16mM 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公f ) ------^--------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -105 - 585911 A7 _________ B7_____ 五、發明說明（l〇3) N a 2 Η P 〇 4 » 4 m Μ N a Η 2 P Ο 4 )。以溶解酶溶解 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞，超音波震盪或法氏壓擠，並藉離心將溶解物之細胞 碎肩清除。 分析一等份之懸浮物，其得自由含有pGEX t h r 一 I FNr之細胞組成之經I PTG誘發的培養物，及一 等份懸浮物，其得自只含p GEX t h r -載體之經 1pTG誘發的培養物，其使用如前所述之SDS-聚丙 烯醯胺凝膠電泳及後續之西方吸漬來完成。 若有必要，可使用超過濾法濃縮萃取物，舉例而言， 如使用’CENTRICON 10"過濾器。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 或者，融合蛋白質可由穀胱甘肽瓊脂糖親和性管柱上 部份純化，如Smith, et a 1.詳載。此方法中，令1 〇 〇 毫升培養物生長一夜。培養物稀釋至1公升且令細胞生長 在3 7°C，再1小時。回收細胞並使用超音波震盪器溶解 細胞。將細胞碎屑團塊化且將澄清之溶解物饋至榖胱甘肽 ’SEPHAROSE"管柱上。以數個管柱體積洗滌管柱。融合 蛋白質與被還原的穀胱甘肽自親和性管柱溶離，並將融合 蛋白質透析。IFNr可自混合型蛋白質釋出，藉凝血原 之處理。混合型蛋白質之s j 26及I FNr片段可再利 用分子大小分級分離法，於管柱或於凝膠上分開。 或者，混合型蛋白質之IFNr部份利用凝血素之處 理自管柱釋出（Guan, et al·; Hakes, et al·)。 C ·洁杭融合蛋白質之抗體 本紙張泛度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇><297公釐) -106 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（104) 將經純化之S j 26/1 FNz·融合蛋白質於Freunds 佐劑中 ，皮下注射 至兔子 。於第 〇 日及第 2 1 日注射 約1毫克之融合蛋白質，傳統上在第6及8週收集兔子血 清。第二隻兔子以得自對照組細菌溶解物之經純化的 Sj26蛋白質而予類似免疫。 製備得自下列細菌培養物之微量溶解物：（1)被含 有I FNr嵌入物之pGEXt hr及pGEXthr感 染之KM3 9 2細胞；及（2)被含有I FNr嵌入物之 Ag t 1 1感染之細胞。藉SDS — PAGE分級分離微 量溶解物及商品化之/3 -半乳糖酶，且將帶（bands )轉 移至硝化纖維膜以進行西方吸漬（Sambrook, et al.; A-usubel, et a 1. ) 0 歸納預期之結果，得自對照組（Sj 26)兔子之血 清，與每一個S j 26及S j 26融合蛋白質抗原免疫反 應。得自經S j 26/1 FNr融合蛋白質免疫之動物血 清，與所有S j — 26及含有I FNr編碼序列之冷一 g a j?融合蛋白質反應，顯示具有與I FN r之特異免疫 反應。無任一血清是預期可與/3 -半乳糖酶免疫反應者。 將抗一 I FNr抗體純化，其存在於以S j 2 6/ 1 F N r免疫之動物的血清中，純化係使用親和性層析法 (使用被固定之重組製備的I FN r作爲配位體，基本上 如實例12中所述用於抗一 /3 -半乳糖酶抗體者）。 雖然本發明已利用針對特定方法及具體實例之參考資 料予以說明，但不偏離本發明所作之不同修飾及變化將可 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------^9— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 107 - 585911 A7 B7 五、發明說明（w5) 接受。 ------------•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 108 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（106) 序列目錄 (1 )一般資料： (i )申請人：Bazer，Fuller w.
Johnson, Howard Μ.
Pontzer, Carol H. 011, Troy L.
Van Heeke, G i no Imakawa, Kazuhito (ii)發明名稱：干擾素T a u組成物及其用途 (iii )序列總數：2 0 (iv )負責地址： (A ) ADDRESSEE : Law Offices of Peter J.
Deh 1 i nger (B ) STREET: 350 Cambridge Ave., Suite 300 (C ) CITY : Palo Alto (D ) STATE : CA (E ) COUNTRY · USA (F ) ZIP : 943 0 6 (v )電腦可讀型： (A )MEDIUM TYPE · Floppy disk 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------•裝--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -109 - 9 5 8 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五 A7 _____B7_ —---1 ' 發明説明（107) (B )COMPUTER:IBM PC compatible (C )〇PERATING SYSTEM : PC/DOS/MS-DOS (D )S0FTWARE : Patentln Rel ease #1.0,
Version #1.25 (vi )目前申請資料： (A )申請案號： (B )申請曰： (C )分類： (vii )先前申請資料： (A )申請案號：us 0 7/3 1 8, 0 5 0 (B )申請日：〇2_MAR_1989 (vii)先前申請資料： (A )申請案號：us 0 7/847, 74 1 (B )申請日：〇9-MAR_1992 (viii )律師/代理人資料： (A )NAME : Fabian, Gary R. (B )REGISTRATION NUMBER : 33,875 (C )REFERENCE/DOCKET NUMBER : 5 6 0 0 - 0 0 0 1 (ix )電傳資料： 本紙張汶度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----1-----•裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 110 - 585911 A7 B7 五、發明說明（108) (A )TELEPHONE : 4 1 5-324-088 0 (B )TELEFAX : 4 1 5-324- 0 9 6 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2 ) S E Q ID NO :1 之資料·· (i )序列特徵： (A )長度：518個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：雙股 (D )拓撲學：環狀
(ϋ )分子型：DNA (iii )臆測型：無 (iv )反意：無 (vi )最初來源： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A )生物體：綿羊 (B )亞種：家畜 (D )發育階段：囊胚（胚胞） (F )組織型：胚膜 (G )細胞型：單核之胚膜細胞 (vii )立即來源： 本纸張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 111 - 585911 A7 B7 五、發明說明（1〇9) (B )單位：oTP-la (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) (viii )P〇SITION IN GENOME : (C )單位：鹼基對 (ix )特性： (A )名稱/關鍵字：CDS (B)座落： (x )發表資料：
(A)作者：〇tt，Troy L (B )文獻名稱：cloning and Expression in 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Saccharomyces cerevisiae of a Synthetic Gene for the Type I Trophoblast Interferon Ovine Trophoblast Protein -1：Pur i f i cat i on and Antivir-a 1 Activity (C )期刊：j. interfer〇n Res· (D )冊：i j (F )頁：35 7-3 64 (G )日期：1 99 1 (K)SEQ ID NO: 1之相關殘基： 由1至5 1 8 乂心通用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） - 112 - 585911 A7 __B7__五、發明說明（110) (X i )序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 TGC TAC CTG TCG CGA AAA CTG ATG CTG GAC GCT CGA GAA AAT TTA AAA Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 48 1 5 10 15 CTG CTG GAC CGT ATG AAT CGA TTG TCT CCG CAC AGC TGC CTG CAA GAC Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gin Asp 20 25 30 9i CGG AAA GAC TTC GGT CTG CCG CAG GAA ATG GTT GAA GGT GAC CAA CTG Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Asp Gin Leu 35 40 45 144 CAA AAA GAC GAA GCT TTC CCG GTA CTG TAT GAA ATG CTG CAG CAG TCT Gin Lys Asp Gin Ala Phe Pro Val I Leu Tyr Glu Met Leu Gin Gin Ser 50 55 60 192 TTC AAC CTG TTC TAC ACT GAA CAT TCT TCG GCC GCT TGG GAC ACT ACT Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80 240 CTT CTA GAA CAA CTG TGC ACT GGT CTG CAA CAG CAA CTG GAC CAT CTG 288 Leu Leu Glu Gin Leu Cys Thr Gly Leu Gin Gin Gin Leu Asp His Leu 85 90 95 GAC ACT TGC CGT GGC CAG GTT ATG GGT GAA GAA GAC TCT GAA CTG GGT 336 Asp Thr Cys Arg Gly Gin Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly 100 105 110 AAC ATG GAT CCG ATC GTT ACT GTT AAA AAA TAT TTC CAG GGT ATC TAC Asn Met Asp Pro lie Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gin Gly lie Tyr 115 120 125 384 -----I------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GAC TAC CTG CAG GAA AAA GGT TAC TCT GAC TGC GCT TGG GAA ATC GTA Asp Tyr Leu Gin Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu lie Val 130 135 140 CGC GTT GAA ATG ATG CGG GCC CTG ACT GTG TCG ACT ACT CTG CAA AAA Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gin Lys 145 150 155 160 432 480 CGG TTA ACT AAA ATG GGT GGT GAC CTG AAT TCT CCG Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 518 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 113 - 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7__ 五、發明說明（in) (2 )S E Q ID N0:2 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：172個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 ：
Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gin Asp 20 25 30 、
Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Asp Gin Leu 35 40 45
Gin Lye Asp Gin Ala Phe Pro Val Leu Tyr 61u Met Leu Gin Gin Ser 50 55 60
Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80
Leu Leu Glu Gin Leu Cys Thr 61y Leu Gin Gin Gin Leu Asp His Leu 85 90 95
Asp Thr Cys Arg Gly Gin Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Val 100 105 110
Asn Met Asp Pro lie Val Thr Val Lye Lys Tyr Phe Gin Gly lie Tyr 115 120 125
Asp Tyr Leu Gin Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu lie Val 130 135 140 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注音3事項再填寫本頁) -114 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 TGTGACTTGT CTCAAAACCA CGTTTTGGTT GGTA6AAA6A ACTTAAGACT ACTAGACGAA 60 ATGAGACGTC TATCTCCACA CTTCTGTCTA CAAGACAGAA AGGACTTCGC TTTGCCTCAG 120 GAAATGGTTG AAGGTG6CCA ACTACAAGAA GCTCAAGCGA TATCTGTTTT 6CAC6AAAT6 180 TTGCAACAAA GCTTCAACTT GTTCCACACC GAACACTCTT CGGCCGCTTG GGACACCACC 240 TTGTTGGAAC CATGTAGAAC CGGTTTGCAC CAACAATTGG ACAACTTGGA TGCATGTTTG 300 GGTCAAGTTA TGGGTGAAGA AGACTCTGCT CTC6GGA6AA CCGGTCCAAC GCTAGCTTTG 360 AAGAGATACT TCCAAGGTAT CCACGTTTAC TTGAAGGAAA AGGGTTACTC TGACTGTGCT 420 TGGGAAACCG TGCGTCTAGA AATCATGCGT AGCTTCTCTT CTTTGATCAG CTTGCAAGAA 480 AGATTACGTA TGATGGACGG TGACTTGTCG AGCCCA 516 A7 B7__ 五、發明說明（112)
Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gin Lys 145 150 155 160
Arg Leu Thr Lye Met: 61y Gly Asp Leu Aen Ser Pro 165 170 (2 ) S E Q ID N0:3 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：516個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID NO: 3: 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 115 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（113) (2 ) S E Q ID NO :4 之資料： (i )序列特徵： (A)長度：172個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 (xi)序列說明 S E Q ID N 0 ： 4 ：
Cys Asp Leu Ser Gin Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg 1 5 10 15
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro His Phe Cys Leu Gin Asp 20 25 30
Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Gly Gin Leu 35 40 45
Gin Glu Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met Leu Gin Gin Ser 50 55 60
Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80
Leu Leu Glu Pro Cys Arg Thr Gly Leu His Gin Gin Leu Asp Aen Leu 85 90 95
Asp Ala Cys Leu Gly Gin Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly 100 105 110
Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lye Arg Tyr Phe Gin Gly lie His 115 120 125 紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ------：---------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585911 A7 B7___ 五、發明說明（114) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val 130 135 140
Arg Leu Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu lie Ser Leu Gin Glu 145 150 155 160
Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro 165 170 (2 )S E Q ID N0:5 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：37個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 5 ： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣
Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 5 10 15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gin Asp 2〇 25 30
Arg Lys Asp Phe Gly 35 (2 ) S E Q ID N0:6 之資料： (i )序列特徵： 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 一 -117 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（115) (A )長度：31個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 6:
Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Asp Gin Leu Gin 5 10 15
Lys Asp Gin Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gin Gin Ser 20 25 30 (2 ) s E Q ID N0:7 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：31個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 7: GXn Gin Ser Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp 5 10 15
Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gin Leu Cys Thr Gly Leu Gin Gin Gin 20 25 30 (2 ) s E Q ID NO :8 之資料： (i )序列特徵： 本紙張匕度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------^^裝--------訂---------^9— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 118 - 585911 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 D N0: A7 B7 五、發明說明（116) (A )長度：33個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 8 ：
Gin Gin Gin Leu Asp His Leu Asp Thr Cys Arg Gly Gin Val Met Gly 5 10 15
Glu 61u Asp Ser 61u Leu Gly Asn Met Asp Pro lie Val Thr Val Lys 20 25 30
Lys (2 ) S E Q ID N0:9 之資料： (i )序列特徵·_ (A )長度：32個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質
X i )序列說明：S E Q
Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gin Gly lie Tyr Αβρ Tyr Leu Gin Glu Lys 5 10 15
Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu lie Val Arg Val Glu Met Met Arg 20 25 30 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 119 一 ------：------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注咅3事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（117) (2 ) S E Q ID NO :1〇 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：34個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 10:
Cys Ala Trp Glu lie Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val 5 l〇 15
Ser Thr Thr Leu Gin Lys Arg L©u Thr Lys Met: Gly Gly Asp Leu Asn 20 25 30
Ser Pro (2 ) S E Q ID NO:ll 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：5 88個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：雙股 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：DNA (基因組的） (fli )臆測型：無 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------Φ 裝--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -120 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 _—___B7___ 五、發明說明（iis) (iv )最初來源： (C)個體單離物··人類干擾素T a u之編碼序列 (i X )特性： (A )名稱/關鍵字：CDS (B )座落：1· · 585 (xi)序列說明·· S E Q ID N 0 ： 1 1 ： ATG GCC TTC GTG CTC TCT CTA CTC ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAC Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 6GC CCA 66A 6GA TCC CTG GGT TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG 96 Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gin Asn His Val Leu 20 25 30 GTT G6C AG6 AA6 AAC CTC A66 CTC CTG GAC GAA ATG AGG AGA CTC TCC 144 Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser 35 40 45 CCT CAC TTT TGT CTG CAG GAC Λ6Α AAA GAC TTC GCT T.TA CCC CAG GAA 192 Pro His Phe Cys Leu Gin Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gin Glu 50 55 60 ATG GTG GAG 66C 66C CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC 240 Met Val Glu Gly Gly Gin Leu Gin Glu Ala Gin Ala lie Ser Val Leu 65 70 75 80 CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC 288 His Glu Met Leu Gin Gin Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser 85 90 95 TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CCA TGC CGC ACT GGA CTC 336 Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Pro Cys Arg Thr Gly Leu 100 105 110 本姑張&度谪用中國國家標準（CNS)A4規格G】()x 297公釐） 、 -121 - ---------------------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 585911 A7 B7 五、發明說明（119) CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA His Gin Gin Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gin Val Met Gly 115 120 125 GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys 130 135 140 AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC Arg Tyr Phe Gin Gly lie His Val Tyr Leu Lye Glu Lys Gly Tyr Ser 145 150 155 160 GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu lie Met Arg Ser Phe Ser 165 170 175 TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG Ser Leu lie Ser Leu Gin Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu 180 185 190 ATG AGC TCA CCT TGA Met Ser Ser Pro 195 384 432 480 528 576 591 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 (2 ) S E Q ID(i )序列特徵 (A )長度 (B )種類 N 0 : 1 2之資料：195個胺基酸 胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：蛋白質 xi)序列說明：SEQ ID NO: 12 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -122 - 585911 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（12〇)
Met Ala Phe Val Leu Sez: Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 I5
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gin Asn His Val Leu 20 25 30
Val 6ly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp 61u Met Arg Arg Leu Ser 35 40 45
Pro His Phe Cys Leu Gin Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gin Glu 5C 55 60
Met Val Glu 61y Gly Gin Leu Gin Glu Ala Gin Ala lie Ser Val Leu 65 70 75 80
His Glu Met Leu Gin Gin Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser 85 90 95
Ser Ala Ala Trp Asp Thxr Thr Leu Leu Glu Pro Cys Arg Thr Gly Leu 100 105 110
His Gin Gin Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gin Val Met Gly 115 120 125
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys 130 135 140
Arg Tyr Phe Gin Gly IXe His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser 145 150 155 160
Asp Cys Ala Trp Glu Thar Val Arg Leu Glu lie Met Arg Ser Phe Ser 165 170 175
Ser Leu He Ser Leu Gin Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu 180 185 190
Met Ser Ser Pro 195 (2 )S E Q ID N0:13 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：25個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -123 一 ------------•裝--------訂---------^9. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（121) (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：CDNA (合成型） (X i )序列說明·· S E Q ID N 0 ： 1 3 · CGCCGCGGTG GCTGCTACCT GTCGCGAAAA CTG 33 (2 ) S E Q ID NO: 14 之資料·· (i )序列特徵： (A )長度：25個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：DNA (合成型） (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 1 4 ： CGAGGCTTAC GGAGAATTTT CAGGTCACCA CC 32 (2 ) S E Q ID NO: 15 之資料·· (i )序列特徵： (A )長度：37個胺基酸 (B )種類：胺基酸 本紙張汶度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —-------·裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 124 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 Α7 Β7 五、發明說明（122) (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：肽 (iii )臆測型：無 (v i )最初來源： (C)個體單離物：人類Ta u — I FN， 片段1 一 3 7之胺基酸序列 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 15:
Cys Asp Leu Ser Gin Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg 1 5 l〇 15
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro His Phe Cys Leu Gin Asp 20 25 3〇
Arg Lys Asp Phe Ala 35 . (2 ) S E Q ID N0:16 之資料： (i )序列特徵： (A)長度：31個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：肽 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------^------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -125 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（123) (iii )臆測型：無 (v i )最初來源： (C)個體單離物：人類Ta u — I FN， 片段34—64之胺基酸序列 (X i )序列說明：S E Q ID N 0 ·· 1 6 :
Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Gly Gin Leu Gin 15 l〇 15
Glu Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met Leu Gin Gin Ser 20 25 30 (2 ) S E Q ID NO :17 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：31個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：肽 (iii )臆測型：無 (v i )最初來源： (C)個體單離物：人類Ta u - I FN， 片段62—92之胺基酸序列 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------1-----裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -126 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585911 A7 B7 五、發明說明（124) (xi)序列說明：s E Q ID N 0 : 1 7 :
Gin Gin Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Ίχηρ 15 10 15
Asp Thr Thr Leu Leu Glu Pro Cye Arg Thr Gly Leu His Gin Gin 20 25 30 (2 )S E Q ID N0:18 之資料： (i )序列特徵： (A )長度：33個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：肽 (迅）臆測型：無 (ν i )最初來源： (C)個體單離物：人類Ta u - I FN， 片段9 0 - 1 2 2之胺基酸序列 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 1 8 ：
His Gin Gin Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gin Val Met Gly 15 10 15
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys 20 25 30
Arg (2 ) S E Q ID NO :19 之資料·· 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I-----^--------------^--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -127 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 585911 A7 B7 五、發明說明（125) (i )序列特徵： (A )長度：32個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：肽 (ifi )臆測型：無 (v i )最初來源： (C)個體單離物：人類Ta u - I FN， 片段11 9 一 150之胺基酸序列 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 19:
Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gin Gly He His Val Tyr Leu Lys Glu Lys 15 10 15
Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu lie Met Arg 2〇 25 30 (2 ) S E Q ID NO :20 之資料·· (i )序列特徵： (A )長度：34個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：直線型 (ϋ )分子型：肽 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I--------訂---------^9! (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -128 - 585911 A7 _B7_ 五、發明說明（I26) (iii )臆測型：無 (v i )最初來源： (C)個體單離物：人類Ta u — I FN， 片段1 39 - 1 72之胺基酸序列 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 0 ：
Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Ser 15 l〇 15
Leu lie Ser Leu Gin Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser 20 25 3〇
Ser Pro -----I--------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -129 -

Claims (1)

  1. 585911] 修正補充
    六、申請專利範圍 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 附件2A :第89102648號專利申請案 中文申請專利範圍替換本民國93年3月4曰呈1 · 一種融合多肽，包括 (a)干擾素一 τ多肽’具有由（i )下示SEQID N〇：1核酸序列所編碼之胺酸酸序列 S E Q ID N 〇：1 TGC TAC CTG TCG CGA AAA CTG ATG CTG GAC GCT CGA GAA AAT TTA AAA 48 Cys Tyr Leu Ser Arg LyB Leu Met Leu Aep Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15 CTG CTG GAC CGT ATG AAT CGA TTG TCT CCG CAC AGC TGC CTG CAA GAC 96 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg.Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gin Asp 20 25 30 CGG AAA GAC TTC GGT CTG CCG CAG GAA ATG GTT GAA GGT GAC CAA CTG 144 Arg Lye Αερ Phe Gly Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Asp Gin Leu 35 40 45 CAA AAA GAC CAA GCT TTC CCG GTA CTG TAT GAA ATG CTG CAG CAG TCT 192 Gin Ly曰 Asp Gin Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gin Gin Ser 50 55 60 TTC AAC CTG TTC TAC ACT GAA CAT TCT TCG GCC GCT TGG GAC ACT ACT 240 Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Αερ Thr Thr 65 70 75 80 CTT CTA GAA CAA CTG TGC ACT GGT CTG CAA CAG CAA CTG GAC CAT CTG 288 Leu Leu Glu Gin Leu Cys Thr Gly Leu Gin Gin Gin Leu Asp His Leu 85 90 95 GAC ACT TGC CGT GGC CAG GTT ATG GGT GAA GAA GAC TCT GAA CTG GGT 336 Aep Thr Cys Arg Gly Gin Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly . 100 105 110 AAC ATG GAT CCG ATC GTT ACT GTT AAA AAA TAT TTC CAG GGT ATC TAC 364 Asn Met Aep Pro lie Val Thr Val Lys Lye Tyr Phe Gin Gly lie Tyr 115 120 125 ---------II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 585911 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 GAC TAC CTG CAG GAA AAA GGT TAC TCT GAC TGC GCT TGG GAA ATC GTA 432 Asp Tyr Leu Gin Glu LyB Gly Tyr Ser Asp Cye Ala Trp Glu lie Val 130 135 140 CGC GTT GAA ATG ATG CGG GCC CTG ACT GTG TCG ACT ACT CTG CAA AAA 480 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gin Lys 145 150 155 160 CGG TTA ACT AAA ATG GGT GGT GAC CTG AAT TCT CCG 518 Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 或是（ii)在嚴苛條件下與SEQ ID N0:1核酸 序列雜交且編碼具有抗病毒或抗增生活性之蛋白質的核酸 序列所編碼之胺基酸序列；及 (b )不爲干擾素一 r的第二可溶性多肽， 其中該融合多肽相較於該第二可溶性多肽本身在相同劑量 下有較低的胞毒性。 2 ·如申請專利範圍第1項之融合多肽’其中該干擾 素一 r具有如下SEQ ID N〇：2所示之胺基酸序 列 Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met. Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 . . 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gin Asp 20 25 30 Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Met Val Glu Gly Asp Gin Leu 35 4 0. 45 Gin Lys Asp Gin Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gin Gin Ser 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Gin Leu Cys Thr Gly Leu Gin Gin Gin Leu Asp His Leu 85 90 95 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
    585911 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 Asp Thr Cys Arg Gly Gin Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly 100 105 110 Asn Met Asp Pro lie Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gin Gly He Tyr 115 120 125 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Asp Tyr Leu Gin Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu lie Val 130 135 140 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gin Lys 145 150 155 160 Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 3 .如申請專利範圍第1項之融合多肽，其中該干擾 素- Γ係選自下列胺基酸序列，包括 SEQ ID NO:5: Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gin Asp 20 25 30 Arg Lys Asp Phe Gly 35 5 SEQ ID NO :7 Gin Gin Ser Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp 5. 10 15 Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gin Leu Cys Thr Gly Leu Gin Gin Gin 20 25 30 ’ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 SEQ ID NO :9 Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gin Gly lie Tyr Asp Tyr Leu Gin Glu Lys 5 10 15 Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu lie Val Arg Val Glu Met Met Arg -a 20 25 30 、队 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） · 3 一 585911 A8 B8 C8 D8 大、申請專利範圍 SEQ ID NO:10 Cys Ala Trp Glu lie Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val 5 10 15 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Ser Thr Thr Leu Gin Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn 20 25 30 Ser Pro. 4 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之融合多肽 ，其中該第二可溶性多肽是血淸白蛋白。 5 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之融合多肽 ，其中該第二可溶性多肽是干擾素一 ^。 6 . —種用於抑制細胞增生之藥學組成物，其含有融 合多肽，該融合多肽包含如申請專利範圍第1至3項中任 一項之融合多肽。 7 . —種用於抑制病毒於細胞內複製之藥學組成物， 其含有融合多肽，該融合多肽包含如申請專利範圍第1至 3項中任一項之融合多肽。 8 .如申請專利範圍第6或7項之藥學組成物，其中 該融合多肽包含得自羊之干擾素- r多肽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 9 .如申請專利範圍第6項之藥學組成物，係用於抑 制腫瘤細胞生長，其中該細胞是選自人類肉瘤細胞、人類 血友病細胞、人類T淋巴瘤細胞、及人類黑色素瘤細胞。 1 0 .如申請專利範圍第9項之藥學組成物，其中該 細胞是對類固醇敏感之腫瘤細胞。 1 1 .如申請專利範圍第9項之藥學組成物，其中該 細胞是乳癌細胞。 1 2 .如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585911 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 病毒是RNA病毒。 1 3 ·如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該 病毒是選自貓白血病病毒，人類免疫不全病毒’及C型肝 炎病毒。 1 4 ·如申請專利範圍第7項之藥學組成物’其中該 病毒是B型肝炎病毒。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5 -
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