KR20120126130A - 신규 갈렉틴 9 개변체 단백질 및 그 용도 - Google Patents

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galectin
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노조무 니시
미츠오미 히라시마
아키라 야마우치
아이코 이토
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가르파마 컴퍼니 리미티드
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Abstract

대장균을 숙주로 하여 생산된 재조합체 갈렉틴 9는 종양 세포에 대한 직접 작용(종양 세포의 세포간 접착과 아포토시스를 유도하는 활성)과 면역계를 통한 작용에 의해서, 암의 전이 억제와 퇴축을 유도하는 것이 시사되고, 또한 비활성화 림프구에는 작용하지 않고, 활성화 T 세포, 특히 과잉 면역 반응의 원인이 되는 CD4 양성 T 세포의 아포토시스를 유도하며, 또한 류마티스에 있어서 관절의 변형 등에 관여하는 활막 세포에 대하여 강력한 아포토시스 유도능을 갖지만, 재조합체 갈렉틴 9는 2개의 CRD를 잇는 링크 영역이 프로테아제에 대하여 감수성이 높기 때문에, 매우 용이하게 효소 소화되어버려, 상기 활성을 잃어버리기 때문에, 한층 더한 연구를 위해서는 보다 안정형의 분자가 필요하다. 갈렉틴 9의 2개의 CRD를 잇는 링크 영역의 개변에 의해, 상기 활성에 악영향을 미치는 것을 피하면서, 안정성을 높인 개변 분자를 얻을 수 있었다.

Description

신규 갈렉틴 9 개변체 단백질 및 그 용도{NOVEL GALECTIN 9 MODIFICATION PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은, 신규 갈렉틴 9 개변체(변이체) 단백질 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 링크 영역이 개변된 갈렉틴 9 및 그것을 이용하는 생화학, 임상 검사, 의료 및 의약 응용 기술에 관한 것이다.
특정한 당쇄와 그것에 결합하는 단백질이 포유 동물의 생체에 있어서 생리적 현상 및 진화·성장에 따른 현상, 그리고 여러 가지 병 등에 있어서 다종 다양한 역할이나 기능을 해내고 있음을 시사하고 있는 증거가 발견되어 오고 있다. 생체에는 β-갈락토시드 구조를 지닌 당쇄를 특이적으로 인식하는 동물 렉틴이 존재하고 있는 것이 발견되어 있으며, 이러한 렉틴류의 군인 갈렉틴으로서는, 지금까지 적어도 14종의 유전자가 동정되어 있다. 갈렉틴 패밀리는, 그 구조로부터 3개의 서브그룹, 즉, 프로토형(prototype), 키메라형(chimera), 그리고 탠덤 리피트형(tandem repeat)으로 분류되고 있지만, 그 생체내에서의 기능은 거의 알려져 있지 않다. 특히, 당쇄 인식 도메인을 2개 갖는 탠덤 리피트형 갈렉틴에 대해서는 연구의 역사도 짧고, 그 표적이 되는 생체내의 당쇄(수용체)가 밝혀져 있지 않기 때문에, 그 기능은 해명되지 못하고 있다. 그런데 갈렉틴은 세포 표면의 복잡한 당쇄를 인식하는 단백질을 탐색하고 있다가 발견된 것 등의 경위로부터 보아, 세포의 접착, 세포 사이의 정보 전달, 세포의 활성화 등에 관여하는 등의 기능을 가질 것이라고 예상되고 있어 주목을 끌고 있다. 또한, 그러한 기능 외에, 다른 중요한 여러 가지 기능을 갖고 있다고 예상하게 하는 연구 성과도 계속하여 얻어지고 있다.
탠덤 리피트형 갈렉틴의 하나인 갈렉틴 9는, 인간에 있어서는, 맨 처음 호지킨병 환자의 자기항원(autoantigen)으로서 동정되어(비특허 문헌 1 및 2), 면역 세포 사이의 상호 작용에 중요한 기능을 해내고 있는 것은 아닌가라고 상상되고 있었던 것이었다. 마우스의 갈렉틴 9는, 갈렉틴류의 당쇄 인식 도메인에 있어서 보존성이 높음이 확인되고 있는 서열을 기초로 설계된 디제네레이티드 프라이머(degenerated primer)를 사용한 5'-RACE PCR에 의해 마우스 신장의 cDNA 라이브러리로부터 클론화되고 있다(비특허 문헌 3). 항원으로 자극된 인간 T 세포는 in vivo 및 시험관내로 호산구 유주 인자인 에칼렉틴(ecalectin)을 산생하고 있음이 발견되고, 또한 그 에칼렉틴은 지금까지 알려져 있던 다른 호산구 유주 인자류와는 구조적으로 다르지만, 갈렉틴 패밀리에 속한다고 하여도 좋은, β-갈락토시드 구조를 지닌 당쇄에 대한 결합 친화성을 갖고 있었다. 인간 T 세포 유래의 백혈병 세포주로부터 얻어진 mRNA로부터 에칼렉틴을 클로닝하는 데에 성공한 결과, 에칼렉틴은 갈렉틴 9의 변이체의 하나이며, 갈렉틴 9와 에칼렉틴은 동일 물질임(비특허 문헌 4)이 확인되고 있다.
야생형 갈렉틴 9로서는, 현재 L형 갈렉틴 9(galectin-9 long isoform or long type galectin-9: Gal-9L), M형 갈렉틴 9(galectin-9 medium isoform or medium type galectin-9: Gal-9M) 및 S형 갈렉틴 9(galectin-9 short isoform or short type galectin-9: Gal-9S)가 보고되어 있다. 어느 갈렉틴 9도, 2개의 당쇄 인식 부위(당 인식 도메인, carbohydrate recognition domain: CRD)와 이들을 잇는 링크 펩티트 영역으로 이루어져 있고, L형 갈렉틴 9는 가장 긴 링크 펩티트 영역을 보유하며, 이 링크 팹티드 영역에 의해 N 말단 도메인(NCRD)과 C 말단 도메인(CCRD)이 연결된 것이고, 한편, S형 갈렉틴 9는 가장 짧은 링크 펩티드 영역을 보유하고 있는 것으로, M형 갈렉틴 9는 양자의 중간 길이의 링크 펩티트 영역을 보유하고 있는 것으로, 일반적으로는, 상기 양자보다는 널리 생체내 조직이나 세포에 존재하고 있음이 발견되는 것이 알려져 있다. 또한 인간 세포나 조직으로부터 클로닝되는 갈렉틴 9 유전자의 사이에서는, 유전적 다형 현상의 존재를 시사하는 증거도 확인되어 오고 있다.
야생형 갈렉틴 9는 2개의 당 인식 부위(CRD)와 이들을 잇는 링크 영역으로 이루어지며, 대장균을 숙주로 하여 생산된 재조합체 갈렉틴 9는, 종양 세포에 대한 직접 작용(종양 세포의 세포간 접착과 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 활성)과 면역계를 통한 작용에 의해서, 암의 전이 억제와 퇴축을 유도하는 것이 시사되어 있다. 또한, 갈렉틴 9는 비활성화 림프구에는 작용하지 않고, 활성화 T 세포, 특히 과잉 면역 반응의 원인이 되는 CD4 양성 T 세포의 아포토시스를 유도하는 것도 밝혀져 있다. 또한, 류마티스에 있어서 관절의 변형 등에 관여하는 활막 세포에 대하여 강력한 아포토시스 유도능을 갖는 것도 밝혀져 있다.
<비특허 문헌 1>
Sahin, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11810-11813(1995)
<비특허 문헌 2>
Tureci, O. et al., J. Biol. Chem., 272(10), 6416-6422(1997)
<비특허 문헌 3>
Wada, J. et al., J. Biol. Chem., 272(9), 6078-6086(1997)
<비특허 문헌 4>
Matsumoto, R. et al., J. Biol. Chem., 273(27), 16976-16984(1998)
발명의 개시
이러한 갈렉틴 9의 다면적인 작용을 이용함으로써, 암 치료, 난치성의 자기면역 질환(류마티스를 포함함), 알레르기 질환을 치료하는 것 등이 기대되고 있다. 그러나, 재조합체 갈렉틴 9는 2개의 CRD를 잇는 링크 영역이 프로테아제에 대하여 감수성이 높기 때문에, 매우 용이하게 효소 소화되어버려, 그 활성을 잃는다.
본 발명자들은 예의 연구를 진행시킨 결과, 갈렉틴 9가 갖는 당쇄 인식 활성을 유지하면서 프로테아제에 대하여 보다 안정적인 분자 구조를 탐색하여, 갈렉틴 9의 2개의 CRD를 잇는 링크 영역을 개변함으로써, 상기한 것과 같은 활성에 악영향을 미치는 것을 피하면서, 안정성을 높인 개변 분자를 얻는 데에 성공하여, 본 발명을 완성했다.
본 발명은, 이하를 제공한다.
(1) 갈렉틴 9 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질의 링크 펩티트 또는 그 근방 영역이 개변되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그의 염.
(2) 개변이 갈렉틴 9 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질의 링크 펩티트 또는 그 근방 영역의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실(缺失), 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 갈렉틴 9와 비교하여 적어도 링크 펩티트에 대한 분해 감수성이 개질되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 단백질 또는 그의 염.
(3) 갈렉틴 9와 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질이, 갈렉틴 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 단백질 또는 그의 염.
(4) (1) 갈렉틴 9의 N 말단측의 당쇄 인식 영역(NCRD) 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드와 (2) 갈렉틴 9의 C 말단측의 당쇄 인식 영역(CCRD) 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를, (3) 갈렉틴 9의 링크 펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 개변 링크 펩티드를 통해 결합시켜 놓은 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 단백질 또는 그의 염.
(5) (1) 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 지니고 또한 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 1∼8개의 아미노산 잔기를 결실, 치환 또는 부가시켜 놓은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 (2) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 지니고 또한 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중 적어도 1∼21개의 아미노산 잔기를 결실, 치환 또는 부가시켜 놓은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를, (3) 서열 번호 7∼9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실(단, 서열 번호 7에 있어서 1∼32 및 1∼44의 결실 및 서열 번호 8에 있어서 1∼12의 결실을 제외함), 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 개변 링크 펩티트를 통해 결합시켜 놓은 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 단백질 또는 그의 염.
(6) 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 단백질을 코드하는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
(7) 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 상기 (6)에 기재된 핵산.
(8) DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 상기 (6) 또는 (7)에 기재된 핵산.
(9) 상기 (6)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 핵산을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
(10) 상기 (6)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 핵산에 부가하여 표식 단백질 및/또는 펩티드를 코드하는 염기 서열을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 상기 (9)에 기재된 재조합 벡터.
(11) 상기 (6)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 핵산 또는 상기 (9) 또는 (10)에 기재된 재조합 벡터를 보유하는 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
(12) 형질 전환체 숙주 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (11)에 기재된 형질 전환체.
(13) 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 단백질, 상기 (6)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 핵산, 상기 (9) 또는 (10)에 기재된 재조합 벡터 및 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 형질 전환체로 이루어지는 군에서 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
(14) 면역 조절제인 것을 특징으로 하는 상기 (13)에 기재된 의약.
(15) 항종양약인 것을 특징으로 하는 상기 (13)에 기재된 의약.
(16) 뇌종양(다형성 교아종 등), 척수종양, 상악동암, 췌액선암, 치육암, 설암, 구순암, 상인두암, 중인두암, 하인두암, 후두암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 흉막 종양, 암성 복막염, 암성 흉막염, 식도암, 위암, 대장암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 간암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소 종양, 부신암, 자궁경암, 자궁체암, 질암, 외음암, 난소암, 섬모상피종, 악성 골종양, 연부육종, 유방암, 피부암, 악성 흑색종, 기저 세포종, 백혈병, 골수화성을 동반하는 골수선유증, 악성 림프종, 호지킨병, 형질 세포종, 글리오마 등을 포함하는 암 및 육종으로 이루어지는 군에서 선택된 종양에 대한 항종양약인 것을 특징으로 하는 상기 (15)에 기재된 의약.
(17) 하기의 질환 또는 병, 또는 병적인 증상에 대한 것임을 특징으로 하는 상기 (13)에 기재된 의약:
(A) 염증성 질환으로, 각 장기에서 일어나는 여러 가지 급성 및 만성 염증, 알레르기성 및 자기면역성의 염증, 감염증 등으로 이루어지는 군에서 선택된 것;
(B) 급성 및 만성 질환으로, 기관지염, 기관지 폐렴, 간질성 폐렴, 폐장염, 세기관지염, 급성 종격염을 포함하는 폐의 질환, 심외막염, 심내막염, 심근염, 구내염, 구각염, 편도염, 인두염, 후두염, 식도염, 복막염, 급성 위염, 만성 위염, 급성 장염, 맹장염, 허혈성 대장염, 약물성 대장염, 직장염을 포함하는 폐 이외의 다른 장기의 질환, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 극증 간염, 급성 및 만성의 간염이나 간 경변, 담낭염, 급성 췌염, 만성 췌염, 급성 및 만성 신염, 막성 신염, 사구체신염, IgA 신증, 여러 가지 방광염, 뇌수염, 유선염, 피부염, 표층 각막염, 건성 각결막염, 중이염이나 비염, 부비강염이나 비용종, 치육염, 치주염, 치주위염을 포함하는 염증 등으로 이루어지는 군에서 선택된 것;
(C) 신경성 염증(예컨대, 신경성 위염, 신경성 방광염 등), 암이나 염증에 동반되는 통증으로 이루어지는 군에서 선택된 것;
(D) 알레르기성 염증 질환으로, 전신성 아나필락시스, 기관지 천식, 과민성 폐렴, 화분증, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 면역 복합체가 일으키는 알레르기성 질환, 혈관신경성 부종 등으로 이루어지는 군에서 선택된 것;
(E) 자기면역성의 염증(자기면역 질환)이며, 전신성(만성 관절 류마티스, 전신성 에리토마토데스, 결절성 다발성 동맥염, 강피증, 다발성 근염·피부근염, 쉐그렌 증후군, 베체트병 등), 신경계(다발성 경화증, 중증 근무력증, HAM(HTLV-1 척수증), 근위축성 측색경화증 등), 내분비성(바세도우병, 하시모토병, 1형 당뇨병 등), 혈액(특발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역성 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈 등), 호흡기(사르코이도시스, 폐섬유증 등), 소화관(궤양성 대장염, 크론병 등), 간(자기면역성 간염, 원발성 담즙성 간 경변, 원발성 경화성 담관염, 자기면역성 담관염 등), 콩팥·요로계(항호중구 세포질 항체 관련 신염, 혈관염, 굿패스쳐(Goodpasture) 증후군, 항사구체 기저막 항체병 등) 등으로 이루어지는 군에서 선택된 것;
(F) 감염증으로, 병원체가 생체의 세포·조직·장기를 상해함으로써 생기는 질환, 또는 인간에게 감염증을 가져오는 병원체에 기인하는 질환으로 병원체가, 1) 세균(스피로헤타, 클라미디아, 리케차를 포함함), 2) 바이러스, 3) 진균, 4) 식물(조류), 5) 원충, 6) 기생충(흡충, 조충, 선충), 7) 절족 동물로 이루어지는 군에서 선택된 것으로, 세균성 감염증(콜레라, 페스트, 대장균 감염증 등), 스피로헤타 감염증(렙토스피라증 등), 클라미디아 감염증(옴병 등), 리케차 감염증(발진티푸스, 파상풍 등), 바이러스성 감염증(대상포진, 바이러스성 출혈열, 광견병 등), 진균증(칸디다증, 크립토코커스증, 아스페르길루스증 등), 원충성 질환(아메바 이질, 말라리아, 톡소플라스마증 등), 기생충(흡충증, 선충증 등), 그 외에, 미코플라스마 감염증(미코플라스마 폐렴 등), 미코박테리아 감염증(결핵, 비정형 항산균증 등)을 포함하는 것에서 선택된 것;
(G) 피부과 영역의 질환으로, i) 피부감염증, 알레르기성 염증이나 자기면역성 염증을 포함하는 피부염증이나, 건선, 수포증, 농포증, 각화, 각화 이상증 등 특유의 염증을 갖는 피부 질환, ii) 미용 피부과 관련의 장애 또는 노화로서, a) 멜라닌 대사 조절(미백), b) 모발 성장(발모)의 조절, c) 콜라겐 산생 조절에 관련된 피부과 영역의 질환(노화를 포함함)에서 선택된 것;
(H) 생활 습관병으로, 고지혈증, 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병 등을 포함하는 것에서 선택된 것;
(I) 정상 세균총의 유지에 관련된 이상;
(J) 아밀로이도시스, 알츠하이머병, 골다공증, 골절 등을 포함하는 것에서 선택된 것;
(K) 뇌, 신경 영역에 있어서의 염증 반응, 예컨대, 뇌경색, 심근경색 등의 허혈성 병변의 진전에 동반하여 생기는 염증, 통합 실조증;
(L) 통풍;
(M) 골다공증; 또는
(N) 간질성 폐렴.
(18) 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 단백질, 상기 (6)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 핵산, 상기 (9) 또는 (10)에 기재된 재조합 벡터 및 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 형질 전환체로 이루어지는 군에서 선택된 것을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 분석 또는 검사 시약.
[발명의 효과]
갈렉틴 9에 관하여 얻어진 갈렉틴 9 개변체는, 야생형과 비교하여 프로테아제에 대하여 안정화되어 있기 때문에, 갈렉틴 9가 갖고 있는 생체내에서의 기능의 해명에 이용 가능하며, 종양화 세포의 제어, 면역 조절, 나아가서는 알레르기나 염증의 대조군 등 여러 가지 생체 반응의 제어·조절에 관여하고 있는 갈렉틴 9의 기능·활성을 연구하는 데에 사용할 수 있다. 또한, 상기 갈렉틴 9 개변체 및 그 관련 물질은, 임상 응용, 분자생물학적 응용, 생화학 응용, 의학적 응용에 있어서의 시약 및 활성제로서 유망하다.
본 발명의 그 밖의 목적, 특징, 우수성 및 그것이 갖는 관점은, 이하의 기재로부터 당업자에 있어서는 명백할 것이다. 그러나, 이하의 기재 및 구체적인 실시예 등의 기재를 포함한 본건 명세서의 기재는 본 발명의 바람직한 태양을 나타내는 것으로, 설명을 위해서만 나타나 있는 것임을 이해하길 바란다. 본 명세서에 개시한 본 발명의 의도 및 범위 내에서, 여러 가지 변화 및/또는 개변(또는 수식)을 행하는 것은, 이하의 기재 및 본 명세서의 그 밖의 부분으로부터의 지식에 의해, 당업자에 있어서는 용이하게 자명할 것이다. 본 명세서에서 인용되고 있는 모든 특허 문헌 및 참고 문헌은, 설명의 목적으로 인용되고 있는 것으로, 이들은 본 명세서의 일부로서 그 내용은 여기에 포함시켜 해석되어야 하는 것이다.
도 1은 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null)) 발현 벡터의 구축 방법을 도시한다.
도 2는 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null)) 발현물 및 정제 처리물의 전기 영동 사진을 도시한다.
도 3은 야생형 갈렉틴 9(G9(M))와 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null))와의 사이에서 프로테아제에 대한 내성을 비교한 결과를 나타낸다. 정제 표품에 대하여, 존재하는 대장균 프로테아제에 대한 내성을 조사했다. 도면은 전기 영동 사진을 나타낸다.
도 4는 야생형 갈렉틴 9(G9(S))와 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null))와의 사이에서 프로테아제에 대한 내성을 비교한 결과를 나타낸다. 매트릭스 메탈로프로테아제 3(MMP-3)에 대한 내성을 조사했다. 도면은 전기 영동 사진을 나타낸다.
도 5는 야생형 갈렉틴 9(G9(S))와 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null))와의 사이에서 프로테아제에 대한 내성을 비교한 결과를 나타낸다. 엘라스타제(elastase)에 대한 내성을 조사했다. 도면은 전기 영동 사진을 나타낸다.
도 6은 야생형 갈렉틴 9(G9(S))와 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null))와의 사이에서 생물 활성을 비교한 결과를 나타낸다. MOLT-4 세포에 대한 아포토시스 유도 활성(DNA laddering)을 조사했다. 도면은 전기 영동 사진을 나타낸다.
도 7은 야생형 갈렉틴 9(G9(S))와 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null))와의 사이에서 생물 활성을 비교한 결과를 나타낸다. 말초혈 호산구에 대한 ECA 활성을 조사했다.
도 8은 갈렉틴 9 EST 클론을 BLAST 서열 검색하여 다른 소스로부터의 각 클론의 서열을 비교한 결과를 나타낸다. 검색에서 각 클론은, 97-99%의 상동성(동일성)을 보인다. 5, 88, 135, 238, 281의 위치에서의 변이를 나타낸다.
도 9는, 자이모산은 흉막염을 유발하지만, 갈렉틴 9 개변체(h-gal9NC(nu11)) 단독으로는 염증을 유발하지 않음을 도시한다.
도 10은 자이모산 유도 흉막염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(h-gal9NC(nu11))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 11은 PMA 유도 피부염(스테로이드 감수성 모델)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 12는 아라키돈산 유도 피부염(스테로이드 비감수성 모델)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 13은 캅사이신 유도 피부염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 14는 DNFB 유도 접촉 피부염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 15는 DNFB 유도 접촉 피부염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 16은 FITC 유도 아토피성 피부염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 17은 담마진 모델에 대한 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 18은 담마진 모델에 대한 갈렉틴 9 개변체(Gal-9=G9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 19는 관절염 모델에 대한 갈렉틴 9 개변체(h-gal9NC(null))의 효과를 조사한 결과를 나타낸다.
도 20은 피하 이식 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 종양 세포 증식 억제 효과, 즉, 항종양 활성(항암 효과) 측정의 결과를 나타낸다. 상단은 대조군을, 하단은 갈렉틴 9 개변체 투여군(5주까지 어떠한 종양도 보이지 않음)을 도시한다.
도 21은 피하 이식 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 종양 세포 증식 억제 효과, 즉, 항종양 활성(항암 효과) 측정의 결과로, 조직 병리 해석의 조직 사진을 도시한다. LLC+갈렉틴 9 개변체(Gal9) 투여(하단)의 경우의 5주에서의 피부를 나타내고 있다. 육안적으로 백색조이다.
도 22는 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9)의 배양 종양 세포(Meth A 세포, 24 시간)에 있어서의 아포토시스(세포 장해 활성) 유도의 결과를 나타낸다.
도 23은 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9)의 배양 종양 세포(B16/F10 세포, 24 시간)에 있어서의 아포토시스(세포 장해 활성) 유도의 결과를 나타낸다.
도 24는 동물의 생존 곡선으로, Meth A 세포에 의한 암성 복막염 모델에 있어서, 갈렉틴 9 개변체가 항종양 효과를 가짐을 나타내고 있다.
도 25는 Meth A 세포에 의한 암성 복막염 모델에 있어서, 갈렉틴 9 개변체(Gal9) 비투여군(상단)과 투여군(하단)에서 마우스의 상태를 나타내는 사진을 도시한다.
도 26은 동물의 생존 곡선으로, B16/F10 세포에 의한 암성 복막염 모델에 있어서, 갈렉틴 9 개변체가 항종양 효과를 가짐을 나타내고 있다.
도 27은 B16/F10 세포(멜라노마)에 의한 암성 복막염 모델 마우스의 상태를 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 투여군과 비투여군으로 대비하여 내장 조직(제14일째) 사진을 나타낸다.
도 28은 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9)의 면역 세포에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸다. B16/F10 복강내(i.p.) 침윤 세포(24 시간)의 해석 결과이다.
도 29는 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9)에 의한 접착 저해 실험의 결과를 나타낸다. B16/F10 세포(1 시간)의 해석 결과이다. 도면 중, Collagen type I는 I형 콜라겐, Collagen type IV는 IV형 콜라겐, Laminin은 라미닌, Fibronectin은 피브로넥틴, Vitronectin은 비트로넥틴을 나타낸다.
도 30은 진드기 항원 유발 천식 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 및 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 31은 진드기 항원 유발 천식 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 및 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다. BALF 중에 존재하는 각 세포수를 나타내고 있다.
도 32는 진드기 항원 유발 천식 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9)의 작용 효과를 측정한 결과(기관지 주위 조직의 사진)을 도시한다.
도 33은 OVA 유발 천식 모델(마우스)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 및 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 34는 OVA 유발 천식 모델(마우스)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 및 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다. BALF 중에 존재하는 각 세포수를 나타내고 있다.
도 35는 OVA 유발 천식 모델(몰모트)에 있어서의 즉시형 천식(IAR)·지연형 천식(LAR)에 대한 갈렉틴 9 개변체(gal-9)가 미치는 작용을 나타낸다.
도 36은 OVA 유발 천식 모델(몰모트)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다. BALF 중에 존재하는 각 세포수를 나타내고 있다.
도 37은 자기면역성 용혈성 빈혈 모델(마우스)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9)의 작용 효과를 측정한 결과(헤마토크릿(%))를 나타낸다.
도 38은 아르투스(Arthus) 반응(혈관염) 모델(마우스)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 및 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 39는 ARDS 모델(마우스)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 및 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 40은 ARDS 모델(마우스)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 및 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다. BALF 중에 존재하는 각 세포수를 나타내고 있다.
도 41은 캅사이신 유도 염증 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(Gal-9)(정맥내 투여)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 42는 갈렉틴 9 개변체(Gal-9)에 의한 파골 세포 형성에 미치는 효과를 시험한 결과를 나타낸다. 억제 효과가 있음이 명백하다.
도 43은 갈렉틴 9 개변체(gal-9) 자극에 의한 단구의 아포토시스 유도(M-CSF 존재 하)를 시험한 결과를 나타낸다.
도 44는 갈렉틴 9 개변체(gal-9) 자극에 의한 인간 골아 세포 증식에 미치는 효과를 시험한 결과를 나타낸다.
도 45는 갈렉틴 9 개변체(Galectin-9) 자극(8 시간)에 의한 인간 골아 세포 분화 마커의 발현에 미치는 효과를 시험한 결과를 나타낸다.
도 46은 생존율을 나타내며, 갈렉틴 9 개변체의 간질성 폐렴 모델에의 작용을 시험한 결과를 나타낸다.
도 47은 갈렉틴 9 개변체의 간질성 폐렴 모델에의 작용을 시험한 결과를 나타낸다. Day14에서의 생존 예의 폐 조직(HE 염색, 사진)을 나타낸다.
도 48은 동물의 생존 곡선으로, LLG 세포(아포토시스(+))에 의한 암성 복막염 모델에 있어서, 갈렉틴 9 개변체가 항종양 효과를 가짐을 나타내고 있다.
도 49는 B16/F10 세포를 사용하여 암 전이 모델에의 갈렉틴 9 개변체의 작용을 조사한 결과(모델 동물의 폐의 외관)을 나타낸다.
도 50은 B16/F10 세포를 사용하여 암 전이 모델에의 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null))의 작용을 조사한 결과(폐의 결절수를 센 결과)를 나타낸다.
도 51은 카라게닌 유발 염증 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(gal-9)(정맥내 투여)의 작용 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 52는 카라게닌 유발 염증 모델에 있어서의 포지티브 대조군으로서의 덱사메타손(Dex.)의 작용 효과를 측정한 결과를 비교하기 위해서 도시한다.
도 53은 류마티스(RA) 관절 활막에 있어서의 갈렉틴 9의 발현을 면역 조직 염색을 사용하여 조사한 염색 조직의 결과를 나타낸다.
도 54는 갈렉틴 9에 의한 류마티스(RA) 관절 활막 세포의 아포토시스 유도 활성을 조사한 광학 현미경 관찰의 결과를 나타낸다.
도 55는 갈렉틴 9에 의한 류마티스(RA) 관절 활막 세포의 아포토시스 유도 활성을 PI법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 56은 갈렉틴에 의한 류마티스(RA) 활막 세포의 아포토시스 유도 활성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 57은 갈렉틴에 의한 류마티스(RA) 활막 세포의 증식 억제 활성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 58은 아쥬반트 관절염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 작용(기계 자극에 의한 통증의 억제)을 조사한 결과를 나타낸다.
도 59는 아쥬반트 관절염 모델에 있어서의 작용(기계 자극에 의한 통증의 억제)를 조사한 결과(포지티브 대조군으로서의 인도메타신의 작용)를 비교하기 위해서 도시한다.
도 60은 카라게닌 유발 급성 염증 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 작용(기계 자극에 의한 통증의 억제)을 조사한 결과를 나타낸다.
도 61은 카라게닌 유발 급성 염증 모델에 있어서의 작용(기계 자극에 의한 통증의 억제)를 조사한 결과(포지티브 대조군으로서의 덱사메타손의 작용)를 비교하기 위해서 도시한다.
도 62는 인간 관절액 중에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 안정성을 조사한 결과(SDS-PAGE)를 나타낸다.
도 63은 관절염 모델(항체 칵테일 야기 모델)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9)의 작용을 조사한 결과(정맥내 투여)를 나타낸다.
도 64는 관절염 모델(콜라겐 관절염 모델)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9)의 작용을 조사한 결과(복강내 투여)를 나타낸다.
도 65는 관절염 모델(콜라겐 관절염 모델)에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9)의 작용을 조사한 결과(정맥내 투여)를 나타낸다.
도 66은 아쥬반트 관절염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 작용을 조사한 결과(정맥내 투여)를 나타낸다.
도 67은 아쥬반트 관절염 모델에 있어서의 작용을 조사한 결과(포지티브 대조군으로서의 인도메타신의 작용)를 비교하기 위해서 도시한다.
도 68은 래트 CIA(콜라겐 감작) 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 작용을 조사한 결과(정맥내 투여)를 나타낸다.
지금까지 공표된 연구 및 계속 중인 특허 출원을 참고로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서의 개시 중에 포함된다.
「갈렉틴 9 개변체」란, 갈렉틴 9의 당쇄 인식 부위가 보유하는 특정한 당쇄에 대하여 특이적으로 결합한다고 하는 활성 또는 그것과 유사한 활성(본 활성 중에는 정성적인 활성 및/또는 정량적인 활성이 포함되어도 됨)을 제공하는 물질을 말한다. 갈렉틴 9는 특정한 세포에 대하여 아포토시스 유도 활성을 갖지만, 본 갈렉틴 9 개변체는 야생형 갈렉틴 9가 갖는 아포토시스 유도 활성 또는 그것과 유연(類緣) 활성을 갖는 것이라도 좋고, 갈렉틴 9가 갖는 생물 활성이 개변 또는 수식되어 있는 것이라도 좋으며, 어떤 경우에는 바람직하다. 본 발명에서 특히 바람직한 갈렉틴 9 개변체란, 생물 활성을 갖는 시약으로서, 임상 검사의 분야, 분석의 분야, 또는 의학 또는 의약 등의 분야에서, 야생형 갈렉틴 9보다는 바람직한 성질을 보이는 것을 가리킨다.
갈렉틴 9 개변체는 예컨대, 갈렉틴 9 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질의 링크 펩티트 또는 그 근방 영역이 개변되어 있는 단백질 또는 그의 염, 갈렉틴 9 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질의 링크 펩티트 또는 그 근방 영역의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 갈렉틴 9와 비교하여 적어도 링크 펩티트에 대한 분해 감수성이 개질되어 있다고 하는 개변이 실시된 단백질 또는 그의 염, 갈렉틴 9와 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질이며 또한 갈렉틴 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성, 또는 적어도 75% 이상의 상동성, 또는 적어도 80% 이상의 상동성, 또는 적어도 85% 이상의 상동성, 또는 적어도 90% 이상의 상동성, 또는 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 단백질 또는 그의 염, (1) 갈렉틴 9의 N 말단측의 당쇄 인식 영역(NCRD) 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드와 (2) 갈렉틴 9의 C 말단측의 당쇄 인식 영역(CCRD) 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를, (3) 갈렉틴 9의 링크 펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 개변 링크 펩티트를 통해 결합되고 있는 단백질 또는 그의 염 등이라도 좋다.
그런데, 갈렉틴 9는, J. Biol. Chem., 272(10): pp. 6416-6422(1997)에 있어서, 호지킨병 환자의 비장으로부터 조제한 cDNA에 신규 갈렉틴를 발견하여, 이것을 갈렉틴 9라고 명명하여 그 보고가 이루어지는 동시에, 호지킨병 종양에서의 서열 변이를 피하기 위해서 건강한 보통 사람의 말초혈로부터 조제한 cDNA로 서열의 재확인을 하여, 최종적으로 갈렉틴 9의 서열을 결정하고, 상기 문헌의 제6418페이지의 FIG.1에 그 서열이 표시되어 있다. 한편, 갈렉틴 9에 대해서는, 또한 J. Biol. Chem., 273(27): pp. 16976-16984(1998)에 있어서, 호산구 유주 인자를 생산하는 T 세포주, STO-2로부터 조제한 cDNA로부터 유주 인자 에칼렉틴(Ecalectin)을 단리했지만, 그것은 먼저 보고가 있었던 상기 갈렉틴 9와의 상동성이 높지만, 아미노산 서열 포지션으로 5, 88, 135, 238, 281회째의 아미노산에 차이가 보이는 것이 나타났으며, 그 문헌의 제16983페이지의 Fig.8에 에칼렉틴의 서열이 기재되고, 또한 거기에서는, 에칼렉틴은 갈렉틴 9의 변이체로 추측되고 있다.
또한, J. Biol. Chem., 275(12): pp. 8355-8360(2000)에 있어서, 주르캇 T-세포로부터 조제한 cDNA로부터 갈렉틴 9를 단리하여, 재조합(재조합) 단백질을 제작하고 있지만, 이 갈렉틴 9 재조합 단백질은 호산구 유주 활성을 보였기 때문에, 타이라시마 등은 주르캇 T-세포에 유래하는 서열을 갖는 갈렉틴 9를 앞으로의 연구에 이용하기로 하고, 거기에서는 아미노산 서열 포지션으로 5, 88, 135, 238, 281회째의 아미노산에는 각각 Gly, Lys, Ser, Pro, Glu가 적합하며, 상기한 마쓰모토 등(J. Biol. Chem., 273(27): pp. 16976-16984(1998))이 보고한 에칼렉틴과는 5번째의 아미노산이 Ser와 Gly라는 점에서 다르지만, 호산구 유주 활성에는 차이가 없는 것, 또한 17개의 EST 데이터베이스에 등록되어 있는 갈렉틴 9의 서열(부분 서열을 포함함)을 조회해 보더라도 5, 88, 135, 238, 281회째의 아미노산에는 각각 Gly, Lys, Ser, Pro, Glu가 적합하다는 것이 타당하다고 생각되다는 것이 기재되어 있으며, 그 문헌의 제8359페이지의 Table II에 갈렉틴 9의 변이가 기재되어 있다(도 8 참조). 도 8에 있어서, Gly(G), Lys(K), Ser(S), Pro(P), Glu(E)이다.
J. Biol. Chem., 272(9): pp.6078-6086(1997)(비특허 문헌 3)에 있어서는, 아미노산 서열의 유사성으로부터 2개의 당 인식 부위(CRD)와 이들을 잇는 링크 영역의 26 아미노산(갈렉틴 9M 타입에 관해서)이 결정되어 있다(동 문헌의 Fig.1을 참조). 즉, 서열 번호 5에 나타나 있는 아미노산 서열에서 보면, C 말단측의 당쇄 인식 영역(CCRD)은 Met175에서 시작된다고 되어 있다. 그리고 이것에 기초하여, NCBI 데이터베이스의 등록 번호(Accession Number) NP_033665에 있어서 인간 갈렉틴 9의 CRD와 링크 영역이 등록되어 있다. 한편, J. Biol. Chem., 273(5): pp. 2954-2960(1998)에 있어서는, 갈렉틴 4 및 6의 보고가 이루어져 있으며, 이 중에서는 CRD와 링크 영역의 설정이 아미노산 서열, 유전자 서열에 기초하여 결정되어 있고, 그것이 동 문헌의 제2956페이지의 Fig.2에 기재되어 있지만, 이 설정을 갈렉틴 9에 반영한 경우, 전자(J. Biol. Chem., 272(9): pp. 6079-6086(1997))의 설정과는, 링크 영역과 C 말단측의 CRD에 있어서 다른 것이다. 즉, 서열 번호 5에 나타나 있는 아미노산 서열로 보면, CCRD는 Phe195에서 시작되게 된다.
본 발명자들의 그룹은, 엑손에 의한 스플라이싱의 경계가 Gln148-Pro149 사이, Ile160-Thr161 사이, Ser177-Thr178 사이에 있다고 하는 것처럼 비특허 문헌 3에 있어서의 설정보다 3 아미노산만큼 C 말단측에 존재하고 있음을 고려하는 동시에, C 말단측의 CRD의 당 결합 능력에 관한 검토, 즉, 서열 번호 5에 나타나 있는 아미노산 서열로 보아, Thr178에서 시작되는 전장의 CCRD를 발현시킨 경우는 락토스 결합능이 있고, 또한 6 아미노산의 삭제(서열 Met184에서 시작되는 CCRD 단편), 12 아미노산의 삭제(Ala190에서 시작되는 CCRD 단편)를 하여도 락토스 결합능이 있었지만, 22 아미노산의 삭제(Leu200에서 시작되는 CCRD 단편)를 하면 대장균에 있어서 발현이 없기 때문에, 서열 번호 5에 나타나 있는 아미노산 서열로 보아, CCRD는 Phe195에서 시작된다는 설정이 보다 엄정하다고 고찰할 수 있음도 아울러 생각하여, C 말단측의 CRD로서 서열 번호 5에 나타나 있는 아미노산 서열의 Thr178∼Thr323인 것으로 했다. 갈렉틴 9의 N 말단측의 CRD(NCRD)에 대해서는, 서열 번호 5로 나타나 있는 아미노산 서열로 보아, Gln148까지의 전장의 NCRD를 발현시킨 경우는 락토스 결합능이 있었지만, 9 아미노산을 삭제(서열 Met1∼Ser139의 NCRD 단편)에서는 단백질의 발현은 있지만 락토스 결합능이 보이지 않게 되므로, N 말단측의 CRD로서 서열 번호 5에 나타나 있는 아미노산 서열의 Met1∼Gln148인 것으로 했다.
바람직한 형태에서는, 갈렉틴 9 개변체는 예컨대, (1) 갈렉틴 9의 NCRD로서 서열 번호 2에 나타나 있는 아미노산 서열 또는 그 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것, 또는 서열 번호 2에 나타나 있는 아미노산 서열에 대하여 적어도 70% 이상의 상동성, 또는 적어도 75% 이상의 상동성, 또는 적어도 80% 이상의 상동성, 또는 적어도 85% 이상의 상동성, 또는 적어도 90% 이상의 상동성, 또는 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 지니고, 또한 락토스 결합능을 갖는 것이며, (2) 갈렉틴 9의 CCRD로서 서열 번호 3에 나타나 있는 아미노산 서열 또는 그 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것, 또는 서열 번호 3에 나타나 있는 아미노산 서열에 대하여 적어도 70% 이상의 상동성, 또는 적어도 75% 이상의 상동성, 또는 적어도 80% 이상의 상동성, 또는 적어도 85% 이상의 상동성, 또는 적어도 90% 이상의 상동성, 또는 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 지니고, 또한 락토스 결합능을 갖는 것이며, (3) 상기 (1)과 (2)를 결합하고 있는 링크 영역으로서 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 또는 그 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것으로, 바람직하게는 매트릭스 메탈로프로테아제 등의 단백 분해 효소에 대하여 네이티브한 갈렉틴 9보다 안정화되고 있는 것을 들 수 있다. 그 링크 영역(3)으로서는, 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기가 1개 이상(예컨대, 1∼2개, 바람직하게는 3∼4개, 더욱 바람직하게는 5∼6개, 더욱 바람직하게는 7∼8개, 특히 1∼9개 등) 빠져 있는 결실 유연체, 그 아미노산 잔기의 1개 이상(예컨대, 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼6개, 더더욱 바람직하게는 1∼4개, 특히 1∼2개 등)이 다른 잔기로 치환되어 있는 치환 유연체, 1개 이상(예컨대, 1∼60개, 바람직하게는 1∼40개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 특히 1∼5개 등)의 아미노산 잔기(단, 서열 번호 7 및 8에 나타나 있는 아미노산 서열 중 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열을 제외한 부분으로 표시되는 것은 제외함)가 부가되어 있는 부가 유연체도 포함한다. 대표적인 경우, 그 링크 영역(3)으로서는, 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열을 HM, RIP, 또는 임의의 2 아미노산의 서열로 치환한 것 등을 들 수 있다. 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입은 폴리펩티드의 생리적인 특성이나 화학적인 특성에 큰 변화를 일으키게 하지 않는 것일 수도 있고, 어떤 경우에는 바람직한 변화를 부여하는 것일 수 있다. 그 아미노산 서열 중의 아미노산의 치환체로서는, 그 아미노산이 속하는 곳의 클래스 중의 다른 아미노산류에서 선택할 수 있다. 예컨대, 비극성(소수성) 아미노산으로서는, 알라닌, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 트립토판, 메티오닌 등을 들 수 있고, 극성(중성)으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등을 들 수 있고, 양 전하를 갖는 아미노산(염기성 아미노산)으로서는, 아르기닌, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있고, 음 전하를 갖는 아미노산(산성 아미노산)으로서는, 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.
또한, 상기 링크 영역(3)으로서는, 서열 번호 7 또는 8에 나타나 있는 아미노산 서열을, 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외하고, HM, RIP, 또는 임의의 2 아미노산의 서열로 치환한 것, 서열 번호 7 또는 8에 나타나 있는 아미노산 서열 중 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외하고 그 중의 6 아미노산을 남기고, 그 이외의 잔기를 삭제한 것 등을 들 수 있다. 또한, 상기 링크 영역(3)으로서는, 서열 번호 7 또는 8에 나타나 있는 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기(단, 예컨대, 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외하고, 또는 서열 번호 7의 경우, 서열 번호 8에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외하여도 좋음)가 1개 이상(예컨대, 1∼5개, 바람직하게는 3∼10개, 더욱 바람직하게는 5∼15개, 더욱 바람직하게는 7∼20개, 특히 1∼32개 등) 빠져 있는 결실 유연체, 그 아미노산 잔기의 1개 이상(예컨대, 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼6개, 더더욱 바람직하게는 1∼4개, 특히 1∼2개 등)이 다른 잔기로 치환되어 있는 치환 유연체, 1개 이상(예컨대, 1∼60개, 바람직하게는 1∼40개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 특히 1∼5개 등)의 아미노산 잔기(단, 서열 번호 7 및 8에 나타나 있는 아미노산 서열 중 서열 번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열을 제외한 부분으로 표시되는 것은 제외함)가 부가되어 있는 부가 유연체도 포함한다.
천연의 인간 갈렉틴 9 단백질의 특징인 도메인 구조 또는 당 결합능이 유지되어 있으면, 상기한 것과 같은 변이체는, 전부 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명의 펩티트 또는 폴리펩티드는 천연의 인간 갈렉틴 9 단백질과 실질적으로 동등한 일차 구조 컨포메이션 또는 그 일부를 갖고 있는 것도 포함되어도 된다고 생각되며, 또한 천연의 것과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖고 있는 것도 포함되어도 된다고 생각된다. 또한 천연으로 생기는 변이체의 하나일 수도 있다. 본 발명의 인간 유래의 단백질(또는 펩티트 또는 폴리펩티드)은 예컨대, WO 02/37114 A1의 서열표의 SEQ ID NO: 1∼3으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열에 대하여, 60%, 경우에 따라서는 70%보다 높은 상동성을 갖고 있는 것을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 그것에 대하여, 80% 또는 90% 이상의 상동 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 본 발명의 인간 유래의 단백질의 일부의 것이란, 그 인간 유래의 단백질의 일부의 펩티트(즉, 그 단백질의 부분 펩티트)로서, 본 발명의 갈렉틴 9 단백질과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 것이면 어느 쪽의 것이라도 좋다. 예컨대, 상기 본 발명의 단백질의 부분 펩티트는, 상기 인간 갈렉틴 9의 구성 아미노산 서열 중 적어도 5개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상, 보다 바람직하게는 70개 이상, 가장 바람직하게는 100개 이상, 어떤 경우에는 200개 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 들 수 있으며, 바람직하게는 이들은 연속된 아미노산 잔기에 대응하는 것이거나, 또는 예컨대, 상기 WO 02/37114 A1의 서열표의 SEQ ID N0: 1∼3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 중 대응하는 영역에 대한 상동성에 대해서, 상기와 동일한 상동성을 갖는 것을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「실질적으로 동등」이란 단백질의 활성, 예컨대, 소정의 세포 상해 활성, 아포토시스 유기 활성, 항염증 활성, 항알레르기 활성, 면역 조절 활성, 당쇄 결합 활성, 생리적인 활성, 생물학적인 활성이 실질적으로 같은 것을 의미한다. 더욱이 또한, 그 용어의 의미 중에는, 실질적으로 동질의 활성을 갖는 경우를 포함하고 있어도 좋으며, 그 실질적으로 동질의 활성으로서는, 결합 활성, 세포 상해 활성, 아포토시스 유기 활성 등을 예로 들 수 있다. 그 실질적으로 동질의 활성이란, 이들의 활성이 성질적으로 동질임을 나타내며, 예컨대, 생리적으로, 약리학적으로, 또는 생물학적으로 동질임을 나타낸다. 예컨대, 결합 활성, 세포 상해 활성, 아포토시스 유기 활성 등의 활성이, 동등(예컨대, 약 0.001∼약 1000배, 바람직하게는 약 0.01∼약 100배, 보다 바람직하게는 약 0.1∼약 20배, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼약 2배)한 것이 바람직하지만, 이들 활성의 정도, 단백질의 분자량 등의 양적인 요소는 다르더라도 좋다.
「갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드」란, 야생형 갈렉틴 9의 천연의 서열의 개변체, 그 유도체, 유사체(아날로그), 프레그먼트, 키메라체 및 변이체를 포함하는 것이다. 그 폴리펩티드는, 숙주 세포에 있어서 발현하도록 의도되고 또한 특정한 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하도록 설계된 재조합으로 산생된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해서 코드되고 있는 것을 포함한다.
「갈렉틴 9 개변체 치료제」란, 갈렉틴 9 개변체를 코드하는 폴리뉴클레오티드(갈렉틴 9 개변체 폴리뉴클레오티드) 또는 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드 서열에 유래하는 분자, 이러한 갈렉틴 9 개변체 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 개변체, 변이체, 유사체, 키메라체, 프레그먼트 등 중의 적어도 하나를 포함하는 것을 가리키고 있다. 폴리뉴클레오티드인 갈렉틴 9 개변체 치료제란, 일반적으로는 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 서열이며 또한 숙주 세포에서 재조합 기술로 발현할 수 있는 것을 포함하고 있다. 또한, 갈렉틴 9 개변체 치료제는, 갈렉틴 9 활성의 작용 물질이라도 좋다. 다른 갈렉틴 9 개변체 치료제로서는, 갈렉틴 9 개변체를 공여하는 것, 갈렉틴 9 개변체가 갖는 활성을 지니고 또한 갈렉틴 9 활성의 결여 또는 부족에 관련되는 질환∼병·이상한 증상을 예방 및/또는 치료하는 효과를 만드는 갈렉틴 9 활성의 모듈레이터를 포함하고 있어도 좋다. 갈렉틴 9 활성의 모듈레이터로서는 예컨대, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 저분자라도 좋다.
본 명세서에서 사용하는 용어 「진단제」란, 본 발명에 있어서의 진단에 있어서 사용하는 하나 또는 그 이상의 그 진단 행위에 기여하는 임의의 약제를 말한다. 이들의 진단에의 사용은, 갈렉틴 9 산생 세포의 존재를 결정하기 위한 방법 또는 갈렉틴 9 결합성 물질을 제시하는 세포의 존재를 결정하기 위한 방법을 포함하는 것이라도 좋다. 진단제로서는 예컨대, 갈렉틴 9 개변체 뮤테인을 코드하는 DNA, 안정화 갈렉틴 9 개변체 뮤테인, 및 그 안정화 갈렉틴 9 개변체 뮤테인을 갖는 세포 또는 세포 호모지네이트로 이루어지는 군에서 선택된 것을 함유하는 것을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 「치료제」란, 본 발명에 있어서의 치료에 있어서 사용하는 하나 또는 그 이상의 그 치료 행위를 달성하거나 또는 달성하는 데에 기여하는 임의의 약제라도 좋다. 예컨대, 치료제가 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 발현하도록 설계된 폴리뉴클레오티드인 경우, 그 약제는 포유 동물에게 투여되어 그리고 세포에서 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 이 경우, 약제의 활성 형태는 발현된 폴리펩티드이다.
갈렉틴 9 개변체 치료제는, 갈렉틴 9 개변체의 생물 활성을 갖는 치료제, 또는 천연의 갈렉틴 9 개변체보다도 길고 특정한 당쇄에 대하여 결합하고 있는 활성을 갖는 폴리펩티드, 매트릭스 메탈로프로테아제 등의 단백 분해 효소에 대하여 네이티브한 갈렉틴 9보다 안정화되어 있는 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 같은 갈렉틴 9 개변체에 유래하는 치료제이다. 이 치료제는 단독으로, 또는 다른 약제(예컨대, 갈렉틴 9 개변체의 투여와 함께 사용되고 또한 특정 종양 또는 자기면역 등에 대한 그 밖의 공지된 처치법에 사용되는 약품, 또는 포유 동물에서의 갈렉틴 9 개변체의 발현을 용이하게 행할 수 있는 유전자 송달 비히클 등)와 조합하여, 그 치료 목적을 달성한다. 예컨대, 이 치료제는, 다른 목적을 위해 개발된 갈렉틴 9 개변체를 포함하는 것이라도 좋고, 나아가서는, 갈렉틴 9의 작용 물질, 갈렉틴 9 활성을 수식 또는 조절하는 약물을 포함하는 것이라도 좋고, 예컨대, 유기 저분자 화합물 또는 물질, 펩티트, 펩티트 유사 화합물 또는 물질, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드, 프로테아제에 대하여 네이티브한 갈렉틴 9보다 안정화되어 있는 갈렉틴 9 개변체의 키메라체 또는 변이체 등을 발현하고 또한 형질 전환된 세포라도 좋다.
본 명세서에서 「배합 치료제」란, 함께 투여한 경우에 이들의 따로따로의 효과를 일으킨다고 하는, 몇 개의 성분 또는 몇 개의 약제를 함유하는 치료 조성물을 가리키고 있으며, 이들은 질환 등을 처치하기 위해서 함께 투여된 경우에 상승 효과를 만드는 것을 가리키더라도 좋다. 바람직하게는, 배합 치료제 중의 몇 개의 성분 또는 몇 개의 약제의 각각에 의해 얻어지는 따로따로의 작용 효과는, 보다 큰 치료 효과, 예컨대 종양의 소실 또는 정상화, 자기면역 질환으로부터의 회복 및 장기간 생존을 얻을 수 있도록 그것을 조합할 수 있는 것이다. 배합 치료제를 투여하여 얻어지는 효과의 예로서는, 단기의 증상 회복과 장기간 투여 후에 얻어지는 증상의 회복과의 조합이라든지, 환자에 있어서의 특정 타입의 세포의 각각에 대한 자기면역 응답을 감소시키는 것과 같은 효과의 조합을 들 수 있다. 본 발명의 배합 치료제의 예로서는, 갈렉틴 9 개변체를 코드하는 폴리뉴클레오디드와 IFN류, IL-2 등의 시토킨류의 적어도 하나를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 유전자 송달 비히클을 투여하기 위한 것 등을 들 수 있다. 다른 예로서는, 2개의 유전자 송달 벡터를 사용할 수도 있으며, 예컨대, 하나는 갈렉틴 9 개변체를 발현하는 것이고, 다른 쪽은 시토킨류의 적어도 하나를 발현하기 위한 것이라도 좋다. 또한, 표적 세포에 있어서 아포토시스를 유도하기 위한 갈렉틴 9 개변체의 투여를 예측하여 상향 조절(upregulate)하기 위해서, IFN류, IL-2 등, 또는 IFN-γ 등을 발현하는 유전자 송달 비히클을 투여할 수도 있다. 여러 가지 치료제는, 그것을 동시에 공여하는 것도 가능하고, 예컨대, 치료를 효율화하도록 필요에 따라 개개의 약제의 하나 또는 전부를 반복하여 투여하는 것이라도 좋고, 동일한 약학적으로 허용되는 담체 중에 넣어 투여할 수도 있다.
「유전자 송달 비히클」이란, 세포에 있어서의 폴리펩티드의 발현을 위한 코드 서열을 세포에 송달하는 것을 용이하게 할 수 있도록 하는 성분을 말한다. 이 세포는, 생체내 유전자 치료에 있어서와 같이 포유 동물의 체내에 존재하고 있더라도 좋고, 생체외 유전자 치료에 있어서와 같이 트랜스펙션 처리를 위해 일단 포유 동물로부터 빼내어져, 폴리펩티드가 발현하도록 포유 동물에게 되돌린 것이라도 좋다. 유전자 송달 비히클은, 세포에의 유전자 송달을 달성할 수 있는 임의의 성분 또는 비히클이라도 좋고, 예컨대, 리포좀, 입자, 벡터 등이라도 좋다. 유전자 송달 비히클로서는, 재조합 비히클(예컨대, 재조합 바이러스 벡터), 핵산 벡터(예컨대, 플라스미드), 네이키드 핵산 분자(예컨대, 유전자), 핵산 분자 상의 부전하를 중화하고 또한 핵산 분자를 접어 포갠 분자로서 응집시킬 수 있는 폴리카티온 분자와 복합체화되어 있는 핵산 분자, 리포좀과 결합한 핵산(미국 특허 제5,166,320호 명세서; 미국 특허 제5,547,932호 명세서; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7851, 1987) 등을 들 수 있다. 이 유전자 송달 비히클은, 프로듀서 세포와 같은 특정한 진핵 생물 세포를 포함하고 있어도 좋으며, 이들은 숙주 세포에 하나 이상의 소망의 특성을 생물학적으로 갖고 있는 핵산 분자를 송달할 수 있는 것이다. 소망의 특성이란, 이하에 논의하는 것과 같이, 예컨대 단백질, 효소, 또는 항체 등과 같은 소망의 물질을 발현하는 능력 및/또는 생물학적 활성을 제공하는 능력을 포함하고 있어도 좋다. 즉, 유전자 송달 비히클에 의해서 운반되는 핵산 분자가, 소망의 물질을 발현하는 것을 필요로 하지 않고서, 그 자체가 활성인 약제라도 좋다. 이러한 생물학적 활성의 하나의 예는, 유전자 치료에 있어서 볼 수 있는 것이다. 유전자 치료에서는, 어떤 종류의 유전자를 불활성화하여, 그 유전자에게 지시되는 산물이 발생되는 것을 차단하여, 송달된 핵산 분자가 특이적으로 발현하도록 한 유전자에 삽입하는 것이다. 유전자 송달 비히클이란, 하나 또는 복수의 목적의 서열 또는 유전자가 발현하도록 지시할 수 있는 집합체(어셈블리)를 가리키고 있다.
유전자 송달 비히클은 일반적으로는, 프로모터 엘리멘트를 포함하고 있고, 그리고 폴리아데닐화를 지시하는 시그널을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 유전자 송달 비히클은, 하나 또는 복수의 목적의 서열 또는 유전자에, 전사된 경우에 작동할 수 있도록 연결되어 있으며, 번역 개시 서열로서 작용하는 서열을 포함하고 있다. 또한, 유전자 송달 비히클은, Neo, SV2Neo, TK, 하이글로마이신, 블레오마이신(플레오마이신), 퓨로마이신, 히스티디놀, DHFR 등과 같은 선택 가능 마커, 하나 이상의 제한 효소 부위 및 번역 종결 서열을 포함하고 있어도 좋다. 본 발명에서 사용되는 경우, 유전자 송달 비히클이란, 바이러스 벡터(Jolly, Cancer Gen. Therapy, 1: 51-64, 1994), 핵산 벡터, 네이키드 DNA, 리포좀 DNA, 코스미드, 세균, 특정한 진핵 생물 세포(프로듀서 세포를 포함함; 미국 특허 제6,333,195호 명세서 참조)와 같은 재조합 비히클을 포함하고 있어도 좋다.
*「생물학적 활성」이란, 특이적인 활성을 유지하고 있는 분자를 가리키는 경우에 사용된다. 예컨대, 생물학적으로 활성인 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드는, 갈렉틴 9의 당쇄 인식 부위가 보유하는 특정한 당쇄에 대하여 특이적으로 결합한다고 하는 활성 또는 그것과 실질적으로 동등한 성질의 활성을 지니고 또한 매트릭스 메탈로프로테아제의 단백 분해 효소에 대하여 네이티브한 갈렉틴 9보다 정성적 및/또는 정량적으로 안정화되어 있는 능력을 유지하여, 예컨대, 갈렉틴 9가 보유하는 항종양 활성 또는 아포토시스를 유도하는 아포토시스 경로를 활성화하는 활성을 보인다.
본 명세서에서 사용하는 용어 「핵산 분자」 또는 「폴리뉴클레오티드」란, 특정한 아미노산 서열 또는 그 상보쇄를 코드하는 RNA 또는 DNA, 나아가서는 DNA:RNA 하이브리드 등의 분자를 말한다. 본 명세서에서 사용하는 「코드 서열」이란, 특정한 아미노산 서열 또는 그 상보쇄를 코드하는 RNA 또는 DNA, 나아가서는 DNA:RNA 하이브리드 등 중 어느 하나를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 안티센스올리고뉴클레오티드 또는 리보자임을 포함하고 있어도 좋고, 또한 유전자의 3' 또는 5' 비번역 영역과 같은 서열, 유전자의 인트론, 유전자의 코드 영역을 구성하고 있지 않은 유전자의 다른 영역을 포함하고 있어도 좋다. DNA이나 RNA는 단일쇄 또는 이중쇄라도 좋다. 합성 핵산이나 합성 폴리뉴클레오티드에는 화학적으로 합성된 핵산 서열을 갖는 것도 포함되어도 좋고, 또한 변성에 대한 저항성을 분자에 부여하기 위해서 화학적으로 부분 개변해 둘 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭, 상보적 DNA 또는 RNA를 사용한 재조합 발현 등에 의해서 제조할 수 있거나, 또는 화학 합성에 의해서 생성시킬 수도 있다.
본 명세서 중 용어 「발현 제어 서열」이나 「조절 서열」이란, 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현에 영향을 주어, 전사나 번역을 위한 시그널을 포함한다고 하는 발현에 영향을 미치는 하나 또는 그 이상의 성분을 포함하고 있고 또한 그 분야에서 사용되고 있는 서열을 말한다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 적합한 발현 제어 서열은, 폴리펩티드가 발현되어야 하는 숙주계에 따라서 그것은 다르다.
본 발명의 「폴리펩티드」로서는, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 포함하는 것이라면 어떠한 것이라도 좋으며, 성숙 단백질을 포함하는 갈렉틴 9 개변체 단백질의 임의의 부분을 들 수 있고, 또한 그 단축형, 개변체, 대립 유전자체, 아날로그, 유도체 등을 들 수 있다. 개변체로서는, 관련 단백질과 동일한 유전자로부터 발현되는 스플라이스된 개변체로부터 유도된 것이라도 좋다. 그 외에 특별히 지시가 없는 한, 이러한 폴리펩티드는 예컨대, 특정 당쇄에 대하여 특이적으로 결합한다고 하는 친화 결합성 또는 특이적 파트너에의 결합 활성 등의 상기 갈렉틴 9 단백질이 갖는 생물 활성 중의 하나 또는 그 이상의 생물 활성을 갖는 것이다. 본 「폴리펩티드」라는 용어는, 특정한 길이의 유전자 산물에 한정하는 것은 아니다. 인간에 유래하거나 또는 인간 이외의 공급원에게서 유래하는 것에 상관없이, 갈렉틴 9의 N 말단측 당쇄 인식 부위(NCRD) 및 C 말단측 당쇄 인식 부위(CCRD)에 대해서 표적 단백질 또는 성숙 단백질과 동일한, 또는 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 및 가장 바람직하게는 90%, 나아가서는 95%의 상동성을 갖고 있는 폴리펩티드는, 본 폴리펩티드의 이 정의 내에 포함된다. 따라서, 대립 유전자에 기초한 개변체, 및 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 유전자 산물의 개변체도 포함되어도 좋다. 아미노산의 치환은 아미노산의 보존성의 치환, 또는 글리코실화 부위, 인산화 부위, 아세틸화 부위 등을 개변하는 아미노산의 치환, 또는 기능에 필요하지 않은 시스테인 잔기의 위치를 개변하여 접어 겹치는 패턴을 바꾼다고 하는 것, 또한 필수 아미노산 잔기가 아닌 것을 제거한다고 하는 치환이라도 좋다. 아미노산의 보존성의 치환이란, 일반적으로는 전하, 소수성/친수성, 및/또는 치환되는 아미노산의 입체적인 사이즈(크기)를 보존하는 치환이며, 예컨대, Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/GIn, Ser/Cys/Thr 및 Phe/Trp/Tyr 등과 같은 군의 멤버 사이에서의 치환이 보존성의 치환이다.
아날로그란, 표적 단백질 모양의 활성을 갖는 것으로, 펩티드 모양의 것으로서 널리 알려져 있는 펩티트 모방 물질의 하나 또는 그 이상을 갖고 있는 펩티드 등을 들 수 있다. 본 정의 중에는 예컨대, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 아날로그(예컨대, 비천연형 아미노산 등을 포함함)를 포함하고 있는 폴리펩티드, 치환된 연결부를 갖는 폴리펩티드, 천연에 존재하는 변이 및 천연에는 존재하지 않는 변이와 같은 당해 기술분야에서 공지된 그 밖의 개변·수식이 포함된다.
본 명세서에서 용어 「폴리펩티드」는, 폴리펩티드 발현 후 개변되어 있는 것, 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 미리스토일화 등으로 되어 있는 것이라도 좋다.
본 명세서에서 용어 「네이키드 DNA」란, 포유 동물에서의 발현을 위해 포유 동물에게 투여하는 폴리뉴클레오티드 DNA를 가리키고 있어도 좋다. 폴리뉴클레오티드로서는 예컨대, 코드 서열이라도 좋고, 폴리뉴클레오티드 DNA는 일단 DNA가 세포 안으로 들어가면 코드 서열이 용이하게 발현하도록 발현 제어 서열에 직접적 또는 간접적으로 결합하고 있는 것이라도 좋다. 간접적인 결합이란, 포유 동물 세포에서의 DNA의 발현을 용이하게 할 목적으로 조절 영역과 코드 서열을 결합하기 위해서라든가, 다른 서열을 삽입하는 것을 용이하게 하는 등을 위해서, 링커 또는 스페이서를 통해 2개의 폴리뉴클레오티드 영역을 함께 결합하는 것을 포함하고 있더라도 좋다.
본 명세서에서 「벡터」란, 하나 또는 복수의 목적의 서열 또는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 집합체(어셈블리)를 가리키고 있다. 벡터는, 전사 프로모터/인핸서, 1 또는 복수의 유전자좌를 규정하고 있는 엘리멘트, 나아가서는 얼터너티브 스플라이싱(Alternatives splicing), 핵 RNA 수송, 메신저의 번역 후에 발생하는 수식, 또는 단백질의 전사 후에 발생하는 수식 등과 같은 과정을 지시 또는 제어하고 있는 다른 유전자가 발현하는 것을 제어하고 있는 그 밖의 엘리멘트를 임의로 포함하고 있어야만 한다.
또한, 벡터는, 전사되는 경우에 하나 또는 그 이상의 목적의 서열 또는 유전자에게 작동할 수 있게 연결되고, 또한 번역 개시 서열로서 작용하는 서열을 포함하여야만 한다. 필요에 따라 벡터는 폴리아데닐화를 지시하는 시그널, Neo, TK, 하이글로마이신, 블레오마이신(플레오마이신), 히스티디놀, DHFR 등과 같은 선택 마커, 하나 또는 그 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 벡터가 레트로바이러스 중에 배치되는 경우, 벡터는 패키징 시그널, 장말단 반복 서열(LTR), 그리고, 만약 그것이 없으면, 사용되는 레트로바이러스에 알맞은 플러스쇄나 마이너스쇄의 프라이머 결합 부위를 포함하여야만 한다.
「조직 특이적 프로모터」란, 한정된 수의 조직 타입 또는 세포 타입에 있어서 우선적으로 활성인 것으로, 전사 프로모터/인핸서 또는 유전자좌를 규정하고 있는 엘리멘트, 또는 상기한 것과 같이 유전자 발현을 제어하는 그 밖의 엘리멘트를 가리키고 있다. 이러한 조직 특이적 프로모터의 대표적 예로서는, 예컨대, PEPCK 프로모터, HER2/neu 프로모터, 카제인 프로모터, IgG 프로모터, 융모성 배 항원 프로모터, 엘라스타제 프로모터, 폴포빌리노겐 디아미나아제 프로모터, 인슐린 프로모터, 성장 호르몬 인자 프로모터, 티로신 히드록실라아제 프로모터, 알부민 프로모터, α 페토프로테인 프로모터, 아세틸콜린 리셉터 프로모터, 알콜 디히드로게나제 프로모터, α 또는 β 글로빈 프로모터, T 세포 리셉터 프로모터, 오스테오칼신 프로모터 등을 들 수 있다.
「사상 특이적 프로모터」란, 전사 프로모터/인핸서 또는 유전자좌를 규정하고 있는 엘리멘트, 또는 상기한 것과 같이 유전자 발현을 제어하는 그 밖의 엘리멘트이며 또한 이들의 전사 활성이 세포성 자극에 대한 응답시에 변화되는 것을 가리키고 있다. 이러한 사상 특이적 프로모터의 대표적인 예로서는, 티미딘키나제 또는 티미디레이트신타제 프로모터, α 또는 β 인터페론 프로모터, 또한 호르몬(천연 호르몬, 합성 호르몬, 또는 다른 비숙주 생물로부터의 호르몬 중 어느 하나, 예컨대, 곤충 호르몬 등)의 존재에 응답하는 프로모터 등을 들 수 있다.
용어 「융합 단백질」 또는 「융합 폴리펩티드」란, 하나보다 많은 단백질 또는 하나보다 많은 단백질의 부분을 포함하는 하나의 폴리펩티드의 발현을 일으키는 벡터를 사용한 발현으로 산생되는 것이며 또한 벡터 또는 연속된 결합 중의 하나보다 많은 이종 코드 서열을 재조합 발현시켜 얻어지는 단백질 또는 폴리펩티드를 가리키고 있다. 가장 바람직하게는, 융합 단백질은, 그것을 구축하는 데에 사용된 유래 단백질 또는 폴리펩티드가 갖고 있었던 생물학적 활성 중의 적어도 하나를 유지하고 있는 폴리펩티드 단위를 가지고 있고, 바람직하게는, 따로따로의 단백질 부분을 조합시킴으로써 시그널 폴리펩티드를 형성하여, 상승적으로 개량된 생물학적 활성을 생기게 하고 있는 것이 포함된다. 생성되는 융합 단백질로서는, 발현된 경우에 기능을 갖는 폴리펩티드를 갖는 것, 발현된 경우에 기능을 갖지 않는 펩티트를 갖는 것을 들 수 있다. 이 발현된 경우에 기능을 갖지 않는 펩티드로서는, 바람직하게는 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하기 위해서 도움이 되는 것을 들 수 있다. 본 발명에 유용한 융합 단백질의 예로서는, 치료를 위해 또는 검지 또는 측정을 위해, 나아가서는 분석 또는 분리나 정제를 위해서와 같은 이용 관점으로부터의 몇 개의 이점을 갖고 있는 유전자 조작된 임의의 갈렉틴 9 개변체 융합 폴리펩티드를 들 수 있다.
용어 「키메라」 또는 「키메라 단백질」은 융합 단백질 또는 융합 폴리펩티드와 등가의 의미를 갖는다고 생각하여도 좋다. 「키메라 분자」는, 융합 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 융합 분자라도 좋다. 키메라는, 연결된 DNA 코드 서열로 구축되고, 그리고 세포계에서 발현되거나, 또는 벡터로서 투여하여 동물에 있어서 생체내 발현할 수 있다. 예컨대, 갈렉틴 9 개변체를 포함하는 키메라 또는 융합 단백질은 생체내 또는 생체외에서의 유전자 치료 프로토콜로 투여할 수 있다.
본 명세서에서 「환자」란, 살아 있는 생물로 임의의 치료 또는 예방 처치 가능한 것을 가리키더라도 좋고, 진핵 생물 또는 원핵 생물을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 환자인 진핵 생물로서는, 척추동물이나 무척추동물이라도 좋다. 따라서, 예컨대, 환자는 물고기, 새, 유충, 곤충, 포유 동물, 파충류, 양서류, 균류, 식물이라도 좋고, 바람직하게는 포유 동물이다. 포유 동물로서는 예컨대 인간을 들 수 있다.
본 발명의 갈렉틴 9 개변체 치료제 및/또는 진단제의 일반적 제조 및 사용법을 이하에 설명한다. 한 형태에서는, 본 발명은, 갈렉틴 9가 보유하는 생리 활성 또는 생물 활성의 부족 또는 결여에 기인하는 질환·병·이상 상태를 처치하는 기술을 제공한다. 이 처치 기술로서는 예컨대, 갈렉틴 9 개변체 치료제를 제공하는 단계 및/또는 그 질환 등을 갖는 포유 동물에게 유효량의 갈렉틴 9 개변체 치료제를 투여하는 단계 등을 들 수 있다. 갈렉틴 9 개변체는, 악성 종양 세포에 대한 세포 상해 활성, 악성 종양 세포에 대한 아포토시스 유도 활성, 악성 종양 세포에 대한 항종양 활성(항암 활성), 활성화 T 세포의 아포토시스 유도 활성, 특히 CD4 양성 T 세포의 아포토시스 유도 활성, 면역 조절 활성, 항염증 작용, 항알레르기 작용을 발휘함으로써, 항종양제(항암제), 항알레르기제, 면역 조절제, 자기면역 질환용제, 항염증제 및 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용제로서 기대할 수 있는 것이다. 이 처치 기술은, 활성화 T 세포가 현저한 자기면역 질환을 처치하는 방법을 포함한다. 「자기면역 질환」 및 「자기면역」이란 모두 포유 동물에서의 자기면역에 의해서 특징지어지는 장애(이것은, 자신 성분에 대한 면역계의 응답임)를 말한다. 자기면역 응답은, 임상적 징후를 나타내는 증상으로 진전할 수 있는 것이다. 엄밀히 말하면, 이식 거절은 자기면역 반응은 아니지만, 환자가 증상적으로 세포, 조직 또는 기관을 치환하거나 또는 이식한다고 하는 외과 수술을 받는 경우, 동종 이식을 받는 몸이라는 것은, 외래 이식에 대하여 면역학적으로 반응하는 것이다. 종의 하나의 멤버로부터 다른 종으로의, 세포, 조직 또는 기관의 동종 이식 중에, 수용체(레시피언트)에서는 이식된 세포, 조직 또는 기관을 거절하는 데에 충분한 면역 응답이 생기는 경우는 「이식 거절」이 발생하는 것이다.
본 발명의 방법 및 치료제에 의해서 처치할 수 있는 「종양」의 예로서는, 악성 종양이 포함되어 있어도 되며, 예컨대, 전이를 하는 종양은 악성 종양으로서, 일반적으로 그 악성 종양은 상피성과 비상피성인 것이 있다고 여겨지며, 어떤 경우에는 암, 육종, 백혈병 등으로 구분하여 생각되는 경우도 있지만, 단순히 「암」이라고 부른 경우, 일반인이라면 악성 종양을 가리키는 경우가 많다.
본 명세서에서 「암」이란, 넓은 의미로 해석하면 되며, 단순히 상피성의 악성 종양으로 해석하면 안 된다. 본 명세서에 있어서 「암」이란, 상피성 악성 종양 및 비상피성 악성 종양(종양 형성성인 것도 비형성성인 것도 포함함)을 포함하고 있더라도 좋고, 피부암(멜라노마를 포함하여도 좋음), 유방암, 난소암, 자궁암, 고환 악성 종양, 전립선암, 방광암, 신장암, 갑상선암, 인두·후두암, 설암, 상악암, 식도암, 위암, 결장·직장암, 폐·기관지암, 간암(간세포암, 간내담관암을 포함함), 간외담관·담낭암, 췌장암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 선유육종, 악성 혈관종, 악성 혈관내피종, 뇌종양(수막종, 글리오마, 성상 세포종 등을 포함함) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않으며, 본 발명의 갈렉틴 9 개변체를 사용함으로써 바람직한 결과를 얻을 수 있는 것, 나아가서는 그 갈렉틴 9 개변체가 관여하여 어떠한 생리적 또는 생물학적인 응답을 얻을 수 있는 것은 포함되어도 된다고 이해되어야 한다.
본 발명의 방법 및 치료제에 의해서 처치할 수 있는 「자기면역 질환」의 예로서는, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 전신성 에리테마토데스(SLE), 굿패스쳐(Goodpasture) 증후군, 천포창, 리셉터 자기면역, 자기면역 용혈성 빈혈, 자기면역혈소판 감소성 자반병, 변형성 관절증, 만성 관절염 류마티스, 항콜라겐 항체에 의한 강피증(schleroderma), 복합화 결합 조직병, 다발성 근염, 악성 빈혈, 특발성 에디슨병, 자발성 불임증, 사구체신염, 수포성 유천포창, 아드레날린 작용성 약물 내성, 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간 경변, 자기면역 베이스의 내분비선부전, 백반, 맥관염, 심근경색후유증(post-myocardial infarction), 심장천공 증후군, 담마진, 아토피성 피부염, 자기면역 베이스의 천식, 자기면역 베이스의 염증성 반응, 육아종증 장애, 강직성(alkylizing) 척추염, 연쇄 구균 감염후(poststreptococcal) 사구체신염, 자기면역 용혈성 빈혈, 뇌염, 림프종에 대한 이차적 자기면역 반응, 변성 장애, 위축성 장애 등을 들 수 있다. 리셉터 자기면역을 나타내는 자기면역 질환으로서는, 예컨대, 그레이브스병, 중증 근무력증, 인슐린 내성증 등을 들 수 있다. 아드레날린성 약물 내성의 자기면역 질환으로서는 예컨대, 천식 및 낭포성 선유증 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 다른 자기면역 질환으로서는 예컨대, 동물 모델이 존재하는 것을 들 수 있으며, 예컨대, 쉐그렌 증후군(자기면역 누선염(dacryodentis) 또는 면역 매개 타액선염), 자기면역 심근염, 원발성 담즙성 간 경변(PBC), 염증성 심장병, 수은 유도성 콩팥 자기면역, 인슐린 의존성 당뇨병(1형 당뇨병 또는 IDD), 흉선 절제술후 자기면역, 중추신경계(CNS) 탈수 장애, CNS 낭창, 수면 발작, 면역매개 PNS 장애, 변형성 관절증, 만성 관절염 류마티스, 포도막염, 수질 낭포성 선유증, 자기면역 용혈성 질환, 자기면역 맥관염, 난소 자기면역 질환, 인간 강피증(scheroderma) 등을 들 수 있다. 중추신경계(CNS) 탈수 장애에 의해서 특징지어지는 자기면역 질환으로서는 예컨대, 다발성 경화증(MS) 등을 들 수 있다. 말초 신경계(PNS) 자기면역 질환은 예컨대, 길랑-바레 증후군(GBS)이라도 좋다.
갈렉틴 9 개변체 치료제로서는, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 저분자의 유기 화합물, 펩티트, 또는 펩티트 유사 화합물 또는 물질 등을 들 수 있다. 또한, 갈렉틴 9 개변체 치료제는, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드, 상기 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 펩티드 유도체, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드에 유래하는 생물학적으로 활성인 펩티드 유사 화합물 또는 물질, 또는 갈렉틴 9 개변체 활성을 갖고 있고 또한 갈렉틴 9 개변체의 구조를 모방하고 있는 저분자의 유기 화합물(예컨대, 작용 물질을 포함하여도 좋음) 등이 포함되어 있어도 좋다. 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드는, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드 개변체, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드 유도체, 변이한 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드, 또는 단축형 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드와 같은 생물학적으로 활성인 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드라도 좋다. 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 갈렉틴 9의 N 말단측 CRD 전장 및 C 말단측 CRD 전장을 가지고 있는 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 부분을 코드하는 서열, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드에 유래하는 생물학적으로 활성인 펩티트를 코드하는 서열, 가용성 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 서열 등이라도 좋다. 본 발명의 다른 실시 태양은, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있는 유전자 송달 비히클을 갖는 조성물이다.
본 발명에서는, 「유전자 재조합 기술」을 이용하여 소정의 핵산(폴리뉴클레오티드)나 소정의 펩티드(폴리펩티드)를 구축하거나 취득하는 것, 또한 단리·서열 결정하거나, 재조합체를 제작하거나 할 수 있다. 본 명세서 중에서 사용할 수 있는 유전자 재조합 기술(재조합 DNA 기술을 포함함)로서는, 이 분야에서 알려진 것을 들 수 있으며, 예컨대 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4,(The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995); 일본생화학회편, 「속 생화학 실험 강좌 1, 유전자 연구법 II」, 동경화학동인(1986); 일본생화학회편, 「신 생화학 실험 강좌 2, 핵산 III(재조합 DNA 기술)」, 동경화학동인(1992); M. J. Gait(Ed), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press(1984); B. D. Hames and S. J. Higgins(Ed), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford, UK(1985); B. D. Hames and S. J. Higgins(Ed), Transcription and Translation: A Practical Approach(Practical Approach Series), IRL Press Ltd., Oxford, UK(1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(2nd Edition), John Wiley & Sons, New York(1988); J. H. Miller and M. P. Calos(Ed), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1987); R. J. Mayer and J. H. Walker(Ed), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, (1987); R. K. Scopes et al. (Ed), Protein Purification: Principles and Practice(2nd Edition, 1987 & 3rd Edition, 1993), Springer-Verlag, N.Y.; D. M. Weir and C. C. Blackwell(Ed), Handbook of Experimental Immunology, Vo1. 1, 2, 3 and 4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, (1986); L. A. Herzenberg et al.(Ed), Weir's Handbook of Experimental Immuno1ogy, Vol. 1, 2, 3 and 4, Blackwell Science Ltd.(1997); R. W. Ellis(Ed), Vaccines new approaches to immunological problems, Butterworth-Heinemann, London(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68(Recombinant DNA), Academic Press, New York(1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100(Recombinant DNA, Part B) & 101(Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York(1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153(Recombinant DNA, Part D), 154(Recombinant DNA, Part E) & 155(Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York(1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York(1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York(1993); S. Weissman(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York(1999); J. C. Glorioso et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York(1999) 등에 기재된 방법 또는 거기에서 인용된 문헌에 기재된 방법 또는 이들과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 행할 수 있다(이들 중에 있는 기재는 그것을 참조함으로써 본 명세서의 개시에 포함됨)[이하, 이들 모두를 「유전자 재조합 기술」이라고 함].
본 명세서 중, 「상동성」이란, 폴리펩티드 서열(또는 아미노산 서열) 또는 폴리뉴클레오티드 서열(또는 염기 서열)에 있어서의 2 라인의 쇄 사이에서 그 쇄를 구성하고 있는 각 아미노산 잔기끼리 또는 각 염기끼리의 서로의 적합 관계에 있어서 동일하다고 결정할 수 있는 것의 양(수)을 의미하며, 2개의 폴리펩티드 서열 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 상관성의 정도를 의미하는 것이다. 상동성은 용이하게 산출할 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열 사이의 상동성을 측정하는 방법은 다수 알려져 있으며, 「상동성」(「동일성」이라고도 불림)이란 용어는 당업자에게는 주지의 것이다(예컨대, Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biol ogy, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 등). 2개의 서열의 상동성을 측정하는 데에 이용하는 일반적인 방법에는 Martin, J. Bishop(Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, 샌 디에고, (1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073(1988) 등에 개시되어 있는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상동성을 측정하기 위한 바람직한 방법으로서는, 시험하는 2개의 서열 사이의 가장 큰 적합 관계 부분을 얻도록 설계한 것을 들 수 있다. 이러한 방법은, 컴퓨터 프로그램으로서 조립되어 있는 것을 들 수 있다. 2개의 서열 사이의 상동성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램법으로서는, GCG 프로그램 패키지(Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215: 403(1990)) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니며, 이 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 명세서 중, 「폴리머라제 연쇄 반응」 또는 「폴리머라제 체인 리액션(polymerase chain reaction)」 또는 「PCR」이란, 일반적으로 미국 특허 제4,683,195호 명세서 등에 기재된 것과 같은 방법을 가리키며, 예컨대, 소망의 뉴클레오티드 서열을 시험관내에서 효소적으로 증폭하기 위한 방법을 가리키고 있다. 일반적으로 PCR법은, 주형 핵산과 우선적으로 하이브리다이즈할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 프라이머 신장 합성을 행하는 사이클을 반복하여 행하는 것을 포함하는 것이다. 전형적으로는, PCR법에서 이용되는 프라이머는, 주형 내부의 증폭되어야 할 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 프라이머를 사용할 수 있으며, 예컨대, 이 증폭되어야 할 뉴클레오티드 서열과 그 양단에 있어서 상보적이거나, 또는 그 증폭되어야 할 뉴클레오티드 서열에 인접하고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 5'단측의 프라이머로서는, 적어도 개시 코돈을 함유하거나, 또는 그 개시 코돈을 포함하여 증폭할 수 있도록 선택하고, 또한 3'단측의 프라이머로서는, 적어도 정지 코돈을 함유하거나, 또는 이 정지 코돈을 포함해서 증폭할 수 있도록 선택하는 것이 바람직하다. 프라이머는, 바람직하게는 5개 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 18∼25개의 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
PCR 반응은, 이 분야에서 공지된 방법 또는 그것과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 행할 수 있지만, 예컨대 R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989; D. M. Glover et al. ed., "DM Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995); M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York(1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford(1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002(1988) 등에 기재된 방법 또는 그것을 수식하거나, 개변한 방법에 따라서 행할 수 있다. 또한, PCR법은, 그것에 알맞은 시판되는 키트를 이용하여 행할 수 있으며, 키트 제조업자 또는 키트 판매업자에 의해 밝혀져 있는 프로토콜에 따라서 실시할 수도 있다.
PCR 반응은, 대표적인 경우에는 예컨대 주형(예컨대, mRNA를 주형으로 하여 합성된 DM; 1st strand DNA)과 이 유전자에 기초하여 디자인된 프라이머를, 10×반응 완충액(Taq DNA 폴리머라제에 첨부되어 있음), dNTPs(디옥시뉴클레오시드3인산 dATP, dGTP, dCTP, dTTP의 혼합물), Taq DNA 폴리머라제 및 탈이온 증류수와 혼합한다. 혼합물을 예컨대, GeneAmp 240O PCR system, Perkin-Elmer/Cetus사 등의 자동 서멀 사이클러를 이용하여 일반적인 PCR 사이클 조건 하에 그 사이클을 25∼60회 반복하지만, 증폭을 위한 사이클수는 적절하게 목적에 따라서 적당한 회수로 할 수 있다. PCR 사이클 조건으로서는 예컨대, 변성 90∼95℃ 5∼100초, 어닐링 40∼60℃ 5∼150초, 신장 65∼75℃ 30∼300초의 사이클, 바람직하게는 변성 94℃ 15초, 어닐링 58℃ 15초, 신장 72℃ 45초의 사이클을 들 수 있지만, 어닐링의 반응 온도 및 시간은 적절하게 실험에 의해서 적당한 값을 선택할 수 있고, 변성 반응 및 신장 반응의 시간이나, 예상되는 PCR 산물의 쇄길이에 따라서 적당한 값을 선택할 수 있다. 어닐링의 반응 온도는, 통상 프라이머와 주형 DNA와의 하이브리드의 Tm치에 따라 바꾸는 것이 바람직하다. 신장 반응의 시간은, 통상 1000 bp의 쇄길이당 1분 정도가 대략의 기준이지만, 보다 짧은 시간을 선택하는 것도 경우에 따라 가능하다.
본 명세서 중, 「올리고뉴클레오티드」란, 비교적 짧은 단일쇄 또는 이중쇄의 폴리뉴클레오티드로, 바람직하게는 폴리디옥시뉴클레오티드를 들 수 있고, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734(1989)에 기재되어 있는 것과 같은 기지의 방법, 예컨대, 포스포트리에스테르법, 포스포디에스테르법, 포스파이트법, 포스포아미다이트법, 포스포네이트법 등의 방법에 의해 화학 합성될 수 있다. 통상 합성은, 수식된 고체 지지체 상에서 합성을 편리하게 행할 수 있는 것이 알려져 있고, 예컨대, 자동화된 합성 장치를 이용하여 행할 수 있으며, 그 장치는 시판되고 있다. 이 올리고뉴클레오티드는, 하나 또는 그 이상의 수식된 염기를 함유하고 있어도 좋고, 예컨대, 이노신 등의 천연에 있어서는 보통이 아닌 염기 또는 트리틸화된 염기 등을 함유하고 있어도 좋고, 경우에 따라서는, 마커가 붙은 염기를 함유하고 있어도 좋다.
소정의 핵산을 동정하거나 하려면, 하이브리다이제이션 기술을 이용할 수 있다. 이 하이브리다이제이션은 상기 「유전자 재조합 기술」을 개시하는 문헌에 기재된 방법 또는 그것과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 행할 수 있다. 예컨대, 하이브리다이제이션은 DNA 등의 핵산을 함유하고 있는 샘플을 나일론 필터 등의 막을 포함한 담체에 전사시켜, 필요에 따라 변성 처리, 고정화 처리, 세정 처리 등을 실시한 후, 그 담체(예컨대, 막 등)에 전사된 것을, 필요에 따라 변성시킨 표식 프로브 DNA 단편과, 하이브리다이제이션용 완충액 중에서 반응시켜 이루어진다.
하이브리다이제이션 처리는, 보통 약 35∼약 80℃, 보다 적합하게는 약 50∼약 65℃에서, 약 15분간∼약 36시간, 보다 적합하게는 약 1∼약 24시간 이루어지는데, 적절하게 최적의 조건을 선택하여 행할 수 있다. 예컨대, 하이브리다이제이션 처리는 약 55℃에서 약 18시간 이루어진다. 하이브리다이제이션용 완충액으로서는, 이 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있으며, 예컨대, 고속 혼성화 완충액(Rapid hybridization buffer)(Amersham사) 등을 이용할 수 있다. 전사한 담체(예컨대, 막 등)의 변성 처리로서는, 알칼리 변성액을 사용하는 방법을 들 수 있고, 그 처리 후 중화액이나 완충액으로 처리하는 것이 바람직하다. 또한 담체(예컨대, 막 등)의 고정화 처리로서는, 보통 약 40∼약 100℃, 보다 적합하게는 약 70∼약 90℃에서, 약 15분간∼약 24시간, 보다 적합하게는 약 1∼약 4시간 베이킹함으로써 이루어지는데, 적절하게 바람직한 조건을 선택하여 행할 수 있다. 예컨대, 필터 등의 담체를 약 80℃에서 약 2시간 베이킹함으로써 고정화가 이루어진다. 전사한 담체(예컨대, 막 등)의 세정 처리로서는, 이 분야에서 보통 사용되는 세정액, 예컨대 1 M NaCl, 1 Mm EDTA 및 O.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0 등으로 세정함으로써 행할 수 있다. 나일론 필터 등의 막을 포함한 담체로서는, 이 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있다.
상기 알칼리 변성액, 중화액, 완충액으로서는, 이 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있으며, 알칼리 변성액으로서는 예컨대, 0.5 M NaOH 및 1.5 M NaCl을 함유하는 액 등을 들 수 있고, 중화액으로서는 예컨대, 1.5 M NaCl 함유 0.5 M Tris-HCl 완충액, pH 8.0 등을 들 수 있고, 완충액으로서는, 예컨대, 2×SSPE(0.36 M NaCl, 20 mM NaH2PO4 및 2 mM EDTA) 등을 들 수 있다. 또한 하이브리다이제이션 처리에 앞서서, 비특이적인 하이브리다이제이션 반응을 막기 위해서, 필요에 따라 전사한 담체(예컨대, 막 등)는 예비 하이브리다이제이션 처리하는 것이 바람직하다. 이 예비 하이브리다이제이션 처리는 예컨대, 예비 하이브리다이제이션 용액[50% 포름아미드, 5×덴하르트(Denhardt) 용액(0.2% 소 혈청 알부민, 0.2% 폴리비닐 피롤리돈), 5×SSPE, 0.1% SDS, 100 ㎍/ml 열변성 연어 정자 DNA] 등에 침지하여, 약 35∼약 50℃, 바람직하게는 약 42℃에서, 약 4∼약 24시간, 바람직하게는 약 6∼약 8시간 반응시킴으로써 행할 수 있지만, 이러한 조건은 당업자라면 적절하게 실험을 반복하여, 보다 바람직한 조건을 결정할 수 있다. 하이브리다이제이션에 이용하는 표식 프로브 DNA 단편의 변성은 예컨대, 약 70∼약 100℃, 바람직하게는 약 100℃에서, 약 1∼약 60분간, 바람직하게는 약 5분간 가열하는 등으로 행할 수 있다. 한편, 하이브리다이제이션은 그 자체 공지의 방법 또는 그것에 준한 방법으로 행할 수 있지만, 본 명세서에서 엄중한(stringent) 조건이란, 예컨대 나트륨 농도에 대하여, 약 15∼약 50 mM, 바람직하게는 약 19∼약 40 mM, 보다 바람직하게는 약 19∼약 20 mM이고, 온도에 대하여는 약 35∼약 85℃, 바람직하게는 약 50∼약 70℃, 보다 바람직하게는 약 60∼약 65℃의 조건을 나타낸다.
하이브리다이제이션이 완료된 후, 필터 등의 담체를 충분히 세정 처리하여, 특이적인 하이브리다이제이션 반응을 한 표식 프로브 DNA 단편 이외의 표식 프로브를 제거하는 등을 하고 나서 검출 처리를 할 수 있다. 필터 등의 담체의 세정 처리는, 이 분야에서 보통 사용되는 것 중에서 선택 이용하여 실시할 수 있고, 예컨대, O.1% SDS 함유 0.5×SSC(0.15 M NaCl, 15 mM 시트르산) 용액 등으로 세정함으로써 실시할 수 있다. 하이브리다이즈한 핵산은, 대표적으로는 오토라디오그래피에 의해 검출할 수 있는데, 이 분야에서 이용되는 방법 중에서 적절하게 선택하여 검출에 이용하는 것도 가능하다. 검출한 시그널에 상당하는 핵산 밴드를, 적절한 완충액, 예컨대, SM 용액(100 mM NaCl 및 10 mM mgSO4 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5) 등에 현탁하고, 이어서 이 현탁액을 적절하게 희석하여, 소정의 핵산을 단리·정제, 그리고 한층 더 증폭 처리시킬 수 있다. 본 명세서에서 「높은 상동성」이라고 한 경우 그 대상 서열의 길이에 따라 다르기도 하지만, 예컨대 50% 이상, 나아가서는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 그리고 특정한 경우에는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상이라도 좋다. 이 「같은 효과의 염기 서열」이란, 예컨대 엄중한 조건에서 문제의 서열을 갖는 것에 하이브리다이즈하는 것이라도 좋고, 예컨대 그의 염기 서열 중의 연속된 5개 이상의 염기 서열, 바람직하게는 10개 이상의 염기 서열, 보다 바람직하게는 15개 이상의 염기 서열, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 염기 서열과 하이브리다이즈하여, 그 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 아미노산 서열을 코드하는 것 등을 들 수 있다. 핵산은, 화학 합성에 의해서 얻는 것도 가능하다. 그 경우 단편을 화학 합성하고, 이들을 효소에 의해 결합하여도 좋다.
하이브리다이제이션 처리에 의해 유전자 라이브러리나 cDNA 라이브러리 등을 포함한 핵산 샘플로부터 목적 핵산을 스크리닝하는 처리는, 반복하여 행할 수 있다. 클로닝되어 있는 인간 유래의 cDNA 라이브러리, 예컨대 여러 가지의 인간 유래의 조직 또는 배양 세포(특히, 인간의 신장, 뇌, 송과체, 하수체 후엽, 신경 세포, 망막, 망막 혈관 세포, 망막 신경 세포, 흉선, 혈관, 내피 세포, 혈관 평활근 세포, 혈액 세포, 대식 세포, 림프구, 정소, 난소, 자궁, 창자, 심장, 간장, 췌장, 소장, 대장, 치육 관련 세포, 피부 관련 세포, 사구체 세포, 요세관 세포, 결합 조직 세포 등의 조직·세포, 나아가서는 각종 종양 조직, 암 세포 등) cDNA 라이브러리를 사용할 수 있다. 또한 주형 등으로서 이용하는 cDNA 라이브러리는, 시판되는 여러 가지 조직에서 유래하는 cDNA 라이브러리를 직접 사용할 수도 있으며, 예컨대 Stratagene사, Invitrogen사, Clontech사 등으로부터 시판된 cDNA 라이브러리를 이용할 수 있다. 전형적인 예로서는, 인간 조직·세포로부터 조제한 유전자 라이브러리, 예컨대 인간 P1 인공 염색체(artificial chromosome) 게노믹 라이브러리(Human Genome Mapping Resource Center), 인간 조직 cDNA 라이브러리(예컨대, Clontech사 등으로부터 입수 가능)를 이용할 수 있다. 여러 가지 인간 조직 또는 배양 세포 등으로 구축된 인간 게노믹 DNA 라이브러리 또는 인간 유래 cDNA 라이브러리를 프로브를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 프로브 등을 방사성 동위체 등에 의해서 표식하기 위해서는, 시판되는 표식 키트, 예컨대 랜덤 프라임 DNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim사) 등을 사용하여 행할 수 있다. 예컨대, random-priming 키트(Pharmacia LKB사, Uppsala) 등을 사용하여, 프로브용 DNA를 [α-32P]dCTP(Amersham사) 등으로 표식하여, 방사 활성을 갖는 프로브를 얻을 수 있다.
소정의 핵산을 보유하는, 파지 입자, 재조합 플라스미드, 재조합 벡터 등은, 이 분야에서 보통 사용되는 방법으로 그것을 정제 분리할 수 있고, 예컨대, 글리세롤 그라디엔트 초원심 분리법(Molecular Cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989), 전기영동법 등에 의해 정제할 수 있다. 파지 입자 등으로부터는, 이 분야에서 보통 사용되는 방법으로 DNA를 정제 분리할 수 있으며, 예컨대, 얻어진 파지 등을 TM 용액 (10 mM mgSO4 함유 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8) 등에 현탁하고, DNase I 및 RNase A 등으로 처리한 후, 20 mM EDTA, 50 ㎍/ml Proteinase K 및 O.5% SDS 혼합액 등을 첨가하여, 약 65℃, 약 1시간 보온한 후, 이것을 페놀 추출 디에틸에테르 추출한 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시키고, 이어서 얻어진 DNA를 70% 에탄올로 세정한 후 건조하여, TE 용액(10 mM EDTA 함유 10 mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0)에 용해하는 등으로 하여 얻어진다. 또한, 목적으로 하고 있는 DNA는 서브 클로닝 등에 의해 대량으로 얻는 것도 가능하며, 예컨대 서브 클로닝은 숙주로서 대장균을 이용하여 플라스미드 벡터 등을 이용하여 행할 수 있다. 이러한 서브 클로닝에 의해 얻어진 DNA도, 상기한 것과 동일하게 하여 원심 분리, 페놀 추출, 에탄올 침전 등의 방법에 의해 정제 분리할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 얻어진 PCR 산물 등의 핵산(DNA를 포함함)은, 통상 1∼2% 아가로스 겔 전기 영동에 걸어, 특이한 밴드로서 겔로부터 잘라내어, 예컨대, gene clean kit(Bio 101) 등의 시판되는 추출 키트를 이용하여 추출한다. 추출된 DNA는 적당한 제한 효소로 절단하여, 필요에 따라 정제 처리하거나, 나아가서는 필요에 따라 5' 말단을 T4 폴리뉴클레오티드키나제 등에 의해 인산화한 후, pUC18 등의 pUC계 벡터와 같은 적당한 플라스미드 벡터에 라이게이션하여, 적당한 반응성 세포(competent cell)를 형질 전환한다. 클로닝된 PCR 산물은 그의 염기 서열을 해석할 수 있다. PCR 산물의 클로닝에는 예컨대, p-Direct(Clontech사), pCR-ScripTM SK(+)(Stratagene사), pGEM-T(Promega사), pAmpTM(Gibco-BRL사) 등의 시판되는 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 숙주 세포의 형질 전환을 하기 위해서는, 예컨대 파지 벡터를 사용하거나, 칼슘법, 루비듐/칼슘법, 칼슘/망간법, TFB 고효율법, FSB 동결 반응성 세포법, 신속 콜로니법, 일렉트로포레이션 등 이 분야에서 알려진 방법 또는 그것과 실질적으로 동일한 방법으로 행할 수 있다(D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983 등). 목적으로 하는 DNA를 단리하기 위해서는, 역전사 PCR(polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR), RACE(rapid amplification of cDNA ends)를 적용할 수 있다. RACE는 예컨대, M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols"(M. A. Frohman, "a guide to methods and applications"), pp. 28-38, Academic Press, New York(1990) 등에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.
DNA는 필요에 따라 클로닝할 수 있으며, 예컨대, 플라스미드, λ파지, 코스미드, P1파지, F 인자, YAC 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 λ파지 유래의 벡터를 들 수 있으며, 예컨대 Charon 4A, Charon 21A, λgt10, λgt11, λDASHII, λFIXII, λEMBL3, λZAPIITM(Stratagene사) 등을 이용할 수 있다. 또한, 얻어진 DNA를, 하기에서 상세히 설명하는 것과 같은 적당한 벡터, 예컨대, 플라스미드 pEX, pMAMneo, pKG5 등의 벡터에 삽입하여, 하기에서 자세히 설명하는 것과 같은 적당한 숙주 세포, 예컨대, 대장균, 효모, CHO 세포, COS 세포 등에서 발현시킬 수 있다. 또한, 이 DNA 단편은 그대로 또는 적당한 제어 서열을 부가한 DNA 단편으로서, 또는 적당한 벡터에 삽입하고, 그리고 동물에게 도입하여, 소정의 유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물을 작성할 수 있다. 동물로는 포유 동물을 들 수 있으며, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 몰모트, 소 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 마우스 등의 동물의 수정란에 그 DNA 단편을 도입하여, 트랜스제닉 동물을 작성할 수 있다. 소정의 유전자 산물의 확인을, 그 외래 유전자를 트랜스펙션한, 293T 세포, COS-1 세포 등의 그것에 알맞은 동물 세포 등을 이용하여 행할 수 있다.
외래 유전자를 포유 동물 등의 동물 세포에 도입하는 방법으로서는 이 분야에서 알려진 방법 또는 그것과 실질적으로 동일한 방법으로 행할 수 있으며, 예컨대 인산칼슘법(예컨대, F. L. Graham et al., Virology, 52: 456, 1973 등), DEAE-덱스트란법(예컨대, D. Warden et al., J. Gen. Virol., 3: 371, 1968 등), 일렉트로포레이션법(예컨대, E. Neumann et al., EMBO J, 1: 841, 1982 등), 마이크로이젝션법, 리보솜법, 바이러스 감염법, 파지입자법 등을 들 수 있다. 이렇게 해서 소정의 유전자가 트랜스펙션된 동물 세포가 산생하는 유전자 산물은 그것을 해석할 수도 있다.
소정의 유전자 등(본 발명에서 얻어진 DNA 등)을 삽입하는 플라스미드로서는 유전자 공학적으로 상용되는 숙주 세포(예컨대, 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 숙주, 효모, 293T 세포, CHO 세포, COS 세포 등의 진핵 세포 숙주, Sf21 등의 곤충 세포 숙주) 중에서 그 DNA가 발현할 수 있는 플라스미드라면 어떠한 플라스미드라도 좋다. 물론, 시판되는 키트나 시약에 첨부된 것에서 선택하여 사용할 수도 있다. 이러한 서열 내에는, 예컨대 선택한 숙주 세포에서 발현하는 데 적합하게 수식된 코돈이 포함되어 있을 수 있고, 제한 효소 부위가 마련되어 있을 수도 있으며, 목적으로 하는 유전자의 발현을 용이하게 하기 위한 발현 제어 서열, 조절 서열 등, 목적으로 하는 유전자를 결합하는 데에 도움이 되는 링커, 어댑터 등, 나아가서는 항생 물질 내성 등을 제어하거나, 대사를 제어하거나 하여, 선별 등에 유용한 서열(하이브리드 단백질이나 융합 단백질을 코드하는 것도 포함함) 등을 포함하고 있을 수 있다. 바람직하게는, 적당한 프로모터, 예컨대 대장균을 숙주로 하는 플라스미드에서는, 트립토판 프로모터(trp), 락토스 프로모터(lac), 트립토판·락토스 프로모터(tac), 리포프로테인 프로모터(lpp), λ파지PL 프로모터 등을, 동물 세포를 숙주로 하는 플라스미드에서는, SV4O 레이트 프로모터, MMTV LTR 프로모터, RSV LTR 프로모터, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등을, 효모를 숙주로 하는 플라스미드에서는, GAL1, GAL1O 프로모터 등을 사용할 수 있다. 또한 CYC1, HIS3, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, EN0, TP1, AOX1 등의 제어계를 사용할 수도 있다.
소망의 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 트랜스크립션을 촉진하기 위해서 인핸서를 벡터에 삽입할 수 있고, 그러한 인핸서로서는 프로모터에 작용하여 트랜스크립션을 촉진하는 작용을 갖는, 통상 약 10∼100 bp의 cis 작용을 갖는 엘리멘트의 것을 들 수 있다. 많은 인핸서가, 글로빈, 에라스타제, 알부민, α-페토프로테인, 인슐린 등의 포유 동물 유전자로부터 알려져 있다. 대표적으로는, 진핵 세포 감염성 바이러스로부터 얻어지는 인핸서를 적합하게 사용할 수 있으며, 예컨대 레플리케이션 오리진의 레이트 영역에 있는 SV40 인핸서(100-270 bp), 사이토메갈로바이러스의 초기 프로모터의 인핸서, 폴리오마의 레플리케이션 오리진의 레이트 영역에 있는 인핸서, 아데노바이러스의 인핸서 등의 예를 들 수 있다. 또한, 필요에 따라 숙주에 맞는 시그널 서열을 부가할 수도 있으며, 이들은 당업자에게 잘 알려져 있는 것을 사용할 수 있다.
대장균을 숙주로 하는 플라스미드로서는, 예컨대 pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript KSTM(Stratagene사) 등을 들 수 있다. 대장균에서의 발현에 알맞은 플라스미드 벡터로서는, 예컨대 pAS, pKK223(Pharmacia사), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B(Invitrogen사) 등도 들 수 있다. 동물 세포를 숙주로 하는 플라스미드로서는, 예컨대 SV40 벡터, 폴리오마·바이러스 벡터, 백시니아·바이러스, 레트로바이러스 벡터 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 pcD, pcD-SRα, CDM8, pCEV4, pME18S, pBC12BI, pSG5(Stratagene사) 등을 들 수 있다. 효모를 숙주로 하는 플라스미드로서는, YIp형 벡터, YEp형 벡터, YRp형 벡터, YCp형 벡터 등을 들 수 있고, 예컨대 pGPD-2 등을 들 수 있다. 숙주 세포로서는, 숙주 세포가 대장균인 경우, 예컨대 대장균 K12주에 유래하는 것을 들 수 있으며, 예컨대 NM533, XL1-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α, DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, B834주 유래로서는, BL21(DE3)pLysS 등을 들 수 있다. 세균에 있어서의 발현계로서, 예컨대, Chang et al., Nature(1978) 275: 615; Goeddel et al., Nature(1979) 281:544; Goeddel et al., Nucleic Acid Res., (1980) 8: 4057; EP 36,776, 미국 특허 제4,551,433호 명세서; deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983) 80:21-25; Siebenlist et al., Cell(1980) 20: 269 등의 기재를 참조할 수 있다. 숙주 세포가 효모인 경우, 예컨대 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces주, Candida, Trichoderma reesia, 그 밖의 효모주 등을 들 수 있다. 효모에 있어서의 발현계로서, 예컨대, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol.(1983) 153: 163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol.(1986) 6:142; Kunze et al., J. Basic Micro Biol.(1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Micro Biol.(1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet(1986) 202: 302; Das et al., J. Bacteriol.(1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol.(1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology(1990) 8: 135; Kunze et al., J. Basic Micr Biol.(1985) 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol.(1985) 5: 3376; 미국 특허 제4,837,148호 명세서, 동 제4,929,555호 명세서; Beach and Nurse, Nature(1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet.(1985) 10: 380; Gaillardin et al., Curr. Genet.(1985) 10: 49; Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.(1983)112: 284-289; Tilburn et al., Gene(1983) 26: 205-221; Yalton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81: 1470-1474; Kelly and Hynes, EMBO J., (1985) 4: 475479; EP 244,234; WO 91/00357 등에 기재되어 있는 것을 참조할 수 있다.
숙주 세포가 동물 세포인 경우, 예컨대 아프리카 미도리잘 선유아 세포 유래의 COS-7 세포, COS-1 세포, CV-1 세포, 인간 콩팥 세포 유래 293 세포, 인간 표피 세포 유래 A431 세포, 인간 결장 유래 205 세포, 마우스 선유아 세포 유래의 COP 세포, MOP 세포, WOP 세포, 차이니즈 햄스터 세포 유래의 CHO 세포, CHO DHFR- 세포, 인간 HeLa 세포, 마우스 세포 유래 C127 세포, 마우스 세포 유래 NIH 3T3 세포, 마우스 L 세포, 9BHK, HL60, U937, HaK, 주르캇 세포, 그 밖의 형질 전환되어 얻어진 셀라인, 통상의 2배체 세포, 시험관내의 일차 배양 조직으로부터 유도된 세포주 등을 들 수 있다. 포유 동물 발현은 예컨대, Dijkema et al., EMBO J.(1985) 4: 761; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982b) 79: 6777; Boshart et al., Cell(1985) 41: 521; 미국 특허 제4,399,216호 명세서; Ham and Wallace, Methods in Enzymology(1979) 58: 44; Barnes and Sato, Anal. Biochem.(1980) 102: 255; 미국 특허 제4,767,704호 명세서; 동 제4,657,866호 명세서; 동 제4,927,762호 명세서; 동 제4,560,655호 명세서; WO 90/103430; WO 87/00195; 미국 특허 제 RE30,985호 명세서 등에 기재되어 있는 것을 참조할 수 있다. 곤충 세포로서는, 집누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus), 그것에 유래하는 것 또는 그 밖의 적절한 것을 벡터로 하여, Spodoptera frugiperda(caterpillar), Aedes aegypti(mosquito), Aedes albopictus(mosquito), Drosophila melangaster(fruitfly), 집누에 유충 또는 집누에 배양 세포, 예컨대 BM-N 세포 등을 이용하는 것을 들 수 있다(예컨대, Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47-55(1988); Setlow, J. K. et al.(eds.), Genetic Engineering, Vol. 8, pp. 277-279, Plenum Publishing, 1986; Maeda et al., Nature, 315, pp. 592-594(1985)). 곤충에 있어서의 이종 유전자의 발현에 대해서는 예컨대, 미국 특허 제4,745,051호 명세서; Friesen et al.(1986), "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", The Molecular Biology of Baculoviruses(W. Doerfler(Ed)); EP 127,839; EP 155,476; Vlak et al., J. Gen. Virol., (1988) 69:765-776; Miller et al., Ann. Rev. MicroBiol.(1988) 42: 177; Carbonell et al., Gene(1988) 73: 409; Maeda et al., Nature, (1985) 315:592-594; Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:8404; Miyajima et al., Gene(1987) 58: 273; Martin et al., DNA(1988)7: 99 등에 기재되어 있는 것을 참조할 수 있다. 또한, 다수의 바큐로바이러스주와 개변체 및 숙주 유래의 대응하는 허용 곤충 숙주 세포에 대해서는 예컨대, Luckow et al., Bio/Technology(1988) 6: 47-55; Miller et al., Generic Engeneering(Serlow, J. K. et al.(Ed)) Vol. 8(Plenum Pub1ishing, 1986) pp. 277-279; Maeda et al., Nature(1985) 315: 592-594 등에 기재되어 있는 것을 참조할 수 있다.
Agrobacterium tumefaciens 등을 이용하여, 식물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 것도 가능하며, 그것에 알맞은 벡터와 함께, 이들은 이 분야에서 널리 알려져 있다. 본 발명의 유전자 공학적 수법에 있어서는, 이 분야에서 알려진 또는 범용되고 있는 제한 효소, 역전사 효소, DNA 단편을 클론화하는 데에 알맞은 구조로 수식하거나 또는 변환하기 위한 효소인 DNA 수식·분해 효소, DNA 폴리머라제, 말단 뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제, DNA 리가아제 등을 이용할 수 있다. 제한 효소로서는 예컨대, R. J. Roberts, Nucleic Acids Res., 13: r165, 1985; S. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. Macelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991 등에 기재된 것을 들 수 있다.
본 발명에 따라서, 폴리펩티드(또는 단백질)를 코드하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체는 필요에 따라 적당한 선택 마커를 이용하여, 반복 클로닝을 행함으로써, 높은 발현능을 안정적으로 갖는 세포주를 얻을 수 있다. 예컨대, 숙주 세포로서 동물 세포를 이용한 형질 전환체에 있어서, dhfr 유전자를 선택 마커로서 이용한 경우, MTX 농도를 서서히 올려 배양하여, 내성주를 선택함으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 증폭시켜, 보다 높은 발현을 얻을 수 있는 세포주를 얻을 수 있다. 본 발명의 형질 전환체는, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산이 발현 가능한 조건 하에서 배양하여, 목적물을 생성, 축적시킬 수 있다. 이 형질 전환체는, 이 분야에서 범용되고 있는 배지 중에서 배양할 수 있다. 예컨대, 대장균, 고초균 등의 원핵 세포 숙주, 효모 등을 숙주로 하고 있는 형질 전환체는, 액체 배지를 적합하게 사용할 수 있다. 배지 중에는, 상기 형질 전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물, 기타가 함유된다. 탄소원으로서는, 예컨대 글루코오스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등, 질소원으로서는, 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘 스티프 리쿼(corn steep liquor), 펩톤, 카제인, 고기 엑기스, 맥아 엑기스, 대두박, 감자 추출액 등의 무기 또는 유기 물질, 무기물로서는 예컨대, 염화칼슘, 인산2수소나트륨, 염화마그네슘, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 또한, 효모, 비타민류, 카사미노산, 생장 촉진 인자 등을 첨가하더라도 좋다. 또한, 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작용하게 하기 위해서, 예컨대, 3β-인돌릴 아크릴산과 같은 약제를 가할 수 있다. 배지의 pH는 약 5∼약 8이 바람직하다.
배양은, 예컨대 대장균에서는 통상 약 15∼약 45℃에서 약 3∼약 75시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가하는 것도 가능하다. 숙주가 동물 세포인 형질 전환체를 배양할 때, 배지로서는, 예컨대 약 5∼약 20%의 우태아 혈청을 포함하는 MEM 배지, PRMI1640 배지, DMEM 배지 등이 이용된다. pH는 약 6∼약 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30∼약 40℃에서 약 15∼약 72시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가한다. 소정의 유전자 산물을 발현하고 있는 형질 전환체는 그대로 이용 가능한데, 그 세포 호모지네이트로서도 이용할 수 있지만, 소정의 유전자 산물을 단리하여 이용하는 것도 가능하다. 상기 배양 세포로부터 추출함에 있어서는, 배양 후에, 공지의 방법으로 균체 또는 세포를 모아, 이것을 적당한 완충액에 현탁하여, 초음파, 리조침 및/또는 동결 융해 등에 의해서 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심 분리나 여과에 의해 조추출액을 얻는 방법 등을 적절하게 이용할 수 있다. 완충액 중에는 요소나 염산구아니딘 등의 단백질 변성제나, 트리톤X-100(상품명), 트윈20(상품명) 등의 계면 활성제를 첨가해 두더라도 좋다. 배양액 중에 목적 생성물이 분비되는 경우에는, 배양 종료 후에, 그 자체 공지의 방법으로 균체 또는 세포와 상청을 분리하여, 상청을 모은다.
이와 같이 하여 얻어진 배양 상청, 또는 추출액 중에 포함되는 목적 생성물은 자체 공지의 분리·정제법을 적절히 조합하여 그 정제를 행할 수 있으며, 예컨대 황산암모늄 침전법 등의 염석, 세파덱스 등에 의한 겔 여과법, 예컨대 디에틸아미노에틸기 또는 카르복시메틸기 등을 갖는 담체 등을 이용한 이온 교환 크로마토그래피법, 예컨대 부틸기, 옥틸기, 페닐기 등 소수성 기를 갖는 담체 등을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 색소 겔 크로마토그래피법, 전기영동법, 투석, 한외여과법, 어피니티·크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법 등에 의해 정제하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 리간드 등을 고정화한 어피니티·크로마토그래피 등으로 처리하여 정제 분리 처리할 수 있다. 이 리간드로서는, 특이적 인식을 하는 모노클로날 항체를 포함한 항체 또는 그 프레그먼트, 렉틴, 당, 결합 페어의 한 쪽 등을 들 수 있다. 예컨대, 이뮤노·어피니티·크로마토그래피, 젤라틴-아가로스·어피니티·크로마토그래피, 헤파린-아가로스·크로마토그래피 등을 들 수 있다.
또한 얻어진 본 발명의 폴리펩티드(또는 단백질)는, 화학적인 수법으로 그 함유되는 아미노산 잔기를 수식할 수도 있고, 펩티다아제, 예컨대 펩신, 키모트립신, 파파인, 브로멜라인, 엔도펩티다아제, 엑소펩티다아제 등의 효소를 이용하여 수식하거나, 부분 분해하기나 하여 그 유도체 등으로 할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는, C 말단이 통상 카르복실기(-COOH) 또는 카르복실레이트(-COO-)이지만, C 말단이 아미드(-CONH2) 또는 에스테르(-COOR)라도 좋다. 여기서 에스테르에 있어서의 R로서는 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C1 - 6알킬기, 예컨대, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C3 - 8시클로알킬기, 예컨대, 페닐, α-나프틸 등의 C6 - 12아릴기, 예컨대, 벤질, 페네틸 등의 페닐-C1 - 2알킬기 또는 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C1 - 2알킬기 등의 C7 - 14아랄킬기 외에, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등이 이용된다. 본 발명의 단백질이 C 말단 이외에 카르복실기(또는 카르복실레이트)를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다. 이 경우의 에스테르로서는, 예컨대 상기한 C 말단의 에스테르 등이 이용된다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드(또는 단백질)에는, 상기한 폴리펩티드에 있어서, N 말단의 메티오닌 잔기의 아미노기가 보호기(예컨대, 포르밀기, 아세틸 등의 C1-5알킬-카르보닐기 등의 C1 - 6아실기 등)로 보호되어 있는 것, N 말단측이 생체내에서 절단되어 생성된 글루타밀기가 피로글루타밀화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기(예컨대, -OH, -COOH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등)가 적당한 보호기(예컨대, 포르밀기, 아세틸기 등의 C1 - 6아실기 등)로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합한 소위 당 단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 유전자의 염기 서열을 기초로 유전자 공학적으로 상용되는 방법을 이용함으로써, 소정의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중에 적절하게, 1개 내지 복수 개 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 전이 또는 부가한 것과 같은 변이를 도입한 상당하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 변이·변환·수식법으로서는, 예컨대 일본생화학회편, 「속 생화학 실험 강좌 1, 유전자 연구법 II」, p105(히로세 스스무), 동경화학동인(1986); 일본생화학회편, 「신 생화학 실험 강좌 2, 핵산 III(재조합 DNA 기술)」, p233(히로세 스스무), 동경화학동인(1992); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 154, p.350 & p.367, Academic Press, New York(1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p.457 & p.468, Academic Press, New York(1983); J. A. Wells et al., Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et al., Nucleic Acids Res., 13: 3305, 1985; J. Taylor et al., Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 155, p.568, Academic Press, New York(1987); A. R. Oliphant et al., Gene, 44: 177, 1986 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 예컨대 합성 올리고뉴클레오티드 등을 이용하는 위치 지정 변이 도입법(부위 특이적 변이 도입법)(Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331, 1986), 카세트 변이 도입법(cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985), 제한 부위 선택 변이 도입법(restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986), 알라닌·스캐닝법(Cunningham & Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989), PCR 변이 도입법, Kunkel법, dNTP[αS]법(Eckstein), 아황산이나 아질산 등을 이용하는 영역 지정 변이 도입법 등의 방법을 들 수 있다.
또한, 유전자 재조합법으로 제조할 시에 융합 폴리펩티드(융합 단백질)로서 발현시켜, 생체내 또는 생체외에서, 소망의 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖고 있는 것으로 변환·가공하더라도 좋다. 유전자 공학적으로 상용되는 융합 산생법을 이용할 수 있지만, 이러한 융합 폴리펩티드는 그 융합부를 이용하여 어피니티 크로마토그래피 등으로 정제하는 것도 가능하다. 이러한 융합 폴리펩티드로서는, 히스티딘 태그에 융합된 것, 또는 β-갈락토시다제(β-gal), 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타치온-S-트랜스페라제(GST), 티오레독신(TRX) 또는 Cre Recombinase의 아미노산 서열에 융합된 것 등을 들 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드는 이질적인 에피톱의 태그를 부가할 수 있고, 이 에피톱에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 이뮤노 어피니티·크로마토그래피에 의한 정제를 할 수 있도록 할 수도 있다. 보다 알맞은 실시 태양에 있어서는, 폴리히스티딘(poly-His) 또는 폴리히스티딘-글리실(poly-His-Gly) 태그, 또한 이 에피톱 태그로서는, 예컨대 AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, HA, Ha.11, KT3, FLAG(registered trademark, Sigma-Aldrich), Omni-probe, S-probe, T7, Lex A, V5, VP16, GAL4, VSV-G 등을 들 수 있다(Field et al., Molecular and Cellular Biology, 8: pp.2159-2165(1988); Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: pp.3610-3616(1985); Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): pp.547-553(1990); Hopp et al., BioTechnology, 6: pp.1204-1210(1988); Martin et al., Science, 255: pp·192-194(1992); Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: pp.15163-15166(1991); Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp.6393-6397(1990) 등). 효모를 이용한 two-hybrid법도 이용할 수 있다.
또한 융합 폴리펩티드로서는, 검출 가능한 단백질이 되는 마커가 첨부된 것도 가능하다. 보다 적합한 실시 태양에 있어서는, 이 검출 가능한 마커는, 비오틴/스트렙토아비딘계의 Biotin Avi Tag, 형광을 발하는 물질 등이라도 좋다. 이 형광을 발하는 물질로서는, 애쿼리아 빅토리아(Aequorea victorea) 등의 발광 해파리 유래의 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 그것을 개변한 변이체(GFP variant), 예컨대, EGFP(Enhanced-humanized GFP), rsGFP(red-shift GFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein: YFP), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP), 남색 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein: BFP), 바다팬지(Renilla reniformis) 유래의 GFP 등을 들 수 있다(미야와키 아쯔시편, 실험의학 별책 포스트게놈 시대의 실험 강좌 3-GFP와 바이오이미징, 요도샤(2000년)). 또한, 상기 융합태그를 특이적으로 인식하는 항체(모노클로날 항체 및 그 프레그먼트를 포함함)를 사용하여 검출을 하는 것도 가능하다. 이러한 융합 폴리펩티드의 발현 및 정제는, 그것에 알맞은 시판되는 키트를 이용하여 행할 수 있으며, 키트 제조업자 또는 키트 판매업자에 의해 밝혀져 있는 프로토콜에 따라서 실시할 수도 있다.
얻어진 단백질(펩티트 또는 폴리펩티드를 포함하고 있어도 좋음)은 그것을 효소 면역 측정법 등 알려진 수법으로, 적당한 담체 또는 고상으로 결합시켜 고상화할 수 있다. 고상화 단백질, 고상화 펩티트는 편리하게 결합 분석이나 물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.
폴리펩티드나 단백질의 구조의 수식·개변 등은, 예컨대 일본생화학회편, 「신 생화학 실험 강좌 1, 단백질 VII, 단백질 공학」, 동경화학동인(1993)을 참고로 하여, 거기에 기재된 방법 또는 거기서 인용된 문헌 기재의 방법, 나아가서는 이들과 실질적으로 동일한 방법으로 행할 수 있다. 또한 하기하는 것과 같이 그 생물학적 활성 중에는, 면역적으로 활성, 예컨대 항원성을 갖는다는 것도 포함되어도 좋다. 이 수식·개변 중에는, 탈아미노화, 히드록실화, 카르복실화, 인산화, 황산화, 메틸화 등의 알킬화, 아세틸화 등의 아실화, 에스테르화, 아미드화, 개환, 폐환, 글리코실화, 함유 당쇄의 종류를 다른 것으로 바꾸는 것, 함유 당쇄의 수를 증감시키는 것, 지질 결합, D-체 아미노산 잔기에의 치환 등이라도 좋다. 이들 방법은, 이 분야에서 알려져 있다(예컨대, T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, pp.79-86 W. H. Freeman & Co., San Francisco, USA(1983) 등).
본 발명의 갈렉틴 9 개변체를 이용하여, 그 갈렉틴 9의 소정의 생물학적 활성 등의 기능(예컨대, 세포 상해 활성, 아포토시스 유도 활성, 글루코콜티코이드와 유연 관계의 활성, 악성 세포의 전이를 억제하는 활성 등)을 촉진하는 화합물(작용물질)이나 저해하는 화합물(길항물질) 또는 그들의 염을 스크리닝할 수 있다. 이 것은 그 스크리닝 시약의 제공도 의미한다. 이리하여, 본 발명에서 해명되는 이 갈렉틴 9 단백질 등의 폴리펩티드, 그 일부의 펩티트 또는 그들의 염이 나타내는 활성을 이용한다. 여러 가지 물질에 관하여, 본 발명의 상기 갈렉틴 9 단백질, 그 일부의 펩티트 또는 그들의 염 등이 나타내는 생물학적 활성 등의 소정의 기능을 촉진하는 화합물(작용물질)이나 저해하는 화합물(길항물질) 또는 그들의 염의 스크리닝 방법도 제공된다.
이 스크리닝에서는, 예컨대 (i) 갈렉틴 9 개변체 단백질, 그 일부의 펩티드 또는 그들의 염(이 단백질을 발현하는 형질 전환체를 포함하고 있더라도 좋음, 이하 마찬가지) 등에 적당한 시험 시료를 접촉시킨 경우와, (ii) 본 발명의 단백질, 그 일부의 펩티트 또는 그들의 염 등에 문제의 시험 시료가 존재하지 않는 경우의 비교를 한다. 구체적으로는 상기 스크리닝에서는, 그 생물학적 활성(예컨대, 각 갈렉틴 9 단백질과 생체 성분과의 사이의 상호 작용에 관련된 활성 등)을 측정하여, 비교한다.
이 스크리닝계에는, 측정에 편리하게 되도록 적당한 검지용 기질을 존재시키더라도 좋다. 이 기질로서는, 측정에 유효하게 이용할 수 있는 것이라면 어느 하나라도 좋다. 예컨대, 공지의 기질로서 알려져 있는 것 중에서 선택하여 이용할 수 있는데, 바람직하게는 합성된 화합물 등을 사용할 수 있다. 기질은, 그대로 사용할 수 있지만, 바람직하게는 플루오레세인 등의 형광, 효소나 방사성 물질로 표식한 것을 사용할 수 있다.
시험 시료로서는, 예컨대 단백질, 펩티트, 비펩티트성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 식물 추출물, 동물 등의 조직 추출물, 세포 추출물 등을 들 수 있다. 시험 시료에 사용되는 시험 화합물의 예에는, 바람직하게는 항갈렉틴 항체, 효소 저해제, 시토킨, 각종 인히비터 활성을 갖는 화합물, 특히 합성 화합물 등을 포함하고 있어도 좋다. 이들 화합물은, 신규의 화합물이라도 좋고, 공지의 화합물이라도 좋다. 이 스크리닝은, 통상의 결합 활성 또는 효소 활성의 측정법에 준하여 실시할 수 있으며, 예컨대 이 분야에서 공지된 방법 등을 참고로 하여 실시할 수 있다. 또한, 각종 표식, 완충액계 그 밖의 적당한 시약 등을 사용하거나, 여기서 설명한 조작 등에 준하여 행할 수 있다. 사용 펩티트 등은, 활성화제로 처리하거나, 그 전구체 또는 잠재형의 것을 활성형의 것으로 미리 변환해 두는 것도 가능하다. 측정은 통상 Tris-HCl 완충액, 인산염 완충액 등의 반응에 악영향을 주지 않는 완충액 등 중에서, 예컨대, pH 약 4∼약 10(바람직하게는, pH 약 6∼약 8)에 있어서 행할 수 있다. 이들 개개의 스크리닝에 있어서는, 각각의 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 가하여, 본 발명의 이 갈렉틴 9단백질 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 펩티트에 관련된 측정계를 구축하면 된다. 이들의 일반적인 기술 수단의 상세에 대해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다[예컨대, Methods in Enzymology, Academic Press사(USA) 발행) 등 참조]. 또한, 아포토시스 유도 활성 측정법 등은, 다누마 세이이치 감수, 「세포공학별책: 실험 프로토콜 시리즈, 아포토시스 실험 프로토콜」 주식회사 슈쥰사, 1995년 1월 20일(제1판 제2쇄) 등을 참고로 할 수 있고, 시판되는 측정 키트 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝 키트를 이용하여 얻어지는 화합물 또는 그의 염은, 상기한 시험 화합물, 예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티트성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 등에서 선택된 화합물이며, 본 발명의 단백질 등의 기능을 촉진하거나 또는 저해하는 화합물이다. 이 화합물의 염으로서는 예컨대, 약학적으로 허용되는 염 등을 들 수 있다. 예컨대, 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등을 들 수 있다. 무기 염기와의 염의 적합한 예로서는 예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 및 알루미늄염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 유기 염기와의 염의 적합한 예로서는 예컨대, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 등과의 염을 들 수 있다. 무기산과의 염의 적합한 예로서는 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염의 적합한 예로서는, 예컨대, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 호박산, 말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 벤조산 등과의 염을 들 수 있다. 염기성 아미노산과의 염의 적합한 예로서는 예컨대, 아르기닌, 리신, 오르니틴 등과의 염을 들 수 있고, 산성 아미노산과의 염의 적합한 예로서는 예컨대, 아스파라긴산, 글루타민산 등과의 염을 들 수 있다.
본 발명의 활성 성분[예컨대, (a) 상기 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드, 그 일부의 펩티트 또는 그들의 염, 그것에 관련된 펩티드 등, (b) 상기 갈렉틴 9 개변체 또는 그 관련 폴리펩티드를 코드하는 DNA 등의 핵산 등, (c) 상기 갈렉틴 9 단백질의 문제의 활성을 제어하는 화합물(이 갈렉틴 9 단백질의 세포 상해 활성, 아포토시스 유도 활성, 정상 세포에는 악영향을 주지 않고서 소정의 효능을 다하는 활성 등을 촉진하거나 또는 억제·저해하는 등의 현상, 또는 조직 또는 단백질의 변질·과잉 생산 또는 분해 현상과 같은 생물학적 활성을 촉진하거나 또는 억제 및/또는 저해하는 화합물) 또는 그의 염, 상기 단백질 산생을 제어하는 화합물 또는 그의 염, (d) 본 발명을 사용하여 발견된 활성 물질 등]을 의약으로서 이용하는 경우, 통상 단독 또는 약리적으로 허용되는 각종 제제 보조제와 혼합하여, 의약 조성물 또는 의약 조제물 등으로서 투여할 수 있다. 바람직하게는, 경구 투여, 국소 투여, 또는 비경구 투여 등의 사용에 알맞은 제제 조제물의 형태로 투여되며, 목적에 따라서 어느 투여 형태(흡입법 또는 직장 투여도 포함함)에 의하더라도 좋다.
또한, 본 발명의 활성 성분은, 각종 의약, 예컨대 항종양제(항암제), 종양 전이 억제제, 혈전 형성 저해제, 관절 파괴 치료제, 진통제, 소염제, 면역 조절제 및/또는 면역 억제제와 배합하여 사용할 수도 있으며, 이들은 유리한 기능을 갖는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있고, 예컨대 이 분야에서 알아진 것 중에서 선택할 수 있다.
그리고, 비경구적인 투여 형태로서는, 국소, 경피, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 또는 복강내 투여를 포함할 수 있는데, 환부에의 직접 투여도 가능하고, 또한 어떤 경우에는 적합하다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유 동물에게 경구적으로, 또는 비경구적(예, 세포내, 조직내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 복강내, 흉강내, 척수강내, 점적법, 주장(注腸), 경직장, 점이, 점안이나 점비, 치아, 피부나 점막에의 도포 등)으로 투여할 수 있다. 구체적인 제제 조제물의 형태로서는, 용액 제제, 분산 제제, 반고형 제제, 분립체 제제, 성형 제제, 침출 제제 등을 들 수 있으며, 예컨대, 정제, 피복 정제, 당의를 실시한 제, 환제, 트로치제, 경캡슐제, 연캡슐제, 마이크로캡슐제, 매립제, 분말제, 산제, 과립제, 세립제, 주사제, 액제, 엘릭시르제, 에멀젼제, 관주제, 시럽제, 수제, 유제, 현탁제, 리니멘트제, 로션제, 에어졸제, 스프레이제, 흡입제, 분무제, 연고 제제, 경고 제제, 첨부제, 페이스트제, 습포제, 크림제, 오일제, 좌제(예컨대, 직장좌제), 팅크제, 피부용수제, 점안제, 점비제, 점이제, 도포제, 수액제, 주사용 액제 등을 위한 분말제, 동결 건조 제제, 겔 조제품 등을 들 수 있다.
의약용의 조성물은 통상의 방법에 따라서 제제화할 수 있다. 예컨대, 적절하게 필요에 따라 생리학적으로 허용되는 담체, 의약으로서 허용되는 담체, 아쥬반트제, 부형제, 보형제, 희석제, 향미제, 향료, 감미제, 비히클, 방부제, 안정화제, 결합제, pH 조절제, 완충제, 계면 활성제, 기제, 용제, 충전제, 증량제, 용해보조제, 가용화제, 등장화제, 유화제, 현탁화제, 분산제, 증점제, 겔화제, 경화제, 흡수제, 점착제, 탄성제, 가소제, 붕괴제, 분사제, 보존제, 항산화제, 차광제, 보습제, 완화제, 대전 방지제, 무통화제 등을 단독으로 또는 조합하여 이용하고, 그것과 함께 본 발명의 단백질 등을 혼화함으로써, 일반적으로 확인된 제제 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 하여 제조할 수 있다.
비경구적 사용에 알맞은 제제로서는, 활성 성분과, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 매체와의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등, 예컨대 주사제 등을 들 수 있다. 일반적으로는, 물, 식염수, 덱스트로스 수용액, 기타 관련된 당의 용액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 글리콜류를 바람직한 주사제용 액체 담체로서 들 수 있다. 주사제를 조제할 때는, 증류수, 링거액, 생리 식염액과 같은 담체, 적당한 분산화제 또는 습화제 및 현탁화제 등을 사용하여 이 분야에서 알려진 방법으로, 용액, 현탁액, 에멀젼과 같은 주사할 수 있는 형태로 조제한다.
주사용의 수성액으로서는, 예컨대 생리 식염액, 포도당이나 그 밖의 보조약(예컨대, D-솔비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등)을 포함하는 등장액 등을 들 수 있으며, 약리적으로 허용되는 적당한 용해 보조제, 예컨대 알콜(예컨대 에탄올 등), 폴리알콜(예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면 활성제(예컨대 폴리솔베이트80TM, HCO-50 등) 등과 병용하더라도 좋다. 유성액으로서는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알콜 등과 병용하더라도 좋다. 또한, 완충제(예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액 등) 또는 침투압 조절을 위한 시약, 무통화제(예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제(예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제(예컨대, 벤질알콜, 페놀 등), 아스코르빈산 등의 산화 방지제, 흡수 촉진제 등과 배합하더라도 좋다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전된다.
비경구 투여에는, 계면 활성제 및 그 밖의 약학적으로 허용되는 조제를 첨가하거나, 또는 첨가하지 않고서, 물, 에탄올 또는 오일과 같은 무균의 약학적으로 허용되는 액체 중의 용액 또는 현탁액의 형태로 제제화된다. 제제에 사용되는 유성 비히클 또는 용제로서는, 천연 또는 합성 또는 반합성의 모노 또는 디 또는 트리글리세리드류, 천연, 반합성 또는 합성의 유지류 또는 지방산류를 들 수 있고, 예컨대 피너츠유, 옥수수유, 대두유, 참기름 등의 식물유를 들 수 있다. 예컨대, 이 주사제는, 통상 본 발명 화합물을 0.1∼10 중량% 정도 함유하도록 조제될 수 있다.
국소적, 예컨대 구강, 또는 직장적 사용에 알맞은 제제로서는, 예컨대 세구제, 양치제, 구강 분무제, 흡입제, 연고제, 치과 충전제, 치과 코팅제, 치과 페이스트제, 좌제 등을 들 수 있다. 세구제, 기타 치과용제로서는, 약리적으로 허용되는 담체를 이용하여 관용의 방법에 의해 조제된다. 구강 분무제, 흡입제로서는, 본 발명 화합물 자체 또는 약리적으로 허용되는 불활성 담체와 함께 에어졸 또는 네블라이저용의 용액에 용해시키거나 또는, 흡입용 미분말로서 치아 등에 투여할 수 있다. 연고제는 통상 사용되는 기제, 예컨대, 연고 기제(백색 바셀린, 파라핀, 올리브유, 매크로골400, 매크로골 연고 등)등을 첨가하여, 관용의 방법에 의해 조제된다.
치아, 피부에의 국소 도포용의 약품은, 적절하게 살균한 물 또는 비수부형제의 용액 또는 현탁액으로 조제할 수 있다. 첨가제로서는, 예컨대 아황산수소나트륨 또는 에데트산2나트륨과 같은 완충제; 아세트산 또는 질산페닐수은, 염화벤잘코늄 또는 클로로헥시딘과 같은 살균 및 항진균제를 포함하는 방부제 및 히프로멜로스와 같은 농후제를 들 수 있다.
좌제는, 이 분야에서 주지된 담체, 바람직하게는 비자극성의 적당한 보형제, 예컨대 폴리에틸렌글리콜류, 라놀린, 카카오 기름, 지방산트리글리세라이드 등의, 바람직하게는 상온에서는 고체이지만 장관의 온도에서는 액체이며 직장내에서 융해되어 약물을 방출하는 것 등을 사용하여, 관용의 방법에 의해 조제되는데, 통상 본 발명 화합물을 0.1∼95 중량% 정도 함유하도록 조제된다. 사용하는 부형제 및 농도에 따라서 약품은 부형제에 현탁시키거나 또는 용해시킬 수 있다. 국부 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 보조약은, 부형제에 용해 가능하다. 경구적 사용에 알맞은 제제로서는 예컨대, 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 트로키와 같은 고형 조성물이나, 액제, 시럽제, 현탁제와 같은 액상 조성물 등을 들 수 있다. 제제 조제할 때는, 이 분야에서 알려진 제제 보조제 등을 이용한다. 정제 및 환제는 추가로 장용 코팅되어 제조되는 것도 가능하다. 조제 단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다.
또한, 활성 성분이 단백질이나 폴리펩티드인 경우, 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 포유 동물 중에서 매우 독성이 낮으므로, 그것을 결합시키는 것은 특히 유용하다. 또한, PEG을 결합시키면, 이종성 화합물의 면역 원성 및 항원성을 효과적으로 감소시킬 수 있는 경우가 있다. 그 화합물은, 마이크로 캡슐 장치 속에 넣어 부여하더라도 좋다. PEG와 같은 중합체는 아미노 말단의 아미노산의 α-아미노기, 리신 측쇄의 ε-아미노기, 아스파라긴산 또는 글루타민산 측쇄의 카르복실기, 카르복시 말단의 아미노산의 α-카르복실기 또는 특정 종류의 아스파라긴산, 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착된 글리코실쇄의 활성화된 유도체에, 간편하게 부착시킬 수 있다.
단백질과의 직접적인 반응에 알맞은 많은 활성화된 형태의 PEG가 알려져 있다. 단백질의 아미노기와 반응시키는 데에 유용한 PEG 시약으로서는, 카르복실산, 카르보네이트 유도체의 활성 에스테르, 특히, 이탈기가 N-히드록시숙신산이미드, p-니트로페놀, 이미다졸, 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-4-술포네이트인 것을 들 수 있다. 마찬가지로, 아미노히드라진 또는 히드라지드기를 함유하는 PEG 시약은, 단백질 중의 과요소산 산화에 의해서 생성된 알데히드와의 반응에 유용하다.
본 발명의 진단 및 치료는, 포유 동물이 나타내고 있을 지도 모르는 특정한 자기면역 등의 질환·병, 암 등의 악성 종양을 포함한 종양, 알레르기 질환, 염증 등에 대해서 적절하도록, 그 포유 동물을 진단함으로써 그 실시가 개시된다. 진단은 또한, 처치의 진행을 모니터하기 위해서, 및 예컨대, 이루어지고 있는 치료에 있어서의 투여량 또는 투여 회수와 같은 파라미터를 바꾸는지의 여부를 판단하기 위해서, 치료 수순으로서 치료 동안 계속될 수 있다. 갈렉틴 9 개변체 치료약의 투여에 관한 적절성을 결정하는 것을 도울 수 있는 진단 수법으로서는, 포유 동물에 있어서의 갈렉틴 9의 발현 레벨의 분석, 및 자기면역 부위로부터 떨어진 림프구 등의 세포와 자기면역의 부위에 근접하는 림프구 등의 세포와의 사이의 이들의 레벨 비교 등을 들 수 있다. 처치되어야 할 포유 동물의 자기면역 질환 등의 질환·병, 암 등의 악성 종양을 포함한 종양, 알레르기 질환, 염증 등은 세포내의 갈렉틴 9 항원을 검출함으로써 모니터될 수 있다. 이 모니터링은 포유 동물 유래의 샘플을 갈렉틴 9 특이적 항체와 접촉시키고, 그리고 샘플과의 항체의 결합을 검출하는 것을 포함하고 있어도 좋다.
유전자 치료용 비히클은, 포유 동물에 있어서의 발현을 위해 포유 동물에게 송달되어야 하는 본 발명의 치료약인 코드 서열(예컨대, 갈렉틴 9 개변체 코드 서열)을 포함하고 있는 구축물(컨스트럭트, construct)을 송달하기 위한 것, 또는, 갈렉틴 9 개변체의 전부 또는 부분이며 또한 송달을 위한 것인 핵산 서열도 포함하고 있는 상기 구축물을 송달하기 위한 것으로, 국소적 또는 전신적 중 어느 방법으로 투여할 수 있는 것이다. 이들 구축물은, 생체내 또는 생체외의 형태로, 바이러스 벡터에 의한 어프로치 또는 비바이러스 벡터 형식으로의 어프로치를 이용할 수 있다. 이러한 코드 서열을 발현하기 위해서는, 내인성의 포유 동물 프로모터 또는 이종 프로모터를 사용하여 유도함으로써 행할 수 있다. 생체내에서의 코드 서열의 발현은, 구축적으로 이루어지거나, 또는 조절되어 이루어지는 것 중 어느 하나이다. 갈렉틴 9 개변체가 포유 동물에 있어서 발현되는 경우, 가용성의 갈렉틴 9 개변체로서 발현될 수 있고, 어떤 경우에는 전구체형 갈렉틴 9 개변체로서 발현되는 것도 가능하다. 이들 양방에 있어서 또는 그 어느 하나인가에 있어서, 이들은 예컨대, 모든 갈렉틴 9 개변체, 또는 갈렉틴 9 개변체의 생물학적으로 활성인 부분, 변이체, 유도체 또는 융합체 등이라도 좋다.
본 발명은, 소요의 갈렉틴 9 개변체의 핵산 서열을 발현할 수 있는 유전자 송달 비히클을 제공한다. 유전자 송달 비히클로서는, 바람직하게는, 바이러스 벡터를 들 수 있으며, 보다 바람직하게는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스(AAV), 헤르페스바이러스, 또는 알파바이러스 등의 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 또한 아스트로바이러스, 코로나바이러스, 오르쏘믹소바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 파르보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 토가바이러스 등의 바이러스 벡터도 들 수 있다. 이 유전자 송달 비히클에 대해서는 일반적으로는, D. Jolly, Cancer Gene Therapy, 1(1): 51-64(1994); 0. Kimura et al., Human Gene Therapy, 5: 845-852(1994); S. Connelly et al., Human Gene Therapy, 6: 185-193(1995); M. G. Kaplitt et al., Nature Genetics, 8: 148-153(1994) 등을 참조할 수 있다.
레트로바이러스 벡터는, 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예컨대, B형, C형, 및 D형 레트로바이러스, 친이종(xenotropic) 레트로바이러스(예컨대, NZB-X1, NZB-X2, NZB9.1(R. R. 0'Neill, J. Virol., 53: 100-106(1985) 참조) 등), 폴리트로픽(polytropic) 레트로바이러스(예컨대, MCF, MCF- mlV(M. Kelly, J. Virol., 45: 291-298(1983) 참조) 등), 스푸마바이러스, 렌티바이러스 등(R. L. Weiss et al. (Eds.), RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1985 참조)을 포함하는 임의의 레트로바이러스 유전자 치료 벡터가 본 발명에 있어서 사용 가능하다.
유전자 치료 레트로바이러스 벡터의 일부는, 다른 레트로바이러스 유래의 것이라도 좋다. 예컨대, 레트로 벡터의 LTR는 쥐 육종 바이러스 유래의 것이라도 좋고, tRNA 결합 부위는 로우스 육종 바이러스 유래의 것이라도 좋고, 패키징 시그널은 쥐 백혈병 바이러스 유래의 것이라도 좋고, 제2쇄 합성 오리진은 조류 백혈증 바이러스 유래의 것이라도 좋다. 이들 재조합 레트로바이러스 벡터는, 이들을 적절한 패키징 세포주에 도입함으로써 형질 도입 가능한 레트로바이러스 벡터 입자를 형성시키는 데에 사용할 수 있다(미국 특허 제5,591,624호 명세서 참조). 레트로바이러스 벡터는, 인테그라제라는 목적 DNA를 숙주 세포의 DNA 중에 부위 특이적으로 삽입하는 능력을 갖는 삽입 효소를 레트로바이러스 입자 내에 갖도록 함으로써 구축할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터로서는, 복제능 결손 재조합 바이러스인 것이 바람직하다.
상기한 레트로바이러스 벡터와의 사용에 적합한 패키징 세포주로서는, 이 분야에서 잘 알려져 있는 것을 들 수 있으며, 또한 용이하게 조제될 수 있다(미국 특허 제6,013,517호 명세서, WO 92/05266 참조). 이 패키징 세포주는, 재조합 벡터 입자를 산생하기 위한 프로듀서 세포주(벡터 세포주, vector cell line: VCL)를 제작하는 데 사용할 수 있다. 바람직하게는, 패키징 세포주는, 인간 혈청 중에서 불활화하는 일이 없도록 하여, 인간의 친세포(예컨대, HT1080 세포) 또는 밍크의 친세포주로부터 제작된다.
레트로바이러스 유전자 치료 벡터의 구축에 바람직한 레트로바이러스로서는, 조류 백혈증 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 밍크 세포 포커스 형성 바이러스, 쥐 육종 바이러스, 세망 내피증 바이러스, 로우스 육종 바이러스 등을 들 수 있다. 쥐 백혈병 바이러스로서 특히 바람직한 것으로서는, 예컨대, 4070A 및 1504A(Hartley & Rowe, J. Virol., 19: 19-25(1976)), Abelson(ATCC No. VR-999), Friend(ATCC No. VR-245), Graffi, Gross(ATCC No. VR-590), Kirsten, 하베이 육종 바이러스 및 Rauscher(ATCC No.VR-998)와 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(ATCC No. VR-190) 등을 들 수 있다.
이러한 레트로바이러스는 아메리칸·타입·컬쳐·컬렉션(ATCC, Rockville, Maryland, 미국)과 같은 기탁 기관 또는 보존 기관에서 입수 가능하거나, 또는 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 기지의 공급원으로부터 단리할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 공지의 레트로바이러스 유전자 치료 벡터의 예로서는, GB 2200651, EP 0415731, EP 0345242, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03662, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 93/10218, WO 91/02805, 미국 특허 제5,219,740호 명세서, 동 제4,405,712호 명세서, 동 제4,861,719호 명세서, 동 제4,980,289호 명세서, 동 제4,777,127호 명세서, 동 제5,591,624호 명세서, Vile, Cancer Res, 53: 3860-3864(1993), Vile, Cancer Res, 53: 962-967(1993), Ra, Cancer Res, 53: 83-88(1993), Takamiya, J Neurosci Res, 33: 493-503(1992), Baba, J Neurosurg, 79: 729-735(1993), Mann, Cell 33: 153(1983), Cane, Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6349(1984), Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14(1990) 등에 기재된 것을 들 수 있다.
인간의 아데노바이러스 유전자 치료 벡터도 또한 이 분야에서 공지이며, 본 발명에서 사용 가능하고, 예컨대, Berkne, Biotechniques, 6: 616(1988); Rosenfeld, Science, 252: 431(1991); WO 93/07283; WO 93/06223; WO 93/07282 등을 참조할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 기지의 아데노바이러스 유전자 치료 벡터의 예로서는, 상기한 참고 문헌에 기재되어 있는 것이나, 예컨대, WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; WO 95/00655; WO 95/27071; WO 95/29993; WO 95/34671; WO 96/05320; WO 94/08026; WO 94/11506; WO 93/06223; WO 94/24299; WO 95/14102; WO 95/24297; WO 95/02697; WO 94/28152; WO 94/24299; WO 95/09241; WO 95/25807; WO 95/05835; WO 94/l8922; WO 95/09654 등에 기재되어 있는 것을 들 수 있다. 또한, Curiel, Human Gene Therapy, 3: 147-154(1992)에 기재되어 있는 것과 같이 죽어 있는 아데노바이러스에 연결된 DNA를 투여하여도 좋다.
또한, 본 발명의 유전자 송달 비히클로서는, 아데노바이러스 수반 바이러스(AAV) 벡터를 들 수 있다. 이러한 벡터 중 본 발명에서의 사용을 위한 바람직한 예로서는, WO 93/09239에 개시되어 있는 것과 같은, AAV-2에 기초한 벡터를 들 수 있다. 가장 바람직한 AAV 벡터로서는, 2개의 AAV의 역말단 반복 서열을 포함하는 것이다. 이것은, 천연의 D 서열이 뉴클레오티드 치환에 의해 개변되어 있고, 그 결과, 적어도 5개의 천연형의 뉴클레오티드 및 18개까지의 천연형 뉴클레오티드(바람직하게는, 적어도 10개의 천연형 뉴클레오티드 및 18개까지의 천연형 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는, 10개의 천연형 뉴클레오티드)가 유지되어 있는 것으로, D 서열의 나머지의 뉴클레오티드는 결실되고 있거나 또는 비천연형의 뉴클레오티드로 치환되어 있는 것이다. AAV 역말단 반복 영역의 천연형의 D 서열은 각 AAV 역말단반복 서열 중에 20개의 연속되는 뉴클레오티드를 갖는 서열(즉, 각 말단에 하나의 서열이 존재하는 것)이며, 이것은 HP 형성에는 관여하고 있지는 않다. 비천연형의 치환된 뉴클레오티드는, 동일한 부위에서 천연형의 D 서열 중에 발견되는 뉴클레오티드와는 다른 임의의 뉴클레오티드라도 좋다. 다른 사용 가능한 AAV 벡터의 예로서는, pWP-19, pWN-1 등을 들 수 있다(Nahreini, Gene, 124: 257-262(1993)). 이와 같은 벡터의 다른 예로서는, psub201 등을 들 수 있다(Samulski, J. Virol., 61: 3096(1987)). 다른 AAV 벡터의 예로서는, Double-D ITR 벡터 등을 들 수 있다. Double-D ITR를 제작하는 방법은 미국 특허 제5,478,745호 명세서에 개시되어 있다. 또한 그것에 더하여, AAV 벡터는 예컨대, 미국 특허 제4,797,368호 명세서, 동 제5,139,941호 명세서, 동 제5,474,935호 명세서, WO 94/288157호 등에 개시된 것을 들 수 있다. 본 발명에서 이용 가능한 AAV 벡터의 다른 예로서는, SSV9AFABTKneo을 들 수 있으며, 이것은, AFP 인핸서 및 알부민 프로모터를 포함하고 있고, 또한 간에서 우선적으로 발현시키는 것을 위한 것이다. 그 구조 및 제작 방법은, Su, Human Gene Therapy, 7: 463-470(1996)에 개시되어 있다. 다른 AAV 유전자 치료 벡터로서는, 미국 특허 제5,354,678호 명세서, 동 제5,173,414호 명세서, 동 제5,139,941호 명세서, 동 제5,252,479호 명세서 등에 기재되어 있는 것을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 치료 벡터는, 헤르페스 벡터라도 좋다. 주된 헤르페스 벡터의 바람직한 예로서는, 티마딘키나제 폴리펩티드를 코드하는 서열을 포함하고 있는 단순 헤르페스바이러스 벡터(예컨대, 미국 특허 제5,288,641호 명세서 및 EP O176170에 개시되는 벡터)를 들 수 있다. 또한 단순 헤르페스바이러스 벡터의 예로서는, WO 95/04139 등에 개시되는 HFEM/ICP6-LacZ, Geller, Science, 241: 1667-1669(1988), WO 90/09441, WO 92/07945 등에 기재되는 pHSVlac, Fink, Human Gene Therapy, 3: 11-19(1992)에 기재되는 HSV Us3::pgC-lacZ, EP O453242A에 기재되는 HSV7134, 2RH 105 및 GAL4, 기탁 번호 ATCC VR-977 및 ATCC VR-260으로서 ATCC에 기탁되어 있는 벡터 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 알파바이러스 유전자 치료 벡터를 사용할 수도 있다. 바람직한 알파바이러스 벡터로서는, 신드비스바이러스 벡터, 토가바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 미들버그(Middleberg) 바이러스(ATCC VR-370), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246), 베네수엘라 말뇌염 바이러스(ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532), 미국 특허 제5,091,309호, 동 제5,217,879호, 및 WO 92/10578에 기재되는 벡터 등을 들 수 있다. 또한, 사용 가능한 알파바이러스 벡터로서는, 미국 특허 제5,091,309호 명세서, 동 제5,217,879호 명세서, 동 제5,843,723호 명세서, 동 제6,376,236호 명세서, WO 94/21792, WO 92/10578, WO 95/07994 등에 기재되는 것도 들 수 있다. 이러한 알파바이러스는, ATCC(Rockville, Maryland, 미국)와 같은 기탁 기관 또는 보존 기관에서 입수할 수 있거나 또는 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 기지의 공급원으로부터 단리할 수 있다. 바람직하게는, 세포 상해성이 저감되어 있는 알파바이러스 벡터를 사용할 수 있다(미국 특허 제6,391,632호 명세서 참조).
DNA 벡터계(예컨대, 진핵 생물 계층형 발현계(eukarytic layered expression system) 등)는 본 발명의 갈렉틴 9 개변체의 핵산을 발현하기 위해서 유용하다. 진핵 생물 계층형 발현계의 상세에 관해서는 WO 95/07994를 참조할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 진핵 생물 계층형 발현계로서는, 알파바이러스 벡터에 유래하는 것을 들 수 있고, 바람직하게는, 신드비스바이러스 벡터에 유래하는 것을 들 수 있다.
본 발명에서의 사용에 알맞은 다른 바이러스 벡터로서는, 폴리오바이러스(예컨대, ATCC VR-58, Evans, Nature, 339: 385(1989), Sabin, J. Biol. Standardization, 1: 115(1973) 등에 기재되어 있는 바이러스 등); 라이노바이러스(예컨대, ATCC VR-1110 및 Arnold, J. Cell Biochem, L401-405(1990)에 기재되는 바이러스 등); 폭스바이러스(예컨대, 카나리아폭스바이러스 등) 또는 백시니아바이러스(예컨대, ATCC VR-111, ATCC VR-2010 등, Fisher-Hoch, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 317(1989), Flexner, Ann NY Acad Sci, 569: 86(1989), Flexner, Vaccine, 8: 17(1990), 미국 특허 제4,603,112호 명세서와 동 제4,769,330호 명세서, 및 WO 89/01973에 기재되는 바이러스 등); SV40바이러스(예컨대, ATCC VR-305 및 Mulligan, Nature, 277: 108(1979) 및 Madzak, J. Gen. Vir, 73: 1533(1992)에 기재되는 바이러스 등); 인플루엔자 바이러스(예컨대, ATCC VR-797 등), 미국 특허 제5,166,057호 명세서, Enami, Proc Natl Acad Sci USA, 87: 3802-3805(1990), Enami & Palese, J Virol, 65: 2711-2713(1991), Luytjes, Cell, 59: 110(1989), McMicheal., N E J Med, 309: 13(1983), Yap, Nature, 273: 238(1978), 및 Nature, 277: 108(1979) 등에 기재되어 있는 것과 같은 역유전학 기술을 이용하여 제작된 재조합 인플루엔자 바이러스; EP 0386882, Ruchschacher, J. Vir., 66: 2731(1992) 등에 기재되어 있는 인간 면역 부전증 바이러스; 홍역 바이러스(예컨대, ATCC VR-67, VR-1247 및 EP 0440219에 기재되어 있는 바이러스 등); 아우라바이러스(예컨대, ATCC VR-368 등); 베바루바이러스(예컨대, ATCC VR-600 및 ATCC VR-1240 등); 카바소우(Cabassou) 바이러스(예컨대, ATCC VR-922 등); 치쿤그니아(Chikungnya) 바이러스(예컨대, ATCC VR-64, ATCC VR-1241 등); 포트 모건(Fort Morgan) 바이러스(예컨대, ATCC VR-924 등); 게타 바이러스(예컨대, ATCC VR-369, ATCC VR-1243 등); 키질라가츠(Kyzylagach) 바이러스(예컨대, ATCC VR-927 등); 마야로 바이러스(예컨대, ATCC VR-66 등); 느두무(Ndumu) 바이러스(예컨대, ATCC VR-580, ATCCVR-1244 등); 느즘 바이러스(예컨대, ATCC VR-371 등); 픽수나 바이러스(예컨대, ATCC VR-372, ATCC VR-1245 등); 토네이트(Tonate) 바이러스(예컨대, ATCCVR-925 등); 트리니티 바이러스(예컨대, ATCC VR-469 등); 유나 바이러스(예컨대, ATCC VR-374 등); 와타로어 바이러스(예컨대, ATCC VR-926 등); Y-62-33 바이러스(예컨대, ATCC VR-375 등); 오녕(O'Nyong) 바이러스, 동부 뇌염 바이러스(예컨대, ATCC VR-65, ATCC VR-1242 등); 서부 뇌염 바이러스(예컨대, ATCC VR-70, ATCC VR-125L, ATCC VR-622, ATCC VR-1252 등); 코로나 바이러스(예컨대, ATCC VR-740, Hamre, Proc Soc Exp Biol Med, 121: 190(1966)에 기재되는 바이러스)에 유래되는 벡터 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물을 세포에 송달하는 것은, 전술한 바이러스 벡터에 한정되지 않는다. 다른 송달 방법 및 매체도 사용할 수 있는데, 그러한 것으로는, 예컨대, 핵산 발현 벡터, 죽어 있는 아데노바이러스에만 연결된 폴리카티온성 콤플렉스 DNA(예컨대, Curiel, Hum Gene Ther, 3: 147-154(1992) 참조), 리간드 연결 DNA(예컨대, Wu, J Biol Chem, 64: 16985-16987(1989) 참조), 진핵 생물 세포 송달 비히클 세포(예컨대, 미국 특허 제6,013,517호 명세서, 동 제6,015,686호 명세서 등 참조), 광중합된 히드로겔 물질 침전물, 미국 특허 제5,149,655호 명세서에 기재되어 있는 것과 같은 휴대형 유전자 도입 파티클 건, WO 92/11033에 기재되는 전리방사선법, 핵전하 중화법, 또는 세포막과의 융합법 등을 들 수 있다. 또한 다른 수법으로는, Philip, Mol Cell Biol, 14: 2411-2418(1994), Woffendin, Proc Natl Acad Sci USA, 91: 1581-585(1994)에 기재되어 있는 것 등을 들 수 있다.
입자 매개 유전자 전이 기술도 사용할 수 있으며, 서열은 하이 레벨 발현을 위한 관용의 제어 서열을 포함하는 통상의 벡터에 삽입되고, 이어서 합성 유전자 전이 분자(예컨대, 세포 표적 리간드(예컨대, Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432(1987)에 기재되어 있는 것과 같은 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid), Hucked, Biochem Pharmacol, 40: 253-263(1990)에 기재되어 있는 것과 같은 인슐린, Plank, Bioconjugate Chem, 3: 533-539(1992)에 기재되어 있는 것과 같은 갈락토스, 락토스, 또는 트랜스페린 등)에 연결된, 폴리리신, 프로타민 및 알부민과 같은 중합체성 DNA 결합 카티온)와 인큐베이트된다.
네이키드 DNA도 사용할 수 있으며, 예컨대, 네이키드 DNA의 도입 방법으로서는, WO 90/11092 및 미국 특허 제5,580,859호 명세서에 기재되는 것 등을 들 수 있다. 수득 효율은, 생분해성 라텍스 비드를 이용하여 개선할 수 있다. DNA 코트 라텍스 비드는, 그 비드가 엔도시토시스된 후에 효율적으로 세포에 수송된다. 이 방법은, 소수성을 증대시키고, 이에 따라 엔도솜 파열 및 DNA의 세포질에의 방출을 용이하게 하는 비드 처리에 의해 더욱 개선될 수 있다.
유전자 송달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은, 미국 특허 제5,422,120호 명세서, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/144445 및 EP 524,968에 기재되어 있다. 비바이러스적 송달법에 있어서, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열은, 하이 레벨 발현을 위한 통상의 제어 서열을 포함하는 관용적인 벡터에 삽입할 수 있고, 이어서 합성 유전자 도입 분자와 인큐베이트될 수 있다. 이 합성 유전자 도입 분자로서는 예컨대, 세포 표적 리간드(예컨대, 아시알로오로소뮤코이드, 인슐린, 갈락토스, 락토스, 트랜스페린 등)에 연결된 중합체성 DNA 결합 카티온을 들 수 있다. 중합체성 DNA 결합 카티온으로서는 예컨대, 폴리리신, 프로타민, 알부민 등을 들 수 있다. 다른 송달계로서는, 여러 가지 조직 특이적 또는 편재적으로 활성인 프로모터 제어 하의 유전자를 포함하는 DNA를 캡슐화하기 위한 리포좀을 사용하는 것을 들 수 있다. 사용에 알맞은 비바이러스적 송달법으로서는, 기계적 송달계(예컨대, Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(24): 11581-11585(l994)에 기재되어 있는 수법)도 들 수 있다.
또한, 코드 서열 및 이러한 발현의 산물은, 광중합된 히드로겔 물질의 침전에 의해 송달할 수 있다. 코드 서열을 송달하는 데 사용될 수 있는 유전자 송달의 다른 방법으로서는 예컨대, 미국 특허 제5,149,655호 명세서에 기재되는 휴대형 유전자 도입 파티클 건을 사용하는 것, WO 92/11033에 기재되어 있는 것과 같은 도입되는 유전자를 활성화하기 위해서 전리 방사선을 사용하는 것 등을 들 수 있다.
리보솜 및 폴리카티온성 유전자 송달 비히클의 예로서는, 미국 특허 제5,422,120호 명세서 및 동 제4,762,915호 명세서, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445, EP 0524968, Stryer, Biochemistry, 236-240(1975), W. H. Freeman et al., Biochem Biophys Acta, 600: 1(1980), Bayer, Biochem Biophys Acta, 550: 464(1979), Rivnay, Meth Enzymol, 149: 119(1987), Wang, Proc Natl Acad Sci USA, 84: 7851(1987), Plant, Anal Biochem, 176: 420(1989) 등에 기재되는 것을 들 수 있다.
본 발명은, 암 등의 악성 종양을 포함하는 종양, 알레르기성 질환, 염증, 면역 이상, 활성화 림프구(특히 활성화 T 세포를 들 수 있고, 또한 활성화 B 세포를 포함하고 있더라도 좋음)를 포함하는 자기면역 질환 등의 질환이나 병을 앓는 포유 동물을, 갈렉틴 9 개변체 또는 갈렉틴 9 개변체 유래 치료제(예컨대, 치료 활성 성분으로서 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드 또는 포유 동물에 있어서의 발현을 위한 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 등을 포함하는 조성물)의 투여에 의해 처치하는 방법을 개시하는 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 처치될 수 있는 자기면역 질환으로서는, 임의의 자기면역 질환 또는 이식 거절(예컨대, 본 명세서 중에 열거되는 자기면역 질환을 포함하지만, 이들에 한정되지 않음)을 들 수 있다.
갈렉틴 9 개변체는 예컨대, 재조합 기술로 발현된 폴리펩티드, 또는 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드의 개변체, 그 유도체, 또는 그 융합 단백질로서 투여할 수 있고, 포유 동물에 국소적 또는 전신적인 형태 중 어느 하나에 의해 송달될 수 있는 것이다. 갈렉틴 9 개변체, 갈렉틴 9 개변체의 유도체 또는 개변체, 또는 갈렉틴 9 개변체 융합체를 코드하는 핵산(DNA, RNA 등)은 유전자 치료 프로토콜에 있어서, 포유 동물에 있어서의 발현을 위한 조절 영역을 포함하는 네이키드 플라스미드 DNA로서, 또는 포유 동물에 있어서의 발현을 위한 바이러스 벡터로 투여할 수 있다. 발현을 위한 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드의 송달은, 송달을 용이하게 할 수 있는 약학적으로 허용되는 담체를 이용하여 달성할 수 있다. 자기면역 질환을 갖는 포유 동물을 갈렉틴 9 개변체 유래 치료제로 처치하여, 자기면역 질환의 개선 또는 완화, 또는 자기면역에 기인하는 임상 징후가 없어지도록 할 수 있다.
본 발명은, 본 발명에 개시된 것이 어떻게 작용하는지의 이론에 한정되지 않지만, 자기 인식을 일으키고, 이어서 자기면역을 상해하는 활성화 T 세포 등에 의해 그것이 결정될 것이다. 갈렉틴 9 개변체를 발현하거나, 또는 갈렉틴 9 개변체를 발현시킴으로써, 또는 갈렉틴 9 개변체 유래 치료제를 투여함으로써, 문제의 활성화 림프구는, 이용 가능하게 되어 있는 갈렉틴 9 개변체의 영향을 받아, 우선적으로 표적화되어 아포토시스를 받는다. 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드 또는 갈렉틴 9 개변체 유래 치료제는, 자기면역을 나타내고 있는 영역(예컨대, 치료가 이루어지고 있는 특정한 자기면역 질환을 특징짓고 있는 국재 영역)에 투여할 수 있다. 이에 따라, 투여한 갈렉틴 9 개변체, 나아가서는 그 밖의 치료제와, 그 영역의 세포로 발현되고 있는 표적물을 갖고 있는 활성화 T 세포 등과의 사이의 접촉이 최적화된다. 따라서, 그 영역의 세포는, 유전자 송달 비히클의 도움을 받아, 그 영역에 투여한 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현함에 있어서의 양호한 후보인 것이다. 이리하여, 본 발명을 여러 가지로 변경하거나 적용하여, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 발현하도록 조작되어, 활성화 T 세포 등에 의한 공격 하에 있는 세포에 있어서 발현이 이루어지도록 할 수 있다. 이식 거절의 경우에는, 많은 세포 타입의 세포 표면 상에서 유비쿼터스하게 발현되는 단백질을 결합할 수 있는 분자의 결합부와 융합하고 있는 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 들 수 있다. 이 결합 부분은 예컨대, 헤파린이라도 좋고, 그리고 결합하는 세포 표면 상의 분자는 글리코사미노글리칸이라도 좋다. 또한 그 결합 부분은, 임의의 선택된 세포 표면 항원에 특이적인 단쇄 항체의 결합 도메인일 수도 있다.
본 발명에 관하여, 암 등의 악성 종양 세포를 포함하는 종양 세포에 대하여 세포 상해 작용을 얻거나, 항알레르기 작용을 얻거나, 항염증 작용을 얻거나, 면역 이상을 정상화시키거나, 활성화 림프구(특히 활성화 T 세포를 포함하고 있더라도 좋음)에 대하여 아포토시스를 유도하게 하는 경우도, 상기 자기면역의 경우와 같은 식으로 이해되어야 한다.
본 명세서 중에서 사용하는 「투여」 또는 「투여한다」란, 치료제 또는 치료제의 배합물을 포유 동물에게 송달하는 프로세스를 말한다. 투여 프로세스는, 치료제(단수 또는 복수의 치료제) 및 소망의 효과에 의해 바꿀 수 있다. 투여는 예컨대, 비경구적 송달 또는 경구적 송달 등, 치료제에 알맞은 임의의 수단에 의해 달성할 수 있다. 비경구적 송달로서는 예컨대, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내 송달, 기관 조직에의 주사, 점막, 폐, 국소적, 또는 카테터에 의한 송달 등을 들 수 있다. 경구적 수단은 입을 경유하여 이루어지는 것으로, 예컨대, 정제 또는 그 밖의 위장 경유의 송달 수단(음용 가능한 액체를 포함함)을 사용하거나 하여 이루어진다. 점막 경유의 송달로서는 예컨대, 비강내(i.n.) 송달 등을 들 수 있다. 폐 경유의 송달로서는, 약제를 흡입시키는 것이라도 좋다. 투여는 일반적으로, 약학적으로 허용되는 담체(예컨대, 완충액, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리사카라이드 콘쥬게이트, 리포좀, 리피드 등)를 이용한 송달에 의해 이루어지더라도 좋다. 유전자 치료 프로토콜이란, 포유 동물에 있어서 전사물 또는 폴리펩티드로서 발현된 경우에 치료 목적을 달성할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 치료제로서 투여하고 있는 것으로 생각하여도 좋은 경우를 포함하는 것으로, 여기서는 비경구적 송달 수단 및 경구적 송달 수단의 어느 것도 적용될 수 있다. 이러한 투여 수단은, 처치되는 질환에 적합하도록 선택된다. 예컨대, 질환이 기관 베이스인 경우, 송달은 국소적일 수 있고, 예컨대, 질환이 전신적인 경우, 송달은 전신적이라도 좋다. 병용 투여란, 어떤 환자에게 가해지고 있는 치료에 있어서 하나 또는 그 이상의 치료제를 투여하는 것을 말하고 있다. 치료제는, 동일한 약학적 담체를 이용하여 투여할 수 있고, 또는 다른 담체를 이용하여 투여하는 것도 가능하다. 이들은, 동일한 또는 다른 투여 수단에 의해 투여할 수도 있다. 약제는, 동일한 타입의 약제라도, 또는 다른 타입의 약제라도 좋으며, 예컨대, 다른 타입으로는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 저분자의 것을 들 수 있다. 투여 시간은 정확하게 동일한 시간이라도 좋고, 하나의 치료제는 다른 약제의 전 또는 후에 투여하더라도 좋다. 따라서, 병용 투여는 동시라도 좋고, 연속적이라도 좋다. 치료제를 소정의 조합으로 하기 위한 정확한 프로토콜은 약제 및 그 밖을 고려하면서 처치되는 상태를 고려하여 결정된다.
용어 「생체내 투여」란, 포유 동물에 있어서의 발현을 위해, 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 환자(예컨대, 포유 동물)에게 투여하는 것을 말한다. 특히, 직접적인 생체내 투여로서는, 세포를 포유 동물로부터 빼내지 않고서, 포유 동물 세포를 코드 서열로 트랜스펙트하는 것을 들 수 있다. 따라서, 직접적 생체내 투여로서는, 환자 세포에서 발현이 일어나도록, 자기면역 질환을 앓고 있는 영역에 목적의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 직접 주사하는 것을 들 수 있다.
용어「생체외 투여」란, 세포를 환자(예컨대, 포유 동물)로부터 빼낸 후, 세포(예컨대, 자기면역 공격 하에 있는 세포 집단에 유래하는 세포)를 트랜스펙트 처리하는 것을 말한다. 트랙스펙션 후, 세포는 포유 동물에게 되돌려진다. 생체외 투여는, 세포를 포유 동물로부터 빼내어, 필요에 따라 형질 전환되어야 하는 세포(즉, 자기면역 기구에 의한 공격 하의 세포)를 선택하고, 선택된 세포를 복제 불가능으로 하여, 선택된 세포를 발현을 위한 유전자(즉, 갈렉틴 9 개변체)를 코드하는 폴리뉴클레오티드(발현을 용이하게 하기 위한 조절 영역도 포함하고 있는 것)로 형질 전환하여, 갈렉틴 9 개변체 발현을 위해 형질 전환된 세포를 환자에게 되돌림으로써 달성된다.
치료적으로 유효한 양으로서는, 소망의 치료 결과를 생기게 하는 양을 말한다. 예컨대, 소망의 치료 효과가 자기면역으로부터의 관해인 경우, 치료적으로 유효한 양이란, 완화를 용이하게 하는 양을 가리킨다. 치료적으로 유용한 양이란, 예컨대 수일 또는 수주간의 투여를 포함하는 투약 프로토콜에 있어서 투여하는 양이라도 좋다. 치료 효과가 예컨대, 자기면역 질환의 징후가 출현하고 있는 동안에, 포유 동물의 자기면역 응답의 영향을 저감시키는 것인 경우, 포유 동물에 있어서 이것을 달성하기 위한 약제의 유효량이란, 자기면역의 징후의 저감을 가져오는 양을 말한다.
용어 「약학적으로 허용되는 담체」란, 치료제(예컨대, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 저분자, 펩티드성 물질, 펩티트 등)를 투여하기 위한 담체를 가리키고 있으며, 그 자체가 조성물을 수용하는 개체에 유해한 항체의 산생을 유도하지 않고, 그리고 문제가 되는 독성이 없어서 그것을 투여할 수 있는 임의의 약학적으로 허용되는 담체를 말한다. 본 발명의 다른 태양에서는, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 상기와 같은 재조합 바이러스 벡터를 포함하고 있는 약학적 조성물이 제공된다. 이러한 약학적 조성물은, 액체 용액의 형태의 것이라도 좋고, 투여하기 전에 용액에 현탁될 수 있는 고체 형태(예컨대, 동결 건조된 고체)의 것으로서 조제되어 있어도 좋다. 또한, 조성물은 표면에 투여하거나, 주사하거나, 경구 투여하거나, 직장 투여하거나 하는 데에 알맞은 담체 또는 희석제를 이용하여 조제될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는, 사용되는 투여량 및 농도에서 그것을 수용하는 자에게 대하여 실질적으로 무독인 것이다. 주사 가능한 용액을 위한 담체 또는 희석제의 대표적인 예로서는, 물, 등장 생리 식염수 용액(바람직하게는, 생리학적 pH로 완충화되어 있는 것으로, 예컨대, 인산 완충화 생리 식염수 또는 Tris 완충화 생리 식염수 등을 들 수 있음), 만니톨, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 폴리펩티드 또는 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민 등)을 들 수 있다. 특히 바람직한 조성물로는, 10 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris(pH 7.2) 및 150 mM NaCl 중에 벡터 또는 재조합 바이러스를 포함하는 것을 들 수 있다. 이 경우, 재조합 벡터는 약 1 mg의 물질을 나타내는 것이라도 좋고, 고분자 물질이 1% 미만이며, 총 물질량(물을 포함함)의 1/100,000 미만이라도 좋다. 이 조성물은 적어도 6개월 동안 약 20℃에서 안정적이다.
본 발명의 약학적 조성물은, 세포 분열을 자극하는 인자를 포함하고 있어도 좋으며, 따라서 재조합 레트로바이러스 벡터를 집어 넣거나, 삽입하는 것을 자극하는 인자를 포함하고 있어도 좋다. 재조합 바이러스의 보존법은 미국 특허 제5,792,643호 명세서에 기재되어 있는 것을 참조할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 치료법을 수행하기 위한 치료제의 전부는, 치료약용의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고 있는 적절한 약학적 조성물에 넣을 수 있다. 치료약을 위한 약학 담체는 동일한 것이라도 좋고, 또한 각각의 치료약에서 다르더라도 좋다. 알맞은 담체로서는, 크고 천천히 대사되는 거대 분자(예컨대, 단백질, 다당, 폴리젖산, 폴리글리콜산, 중합체아미노산, 아미노산 공중합체, 입자 중의 불활성 바이러스 등)라도 좋다. 이러한 담체는 당업자에게 주지이다.
약학적으로 허용되는 염으로서는 예컨대, 무기산염(예컨대, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등); 유기산염(예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등)을 들 수 있으며, 이들은 상기 조성물에 넣어서 사용될 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는, 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N. J., USA, 1991)를 참조할 수 있다. 치료 조성물 중의 약학적으로 허용되는 담체로서는 예컨대, 물, 생리 식염수, 글리세롤, 에탄올 등의 액체를 들 수 있다. 조제로는 예컨대, 습윤제, 유화제 등을 들 수 있고, pH 완충화 물질 등을 이러한 비히클 중에 넣어 놓는 것도 가능하다. 대표적으로는, 치료 조성물은, 액체 용액 또는 현탁물 중 어느 하나로 하여 주사 가능하도록 조제되거나; 주사 전에 액체 비히클을 사용하여 액체 또는 현탁물로 되는 데에 알맞은 고체 형태의 것도 그것을 조제할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체의 정의 내에는 리포좀도 포함된다.
약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여, 재조합 레트로바이러스 또는 상기한 벡터 구축물 중의 하나를 갖는 바이러스를 포함하고 있는 약학적 조성물도 제공할 수 있다. 이 조성물은, 액체 용액 또는 투여 전에 용액에 현탁되는 고체 형태의 것(예컨대, 동결 건조된 것) 중 어느 하나로서 조제할 수 있다. 또한, 이 조성물은, 표면에 투여하거나, 주사하거나, 경구 투여하거나, 직장 투여하거나 하는 데에 알맞은 담체 또는 희석제를 이용하여 조제할 수도 있다.
약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제로서는, 사용되는 투여량 및 농도에서 그것을 수용하는 자(레피시언트)에 대하여 무독인 것이다. 주사 가능한 용액을 위한 담체 또는 희석제의 대표적인 예로서는, 물, 등장 생리 식염수 용액(바람직하게는, 생리학적 pH로 완충화되어 있는 것을 들 수 있으며, 예컨대, 인산 완충 생리 식염수, Tris 완충 생리 식염수 등임), 만니톨, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 폴리펩티드 또는 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민) 등을 들 수 있다. 벡터 또는 재조합 바이러스는, 10 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris(pH 7.2) 및 150 mM NaCl을 함유하고 있는 것과 같은 약학적 조성물에 넣어 송달할 수 있다. 이 경우, 재조합 벡터는 약 1 g의 물질로, 고분자 물질의 1% 미만이며, 총 물질량(물을 포함함)의 1/100,000 미만이라도 좋다. 이 조성물은, 적어도 6개월 동안 20℃에서 안정적일 것이다.
약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는, 액체 용액 또는 투여 전에 용액에 현탁할 수 있는 고체 형태의 것(예컨대, 동결 건조된 것) 중 어느 하나의 형태의 조성물로 할 수 있도록 유전자 송달 비히클과 조합될 수 있다. 2개 이상의 유전자 송달 비히클은 대표적으로는 전통적인 직접 경로(예컨대, 볼/설하, 직장, 경구, 경비, 국소(예컨대, 경피 및 눈 등), 질, 폐, 동맥내, 근육내, 복강내, 피하, 안내, 비강내, 또는 정맥내)를 통해, 또는 간접적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 치료약은, 임의로 예컨대 포유 동물에 있어서의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있어도 좋으며, 그 치료약은, 이 분야에서 공지된 방법에 따라서 장용성 정제나 캡슐제 등으로 제제화될 수 있다. 이들은, 이하의 특허: 예컨대, 미국 특허 제4,853,230호 명세서, EP 225,189, AU 9,224,296, AU 9,230,801 및 WO 92144,52 등을 참조할 수 있다. 이러한 캡슐은 경구적으로 투여하여, 장을 표적으로 할 수 있다. 경구 투여한 후 1∼4일에, 예컨대, 폴리펩티드의 발현이 이루어지고 있는지의 여부, 또는, 예컨대, 리보자임 또는 안티센스올리고뉴클레오티드에 의한 발현 저해가 일어나고 있는지의 여부를, 그 단백질에 대한 항체를 사용하는 것 등에 의해 혈장 및 혈액을 측정하여 결정할 수 있다.
유전자 송달 비히클은 예컨대, 미국 특허 제4,411,648호 명세서, 동 제5,222,936호 명세서, 동 제5,286,254호 명세서, WO 94/05369 등에 기재되어 있는 것과 같이, 예컨대, 주사, 파티클 건, 국소적 투여, 비경구 투여, 흡입 또는 이온 도입 송달 등에 의해 포유 동물에 도입될 수 있다.
치료 조성물 또는 치료제는, 암 등의 악성 종양을 포함하는 종양, 알레르기증, 염증, 면역 이상, 자기면역 질환을 개선할 수 있는 다른 치료제, 또는 갈렉틴 9 개변체 치료제의 투여로 얻어지는 치료상의 이익을 증강할 수 있는 다른 치료제와 함께 투여하더라도 좋다. 예컨대, 알레르기 반응을 치료하기 위한 투여의 경우, 점막, 코, 기관지, 폐 등의 조직에 존재하는 세포로 발현하도록 갈렉틴 9 개변체 폴리뉴클레오티드의 에어로졸을 투여하더라도 좋고, 유리하게는 예컨대, 알레르기 반응이 안정될 때까지의 사이, 매일 수회, 코용 스프레이 또는 에어로졸 스프레이에 의해서 반복 투여할 수도 있다.
유전자 송달 비히클은, 포유 동물의 단일 부위 또는 복수 부위에 직접적으로 투여할 수 있으며, 예컨대, 직접 주사에 의해 투여할 수 있다. 유전자 송달 비히클은, 생체외에 의해 형질 도입된 표적 세포를 사용하여 투여할 수도 있다. 본 발명은 또한, 유전자 송달 비히클의 투여에 적절한 약학적 조성물(예컨대, 여러 가지 부형제를 포함함)을 제공한다.
갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드, 그 개변체, 유도체, 아날로그, 변이체 또는 키메라의 발현을 지시하는 벡터 구축물을, 암 등의 악성 종양을 포함하는 종양 부위, 알레르기를 나타내는 부위, 염증 부위, 면역 이상을 보이는 부위, 자기면역을 보이는 부위(예컨대, 췌장, 신장, 간장, 관절, 뇌, 척수액, 피부, 또는 신체의 다른 영역 또는 기관)에 직접적으로 투여할 수 있다. 벡터 구축물을 직접적으로 투여하기 위해서, 본 발명의 범위 내에서 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 어떤 영역을 위해 작용하고 있는 동맥이 동정되면, 벡터를 그 부위에 직접적으로 송달하기 위해서 이러한 동맥에 주사할 수 있다. 마찬가지로, 예컨대, 벡터 구축물을 포함하고 있는 국소용 약제 조성물을 적용함으로써, 벡터 구축물을 피부 표면에 직접적으로 투여할 수 있다.
직접 투여에 있어서, 갈렉틴 9 개변체 치료제 및 그 밖의 항자기면역 약제를 포함하고 있는 배합 치료제를 함께 투여할 수 있다. 병용 투여는 그것을 동시에 할 수 있으며, 예컨대, 동일한 벡터 중에 약제를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 놓거나, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 그 밖의 약품인지의 여부에 상관없이, 약제를 동일한 약제 조성물 중에 넣거나, 또는 거의 동일한 시간에, 거의 동일한 위치에 주사할 수 있는 개별의 약제 조성물 중에 약제를 넣어 그것을 투여함으로써 달성할 수 있다. 병용 투여를 동시에 행하지 않는 경우(예컨대, 프로드러그 액티베이터를 투여한 후에 프로드러그를 투여하는 경우), 제2번째의 약제는, 치료 목적에 맞도록, 직접 주사에 의해 투여하여도 좋다. 따라서, 예컨대, 프로드러그를 투여하는 경우, 프로드러그는 프로드러그 액티베이터와 동일한 부위에 투여하도록 한다. 따라서, 병용 투여 프로토콜로서는, 치료 목적을 달성하기 위한 투여의 조합을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 병용 투여는, 필요한 경우, 나중에 투여하는 것을 포함하고 있어도 좋다(예컨대, 갈렉틴 9 개변체를 생체내에서 직접 주사하여 투여하는 처리를 반복한다고 하는 것과 같은 것을 들 수 있음).
본 발명에 있어서는, 빼낸 세포는 동일한 동물 또는 다른 동종 이계의 동물 또는 포유 동물에 되돌릴 수 있음은 이해되어야 한다. 이러한 경우, 일반적으로는, 조직 적합성이 그 동물에서 합치하고 있는 것이 바람직하다(반드시 그렇다고는 할 수 없지만, 예컨대, Yamamoto et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 7: 911-922(1991); Yamamoto et al., Journal of Virology, 67: 601-605(1993) 참조).
환자의 여러 가지 부위로부터 세포를 빼낼 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 실시 태양에서는, 예컨대, 피부 유래의 세포(피부 섬유아 세포 등) 또는 혈액 유래의 세포(예컨대, 말초혈 백혈구 등)에 벡터 구축물을 넣을 수 있다. 소망에 따라, 세포의 특정한 획분(예컨대, T 세포 부분 집합 또는 줄기세포 등)을 혈액으로부터 특이적으로 빼낼 수 있다(예컨대, WO 91/16116 참조). 이어서, 임의의 상기한 기술을 이용하여 빼내어진 세포와 벡터 구축물을 접촉시키고, 계속해서 그 세포를 온혈 동물에(바람직하게는, 자기면역을 보이는 영역의 부근에 또는 부근 내에) 되돌릴 수 있다.
일단, 예컨대, 포유 동물 등의 환자에 대해서 진단이 이루어지면, 갈렉틴 9 개변체 치료제를 부여하거나, 처치되는 특정한 질환·병(예컨대, 종양, 알레르기, 자기면역 질환 등)에 알맞은 수법 및 용량으로 그것을 포유 동물에게 투여하거나, 치료제의 연속 투여 또는 투여의 수정에 대해 그 필요성을 결정하기 위해서 포유 동물은 모니터되는 등을 포함하는 본 발명의 실시가 이루어진다. 본 발명에 있어서 실시란, 처치되는 질환을 동정하여, 표적 유전자 치료를 적용하는 것이 가능한 유망 세포형 또는 신체 영역을 결정하는 것으로 이루어져 있더라도 좋다. 갈렉틴 9 개변체 폴리뉴클레오티드(포유 동물에 있어서의 발현을 위한 조절 영역을 갖는 플라스미드, 또는 발현을 위한 바이러스 벡터를 포함하고 있어도 좋음)를 구축하여, 몇 개의 포유 동물 세포를 빼내, 갈렉틴 9 개변체를 코드하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙트 처리되고, 그리고 갈렉틴 9 개변체 발현을 위해서 포유 동물에 넣는 것이 이루어진다. 또는, 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 질환이 명백한 영역에서 발현하도록, 포유 동물에게 투여할 수 있다.
따라서, 예컨대, 악성 종양 세포의 경우, 갈렉틴 9 개변체를 이용하여 생체내 또는 생체외로 환부 조직 또는 장기 등의 해당 종양 세포를 트랜스펙트 처리할 수 있다. 또한, 예컨대, 만성 관절염 류마티스의 경우, 갈렉틴 9 개변체를 이용하여 생체외로 관절액으로부터 얻어진 세포를 트랜스펙트할 수 있다.
예컨대, 다발성 경화증 처치에 있어서, 영향을 받는 뇌 영역에 갈렉틴 9 개변체를 주사할 수 있고, 자기면역 반응형의 활성 T 세포 등의 공격 하에 있는 세포에서의 갈렉틴 9 개변체 발현을 용이하게 하도록 할 수도 있다. 또한, 일례로서, 다발성 경화증의 경우, 갈렉틴 9 개변체 DNA는 포유 동물 뇌에 국소적으로 주사할 수 있으며, 척수액에 유래하는 세포를 빼내어, 그것을 갈렉틴 9 개변체 DNA로 트랜스펙트 처리하여, 척수 영역으로 되돌릴 수 있다. 또한 다른 예로서는, 쉐그렌 증후군을 갖는 포유 동물를 처치하기 위해서, 이 질환의 표적 기관으로서, 주사에 의한 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드 투여에 알맞은 것이 선택되어도 좋다. 또한, 쉐그렌 증후군을 앓는 포유 동물에 대하여, 이환 기관(예컨대, 콩팥 등)을 동정하여, 갈렉틴 9 개변체 DNA를 그 기관에 직접 투여할 수도 있고, 또한 기관에 유래하는 세포를 빼내어, 트랜스펙트 처리되고, 이어서 포유 동물의 이들 세포에서 갈렉틴 9 개변체가 발현하도록 신체로 되돌릴 수 있다.
예컨대, 이식 거절을 예방하는 경우, 이식을 받는 동물은 외래의 세포, 외래의 조직, 또는 외래의 기관을 공격하는 활성화 환자 세포를 죽이기 위해서, 갈렉틴 9 개변체 치료제를 국재적 또는 전신적으로 투여할 수 있고, 환자 신체 내에서 기관을 일단 보호하기 위해서, 이식 직전에 기관 외표면 상의 세포에 있어서 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드가 발현하도록 하는 것도 가능하다. 이식을 받은 자의 면역계가 외래 세포, 외래 조직, 또는 외래 기관에 순응할 때까지의 사이, 갈렉틴 9 개변체 치료제를 연속하여 투여하는 것이 필요할 것이다.
갈렉틴 9 개변체 치료제는, 천연의 갈렉틴 9와 유사하게 작용하는 것이 기대된다. 따라서, 아포토시스 반응을 일으키기 위해서 그것을 사용할 수 있다. 따라서, 임상의는 아포토시스를 달성하기 위해서, 발현되던지 아니면 포유 동물에게 투여될 필요가 있는 갈렉틴 9 개변체의 양을 화학양론적으로 알 수 있을 것이다. 본 발명의 다른 태양에서는, 본 명세서 중에서 개시되는 벡터 구축물은, 한층 더 비벡터 유래 유전자의 발현을 지시할 수도 있다. 예컨대, 갈렉틴 9 개변체를 투여하는 동시에 적용되는 프로드러그계는, 유전자 치료를 위한 안전한 기구로서 작용하고, 병용 치료제로서 작용할 수도 있다.
프로드러그 액티베이터를 갈렉틴 9 개변체와 함께 벡터에 있어서 발현시켜, 안전한 기구를 확보한 것이라도 좋다. 이 활성화계가 멈춰야한다고 결정되면, 프로드러그가 투여되어, 그 프로드러그 액티베이터를 활성화시킨다. 이러한 처치에 의해, 임상의에게 유전자 치료하고 있는 동안의 제어 수단을 부여하게 된다. 프로드러그 액티베이터/프로드러그계는, 포유 동물(여기서는 예컨대, 자기면역이 갈렉틴 9 개변체 발현에 의해 악화되고 있는 경우)에 있어서 트랜스펙트 세포를 불활화하기 위해서 유용하다. 프로드러그 액티베이터/프로드러그계는, 그 계에 의해 제공되는 프로드러그 활성화를 이용한 세포 상해 작용을 하도록, 조합 치료를 하거나, 치료제에 병용 투여하거나 하여 사용할 수 있다.
프로드러그 액티베이터 및 프로드러그와 함께, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 치료는 면역 조절성의 것이라도 좋다. 면역 조절성이란, 성질 또는 효력이 인자의 비존재 하에서 발생한 면역 응답과는 다른 면역 응답을 야기하는 인자의 사용을 가리키는 것으로, 그 인자는 면역 응답에 관여하는 하나 이상의 세포에 의해 제조되는 것이더라도, 세포에 외인적으로 첨가되는 것이라도 좋다. 응답의 성질 또는 효력은 당업자에게 공지의 여러 가지 분석(예컨대, 세포 증식(예컨대, 3H 티미딘의 수득)을 측정하는 시험관내 분석 및 시험관내 세포 상해 분석(예컨대, 51Cr 방출을 측정함)을 포함함)에 의해 측정할 수 있다(Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses, 7: 645-655(1991) 참조). 면역 조절 인자로서는, 생체내 및 생체외의 양방에서 활성인 것이다. 이러한 인자의 대표적인 예는, 시토킨(예컨대, 인터류킨 2, 4, 6, 12 및 15), α 인터페론, β 인터페론, γ 인터페론, GM-CSF, G-CSF 및 종양 괴사 인자(TNF) 등을 들 수 있다. 다른 면역 조절 인자로서는 예컨대, CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, β2-매크로글로불린, 샤페론, 그 아날로그 등을 들 수 있다. 그러나, 유전자 송달 비히클이, 시토킨인 면역 조절 보인자를 발현하지 않는 경우, 이 시토킨은 상기한 조성물 중에 포함되어 있어도 좋고, 상기한 조성물과는 별개로(동시에 또는 후에) 투여할 수 있다. 요컨대, 이러한 실시 태양에서는, 면역 조절 보인자는 바람직하게는, 그 분야에서 알려져 있는 표준적인 프로토콜 및 투여량에 따라서 투여한다. 예컨대, α 인터페론은 2∼4개월간, 100∼500만 단위/일의 투여량으로 투여할 수 있고, 그리고 IL-2는 2∼12주간, 1∼3 회/일, 10,000∼100,000 단위/kg 체중의 투여량으로 투여할 수 있다. γ 인터페론은 예컨대, 갈렉틴 9 개변체 투여로 보다 효과적인 치료를 달성하기 위해서, 활성화 T 세포에 있어서 문제 유전자의 발현을 상향 조절하기 위해서 2∼12주간, 2∼3 회/주, 150,000∼1,500,000 단위의 투여량으로 투여할 수 있다.
병용 치료제에 있어서는, 프로드러그 액티베이터는, 그를 위한 벡터로부터 발현할 수도 있고, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드와 동일한 벡터로부터 발현할 수도 있다. 어느 한 벡터계(단일 벡터 또는 2개의 벡터)를, 생체내 또는 생체외 수단에 의해 투여할 수 있다. 자기면역 치료에 있어서, 예컨대, 프로드러그 액티베이터의 첨가는 갈렉틴 9 개변체에 의해 달성되는 효과를 지지하는 면역 조절 효과를 더욱 촉진하고, 그리고 추가로 프로드러그 첨가는 트랜스펙트 세포의 살상을 활성화할 수 있다.
샤페론 분자는, 폴리뉴클레오티드 치료약의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여할 수 있고, 그리고 샤페론 분자는, 예컨대, 열 충격 단백질(예컨대, hsp70)이라도 좋다. 또한, 포유 동물에 있어서 발현되는 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 소망의 표적 세포만의 폴리뉴클레오티드 발현을 확실하게 할 목적을 위한, 유도 프로모터(예컨대, 조직 특이적 프로모터)에 연결할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 조직에 효과적으로 송달할 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드는, 그 조직의 세포 게놈에의 삽입에 알맞은 뉴클레오티드 서열에 인접하고 있을 수 있다.
본 발명의 이 형태를 위해서 그리고 대부분의 태양을 위해, 인간을 처치하는 유효성은, 소정의 자기면역 질환의 동물 모델에 있어서 최초로 시험할 수 있다. 이러한 현존하는 동물 모델로서는 예컨대, 쉐그렌 증후군(자기면역 누선염 또는 면역 매개 타액선염), 자기면역 심근염, 원발성 담즙성 간 경변(PBC), 염증성 심질환, 수은 유도성 신장 자기면역, 인슐린 의존성 당뇨병(1형 당뇨병 또는 IDD), 흉선 적출후 자기면역, 중추신경계(CNS) 탈수 장애, CNS 낭창, 나르콜렙시, 중증 근무력증(mg), 그레이브스병, 면역매개 PNS 장애, 변형성 관절증, 만성 관절 류마티스, 포도막염, 수질 낭포성 선유증, 자기면역 용혈성 질환, 자기면역 맥관염, 난소 자기면역 질환 및 인간 강피증(schleroderma) 등을 포함하는 자기면역 질환의 동물 모델을 들 수 있다.
복수의 유전자 송달 비히클을, 동물 또는 식물에 투여할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 동물은 온혈동물이며, 더욱 바람직하게는 마우스, 닭, 소, 돼지, 애완 동물(예컨대, 고양이 및 개), 말 및 인간으로 이루어지는 군에서 선택된다. 폴리펩티드 치료약(예컨대, 갈렉틴 9 개변체 또는 다른 시토킨)에 관해서, 투여량은 약 5∼50 ㎍/kg 포유 동물 체중, 또한 약 50 ㎍/kg∼약 5 mg/kg, 또한 약 100∼500 ㎍/kg 포유 동물 체중, 및 약 200∼약 250 ㎍/kg의 범위라도 좋다.
폴리펩티드 치료약(예컨대, 천연 또는 변이체의 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 등)에 대해서는, 조직을 표적으로 한 투여에서는, 환자(예컨대, 포유 동물)에 있어서의 폴리뉴클레오티드 발현에 따라서, 코드 서열 또는 비코드 서열의 발현 가능 구축물을 포함하는 벡터를 다음과 같이 투여할 수 있다: 국소적 투여의 유전자 치료 프로토콜에서는, 약 100 ng∼약 200 mg DNA, 또는 약 500 ng∼약 50 mg DNA, 또는 약 1 ㎍∼약 2 mg DNA, 또는 약 5 ㎍ DNA∼약 500 ㎍ DNA, 그리고 유전자 치료 프로토콜에 있어서의 국소 투여의 사이에서는, 약 20 ㎍∼약 100 ㎍의 범위, 그리고 예컨대, 주사당 또는 투여당 약 500 ㎍의 용량으로 투여할 수 있다. 보다 많은 발현이 소망되는 경우에는, 조직의 보다 넓은 영역에 걸쳐, 보다 많은 양의 DNA 또는 동일한 양의 DNA가 연속 투여 프로토콜에 따라서 재투여되고, 예컨대, 종양 부위의 다른 근접 또는 밀접한 조직 부분에 몇 갠가가 투여되며, 그러한 것은 양성의 치료 결과를 가져오기 위해서 필요할 것이다.
저분자 치료약의 투여에 대해서는, 저분자의 효력에 따라서, 투여량을 바꿀 수 있다. 매우 강력한 인히비터에서는 그 투여량은, 포유 동물 킬로그램당의 양으로 나타내면, 예컨대, 약 1 ㎍/kg∼약 500 mg/kg, 또는 약 100 ㎍/kg∼약 5 mg/kg, 또는 약 1 ㎍/kg∼약 50 ㎍/kg, 또는 예컨대, 약 10 ㎍/kg의 범위로 충분하다. 펩티드 및 펩토이드의 투여에서는, 효력은 또한 투여량에 따라 변하며, 약 1 ㎍/kg∼약 500 mg/kg 포유 동물 체중, 및 약 100 ㎍/kg∼약 5 mg/kg 및 약 1 ㎍/kg∼약 50 ㎍/kg의 범위라도 좋다. 그리고 통상의 용량은 약 10 ㎍/kg이라도 좋다.
본 발명의 활성 성분은, 그 투여량을 광범위에 걸쳐 선택하여 투여할 수 있지만, 그 투여량 및 투여 회수 등은, 처치 환자의 성별, 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 식사, 투여 시간, 투여 방법, 배설 속도, 약품의 조합, 환자의 그 때에 치료를 하고 있는 병상의 정도에 따라, 이들 또는 그 밖의 요인을 고려하여 결정할 수 있다.
의약품을 제조함에 있어서는, 그 첨가제 등이나 조제법 등은, 예컨대 일본약방해설서편집위원회편, 제14개정 일본약방해설서, 2001년 6월 27일 발행, 주식회사 히로카와쇼텐; 이치반가세 히사시 편저 의약품의 개발 12권(제제소제[I]), 1990년 10월 15일 발행, 주식회사 히로카와쇼텐; 동, 의약품의 개발 12권(제제소재[II]), 1990년 10월 28일 발행, 주식회사 히로카와쇼텐 등의 기재를 참고로 하여 이들 중에서 필요에 따라 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 활성 성분은, 본 명세서에서 설명하고 있는, (a) 갈렉틴 9 개변체 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드 등, (b) 갈렉틴 9 개변체 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있는 폴리뉴클레오티드, (c) 갈렉틴 9 개변체 기술을 이용하여 발견된 인자 등, (d) 갈렉틴 9 개변체 및 그것과 실질적으로 균등한 생물 활성을 갖는 폴리펩티드 유전자 송달 비히클 등을 들 수 있으며, 이들은 인간 갈렉틴 9가 정상 세포에는 상해 활성을 나타내지 않고, 종양 세포에 대하여 세포 상해 활성을 나타낸다고 하는 성상, 종양 세포에 대하여 아포토시스를 유도하지만, 정상 세포에는 아포토시스를 유도하지 않는다고 하는 성상, 악성 세포의 전이성을 억제한다고 하는 성상, 활성화된 면역 세포, 특히 활성화된 CD4 양성 T 세포의 아포토시스를 유도하는 활성(이에 대하여 레스팅 T 세포, 특히 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포)의 아포토시스 유도는 그것을 유도하지 않는다고 하는 성상) 등을 이용하는 데에 있어서 유용하며, 항종양제, 항알레르기제, 면역 조절제, 자기면역 질환 용제, 항염증제, 부신피질 스테로이드 호르몬과 같은 활성을 이용하는 약제로서 유망하다.
본 발명의 활성 성분, 예컨대, 갈렉틴 9 개변체(특히 G9NC(null))를 사용하여 확인된 생물 활성 효과로부터, 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 개변체(특히 G9NC(null))는 다음에 나타내는 바와 같은 병적 증상 및 질환에 대하여 유용한 생물 활성을 나타낸다고 생각된다.
염증성 질환에는, 각 장기에서 일어나는 여러 가지 급성 및 만성 염증, 알레르기성 및 자기면역성의 염증, 감염증 등이 있다.
급성 및 만성 질환으로서는, 폐렴에서는 예컨대, 기관지염, 기관지 폐렴, 간질성 폐렴, 폐장염, 세기관지염이나 급성 횡격염 등을 들 수 있고, 또한 그 밖의 장기의 염증, 예컨대, 심외막염, 심내막염, 심근염, 구내염, 구각염, 편도염, 인두염, 후두염, 식도염, 복막염, 급성 위염, 만성 위염, 급성 장염, 맹장염, 허혈성 대장염, 약품성 대장염, 직장염, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 극증 간염, 만성 간염 등의 여러 가지 급성 및 만성 간염이나 간 경변, 담낭염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 또한 급성 및 만성 신염, 막성 신염, 사구체신염, IgA 신증 등이나, 여러 가지 방광염, 뇌수염, 유선염, 피부염, 표층 각막염, 건성 각결막염, 여러 가지 중이염이나 비염, 부비강염이나 비용종 등, 치육염, 치주염, 치주위염 등, 여러 가지 염증이 포함된다.
또한 신경성 염증(예컨대, 신경성 위염, 신경성 방광염 등)에도 효과가 확인되고 있다. 예컨대, 실시예 8에 의해, 갈렉틴 9가 캅사이신 유도 신경성 피부 염증 모델에 있어서, 그의 염증 반응에 대한 강한 억제 효과가 확인되었다. 캅사이신은 말초 신경을 자극함으로써, 신경성 염증이나 통증을 야기하는 물질이다. 캅사이신은, 지각 신경 C 선유 말단에 저장되어 있는 신경 펩티트인 서브스턴스 P의 유리 자극 작용을 갖는다. 서브스턴스 P는 비만 세포로부터 히스타민을 유리시키는 작용을 지니고, 그 결과 혈관이 확장되어, 부종이 생긴다. 또한, 유리된 히스타민에 의해 지각 신경이 자극을 받아, C 선유 말단에서 서브스턴스 P가 방출되어, 그 주위의 비만 세포에 작용하고, 또한 히스타민을 유리시킨다고 하는 증강 사이클이 성립한다. 갈렉틴은 이 병태 형성의 억제 작용을 갖는다.
*또한, 캅사이신은 감각 신경 종말의 통증 수용 센서인 캅사이신 수용체(바닐로이드 리셉터)에 결합하여, 통증을 야기한다. 통증은 화학적 자극(산 등), 열 자극(열탕 등)이나 지나친 기계적 자극(타박 등)에 의해서 감각 신경 종말이 활성화됨으로써 야기되며, 캅사이신 수용체는 이러한 자극에 의한 통증에도 관여하고 있다. 그래서, 갈렉틴 9가 캅사이신 수용체에 의한 신경 종말의 활성화를 억제하는 것이 시사되어, 암이나 염증에 동반되는 통증의 경감 등, 진통 작용에의 가능성도 기대할 수 있다.
알레르기성 염증 질환에는, 전신성 아나필락시스, 기관지 천식, 과민성 폐렴, 화분증, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 면역 복합체가 일으키는 알레르기성 질환, 혈관 신경성 부종 등을 들 수 있다.
또한, 자기면역성의 염증(자기면역 질환)에는, 전신성(만성 관절 류마티스, 전신성 에리토마토데스, 결절성 다발성 동맥염, 강피증, 다발성 근염·피부근염, 쉐그렌 증후군, 베체트병 등), 신경계(다발성 경화증, 중증 근무력증, HAM(HTLV-1 척수증), 근위축성 측색경화증 등), 내분비성(바세도우병, 하시모토병, 1형 당뇨병 등), 혈액(특발성 혈소판 감소성 자반증, 자기면역성 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈 등), 호흡기(사르코이도시스, 폐섬유증 등), 소화관(궤양성 대장염, 크론병 등), 간(자기면역성 간염, 원발성 담즙성 간 경변, 원발성 경화성 담관염, 자기면역성 담관염 등), 콩팥·요로계(항호중구 세포질 항체 관련 신염, 혈관염, 굿패스쳐 증후군, 항사구체 기저막 항체병 등) 등이 있다.
감염증은, 병원체가 생체의 세포·조직·장기를 상해함으로써 생기는 질환의 총칭이다. 한편, 감염증에 관하여는, 감수: 마치나미 리쿠오, 편집: 카나데 쥰이치, 사카모토 아츠히코, 「표준병리학(제2판)」, 의학서원, 2002년 3월 15일 발행을 참고로 할 수 있다. 인간에게 감염증을 가져오는 병원체에는, 1) 세균(스피로헤터, 크라미디아, 리케티아를 포함함), 2) 바이러스, 3) 진균, 4) 식물(조류), 5) 원충, 6)기생충(흡충, 조충, 선충), 7) 절족 동물이 있다. 각 병원체가 가져오는 주된 질환에는, 세균성 감염증(콜레라, 페스트, 대장균 감염증 등), 스피로헤터 감염증(렙토스피라증 등), 크라미디아 감염증(옴병 등), 리케티아 감염증(발진티푸스, 파상풍 등), 바이러스성 감염증(대상포진, 바이러스성 출혈열, 광견병 등), 진균증(칸디다증, 크립토코커스증, 아스페르질루스증 등), 원충성 질환(아메바 이질, 말라리아, 톡스플라즈마증 등), 기생충(흡충증, 선충증 등), 기타, 마이코플라스마 감염증(마이코플라스마 폐렴 등), 미코박테리아 감염증(결핵, 비정형 항산균증 등)을 들 수 있다.
암 및 육종에 대해서는, 뇌종양(다형성 교아종 등), 척수 종양, 상악동암, 췌액선암, 치육암, 설암, 구순암, 상인두암, 중인두암, 하인두암, 후두암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 흉막 종양, 암성 복막염, 암성 흉막염, 식도암, 위암, 대장암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 간암, 신장의 암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소 종양, 부신의 암, 자궁경암, 자궁체암, 질암, 외음암, 난소암, 섬모상피종, 악성 골종양, 연부육종, 유방암, 피부암, 악성 흑색종, 기저 세포종, 백혈병, 골수화성을 동반하는 골수선유증, 악성 림프종, 호지킨병, 형질 세포종, 글리오마 등을 들 수 있다.
피부과 영역에도 적용할 수 있으며, 예컨대, 1) 피부 질환에는, 감염증, 알레르기성 염증이나 자기면역성 염증을 포함하는 염증이나, 건선, 수포증, 농포증, 각화, 각화 이상증 등 특유의 염증이 있다. 또한, 2) 미용 피부과 관련으로서는, a) 멜라닌 대사 조절(미백) ··· 갈렉틴 9 유전자 도입 멜라노마 세포는 흑색조에서 백색으로 변화. 피부 기저 세포층에 갈렉틴 9 양성 세포 있음. b) 모발 성장(발모)의 조절 ··· 모근부에 갈렉틴 9 발현 있고, 시기적으로 다르다. 갈렉틴 9 유전자 도입 마우스의 모발의 성장은 뮤턴트 갈렉틴 9 유전자 도입 마우스에 비하여 매우 양호. c) 콜라겐 산생 조절 등 ··· 선유아 세포는 여러 가지 자극으로 갈렉틴 9 발현, 선유 결합직에 갈렉틴 9 양성의 부분 있음．
생활 습관병에 대해서는, 고지혈증, 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병 등을 들 수 있다. 생활 습관병 동맥경화증의 병태 형성에 관여하는 세포의 하나인 포말 세포에 gal9 양성 세포와 음성 세포가 존재하는 것이 밝혀졌다. 이로부터 동맥경화증의 병태에는 gal9의 관여가 시사되어, 그것을 제어함으로써 치료나 예방하는 것이 가능하게 되는 것을 부정할 수 없다. 고혈압에서는 동물 실험 모델에 있어서 고혈압 발증시 갈렉틴 9가 요세관이나 사구체의 발현이 증강하므로 갈렉틴 9 발현을 제어하거나, 갈렉틴 9를 투여함으로써 치료할 수 있을 가능성이 높다.
또한, 정상 세균총의 유지에도 적용할 수 있으며, 예컨대, gal9는 장관의 상피에 정상에서도 강하게 발현되고 있고, 또한 악옥 세균총을 투여했을 때에는, 장관 상피 및 대식세포 등의 염증 세포에 있어서의 갈렉틴 9의 발현이 증강한다. 이점에서 소화관에 있어서의 정상 세균총의 유지에 갈렉틴 9가 관여하고 있음이 강하게 시사된다.
또한, 아밀로이도시스에 적용할 수 있으며, 예컨대, 아밀로이도시스를 확인하는 부분에서의 대식세포에서는, 갈렉틴 9 발현을 나타내는 대식세포의 존재가 있다. 갈렉틴 9에 의해서 아밀로이드 침착을 제어할 수 있을 가능성이 있다.
알츠하이머병, 골다공증, 골절 등에도 유용하다고 생각되며, 예컨대, 알츠하이머병 환자의 뇌에 있어서 변성된 신경 세포는 갈렉틴 9 양성 소견을 보인다. 따라서, 치료 및 진단에 이용할 수 있을 가능성이 있다. 또한, 골다공증에서는, 갈렉틴 9에는, 골 흡수는 억제하고 골 형성은 촉진할 가능성을 생각할 수 있다. 이러한 작용은, 골대사의 면에서 생각하면 이상적인 약제라고 생각된다.
또한, 뇌, 신경 영역에서도 유용하며, 예컨대, 뇌경색, 심근경색 등의 허혈성 병변의 진전은, 염증 세포의 습윤을 동반하여, 슈퍼옥사이드 산생 등이 발생하여 악화된다. 그의 염증을 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 개변체가 제어하는 것을 기대할 수 있다. 염증, 면역계의 변화가 원인이 되는 탈골수성 질환으로서, 예컨대 다발성 경화증 등이 있다. 변성 질환으로서, 근위축성 측색경화증, 파킨슨병 등도 들 수 있다. 또한, 통합 실조증은 어떠한 염증성의 변화가 원인이라고 여겨지고 있다. 즉, EPA(에이코사펜타엔산)는 뇌에서 염증 반응의 제어나 신경 세포막의 형성에 이용된다. 통합 실조증 환자에게는 세포막 중의 EPA나 그 밖의 필수 지방산이 고갈되고 있음을 나타내는 연구의 예가 있다.
통풍에 대하여도 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 개변체가 유용하다고 기대할 수 있다. 요산 결정의 조직 침착에 대한 통증이 강한 급성 염증에 대하여도 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 개변체가 그것을 제어하는 것을 기대할 수 있다.
천식은 가역성의 기도 폐색(천식 발작)을 가져오는 호흡기 질환으로, 항원 특이적(allergen) 또는 비특이적(감염, 냉기 등)인 자극에 대한 기도의 반응성이 항진하고 있는 상태를 가리키고 있다. 최근, 천식의 기도에는 발작이 없는 안정기에도 혼산구, T 림프구 및 비만 세포를 주체로 한 염증이 존재하는 것이 증명되어, 현재, 천식의 본체는 만성의 기관지염이라고 생각되고 있다. 또한, 소아 천식의 대부분은 아토피 소인(IgE 산생)과의 관련이 강하지만(아토피형 천식), 성인 천식에서는 IgE의 관여를 증명할 수 없는 것이 약 반수 확인된다(비아토피형 천식). 천식 예방·관리 가이드라인(1998년 후생성 연구반)이 작성되어, 천식 치료는 급성 발작과 만성 기도염증의 둘로 나뉘어 이루어지고 있다. 발작 치료약으로서는, 기관지 확장약(β2 자극약, 아미노필린)이 제1 선택약으로서 이용되고 있지만, 중등증 이상의 발작에서는 이들 약제로는 불충분하고, 스테로이드약의 대량 전신 투여가 이루어진다. 스테로이드약은 부작용이 크고, 특히, 소화성 궤양, 고혈압, 고혈당, 정신 증상 등이 중대하며, 장기간 사용하면, 감염증, 부신 억제, 골다공증 등이 문제가 되게 된다. 또한, 합병증을 수반하는 경우는, 스테로이드의 사용은 위험이 따른다. 부작용이 적고, 스테로이드와 동등한 효과를 갖는 약제의 개발이 요구되고 있다. 장기적인 관리약으로서 만성 기도염증의 치료에는 항염증약이 주체로 되어 있는데, 그 중에서도 흡입 스테로이드약의 사용이 장려되고 있다. 이 스테로이드약을 장기간에 대량으로 사용한 경우, 부신 억제, 골다공증, 기도 감염 등의 부작용이 출현할 가능성은 부정할 수 없다. 또한, 흡입약은 정확한 흡입 손재주가 요구되어, 내복약에 비교하여 컴플라이언스라는 점에서 뒤떨어지고 있다. 중등증 이상의 천식에서는 흡입 스테로이드약에 더하여, 흡입 β2 자극약, 로이코트리엔 길항약 또는 서방성 테오필린약의 병용이 장려되고 있다. 중증의 예에서는 스테로이드의 전신 투여가 부득이하게 되어 있다. 이러한 약제를 대신하는 약제의 개발이 요구되고 있다.
천식의 병태 형성에 있어서, T 림프구, 호산구의 폐 조직 및 기도에의 침윤이 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 한편, 갈렉틴 9는 세포의 아포토시스를 유도하는 기능을 지니고, 활성화 T 세포 및 호산구의 아포토시스를 유도한다. 이러한 것을 근거로 하여, 본 발명에서 갈렉틴 9 개변체 등을 사용한 연구로부터, 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 개변체가 천식에 있어서의 기도 염증을 개선(억제)하는 활성을 갖는 것이 밝혀졌다.
또한, 갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 개변체는, 골아세포 증식과 분화의 증강 및 파골세포 분화 억제 활성을 갖고 있고, 골다공증의 예방 및/또는 치료, 스테로이드 장기간 투여에서 문제가 되는 부작용의 하나인 골 생육 억제에 대하여도 유효하다고 생각된다.
갈렉틴 9 및 갈렉틴 9 개변체는, 림프구에 대한 작용에 있어서 스테로이드와는 달리, 활성화 림프구 특이적인 억제 작용을 보이며, 스테로이드에 비하여 부작용, 예컨대, 면역 억제가 적은 것을 기대할 수 있다. 또한, 스테로이드에 존재하지 않는 접착 분자의 기능 억제 및 신경성 염증의 억제 작용도 가져, 천식 치료, 예컨대, 발작 치료약으로서 유망하다. 또한 스테로이드의 부작용을 경감하는 것도 가능하다고 생각된다.
실시예
이하에 실시예를 들어, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 단순히 본 발명의 설명을 위해, 그 구체적인 태양의 참고를 위해 제공되고 있는 것이다. 이들 예시는 본 발명의 특정한 구체적인 태양을 설명하기 위한 것이지만, 본원에서 개시하는 발명의 범위를 한정하거나, 또는 제한하는 것을 나타내는 것은 아니다. 본 발명에서는, 본 명세서의 사상에 기초한 여러 가지 실시 형태가 가능하다는 것은 이해되어야 한다.
모든 실시예는, 그 외에 상세하게 기재하는 것 이외에는, 표준 기술을 이용하여 실시한 것, 또는 실시할 수 있는 것으로, 이것은 당업자에 있어서 주지이며 관용적인 것이다. 한편, 이하의 실시예에 있어서, 특별히 지적이 없는 경우에는, 구체적인 조작 및 처리 조건 등은 DNA 클로닝에서는 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) 및 D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995); PCR법을 사용하는 경우에는, H. A. Erliched., PCR Technology, Stockton Press, 1989; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995) 및 M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols", Academic Press, New York(1990)에 기재된 방법에 준하여 실행하고 있고, 또한 시판되는 시약 또는 키트를 이용하고 있는 경우에는 이들에 첨부된 지시서(protocols)나 첨부된 약품 등을 사용하고 있다.
실시예 1
(A) 갈렉틴 9 개변체 발현 벡터의 구축
발현 벡터의 제작에는,
(1) 주르캇 세포의 poly(A)+ RNA 획분으로 조제한 cDM
(2) pET-11a 벡터(STRATAGENE)
(3) PCR용 프라이머:
G9NCRD1: CGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG 서열 번호 10
G9NCRD6: CGACCGCATATGCTGGAAGCTGATGTAGGACAG 서열 번호 11
G9CCRD5: CGTCCTCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATG 서열 번호 12
G9CCRD6: CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG 서열 번호 13
을 사용했다.
주르캇 세포(T 세포 유래 세포)는, 아메리칸·타입·컬쳐·컬렉션(ATCC)으로부터 입수했다. 셀라인은 10% FCS를 첨가한 RPMI-1640 배지(Sigma, 세인트루이스, 미국) 중에서 5% CO2의 조건 하에 37℃로 유지했다. 주르캇 세포로부터의 총 RNA의 추출은 다음과 같은 식으로 행했다. 즉, 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지를 이용하여 배양한 주르캇 세포를 원심하여 모은다. 10 ml의 PBS로 세포를 2번 세정한다. 세정한 세포의 침전에, 세포 2×108개당 15 ml의 ISOGEN(상품명: 닛폰진)을 첨가하여, 메뉴얼(닛폰진)에 따라서 총 RNA를 추출한다. 총 RNA로부터의 poly(A)+ RNA의 정제와 cDNA 합성은 다음과 같은 식으로 행했다. 즉, 주르캇 세포로부터 추출한 총 RNA를, 1 mg/ml의 농도가 되도록 DEPC 처리수에 용해한다. PolyATtract mRNA Isolation System(상품명: Promega)을 이용하여, 메뉴얼에 따라서 총총부터 poly(A)+ RNA를 정제한다. 정제한 poly(A)+ RNA를 5 ㎍/20 ㎕의 농도가 되도록 DEPC 처리수에 용해한다.
First-Strand cDNA Synthesis Kit(상품명: Amersham Biosciences)를 이용하여, 메뉴얼에 따라서 5 ㎍의 poly(A)+ RNA로부터 cDNA를 합성한다(프라이머에는 Not I-d(T)18을 사용함).
이어서, 도 1에 도시하는 순서로 pET-11a 벡터의 NdeI-BamHI site에 갈렉틴 9의 N-말단측 당쇄 결합 도메인(N-terminal carbohydrate recognition domain, NCRD)과 C-말단측 당쇄 결합 도메인(CCRD)을 삽입하여, 링커 펩티트이 빠진 개변형 갈렉틴 9(G9NC(null))의 발현 벡터를 제작했다. 우선, 갈렉틴 9 cDNA로부터 각각 (1) 인간 갈렉틴 9의 C-말단측 CRD에 대응하는 cDNA와 (2) 인간 갈렉틴 9의 N-말단측 CRD에 대응하는 cDNA를 취득했다. 즉, cDNA로부터 PCR용 프라이머: G9CCRD5+G9CCRD6을 이용하여 인간 갈렉틴 9의 C-말단측 CRD에 대응하는 cDNA(G9CCRD)를 증폭했다. G9CCRD를 제한 효소(NdeI+BamHI)로 절단한 후, 동일한 제한 효소로 처리한 pET-11a 벡터에 삽입하여 pET-G9CCRD를 얻었다. PCR은 KOD DNA polymerase kit(TOYOBO Code No. KOD-101)를 사용하여 행했다. PCR Reaction mixture(dNTP mix, 25 mM mgCl2, 10×완충액, KOD DNA polymerase(0.05u), 프라이머 및 주형 cDNA)를 다음과 같은 PCR의 사이클 조건으로 반응시켰다: 94℃에서 2분 처리한 후, 사이클(98℃에서 15초, 이어서 65℃에서 2초, 그리고 74℃에서 30초 처리)을 25회 행하고, 마지막으로 4℃에서 반응을 정지했다. PCR 증폭된 단편의 벡터에의 삽입은, Ligation high kit(TOYOBO Code No. LGK-101)를 사용하여 행했다. 반응은, 인서트:벡터의 몰비를 약 5:1로 혼합하여, 그 총 DNA 용액(체적)량의 1/2(체적)량의 시약 Ligation high를 가하여 혼합하여 행했다. 16℃에서 16시간 (0/N) 반응시킴으로써 삽입했다.
한편, 상기 갈렉틴 9 cDNA로부터 PCR용 프라이머: G9NCRD1+G9NCRD6을 이용하여 인간 갈렉틴 9의 N-말단측 CRD에 대응하는 cDNA(G9NCRD)를 증폭했다. G9NCRD를 제한 효소(NdeI)로 절단한 후, 얻어진 단편을 동일한 제한 효소(NdeI)로 처리하고, 또한 탈인산화한 pET-G9CCRD에 삽입하여 pET-G9NC(null)를 얻었다. PCR 증폭 및 벡터에의 삽입은 상기와 같은 식으로 행했다. pET-G9NC(nu11)는 인간의 M형 갈렉틴 9의 제149번째의 Pro로부터 제177번째의 Ser까지의 29개의 아미노산 서열을 His-Met 서열로 대체한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다. 즉, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것으로, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다.
(B) 갈렉틴 9 개변체 재조합 단백질의 발현 및 정제
상기 단계 (A)에서 얻어진 발현용 플라스미드 벡터 pET-G9NC(null)를 대장균(BL21(DE3))에 도입했다. 도입은 일렉트로포레이션법에 의해 행했다. 즉, competent BL21(DE3)과 플라스미드 벡터 수용액을 혼합하여, 1.8 kV의 전압에서의 일렉트로포레이션법에 의해 트랜스펙션을 행했다.
재조합 단백질의 발현은, 대장균을 2%(w/v) 글루코스 및 100 ㎍/ml 암피실린 함유 2×YT 배지 중에서 배양하고, 600 nm에서의 흡광도가 0.7에 달한 시점에서 O.1 M 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 첨가(최종 농도, 0.1 mM)하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하여 행했다. 20℃에서 18시간 배양한 후, 원심에 의해 균체를 모아, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF에 현탁했다. 현탁액을 10분간 음파 처리한 후, 10%(w/v) Triton X-100을 가하여(최종 농도, 1%) 4℃에서 30분간 교반했다. 15,000×g로 30분간 원심하여, 얻어진 상청액 중의 재조합 단백질을, 락토스-아가로스를 이용한 어피니티 크로마토그래피에 의해서 정제했다.
결과, 순도가 높은 표품이 비교적 높은 수율로 얻어졌다. 얻어진 재조합 단백질의 전기 영동의 결과를 도 2에 도시한다. SDS-PAGE 조건은 다음과 같다: Gel, Acrylamide-BIS(12% gel), 전기 영동용 버퍼, 25 mM Tris-192 mM 글리신-0.1% SDS, 영동 조건, 180 V, 45분, 염색, CBB, 60℃/30분. 전기 영동 샘플은, Strata CleanTM Resin(Stratagene)에 흡착시키고, 1×샘플 완충액(62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2%(w/v) SDS, 5%(W/V) 2-ME, Glycerol)로 0.2 mg/ml로 조정하여, 98℃/3분의 열처리 후 레인당 약 2 ㎍의 단백량으로 전기 영동을 했다.
정제된 G9NC(null)는, 4℃에서 90일간 이상 안정적으로 보존할 수 있었다. 한편, 야생형의 갈렉틴 9(M-type, G9(M))는 동일한 보존 조건에서 2주간 이내에 대부분이 분해되었다(도 3 참조). 이 분해는, 정제 갈렉틴 표품에 포함되는 대장균 유래의 프로테아제에 의한 것이라고 생각된다.
실시예 2
인간 조직 중에 존재하는 프로테아제에 대한 감수성을, 야생형의 갈렉틴 9(S-type, G9(S): 가장 짧은 링커 펩티트를 갖는 아이소폼)와 G9NC(null)로 비교했다. PBS에 용해한 갈렉틴에 1/100(중량비)의 matrix metalloproteinase-3(MMP-3) 또는 elastase를 가하여 37℃에서 보온했다. 어느 쪽의 경우도 G9(S)는 1∼2시간에서 대부분이 분해된 데 대하여, G9NC(null)는 2시간 후에 있어서도 전혀 분해를 받고 있지 않았다(도 4 및 5 참조).
실시예 3
갈렉틴 9의 생물 활성에 주는 변이 도입의 효과를 조사하기 위해서, MOLT-4 세포(인간 Tcell leukemia 유래 세포주)에 대한 아포토시스 유도 활성 및 말초혈 호산구에 대한 유주 활성(eosinophil chemoattractant activity, ECA activity)을 검토했다.
(a) 세포 배양물
MOLT-4(T 세포)는 ATCC로부터 입수했다. 셀라인은 10% FCS를 첨가한 RPMI-1640 배지(Sigma, 세인트루이스, 미국) 중에서 5% CO2의 조건 하에 37℃에서 유지했다. Gal-9의 활성을 저해하기 위해서는, 배양용 배지에는 30 mM의 락토스를 첨가할 수 있다. 대조군으로서 동일한 농도의 수크로스를 이용했다.
(b) 아포토시스 측정
(1) PI에 의한 세포 주기(apoptosis) 해석(PI법)
아포토시스 유도 처리된 세포를, 4℃ 5분간 1000 rpm으로 원심 처리한 후, 세포 펠릿을 PBS(300 ㎕)에 재부유시켜, 볼텍스하면서, 세포 부유액에 100% 냉에탄올(700 ㎕)을 서서히 첨가하여, 최종 농도 70% 에탄올이 되도록 한다. 4℃에서 30분간 인큐베이트 처리하여 세포를 고정하고, 이어서 PBS(1 ml)를 가하여 4℃ 5분간 1000 rpm으로 원심 처리한 후, 세포 펠릿을 PBS(440 ㎕)에 재부유시킨다. 세포를 2.5 mg/ml의 리보뉴클레아제 A(10 ㎕; 최종 농도 50 ㎍/ml, Sigma, 세인트루이스, 미주리, 미국)와 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션 처리하고, 이어서 2.5 mg/ml의 요오드화프로피듐(4 ㎕; PI, 최종 농도 20 ㎍/ml, Sigma)과 함께 4℃ 10분간 어두운 곳에서 인큐베이션 처리를 했다. 나일론메쉬를 통과시켜 집괴가 된 세포를 제거한 후, 세포를 PBS로 메스업하여, 염색 세포를 플로우 사이토미터(Sandstrom, K. et al., J Immunol Methods, 240: 55(2000) 및 Zhang L. et al., Cancer Lett, 142: 129(1999))에 의해서 해석했다.
(2) TUNEL(TdT-mediated 표식 dUTP nick end labeling)법
DNA의 단편화에 의해 생긴 말단에, DNA 말단에 뉴클레오티드를 부가하는 효소(TdT; 터미널·데옥시뉴클레오티딜·트랜스페라아제)로, 라벨한 뉴클레오티드(dUTP-biotin 또는 FITC-dUTP 등)를 삽입하여, 아포토시스의 현저한 특징인 세포핵 DNA의 단편화를 검출한다. 실험에는, MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL, 나고야, 일본)를 사용했다. 키트 업자에 의한 지시에 따라, 실험을 다음과 같이 행했다. 즉, 아포토시스 유도를 한 세포(약 2×105개/샘플)를 O.2% FSA 함유 PBS로 세정하고, 이어서 4% 파라포름알데히드(0.1 M NaH2PO4, pH 7.4 중)를 가하여 4℃ 30분간 고정화한 후, 0.2% FSA 함유 PBS로 세정하였다. 세포 펠릿에 70% 냉에탄올을 첨가하여 -20℃ 30분간 인큐베이션 처리하여, 투과성을 항진시켰다. 0.2% FSA 함유 PBS로 세정한 후, 세포 펠릿에 TdT 반응액(TdT, FITC-dUTP 및 TdT 버퍼의 혼합물)을 첨가하여, 교반한 후 37℃에서 1시간 인큐베이션 처리하고, 0.2% FSA 함유 PBS로 세정한 후 0.2% FSA 함유 PBS에 재부유시키고 나서, 염색 세포를 플로우 사이토미터에 의해서 해석했다.
(c) T 세포 해석
24 웰 플레이트를 각 웰당 3 ㎍/ml의 항CD3 항체(Immunotech, Marseille, 프랑스)의 TBS액(pH 8.0)으로 4℃ 밤새 인큐베이션 처리한 후, 항CD3 항체액을 제거하고, 웰을 PBS로 세정하여, 항CD3 항체로 코트한 웰 플레이트를 얻었다.
헤파린 추가 혈액으로부터 단핵 백혈구 세포 분획을 HISTOPAQUE(등록상표, SIGMA)를 사용하여 단리했다. 이어서, CD4 양성 단리 키트(CD4-positive isolation kit; DYNAL, 오슬로, 노르웨이) 및 Dynabeads(등록상표) M-450 CD8(DYNAL, 오슬로, 노르웨이)을 사용하여, 키트 제조업자가 기재하고 있는 것과 같이 하여, CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포를 각각 단리했다. T 세포를 활성화하기 위해서는, CD4 양성 T 세포 또는 CD8 양성 T 세포를 10% FCS 함유 RPMI-1640에 1×106 개/ml로 한 세포를, 20∼24시간 37℃에서 항CD3 항체로 코트된 플레이트 상에서 5% CO2 인큐베이터 속에서 인큐베이션 처리하고, 이어서 재조합 갈렉틴 9(야생형 G9(S) 또는 개변체 G9NC(null))와 함께 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 속에서 인큐베이션 처리를 했다. 이어서, 상기 (b)와 같은 식으로 하여 아포토시스 분석을 했다. 즉, 세포를 37℃에서 50 ㎍/ml의 PI(Sigma)와 함께 어두운 곳에서 10분간 인큐베이션 처리를 했다. 염색 세포를 플로우 사이토미터(Sandstrom, K. et al., J Immunol Methods, 240: 55(2000) 및 Zhang L. et al., Cancer Lett, 142: 129(1999))에 의해서 해석했다.
비활성화(레스팅) T 세포에 대해서도, 재조합 갈렉틴 9(야생형 G9(S) 또는 개변체 G9NC(null))와 함께 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 속에서 인큐베이션 처리를 한 후, 상기와 같은 식으로 하여 아포토시스 분석을 했다.
(d) 결과
아포토시스에 따른 DNA의 단편화를 아가로스 겔 전기 영동과 FACS에 의해 검토한 결과, 어느 방법을 이용한 경우라도, G9NC(null)는 G9(S)와 동등 또는 그 이상의 아포토시스 유도 활성을 유지하고 있는 것이 나타냈다(도 6, 표 1). 챔버법에 의해 ECA 활성을 조사한 결과, G9NC(null)는 G9(S)와 비교하여 보다 높은 활성을 나타냈다(도 7).
아포토시스한 MOLT-4 세포의 비율(%)
대조 0.1 μM 0.3 μM 0.5 μM 1 μM
G9(M) 4.2 5.5 13.8 28.9 58.8
G9(S) 4.5 8.7 23.6 44.7 64.0
G9NC(null) 5.1 11.5 33.9 57.8 72.1
표 1은 야생형 갈렉틴 9(G9(S))과 갈렉틴 9 개변체(G9NC(null))와의 사이에서 생물 활성을 비교한 결과를 나타내는 것으로, MOLT-4 세포에 대한 아포토시스 유도 활성(FACS 분석)을 조사한 것이다.
실시예 4
[1. 류마티스(RA) 관절 활막에 있어서의 갈렉틴 9의 발현]
[방법]
환자 조직은 미국류마티스학회(ACR)의 분류 기준을 충족하는 RA 환자 활막 조직 표본을 사용했다. 환자의 조직 표본의 면역 조직 염색은 이하의 방법으로 행했다. 표본 절편의 조제는, 다음과 같이 했다. (1) 탈파라핀: 크실렌 3회(각 10분), 100% 알콜∼90% 알콜·75% 알콜(각 2분). (2) 마이크로파(MW) 처리: 10 mM 시트르산 완충액(pH 6.0)을 용시 조제한다. 미리 MW 조사하여 비등시킨 완충액 속에 절편을 침지하여, MW 조사한다(500 w 전자레인지인 경우 5분×3회, 합계 15분). 실온에 20분간 방치하여, 천천히 식힌다. (3) 내인성 퍼옥시다제의 불활화: 0.3% 과산화수소·메탄올을 용시 조제하여, 30분간 침지한다. PBS 세정 5분×3회. 5% BSA를 파스퇴르 피펫으로 4방울 넣어 블로킹. 습윤 상자 1시간 실온.
표본 절편의 위로부터 일차 항체 또는 대조군 항체를 파스퇴르로 6방울 넣는다. 습윤 상자 밤새 4℃. 다음날, PBS 세정 5분×3회. 퍼옥시다제 표식 이차 항체(DACO Envision+)를 6방울 넣는다. 습윤 상자 1시간 실온. PBS 세정 5분×3회.
DAB(3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride) 시약에 의한 발색: DAB 시약을 용시 조제한다. 절편을 적셔 3분간 발색시킨다. 즉시 수돗물로 발색 반응을 멈춘다. 핵 염색 마이어 헤마톡실린 20초. 즉시 흐르는 물 세정 15분. 탈수, 투철(透徹), 봉입. 75% 알콜·90% 알콜·100% 알콜(각 2분), 크실렌 3회(각 3분).
[결과]
결과를 도 53에 나타낸다. 갈렉틴 9는 활막 세포 및 임파 여포 주위의 세포군이나 여포 내의 수지상 혈관의 내피 세포에 선택적으로 발현이 확인된다. OA(변형 관절증)에서는 갈렉틴 9 양성 세포는 거의 확인되지 않는다(도 53 참조). 갈렉틴 9는, RA 활막 조직 증식의 본태인 활막 세포나 임파계 세포, 또한 신생 혈관에 강하게 유도되는 분자이다. 한편, 갈렉틴-1은 활막 세포나 혈관 주위 세포에, 갈렉틴 3은 RA 활막 구성 세포 전반에 검출된다.
[2. 갈렉틴-9에 의한 활막 세포의 아포토시스 유도 활성]
[방법]
관절 파괴의 원인이 되는 활막 세포에 대한 갈렉틴 9의 작용을 검토했다. 활막은, 류마티스 환자의 활막 조직을 무균적으로 채취하여, 세포를 분리, 배양했다. 1∼2회의 계대 후, 실험에 사용했다. 본 실험의 조직은 67세 여성, 우측 무릎 RA였다. 활막 세포를 파종 후, 밤새 배양했다. 접착을 확인한 후, rhGa1-9(hG9NC(null), rhGal-9S, rhGal-9M)를 최종 농도 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0 μM이 되도록 첨가했다. 72시간 배양한 후에 광학 현미경으로 관찰하고, 또한 세포를 회수하여, PI법으로 아포토시스 유도 활성을 측정했다. 아포토시스 유도 활성의 측정은 실시예 3과 같은 식으로 하여 실시했다.
[결과]
광학 현미경 관찰의 결과를, 도 54에 도시한다. PI법에 의한 아포토시스 유도 활성의 측정 결과를, 도 55에 도시한다.
갈렉틴 9 개변체(Gal-9(NC-Null))는, 천연형 갈렉틴 9(Gal-9(M), Gal-9(S))보다 아포토시스 유도 활성이 강하다. 모든 재조합에 있어서 농도 의존성에 아포토시스 유도 활성이 확인되었다. 이 아포토시스 유도 활성은 락토스(30 mM)에 의해 저해되었지만, 수크로스(30 mM)에서는 영향을 받지 않았다.
[3. 갈렉틴에 의한 활막 세포의 아포토시스 유도 활성과 증식 억제 활성의 비교]
[방법]
활막 세포에 대한 인간 갈렉틴(Gal-1, Gal-3, Gal-8(M), Gal-9NC(null))의 작용을 검토했다.
활막은, 류마티스 환자의 활막 조직을 무균적으로 채취하여, 세포를 분리, 배양했다. 1-2번의 계대 후, 밤새 파종한 활막 세포의 접착을 확인한 후, 인간 갈렉틴(Gal-1, Gal-3, Gal-8(M), Gal-9NC(nu11))을 최종 농도0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0 μM이 되도록 첨가했다. 24시간 배양 후에 세포를 회수하여, PI법으로 아포토시스 유도 활성을 측정했다. 활막 세포의 증식 억제 효과는 인간 갈렉틴이 최종 농도 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0 μM이 되도록 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여, 48시간 배양한다. 배양한 후 플레이트 안을 PBS로 세정하고, 세포 계수 키트-F(cell counting kit-F)(도진가가쿠, cat. no. 343-07743)를 이용하여, 강한 형광(λex=490 nm, λem=515 nm)을 발하는 생세포수를 형광 플레이트 리더로 측정했다.
[결과]
아포토시스 유도 활성 측정의 결과를, 도 56에 도시하고, 활막 세포의 증식 억제 활성을 측정한 결과를, 도 57(도면 중, hGalectin 1은 재조합 인간 갈렉틴 1을, hGalectin 3은 재조합 인간 갈렉틴 3을, hGalectin8(M)은 재조합 인간 갈렉틴 8M을, hGalectin 9는 hGal-9NC null을 나타냄)에 도시한다. 활막 세포의 증식을 억제하는 것은 류마티스 치료에 있어서 매우 중요하다.
갈렉틴 9 개변체(hGal-9 NCnull)는, 증식한 활막 세포의 아포토시스를 유도하여, 활막 세포의 증식을 억제하기 때문에, 항류마티스약으로서 유용하다. 다른 갈렉틴에는 이러한 작용은 확인되지 않는다.
여러 가지 염증 질환, 즉 급성·만성, 알레르기, 면역계 질환의 마우스 모델에 있어서 갈렉틴 9 개변체 h-G9NC(null)의 효과를 조사했다.
이 결과, 갈렉틴 9 개변체는, 여러 가지 염증의 억제 또는 증강 작용을 갖는 것, 또한 여러 가지 사이토카인 산생의 제어 작용을 가지므로, 염증 반응을 제어할 수 있는 것이 시사되었다. 그 실시예를 기재한다.
이하의 실시예 [실시예 5∼12]에 있어서, G9NC(nuLL)[gal9NC(null), h-gal9NC(null), hG9NC(null) 또는 h-G9NC(null): 인간∼널·갈렉틴 9(human null galectin-9)]는, 갈파마(주)(가가와현, 일본)의 연구소 제조의 것이다. 덱사메타손(dexamethasone; dexamethasone 21-phosphate disodium salt, 시그마알드리치(Sigma-Aldrich)사, 미주리, 미국)은 공급업자로부터 입수했다.
실시예 5
[자이모산 유도 흉막염 모델]
우선, 마우스를 디에틸에테르(와코쥰야쿠)로 마취하여, G9NC(null)[또는 h-gal9NC(null)] 100 ㎍, 자이모산(시그마알드리치사) 100 ㎍, 덱사메타손(시그마알드리치사) 30 mg/kg를 단독 또는 혼합하여 마우스의 흉강내에 주사했다. 대조군에는 PBS를 이용했다. 4시간 뒤에, 마우스에 넴부탈 주사액(상품명: 펜트바르비탈, 다이니폰세이야쿠 주식회사)을 PBS로 10배 희석한 것을 0.2 내지 0.3 ml 복강내에 주사하여 마취한 후, 개복하여 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액 샘플로 했다. 그 후, 탈혈하여 안락사시키고, 흉강내를 PBS(1 ml)로 2회 세정하여, 흉강 세정액 샘플로서 회수했다.
혈액 샘플은, 상온에서 정치한 후 5000 rpm, 10분 원심하여, 상청을 혈청 샘플로서 회수하여, 동결 보존했다. 흉강 세정액 샘플은 터크액(Turk's solution)으로 총 세포수를 카운트했다. 카운트 후, 일부를 사이토스핀에 걸어, 바람에 말리고, 딥퀵(고쿠사이시야쿠 주식회사) 또는 메이그린월드액(무토가가쿠 주식회사)과 김자액(머크저팬 주식회사)으로 염색, 경검하여, 총 세포수 200개 중의 호중구, 호산구, 대식세포, 림프구, 기타 비만 세포 등을 카운트했다. 결과를 도 9 및 도 10에 도시한다.
실시예 6
[PMA 유도 피부염 모델]
포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA, 시그마알드리치사, 미주리, 미국)는 공급업자로부터 입수했다. 동물에의 투여에는, 비히클(담체, Vehicle)의 PBS(-)에 화합물을 현탁하여, 모든 실험에 사용했다(이하의 실시예에 있어서도 마찬가지임).
SLC(시즈오카현, 일본)로부터 Balb/c 마우스(7주령)를 구입했다. 동물은, 먹이 및 물을 자유롭게 섭취할 수 있게 하여, 12시간 낮/밤의 리듬의 표준 조건 하에 계속 두었다. 모든 동물은, 국제적인 가이드라인 및 일본의 법률에 따라서 사람에 의한 보살핌을 받았다(이하의 실시예에 있어서도 마찬가지임).
마우스의 귀에 부종을 다음과 같은 식으로 하여 유도시킨다. 15 mg의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 30 ml의 아세톤에 용해하여, 각 마우스(BALB/c, 암컷, 7∼8주령, SPF, SLC사)의 우측 귀의 내측 및 외측의 표면에 적용했다. 대조군으로서 아세톤을 좌측 귀에 적용했다.
G9NC(null), 덱사메타손, 또는 비히클을 PMA 적용하기 30분 전에 복강내(0.345 ml/머리)투여했다. PMA 적용한 후, 0, 3, 6, 8 및 24시간째에 귀의 두께를 교정 두께 게이지(calibrated thickness gauge; 미쯔토요(Mitsutoyo), 동경, 일본)를 이용하여 에테르 마취 하에 측정했다.
귀 부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타냈다. 여기서, R0 및 L0은 각각 실험 개시시(O 시간)의 우측 귀의 두께 및 좌측 귀의 두께를 나타내고, R 및 L은 각각의 시점에서의 두께의 값을 나타낸다.
데이터의 통계 처리는 다음과 같이 행했다. 특별히 명시하지 않는 한, 데이터는 평균치±SEM로 나타냈다. 데이터 세트의 통계차는 이원 배치 분산 분석(two-way ANOVA)을 사용하여 해석하고, 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 이용하여 본페로니 포스트-시험(Bonferroni Post-Test)에 의해 평가했다. <0.05의 P치의 것은 통계적으로 유의적인 것으로 한다. 상세한 것은 도면 부분에서 나타내고 있다(이하의 실시예에 있어서도 마찬가지임). 결과를 도 11에 도시한다.
실시예 7
[아라키돈산 유도 피부염 모델]
아라키돈산(AA, 시그마알드리치사, 미주리, 미국)은 공급업자로부터 입수했다. 다른 것은 실시예 6과 마찬가지다.
마우스의 귀에 부종을 다음과 같은 식으로 유도시킨다. 750 mg의 아라키돈산(AA)을 30 ml의 아세톤에 용해하여, 각 마우스(BALB/c, 암컷, 7∼8주령, SPF, SLC사)의 우측 귀의 내측 및 외측의 표면에 적용했다. 대조군으로서 아세톤을 좌측 귀에 적용했다.
G9NC(null), 덱사메타손 또는 비히클을 AA 적용 30분 전에 복강내(0.345 ml/머리) 투여했다. AA 적용한 후, 0, 1, 3 및 6시간째에 귀의 두께를 교정 두께 게이지(미쯔토요, 동경, 일본)를 이용하여 에테르 마취 하에 측정했다. 귀 부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타냈다. 여기서, R0 및 L0은 각각 실험 개시시(O 시간)의 우측 귀의 두께 및 좌측 귀의 두께를 나타내고, R 및 L은 각각의 시점에서의 두께의 값을 나타낸다. 데이터의 통계 처리는 실시예 6과 같은 식으로 했다. 결과를 도 12에 도시한다.
실시예 8
[캅사이신 유도 피부염 모델]
시프로헵타딘(cyproheptadine, 시그마알드리치사, 미주리, 미국) 및 캅사이신(capsaicin, 나카라이사, 동경, 일본)은 각 공급업자로부터 입수했다. 다른 것은 실시예 6과 마찬가지다.
마우스의 귀에 부종을 다음과 같은 식으로 유도시킨다. 500 mg의 캅사이신을 30 ml의 아세톤/올리브유(용량비=4/1)에 용해하여, 각 마우스(BALB/c, 암컷, 7∼8주령, SPF, SLC사)의 우측 귀의 내측 및 외측의 표면에 적용했다. 대조군으로서 아세톤/올리브유를 좌측 귀에 적용했다.
G9NC(null), 덱사메타손, 시프로헵타딘 또는 비히클을 캅사이신 적용의 30분 전에 복강내(0.345 ml/머리) 투여했다. 캅사이신 적용 후, 0, 0.5, 1 및 2시간째에 귀의 두께를 교정 두께 게이지(미쯔토요,동경, 일본)를 이용하여 에테르 마취 하에 측정했다. 귀 부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타냈다. 여기서, R0 및 L0는 각각 실험 개시시(0 시간)의 우측 귀의 두께 및 좌측 귀의 두께를 나타내고, R 및 L은 각각의 시점에서의 두께의 값을 나타낸다. 데이터의 통계 처리는 실시예 6과 같은 식으로 행했다. 결과를 도 13에 도시한다.
실시예 9
[DNFB 유도 접촉 피부염 모델]
디니트로플루오로벤젠(dinitro-fluoro-benzene(DNFB), 시그마알드리치사, 미주리, 미국)은 공급업자로부터 입수했다. 다른 것은 실시예 6과 마찬가지다.
마우스의 귀에 부종을 다음과 같은 식으로 유도시킨다. 7일전(day -7) 또는 6일전(day -6)에 0.5%의 디니트로플루오로벤젠(DNFB) 함유 아세톤/올리브유(용량비=4/1)액(30 ml)을, 각 마우스의 면도질한 복부에 적용하여, 감작하여 지연형 과민증(DTH) 유기의 부종 모델로 했다. 실험 시작일(day O)에 0.3%의 DNFB 함유 아세톤/올리브유(용량비=4/1)액(30 ml)을 각 마우스의 우측 귀의 내측 및 외측의 표면에 국소 적용하여 유발시켰다. 대조군으로서 아세톤/올리브유를 좌측 귀에 적용했다.
G9NC(null), 덱사메타손, 또는 비히클을 DNFB 유발의 7일전(day -7)부터 실험 시작일(day 0)까지, 그리고 DNFB 유발 24시간 후 또는 48시간 후에, 복강내(0.345 ml/머리) 투여했다. DNFB 유발 후, 0, 24, 48 및 72시간째에 귀의 두께를 교정 두께 게이지(미쯔토요, 동경, 일본)를 이용하여 에테르 마취 하에 측정했다. 귀 부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타내었다. 여기서, R0 및 L0는 각각 실험 개시시(0 시간)의 우측 귀의 두께 및 좌측 귀의 두께를 나타내고, R 및 L은 각각의 시점에서의 두께의 값을 나타낸다. 데이터의 통계 처리는 실시예 6과 같은 식으로 행했다. 결과를 도 14 및 도 15에 도시한다.
실시예 10
[FITC 유도 아토피성 피부염 모델]
플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate(FITC), 시그마알드리치사, 미주리, 미국)는 공급업자로부터 입수했다. 다른 것은 실시예 6과 마찬가지다.
마우스의 귀에 부종을 다음과 같은 식으로 유도시킨다. 7일전(day -7) 또는 6일전(day -6)에 0.5%의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 함유 아세톤/디부틸프탈레이트(용량비=1/1) 용액(400 ml)을, 각 마우스의 면도질한 복부에 적용하고, 감작하여 FITC 유기의 부종 모델로 했다. 실험 시작일(day O)에 0.5%의 FITC 함유 아세톤/디부틸프탈레이트(용량비=1/1) 용액(30 ml)을 각 마우스의 우측 귀의 내측 및 외측의 표면에 국소 적용하여 유발시켰다. 대조군으로서 아세톤/디부틸프탈레이트를 좌측 귀에 적용했다.
G9NC(null), 덱사메타손 또는 비히클을 FITC 유발하기 30분전, 그리고 FITC 유발 24시간 후 또는 48시간 후에, 복강내(0.41 ml/머리) 투여했다. FITC 유발 후, 0, 24, 48 및 72시간째에 귀의 두께를 교정 두께 게이지(미쯔토요, 동경, 일본)를 이용하여 에테르 마취 하에 측정했다. 귀 부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타냈다. 여기서, R0 및 L0는 각각 실험 개시시(0 시간)의 우측 귀의 두께 및 좌측 귀의 두께를 나타내고, R 및 L은 각각의 시점에서의 두께의 값을 나타낸다. 데이터의 통계 처리는 실시예 6과 같은 식으로 하여 행했다. 결과를 도 16에 도시한다.
실시예 11
[담마진 모델]
항DNP IgE(anti-DNP IgE(SPE7), 시그마알드리치사, 미주리, 미국) 및 디니트로플루오로벤젠(dinitro-fluoro-benzene(DNFB), 시그마알드리치사, 미주리, 미국)은 각 공급업자로부터 입수했다. 다른 것은 실시예 6과 마찬가지다.
마우스의 귀에 부종을 다음와 같이 하여 유도시킨다. 1일전(day -1)에 항DNP IgE(5 mg/마우스) 함유 PBS(-)액을, 정맥내 주사하고 감작하여, 2상성 피부 반응 모델로 했다. 실험 시작일(day O)에 0.15%의 DNFB 함유 아세톤/올리브유(용량비=4/1)액(30 ml)을, 각 마우스의 우측 귀의 내측 및 외측의 표면에 국소 적용하여 유발시켰다. 대조군으로서 아세톤/올리브유를 좌측 귀에 적용했다.
G9NC(null), 덱사메타손 또는 비히클을 DNFB 유발의 30분전에, 복강내(0.345 ml/머리) 투여했다. DNFB 유발 후, 0, 1, 2, 4, 8 및 24시간째에 귀의 두께를 교정 두께 게이지(미쯔토요, 동경, 일본)를 이용하여 에테르 마취 하에 측정했다. 귀 부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타냈다. 여기서, R0 및 L0는 각각 실험 개시시(O 시간)의 우측 귀의 두께 및 좌측 귀의 두께를 나타내고, R 및 L은 각각의 시점에서의 두께의 값을 나타낸다. 데이터의 통계 처리는 실시예 6과 같은 식으로 행했다. 결과를 도 17 및 도 18에 도시한다.
실시예 12
[관절염 모델]
DBA/1J 암컷 마우스(7주령)를 이용하여, 관절염 야기용 모노클로날 항체 칵테일(Chondrex사, No. 62100)을 동물의 꼬리 정맥에 2 mg/0.5 ml/body 투여했다. 그 3일 후에 5 ㎍의 LPS(SIGMA, L6511)와 각 농도의 h-gal9NC(null)를 미리 혼화한 샘플 100 ㎕를 동물의 복강내에 투여했다. 샘플 투여 후, 하루 1회 좌우 앞/뒷다리 관절의 종창을 측정하여, 스코어화했다. 결과를 도 19에 도시한다.
급성 염증 모델로서, 대표적인 자이모산 유도 흉막염 모델(실시예 5)과 LPS 유도 복막염 모델에 있어서의 h-G9NC(null)의 효과를 조사했다. 자이모산 유도 흉막염 모델에 있어서, h-G9NC(null) 100 ㎍의 복강내 투여에 의해 흉막염의 억제 효과가 확인되었다. 한편, h-G9NC(null)은 단독으로는 특히 마우스에게 영향은 미치지 않는다. 그 외에, 카라게난, f mlP 유도 흉막염 모델에 있어서도 h-G9NC(null)는 영향을 주고 있다.
또한, LPS 유도 복막염 모델에 있어서, h-G9NC(null)에 의해, 염증시에 유도되는 혈청 중의 시토킨(IFN-γ이나 IL-4, IL-12, IL-10 등) 산생에 변화가 확인되고 있다. 예컨대, 마우스 복강에 LPS와 h-G9NC를 동시 투여 후, 6시간, 12시간, 24시간 후에 마우스 안와로부터 채혈하여, 그 혈청 중의 IFN-γ값을 측정한 바, LPS 단독 투여군에서는, 염증시에 유도되는 IFN-γ의 일과성의 상승이 확인되었지만, h-G9NC(null) 동시 투여군에서는 IFN-γ의 상승(유도)이 h-G9NC(null)의 투여량에 의존하여 억제되었다. 이로써, h-G9NC(null)가 시토킨 산생을 조절하여, 이에 따라 염증의 조절을 행할 수 있음이 시사되었다.
더욱이, 스테로이드 감수성(PMA 유도) 및 스테로이드 비감수성(아라키돈산 유도) 염증 모델(실시예 6 및 7) 및 캅사이신 유도 염증 모델(실시예 8)에 있어서도, h-G9NC(null)의 억제 효과가 확인되었다.
알레르기성 염증으로서, DNFB 유도 접촉 피부염 모델, FITC 유도 아토피성 피부염 모델, 항DNP 모노클로날 IgE 항체 감작 담마진 모델에 있어서의 h-G9NC(null)의 효과를 조사했다. 예컨대, 실시예 9의 DNFB 유도 접촉 피부염 모델에 있어서, h-G9NC(null)를 복강내 투여하여, 이개부종을 지표로 한 피부 반응으로 효과를 조사했다. 그 결과, h-G9NC(null)의 1, 10, 100 ㎍에 의해, 억제 효과가 확인되었고, 또한 덱사메타손 투여로 생기는 현저한 체중 감소는 확인되지 않았다. 실시예 10의 FITC 유도 아토피성 피부염 모델에 있어서, h-G9NC(null)의 복강내 투여에 의해, 야기상에 있어서 h-G9NC(null)의 효과가 확인되었다. 또한, 실시예 11의 항DNP 모노클로날 IgE 항체 감작 담마진 모델 마우스에게 h-G9NC(null)의 1, 10, 100 ㎍를 각각 복강내 투여한 바, 항원 도포(DNFB)에 의한 이층성 피부 반응이 억제되었다.
자기면역 질환 모델의 하나로서, 항체 칵테일 유발 관절염에 대한 h-G9NC(null)의 실시예를 기재한다. 아쥬반트 관절염, 콜라겐 관절 모델 등에도, h-G9NC(null)는 영향을 미치고 있다. 예컨대, 실시예 12에서는, h-G9NC(null) 1 ㎍에 있어서도, 억제가 확인되었다.
실시예 13
[갈렉틴 9 개변체의 종양 세포에 있어서의 아포토시스(세포 장해 활성) 유도]
[실험 방법]
RPMI(SIGMA) 10% FBS(JRH)에 현탁한 각 세포를 96 웰 플레이트(FALCON)에 3×103개/90 ㎕ 넣고, 24시간 배양(37℃, 5% CO2)한 후, 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))를 최종 농도가 0.03∼1 μM이 되도록 첨가(10 ㎕)하여, 24시간 배양한다. 배양한 후, WST-1 시약(Roche, 1644807) l0 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2∼4시간 반응한 후, 플레이트 리더로, 450 nm의 흡광도를 측정했다. 각 종양 세포에 있어서의 아포토시스(세포 장해 활성) 유도 평가는 Viability(%)=[(검체의 흡광도-Blank)]/(음성 대조의 흡광도-Blank)]×100으로 행했다.
사용한 종양 세포를 표 2에 나타낸다.
Figure pat00001
표 2 중, 「Cell name」은 세포명을, 「Animal」은 그 종양 세포의 유래 동물종을, 「1 μM killing」은, 1 μM의 갈렉틴 9 개변체 첨가시의 killing(%)을, 「Tissue」는, 그 세포의 유래 조직·기관 부위를 나타내고 있다.
[결과]
배양 세포에 있어서의 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))에 의한 아포토시스(세포 장해 활성) 유도 측정의 결과를 표 2에 나타낸다. 이 결과, 갈렉틴 9 개변체는,
1) 혈구계 종양에 효과적
2) 악성 흑색종이나 선유육종 등의 비상피성 악성 종양에도 유효
3) 위암, 췌장암, 폐암 등의 상피성 악성 종양에도 유효
하다고 판단되었다.
실시예 14
[갈렉틴 9 개변체의 피하 이식 모델에 있어서의 항종양 활성(항암 효과)]
[실험 방법]
표적 종양 세포로서 LLC 세포를 사용했다. 배양된 세포(1×106개/100 ㎕)를 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 100 ㎍/100 ㎕) 또는 생리 식염수 100 ㎕와 37℃에서 1시간 반응시킨 후, C57BL6 마우스의 등에 피하 주사했다. 종양경(장축, 단축)을 측정했다.
또한, 이식 5주 후의 투여 피부 부위(종양)를 잘라내어, 10% 중성으로 완충화된 포름알데히드 용액으로 조직 병리 검사용 샘플을 고정화한 후, 파라핀 포매 조직을 절편으로 하여, HE 시약으로 염색했다.
[결과]
도 20에, 피하 이식 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 종양 세포 증식 억제 효과, 즉, 항종양 활성(항암 효과) 측정의 결과를 도시한다. 또한, 도 21에는, 조직 병리 해석에 의해 항종양 활성(항암 효과)을 조사한 결과를 도시한다. 도면 중, Gal9(n) 및 Gal9는 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))를, 5W는 5주를 나타내고 있다.
갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)) 존재 하에 LLC를 배양한 것에서는, 위상차현미경 하에서 명백한 암 세포의 형태 변화가 관찰되었다. 이 때, 갈렉틴 9 개변체는 용량 의존성으로 LLC의 생세포수를 감소시켜(MTT assay), DNA 합성능의 저하(3H-Thymidine 수득능), 배양 상청 중의 LDH 방출량의 항진을 유도했다. 갈렉틴 9 개변체에 의한 이들의 항종양 효과는 인간 폐암 세포주 H226(편평상피암), A549(선암), H69(소세포암)에서도 마찬가지로 확인되었다. 한편, 갈렉틴 9 개변체 존재 하에서 LLC의 아넥신 V 발현량은 유의적으로 증가했다.
한편, LLC를 갈렉틴 9 개변체 공존 하에 동 계통 마우스 C57BL6의 피하에 접종하면 종양은 생착하지 않고, 접종한 후 5주의 시점에서 대조군과 명백한 차가 보였다. 마우스 생존율은 갈렉틴 9 개변체 존재 하에서 유의적으로 개선되었다. 갈렉틴 9 개변체는 암 세포에 아포토시스를 유도하여, 항종양 효과를 발휘하는 것이 판명되었다.
인간 소세포 폐암 세포주 H69 세포를 누드 마우스에 정맥 주사함에 의한 폐암의 다장기 전이 모델에 있어서, 갈렉틴 9 개변체의 복강 투여에 의해 전이 억제 효과도 확인되고 있다.
실시예 15
[갈렉틴 9 개변체의 배양 종양 세포에 있어서의 아포토시스(세포 장해 활성) 유도]
[실험 방법]
(1) Meth A 세포의 아포토시스
RPMI(SIGMA) 10% FBS(JRH)에 현탁한 Meth A를 96 웰 플레이트(FALCON)에 4×104개/90 ㎕ 넣고, 동시에 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))를 1∼30 ㎍/ml(10 ㎕) 첨가하여, 24시간 배양(37℃, 5% CO2)한다. 24시간 후에, 세포를 PBS(-) 200 ㎕로 1회 세정하고, 아넥신 V 결합 완충액(아넥신 V Binding Buffer)(BD PharMingen)에 현탁하여, 아넥신 V-PE(BD PharMingen)과 7-아미노-악티노마이신 D를 첨가하여, 어두운 가운데, 실온에서 15분간 반응시켜, FACS calibur(Becton, Dickinson)로 해석했다.
(2) B16/F10 세포의 아포토시스
RPMI(SIGMA) 10% FBS(JRH)에 현탁한 B16/F10을 96 웰 플레이트(FALCON)에 1×104개/90 ㎕ 넣어, 24시간 배양(37℃, 5% C02)한 후, 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))를 최종 농도가 1∼30 ㎍/ml이 되도록 첨가(10 ㎕)하여, 24시간 배양한다. 그 24시간 후에, 세포를 PBS(-) 200 ㎕로 1회 세정하여, 0.05% 트립신 EDTA(GIBCO)로 처리한 후, 배양액으로 1회 세정하고, 또한 PBS(-)로 세정한다. 그 후, 아넥신 V 결합 완충액(BD PharMingen)에 현탁하고, 아넥신 V-PE(BD PharMingen)와 7-아미노-악티노마이신을 첨가하여, 어두운 가운데, 실온에서 15분간 반응시켜, FACS calibur(Becton, Dickinson)로 해석했다.
[결과]
도 22 및 도 23에 결과를 도시한다. 도 22는 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))에 의한 Meth A 세포의 아포토시스 유도 해석의 결과이다. 도 23은 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))에 의한 B16/F10 세포의 아포토시스 유도 해석의 결과이다.
실시예 16
[갈렉틴 9 개변체의 암성 복막염 모델에 있어서의 항종양 활성(항암 효과)]
[실험 방법]
(1) Meth A 세포: PBS(-)로 조제한 세포(5×105개/100 ㎕)를 BALB/c 마우스(SLC, 6주령의 암컷, n=3)의 복강에 접종했다.
갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 100 ㎍/300 ㎕)는 복강내에 세포 접종한 후 18일까지 연일 투여를 행했다. 투여를 시작하는 시기에서 1) Meth A 세포 접종 후 직후, 2) 3일 후, 3) 7일 후, 4) 10일 후의 4군(n=10)으로 나누어, 생존율을 비교했다.
(2) B16/F10 세포: 세포(5×105개/100 ㎕)를 C57/BL6 마우스(SLC, 6주령의 암컷)의 복강내에 접종했다. 접종한 후 즉시 각 농도의 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 10, 30, 100 ㎍/300 ㎕)를 복강내 투여, 14일간 연일 투여를 행했다. 생존율을 비교했다. 접종한 후 14일에 장기를 관찰했다.
[결과]
도 24∼도 27 및 도 48에 결과를 도시한다. 도 24는 생존 곡선으로, Meth A 세포에 의한 암성 복막염 모델에 있어서, 갈렉틴 9 개변체가 항종양 효과를 갖는 것을 나타내고 있다. 도 25에는, 갈렉틴 9 개변체(Gal9) 비투여군(상단)과 투여군(하단)에서 마우스의 상태를 나타내는 사진을 도시한다. 도 26은 생존 곡선으로, B16/F10 세포에 의한 암성 복막염 모델에 있어서, 갈렉틴 9 개변체가 항종양 효과를 갖는 것을 나타내고 있다. 도 27에는, B16/F10 세포에 의한 암성 복막염 모델 마우스의 상태를 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 투여군과 비투여군으로 대비하여 내장 조직 사진을 도시한다. 도 48은 LLC 세포(1×106개)를 복강내 접종시킨 마우스에게, 매일 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 100 ㎍/마우스) 또는 담체(vehicle)를 복강내 투여한 결과를 도시한다(Day 0에서부터 연일 투여, 각 군 7마리의 마우스). 마우스 암성 복막염 모델(Meth A, B16/F10 세포, LLC 세포)에 있어서 G9NC(null)(복강내) 투여(암 세포 접종시에 동시 투여 및 암 세포 접종 후 투여)에 의한 연명 효과가 확인되고 있다.
Meth A세포, LLC 세포는 갈렉틴 9 개변체에 의해 아포토시스가 유도되는 세포이다. 그러나 B16/F10 세포는 갈렉틴 9 개변체에 의해 아포토시스는 유도되지 않는다.
B16/F10 세포의 경우, 갈렉틴 9 개변체는 암 세포와 세포외 기질과의 결합을 농도 의존성으로 저해하는 것이 밝혀졌다. 또한 B16/F10 세포에 의한 암성 복막염 모델에 있어서, G9NC(null) 투여군에서는 대조군에 비해서, 복강액 중의 NK, NKT 세포가 증가하고 있었다. B16/F10 멜라노마 세포는 안정화 갈렉틴 9에 의한 아포토시스 내성인데, 생존율 개선과 멜라노마 세포의 복벽에의 접착의 억제가 확인되고 있다. 암성 복막염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 항종양 효과는, 종양 세포의 세포외 기질에의 접착 억제, 즉 염증 세포의 침윤 억제 효과, NK, NKT 세포 등의 면역 담당 세포의 관여도 시사되었다.
실시예 17
[B16/F10 복강내 침윤 세포의 해석]
[실험 방법]
PBS(-)에 현탁한 B16/F10을 5×105개/200 ㎕, C57/BL6 마우스(SCL)의 복강에 이식하는 것과 동시에 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))를 30 ㎍/300 ㎕ 복강 투여하고, 24시간 후에, 복강 세포를 채취하여, PBS(-)에 현탁한다. 정제 항마우스 CD16/CD32(2.4G2)(BD PharMingen)로, 4℃, 5분, 반응시킨 후, 각각의 항체[PE 항마우스 CD122(TM-β-1)(BD PharMingen), FITC 항마우스 TCR β-chain(H57-597)(BD Phar mlngen), PE 항마우스 CD11b(M1/70)(BD PharMingen), APC-표식 항마우스 CD11c(HL3)(BD PharMingen), APC 항마우스 CD8a(BD PharMingen), FITC 항마우스 CD4(BD PharMingen)]로 4℃, 30분 반응시켜, FACS calibur(Becton, Dickinson)로 해석했다.
[결과]
도 28에 결과를 도시한다. PBS 투여군에 비해서, 갈렉틴 9 개변체 투여군(30 ㎍)에서는 복강 세정액 중에 NK/NKT 세포 등의 면역에 관여하는 세포의 동원이 확인되었다.
실시예 18
[갈렉틴 9 개변체에 의한 B16/F10 세포의 접착 저해 활성]
[실험 방법]
I형 콜라겐, IV형 콜라겐(co1lagen type I, IV), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin)이 코트된 96 웰 플레이트(CHEMICON)에 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))를 최종 농도 1∼30 ㎍/ml가 되도록 10 ㎕씩 각각 넣어 두고서, 그 플레이트에 RPMI(SIGMA) 0.02% BSA(Wako)로 현탁한 B16/F10을 4×104개/웰(90 ㎕)씩 파종하여, 1시간 인큐베이트(37℃, 5% CO2)한다. 1시간 후, 상청을 제거하고, PBS(-) 200 ㎕로 2회 세정한 후, RPMI 0.02% BSA를 90 ㎕와 WST-1(Roche)을 10 ㎕ 넣어, 2∼3시간 인큐베이트한다. 마지막으로 플레이트 리더를 이용하여, 450∼600의 흡광도를 측정하여, 접착율(Adherence, %)=[(검체의 흡광도-Blank/(음성 대조의 흡광도-Blank))×100으로 계산한다.
[결과]
도 29에 결과를 도시한다. B16/F10 세포와 각 세포외 기질(I형 콜라겐, IV형 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴)과의 결합은 갈렉틴 9 개변체(도면에서는 안정화 갈렉틴으로 기재)에 의해 저해되었다. 그 저해 작용은 갈렉틴 9 개변체의 농도 의존적으로 확인되었다.
이어서, 갈렉틴 9 개변체에 의한 염증에 대한 생물 활성을 조사했다. 염증으로서, I형으로 분류되는 염증인 기관지 천식, II형으로 분류되는 염증인 자기면역성 용혈성 빈혈, 그리고 III형으로 분류되는 염증인 아르투스(Arthus) 반응(혈관염)에 대한, 갈렉틴 9 개변체의 활성을 조사했다.
실시예 19
[진드기 항원 유발 천식 모델(Der f-induced AHR model)]
[실험 방법]
덱사메타손(덱사메타손 21-포스페이트·2나트륨염, Sigma, 미주리, 미국), 메타콜린(methacholine(MCh), Sigma, 미주리, 미국) 및 알레르기 유발성 추출물 혼합 진드기 항원(Allergenic Extract mixed Insects MITE: 집먼지 진드기(D. Farinae, Derf))는 거기에 표시된 공급업자로부터 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하여, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다.
Balb/c 마우스(7주령)를 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입했다. 동물은 적절하게 먹이나 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하여 12시간마다 밤낮이 되는 리듬의 표준 상태로 사육했다. 모든 동물은 국제적인 가이드라인 및 국내법에 따라서 사람의 손에 의해 관리되었다.
마우스에 있어서의 천식성 과민 반응(Asthmatic Hypersensitive Response: AHR)의 유도는 다음과 같은 식으로 이 행했다.
메타콜린과 호산구 침윤에 대한 기도 과민성을 마우스의 기도 조직에 유기하기 위해, 수컷의 마우스를 감작한 후, 상기 진드기 항원(Der f)을 알레르겐으로서 사용하여 유발 처리했다. Der f(0.5 mg/ml)로 0.05 ml씩, 0일째, 7일째 및 20일째에, 비강내 투여함으로써 마우스를 면역하고, 이어서 네뷸라이저를 사용하여 1% 에어졸로 된 Der f로 30분간 처리하여 야기시켰다. 대조군의 동물은, 0일째, 7일째 및 20일째에, 비강내 경유로 통상의 PBS(0.05 ml)의 투여를 받고, 이어서 네뷸라이저를 사용하여 PBS를 가지고 30분간 처리되었다.
갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)) 및 덱사메타손의 작용 효과를 조사하기 위해서, Der f에 의한 유발 전 및 Der f에 의한 유발 후에, 마우스에게 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null) 100 ㎍/410 ㎕(PBS 중)/body, 또는 덱사메타손 3 mg/200 ㎕(PBS 중)/kg(체중)을, 각각 복강내 투여했다.
샘플로서 기관지 폐포 세정액(bronchoalveolar lavage fluid: BAL fluid)을 각 동물로부터 채취했다. 무구속 호흡 기능 해석 장치(unrestrained whole body plethysmograph; PULMOS-I; M.I.P.S, 오사카, 일본)에 의해 구속하고 있지 않은 의식을 갖고 있는 마우스의 전체 폐 기류량을 측정했다. 매분의 기류량, 환기량, 호흡의 빈도, 그리고 비기도 저항(specific airway resistance: sRAW)을 구하기 위해서, 마우스를 수용하고 있는 챔버와 대조용 챔버와의 사이의 압의 차를 이용했다. 기도 저항은, 차원이 없는 파라미터로, 호흡 사이클 중의 마우스의 전체 폐호흡량의 함수이다. 에어졸로 한 PBS(기초 측정치로서) 또는 MCh(6-25 mg/ml)로 마우스를 2분간 처리하고, 측정을 하여, 분무 요법 처리한 후 100회의 호흡의 평균치를 구했다. 현탁하고 있는 세포의 수(세포/ml)를 터크액으로 염색하여 혈구계(hemocytometer)로 측정하여, 사이토스핀(cytospin) 조제물을 얻고, 짐사-메이-그런월드(Giemsa-May-Grunwald) 용액을 사용하여 형태적인 특징 붙이기를 하여 세포의 차이를 측정했다. 각 슬라이드 상, 200-500개의 백혈구를 세었다.
[결과]
도 30, 31 및 32에 결과를 도시한다. 도면 중, 각각의 값은 7마리 동물의 평균±S.E.를 나타내고 있다. 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 듀넷 다중 비교 시험(Dunnett's Multiple Comparison Test)를 사용하여 평가했다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). 도 30으로부터, h-G9NC(null)[Gal-9] 투여로 기도 과민성의 항진이 개선되는 것이 명백하다. 도 31로부터, h-G9NC(null)[Gal-9] 투여로 BALF 중에의 호산구 침윤을 억제하는 것이 명백하다. 도 32로부터, h-G9NC(null)[Gal-9] 투여로 기관지 주위의 염증 세포 침윤을 억제하는 것이 명백하다. 이리하여 갈렉틴 9에 의해, 염증 세포의 기도에의 침윤을 억제함으로써 기도 과민성이 개선되는 것이 시사된다.
실시예 20
[OVA 유발 천식 모델(OVA-induced AHR model)]
[실험 방법]
*동물로서, 마우스 및 몰모트를 사용했다. 난백 알부민(Ovalbumin(OVA), Sigma, 미주리, 미국), 메토피론(metopyrone, Sigma, 미주리, 미국), 메피라민(mepyramine, Sigma, 미주리, 미국)을 거기에 기재된 공급업자로부터 입수했다. 다른 화합물은 실시예 19와 같은 식으로 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하고, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. Balb/c 마우스(7주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터, 그리고 몰모트(5주령)는 Kudou Co. Ltd(구마모토, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다.
마우스에 있어서의 AHR의 유도는 다음과 같이 행했다.
메타콜린과 호산구 침윤에 대한 기도 과민성을 마우스의 기도 조직에 유기하기 위해서, 수컷 마우스를 감작한 후, 상기 OVA를 알레르겐으로서 사용하여 유발 처리했다. 황산알루미늄칼륨과 복합체를 형성하고 있는 OVA(0.5 mg/ml)로써 0.2 ml씩, 0일째 및 14일째에, 복강내 투여함으로써 마우스를 면역했다. 14일째, 18일째 및 22일째에, 보통의 식염수로 희석한 펜트바르비탈(5.0 mg/ml)의 0.2-0.3 ml로 마우스를 마취했다. OVA 감작군의 동물 전부는, 14일째, 18일째 및 22일째에, 비강내 경유로 0.05 ml의 보통의 식염수 중의 2.0 mg/ml의 OVA를 투여했다. 대조군의 동물은 0일째 및 14일째에, 복강내 경유로 황산알루미늄칼륨이 들어간 통상의 PBS의 투여를 받고, 이어서 14일째, 18일째 및 22일째에, 비강내 경유로 통상의 PBS(0.05 ml)의 투여를 받았다.
갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)) 및 덱사메타손의 작용 효과를 조사하기 위해서, OVA에 의한 유발 전 및 OVA에 의한 유발 후 O, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22일째에, 마우스에게 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null) 100 ㎍/410 ㎕(PBS 중)/body, 또는 덱사메타손 3 mg/200 ㎕(PBS 중)/kg(체중)를, 각각 복강내 투여했다.
샘플로서 BAL액을 각 동물로부터 채취했다. 기압식 호흡 기능 해석 장치(whole body barometric plethysmograph; Buxco Electronics, Inc., Sharon, 코네티컷, 미국)에 의해 구속하지 않는 의식을 갖고 있는 마우스의 전체 폐기류량을 측정했다. 이 장치에서는, 높아진 포즈(Pause(Penh))로서 알려져 있는 호흡의 패턴 변화로서 측정이 이루어지며, 그것은 기도 저항과 상관되어, 기도 저항을 모니터하는 데에 사용했다. 에어졸로 한 PBS(기초 측정치로서) 또는 MCh(3-50 mg/ml)로 마우스를 2분간 처리하여, 측정을 하고, MCh 분무 요법 처리한 후 100회의 호흡의 평균치를 구했다. 현탁하고 있는 세포의 수(세포/ml)를 터크액으로 염색하여 혈구계로 측정하고, 사이토스핀 조제물을 얻어, 짐사-메이-그런월드 용액을 사용하여 형태적인 특징 붙이기를 하여 세포의 차이를 측정했다. 각 슬라이드 상, 200-500개의 백혈구를 세었다.
몰모트에 있어서의 AHR의 유도는 다음과 같이 행했다.
항원과 호산구 침윤에 대한 즉시형 기도 과민성(IAR) 및 지연형 기도 과민성(LAR)을 기도 조직에 유기하기 위해서, 수컷의 몰모트를 감작한 후, 상기 OVA를 알레르겐으로서 사용하여 유발 처리했다. 옴론 초음파식 네뷸라이저(Omron NE-U17 nebulizer, 다테이시덴끼(주), 동경, 일본)를 사용하여, 0∼7일째에, 몰모트에 10분간 1% OVA 식염수액의 에어졸로 감작을 행했다. 아나플락시 쇼크를 피하기 위해서 동물의 전부는, 감작 처리 30분 전 및 유발 처리 30분 전에는, 메피라민(10 mg/kg)을 투여했다.
갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))의 작용 효과를 조사하기위해서, OVA에 의한 유발 전 및 OVA에 의한 유발 후에, 몰모트에 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)) 1 ㎍/4 ml(PBS 중)/body를 복강내 투여했다.
샘플로서 BAL액을 각 동물로부터 채취했다.
최초의 감작 후 3일째에, 보디 챔버로부터 떨어져 있는 구비식(口鼻式) 마스크를 갖춘 전신식 호흡 기능 해석 챔버(PULM0S-I; M.I.P.S, 오사카, 일본)에 동물을 놓고, 아그라월(Agrawal)법에 따라서 비기도 콘덕턴스(SGaw)를 측정했다. 기류량과 박스 용량의 변화와의 관계(이것은 박스압의 변화로부터 계산됨)는, 박스 용량의 변화를 기류량과 x-y에 플롯한 경사(슬롭)로 하여 결정할 수 있다. 5회의 호흡 사이클에 있어서의 슬롭의 평균을, SGaw를 계산하는 데 이용했다.
OVA에 의한 유발 전에 10 mg/kg의 메토피론을 몰모트에 복강내 투여하고, 이어서 옴론 초음파식 네뷸라이저(Omron NE-U17 nebulizer, 다테이시덴키(주), 동경, 일본)를 사용하여, 2% OVA의 식염수액의 에어졸에 5분간, 31/분의 유속으로 몰모트는 처리되었다. 그리고, 항원 처리의 1분 전 및 항원 처리 후 2, 4, 5, 6, 7, 8 그리고 23시간째에 SGaw의 변화를 모니터하고, 측정을 하여, 각각의 시점 후의 100회 호흡의 평균치를 구했다. 각 SGaw치는 면역 챌린지 전에 얻어진 값과 비교되어, SGaw에 있어서의 변화 퍼센트로서 나타냈다. 현탁하고 있는 세포의 수(세포/ml)를 터크액으로 염색하여 혈구계를 가지고 측정하여, 사이토스핀 조제물을 얻고, 짐사-메이-그런월드 용액을 사용하여 형태적인 특징 붙이기를 하여 세포의 차이를 측정했다. 각 슬라이드 상, 500개의 백혈구를 세었다.
[결과]
도 33 및 도 34에 마우스에 있어서의 결과, 그리고 도 35 및 도 36에 마우스에 있어서의 결과를 도시한다. 도면 중, 각각의 값은 7마리(도 33), 5∼7마리(도 34), 7 또는 8마리(도 35 및 도 36)의 동물의 평균±S.E.를 나타내고 있다. 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 듀넷 다중 비교 시험을 사용하여 평가했다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 33은 기도 과민성을 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))가 개선하는 작용을 가짐을 도시한다. 도 34는 BALF 중의 호산구의 침윤을 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))가 억제하는 것을 도시한다.
도 35는, 즉시형 천식(IAR)·지연형 천식(LAR)에 대한 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))가 미치는 작용을 도시한다. 결과, 갈렉틴 9 개변체 투여군에서는 IAR 및 LAR, 모두 대조군과 비교하여 유의적인 차가 확인되었다. 즉, 억제 효과가 확인되었다.
도 36은 기도내 염증성 세포 침윤에 대한 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))가 미치는 작용을 도시한다. 결과, 갈렉틴 9 개변체 투여군에서는, 대조군과 비교하여 총 세포수 및 호산구에 대하여 유의적인 차가 확인되었다. 다른 세포에 있어서도 침윤 억제 경향이 보이고 있다.
갈렉틴 9 개변체는 1 mg/body의 용량으로 항원 감작 및 야기 전에 복강내 투여함으로써 능동 감작 몰모트의 항원 야기 즉시형·지연형 천식 반응 및 기도내 세포 침윤을 억제할 가능성이 시사되었다.
실시예 21
[자기면역성 용혈성 빈혈(RαMRC Ab-induced AIHA model)]
[실험 방법]
시클로포스파미드(cyclophosphamide(CY), Sigma, 미주리, 미국), 아자티오프린(azathioprine(AZ), Sigma, 미주리, 미국), 메토트렉세이트(methotrexate(MTX), Sigma, 미주리, 미국) 토끼의 항마우스 적혈구 항체(RαMRC Ab)를 거기에 표시된 공급업자로부터 각각 입수했다. 다른 화합물은 실시예 19와 같은 식으로 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체(V)로서 PBS(-)를 사용하여, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. Balb/c 마우스(7주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다.
마우스에 있어서의 자기면역성 용혈성 빈혈(AIHA)의 유도는 다음과 같은 식으로 행했다.
토끼의 αMRBC 자기 항체를 마우스에게 정맥내 투여하여 용혈성 빈혈을 유도했다. 토끼의 αMRBC 자기 항체 주사 30분 전 및 그 자기 항체 주사 후 1∼4일째에, 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)), 덱사메타손, 그 밖의 약물 또는 담체를 복강내(0.345 ml/머리)에 투여했다.
헤파린 처리된 마이크로헤마토크릿 모세관 튜브 속에 혈액 샘플을 채취하여, 원심기로 5분간 12,000 rpm로 원심했다. 원심한 후 직접 팩되어 있는 RBCs의 퍼센트를 보고 헤마토크릿를 결정했다.
통계적인 해석은 다음과 같은 식으로 행했다.
특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치±SEM로 나타내고 있다. 데이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 듀넷 다중 비교 시험을 가지고 평가했다. P치의 <0.05는, 통계적으로 유의하다고 생각된다.
[결과]
도 37에 결과를 도시한다. 갈렉틴 9 개변체 투여군에서는, 발증 억제 경향이 확인되었다. 도면 중, 각각의 값은 5∼6마리의 동물의 평균치±SEM을 나타내고 있다(*p<0.05, **p<0.01).
실시예 22
[Arthus 반응(혈관염)]
[실험 방법]
면역 복합체 유발 2상 피부 반응(Arthus 반응)에 미치는 갈렉틴 9 개변체의 작용 효과를 조사했다.
항OVA IgG는 공급업자로부터 입수했다. 다른 화합물은 실시예 20과 같은 식으로 하여 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하고, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. Balb/c 마우스(7주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다.
마우스에 있어서의 이개부종의 유도는 다음과 같은 식으로 행했다.
2상 피부 반응 모델의 마우스의 우측 귀에 항OVA IgG(50 ㎍/마우스)를 피내(i.d.) 투여하여 감작하고, 그리고 곧바로 1% OVA의 PBS를 200 ㎕ 정맥내에 투여했다.
갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)), 덱사메타손 또는 담체를, OVA의 주사 30분 전 및 OVA의 주사 후 5시간 지나서, 복강내(0.345 ml/머리)에 투여했다. OVA 주사 후 0, 2, 4, 8 및 24시간 지나서 귀의 두께를, 교정 두께 게이지(Mitsutoyo, 동경, 일본)를 사용하여 에테르 마취 하에 측정했다.
이개부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타내었다. 여기서, R0는 실험 개시시(O 시간)의 우측 귀의 두께, 그리고 L0는 실험 개시시(O 시간)의 좌측 귀의 두께를 나타내고, R은 각각의 시점에서 얻어진 우측 귀의 두께, 그리고 L은 좌측 귀의 두께를 나타낸다.
통계적인 해석은 다음과 같은 식으로 행했다.
특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치±SEM로 나타내고 있다. 데이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 본페로니 포스트-시험을 가지고 평가했다. P치의 <0.05는 통계적으로 유의하다고 생각된다.
[결과]
도 38에 결과를 도시한다. 갈렉틴 9 개변체 투여군에서는, 발증 억제 경향이 확인된다. 도면 중, 각각의 값은 5∼6마리의 동물의 평균치±SEM을 나타내고 있다(*p<0.05, **p<0.01).
실시예 23
[ARDS 모델(LPS-induced ARDS model)]
[실험 방법]
리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, Sigma, 미주리, 미국)를 거기에 표시된 공급업자로부터 각각 입수했다. 다른 화합물은 실시예 19와 같은 식으로 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하고, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. Balb/c 마우스(7주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다.
마우스에 있어서의 ARDS의 유도는 다음과 같은 식으로 행했다.
마우스의 기도 조직에 호흡 곤란증 및 호중산구의 침윤을 야기하기 위해서, 폐 상해 모델로서 LPS를 사용하여 수컷의 마우스를 처치했다. 마우스는, LPS(O.6 mg/ml, 0.05-ml 용량)의 경비(i.n.) 투여를 받았다. 대조군은, 동일한 루트로 통상의 PBS(0.05 ml)의 투여를 받았다.
갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)) 및 덱사메타손의 작용 효과를 조사하기 위해서, LPS에 의한 유발 30분 전 및 LPS에 의한 유발 후 6시간 지나서, 마우스에게 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null) 100 ㎍/410 ㎕(PBS 중)/body를, 또는 덱사메타손 1∼10 mg/200 ㎕(PBS 중)/kg(체중)을, 각각 복강내 투여했다.
기압식 호흡 기능 해석 장치(whole body barometric plethysmography; Buxco Electronics, Inc., Sharon, 코네티컷, 미국) 및 무구속 호흡 기능 해석 장치(unrestrained whole body plethysmograph; PULM0S-I; M.I.P.S, 오사카, 일본)에 의해, LPS에 의한 유발의 1시간 전 및 24시간 후에 마우스의 폐의 기능(pen h값 및 환기량)을 해석했다.
폐의 기능을 해석한 후, 샘플로서 BAL액을 각 동물로부터 채취했다.
무구속 호흡 기능 해석 장치에 의해 구속하고 있지 않은 의식을 갖고 있는 마우스의 전체 폐 기류량을 측정했다. 매분의 기류량, 환기량, 호흡의 빈도, pen h치, 그리고 비기도 저항(sRAW)을 구하기 위해서, 마우스를 수용하고 있는 챔버와 대조용 챔버와의 사이의 압의 차를 이용했다. 기도 저항은, 차원이 없는 파라미터로, 호흡 사이클 중의 마우스의 전체 폐 호흡량의 함수이다.
현탁하고 있는 세포의 수(세포/ml)를 터크액으로 염색하여 혈구계로 측정하여, 사이토스핀 조제물을 얻고, 짐사-메이-그런월드 용액을 사용하여 형태적인 특징 붙이기를 하여 세포의 차이를 측정했다. 각 슬라이드 상, 200-500개의 백혈구를 세었다.
통계적인 해석은 다음과 같은 식으로 행했다.
특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치±SEM로 나타나 있다. 데이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석 또는 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 듀넷 다중 비교 시험 또는 본페로니 포스트-시험로 평가했다. P치의 <0.05는, 통계적으로 유의하다고 생각된다.
[결과]
도 39 및 도 40에 결과를 도시한다. 도면 중, 각각의 값은 5∼6마리의 동물의 평균치±SEM을 나타내고 있다. 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 듀넷 다중 비교 시험을 사용하여 평가했다(*p<0.05, **p<O.01, ***p<0.001). 도 39는, 기도 과민성에 대한 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))가 미치는 작용을 도시한다. 거기서는 개선이 확인되었다. 도 40은 BALF 중의 호중구의 침윤을 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))가 억제하고 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 24
[캅사이신 유도 염증 모델]
[실험 방법]
시프로펩타딘(cyproheptadine, Sigma, 미주리, 미국) 및 캅사이신(capsaicin, Nakarai, 동경, 일본)을 거기에 표시된 공급업자로부터 각각 입수했다. 다른 화합물은 실시예 19와 같은 식으로 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하고, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. Balb/c 마우스(7주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예19와 같은 식으로 사육했다.
마우스에 있어서의 이개부종의 유도는 다음과 같이 행했다.
500 ㎍의 캅사이신을 아세톤/올리브유(4/1, 30 ㎕)에 용해하고, 각 마우스(BALB/c, 암컷, 7-8주령, SPF, SLC Inc.)의 우측 귀의 내측 표면과 외측 표면에 적용했다. 아세톤/올리브유를 좌측 귀에 대조군으로서 적용했다. 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)), 덱사메타손, 시프로헵타딘 또는 담체를, 캅사이신의 투여 30분전에 복강내(0.345 ml/머리)에, 그리고 10분전에 정맥내에 투여했다. 캅사이신 투여 후 0, 0.5, 1 및 2시간 지나서 귀의 두께를, 교정 두께 게이지(Mitsutoyo, 일본, 일본)를 사용하여 에테르 마취 하에 측정했다.
이개부종을 (R-L)-(R0-L0)로 나타냈다. 여기서, R0는 실험 개시시(O 시간)의 우측 귀의 두께, 그리고 L0는 실험 개시시(O 시간)의 좌측 귀의 두께를 나타내고, R은 각각의 시점에서 얻어진 우측 귀의 두께, 그리고 L은 좌측 귀의 두께를 나타낸다.
통계적인 해석은 다음과 같은 식으로 행했다.
특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치±SEM으로 나타내고 있다. 테이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 본페로니 포스트 시험을 가지고 평가했다. P치의 <0.05는 통계적으로 유의하다고 생각된다.
도 41에 결과를 도시한다. 갈렉틴 9 개변체 투여군(정맥 주사 투여)에서는, 발증 억제가 확인된다. 도면 중, 각각의 값은 5∼6마리 동물의 평균치±SEM을 나타내고 있다. 통계상의 차이는, 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 듀넷 다중 비교 시험을 사용하여 평가했다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). 갈렉틴 9 개변체에 의해 신경성, 염증성에 기인하는 통증의 억제가 기대된다.
실시예 25
[갈렉틴 9 개변체의 골 흡수 및 골 형성에의 작용]
[실험 방법]
1. 골 흡수
(파골 세포 형성)
RANKL(50 ng/ml)과 M-CSF(50 ng/ml) 존재 하에 말초혈 단핵구(1×105 세포)를 9일간 배양하고, 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null)) 첨가(0.1∼10 nM)/비첨가군에서 TRAP 양성 다핵 세포수(파골 세포)를 비교했다. h-G9NC(null)는 농도 의존성에 TRAP 양성 다핵 세포(파골 세포)의 형성을 억제했다. 여기서는, h-G9NC(null)을, 단순히 gal-9라 기재하는 경우도 있다.
얻어진 결과를 도 42에 도시한다.
대조군(cont.): 500±13.2 세포/웰이며, 갈렉틴 9 개변체 투여군(h-G9NC(null), 0.1 nM): 451±7.6 세포/웰, (h-G9NC(null), 1.0 nM): 151±12.5 세포/웰, (h-G9NC(null), 10 nM): 29±14.0 세포/웰이었다.
2. 골 형성
(골아 세포 증식)
인간 골아 세포(96 구멍 플레이트에 세포를 2×103 웰로 파종, 밤을 샌 후 h-G9NC(null) 자극을 가하여, 0시간, 24시간, 48시간에 관찰)의 증식에 대한 h-G9NC(null)(0.1∼100 nM)의 영향을 테트라 칼라-1 분석(Tetra color-1 assay)을 이용하여 흡광도에 의해 검토했다.
얻어진 결과를 도 44에 도시한다. 갈렉틴 9 개변체는 골아 세포의 증식을 농도 의존성으로 유도하고, 그것은 락토스에 의해 저해되었다. 갈렉틴 9 개변체는 골아 세포의 증식을 농도 의존성으로 유도하고, 또한 락토스(30 mM)에 의해 저해할 수 있었다. 흡광도는 대조군에서는 0.21±0.01, h-G9NC(null)(0.1 nM)에서는 0.22±0.01, h-G9NC(null)(1.0 nM)에서는 0.24±0.01, h-G9NC(null)(10 nM)에서는 0.25±0.01, h-G9NC(null)(100 nM)에서는 0.26±0.02가 24시간의 값이고, 48시간 후는 대조군에서는 0.22±0.01, h-G9NC(null)(0.1 nM)에서는 0.23±0.01, h-G9NC(null)(1.0 nM)에서는 0.26±0.b1, h-G9NC(null)(10 nM)에서는 0.27±0.01, h-G9NC(null)(100 nM)에서는 0.31±0.04였다.
(골아 세포 분화)
인간 골아 세포(6 구멍 플레이트에 10% FCS/DMEM로 1×105 세포/웰로 파종, 24시간 인큐베이트한 후, 1% FCS/DMEM에 over night로 스타베이션하여 gal-9 자극을 가하고, 8시간 후에 측정)의 분화에 대한 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))(100 nM)의 영향을 세포내 ALP와 오스테오칼신을 플로우 사이토미터로 검토했다.
얻어진 결과를 도 45에 도시한다. 갈렉틴 9 개변체는 골아 세포에 있어서의 골 형성 마커인 ALP, 오스테오칼신의 발현을 유도했다. ALP는 무자극에 비하여 400 분자/세포, 오스테오칼신에 대해서는 무자극에 비하여 800 분자/세포 증가했다. 또한, 골아 세포에 h-G9NC(null) 첨가(10 nM)하여 28일간 배양하면, 비첨가군에 비하여 ALP 염색 및 von kossa 염색이 촉진되었다.
이상의 시험에서, 갈렉틴 9 개변체 첨가한 후 6시간에서 단핵구의 응집이 일어나고 있었다. 그리고 갈렉틴 9 개변체는 농도 의존성으로 TRAP 양성 다핵 세포의 형성을 억제했다. 갈렉틴 9 개변체는 골아 세포의 증식을 농도 의존성으로 유도했다. 갈렉틴 9 개변체는 골아 세포에 있어서의 ALP, 오스테오칼신의 발현을 유도한다.
이상의 결과로부터, 갈렉틴 9 개변체나 네이티브한 갈렉틴 9는 골 흡수에는 억제적으로, 골 형성에는 촉진적으로 작용할 가능성이 시사되어, 골 형성 촉진 작용을 갖는 약제로서 폐경 후 골다공증에의 치료 응용에 대한 가능성이 생각되었다.
실시예 26
[갈렉틴 9 개변체의 간질성 폐렴 모델에의 작용]
[실험 방법]
간질성 폐렴 모델로서 마우스를 사용했다. C57BL/6 마우스(암컷 6주령, 사용시 7∼8주령, 20마리)를 참고 문헌: Blood 2002; 99: 1289-98 및 Am J Respir Crit Care Med 2003; 168: 1075-83에 따라서 처리하여, 간질성 폐렴을 유도했다. rhIL-2(PeproTech, 5 ㎍×10마리×2군×14일=1400 ㎍=1.4 mg) 및 rmIL-18(MBL, 0.2 ㎍×10마리×2군×14일=56 ㎍)을 사용했다.
샘플군으로서는 대조군 및 갈렉틴 9 개변체(Gal-9) 투여군을 준비했다.
(1) 대조군(마우스 10마리)
마우스 1마리당, 매일 IL-2 5 ㎍+IL-18 0.2 ㎍를, day 0∼13 연일 복강내 투여한다. 대조군으로서, 마우스 1마리당, 매일 PBS 200 ㎕를, day 0∼13 연일 복강내 투여한다.
(2) Gal-9 투여군(마우스 10마리)
마우스 1마리당, 매일 IL-25 ㎍+IL-180.2 ㎍를, day O∼13 연일 복강내 투여한다. 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null))는, 마우스 1마리당, 100 ㎍/300 ㎕ PBS를 작성하여 day 0부터 day 13까지 연일 복강내 투여한다. 마취는 모두 넴부탈 복강내 투여로 행한다.
*효과 판정의 지표는 첫째로 생존율로 하고, day 14까지 생존할 수 있었던 예에 대해서는 폐 조직을 조사했다.
마우스 샘플링은 다음과 같이 행했다:
도중 사망예에 대해서는 사망시에 해부하여 폐 조직 채취
day 14까지의 생존예에 대해서는 에테르 마취→안와로부터 채혈→경추 탈구→개흉→폐 조직 채취.
이 모델에 있어서의 rhGa1-9null 복강내 투여의 효과를 검토했다. rhGal-9null 투여군과 비투여군 각각의 Day 14에서의 생존율을 효과 판정의 기준으로 하고, 또한 Day 14에서의 조직상을 비교했다.
얻어진 결과를 도 46 및 도 47에 도시한다. 도 46은 생존율을 나타내고 있다. Day 14에서의 생존율에서는 비투여군에서 30%(10마리 중 3마리 생존)에 대하여, h-G9NC(null)(Gal-9) 투여군에서는 90%(10마리 중 9마리 생존)로, 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null):Gal-9) 투여에 의한 생존율의 개선을 볼 수 있었다.
도 47은 Day 14에서의 생존예의 폐 조직(HE 염색, 사진)을 도시한다. 비투여군에서는 생존예에서도, 광범위하고 또한 강도가 큰 세포 침윤을 동반하는 폐 간질의 비후가 보였다. 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null):Gal-9) 투여군에서는 간질의 비후, 세포 침윤 모두 가벼운 정도이며, 정상 조직의 잔존이 많이 보였다. 따라서, 본 모델에 있어서 갈렉틴 9(Gal-9)는 발증 억제의 효과가 있음이 나타났다. 본 시험에서는 체중 변화를 보았지만, 비투여군에서는 사망예, 생존예 모두 유의적인 체중 변화는 확인되지 않았다.
실시예 27
[암 전이 모델에의 활성]
[실험 방법]
B16/F10 세포를 사용하여 암 전이 모델에의 갈렉틴 9 개변체의 작용을 조사했다.
세포(5×105개/200 ㎕)를 C57/BL6 마우스(SLC, 6주령의 암컷)의 꼬리 정맥에 접종했다. 접종한 후 즉시 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 「Gal-9」라고 약기; 100 ㎍/300 ㎕) 또는 PBS(각 N=15)를 꼬리 정맥에 투여, 11일간 연일 투여(투여 회수 12회)를 행했다. 접종한 후 12일째에 해부하여 폐의 결절수를 카운트했다.
도 49에 시험한 결과(모델 동물의 폐의 외관)를 도시한다. 도 50에 폐의 결절수를 카운트한 결과를 도시한다. 갈렉틴 9 개변체 투여군(Gal-9군)과 PBS 투여군(PBS군)에서 비교하여, 갈렉틴 9 개변체에 의한 전이 억제 효과가 확인되었다. 폐의 결절수의 비교에서는, 각 군의 평균 결절수는 갈렉틴 9 개변체 투여군(Gal-9) 231.3±20.87, PBS 투여군(PBS) 122.1±13.61이 되어 P<0.0001로 유의함이 확인되어, 갈렉틴 9 개변체에 의한 암의 전이를 억제하는 효과가 확인되었다.
실시예 28
[카라게닌 유발 염증 모델: Carrageenan-induced 래트 Paw Edema]
카라게닌(carrageenan, Izushi kagaku, 일본)은 그 공급업자로부터 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하여, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. 암컷의 루이스(Lewis) 래트(5주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다. 갈렉틴 9 개변체의 작용 효과를 조사하기 위해서, 카라게닌 주사의 10분전에, 래트에게 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 「gal-9」라고 약기; 30-300 ㎍/body(PBS 중)를 정맥내 투여했다. 포지티브 대조군으로서 덱사마타손(Dex.)을 3 mg/kg, 7 mg/kg 투여했다.
[카라게닌 족척부종]
Sugishita et al.(1981)의 방법에 따라서, 래트에 있어서의 카라게닌 유발 족척부종 시험을 행하여 갈렉틴 9 개변체(human null galectin-9, h-G9NC(null))의 항염증 활성을 조사했다. 우측 뒷다리의 발 뒤에 카라게닌(0.15 ml; 1% w/v in saline)을 주사하기 10분전에 약제 화합물(30, 100 and 300 ㎍/body) 또는 담체(PBS)를 정맥내에 투여했다. 부종을 유도한 후, 수은 치환형 호흡 기능 해석 장치(mercury displacement plethysmography; Muromachi, 동경, 일본)를 사용하여 -1, 2, 4, 6, 24, 48 및 72 h에서의 카라게닌 주사한 측의 발과 그것과 다른 측의 발(우측 뒷다리에 식염수액(saline)을 주사)과의 용적을 측정했다. 발의 체적의 변화를 -1 h와 각각의 시간과의 사이의 차이로서 계산했다. 카라게닌에 의해 유도된 부종을, 카라게닌 주사한 측의 발과 그것과는 다른 측의 발과의 사이에서의 차이로서 각각의 동물에 대해서 나타내었다.
통계적인 해석은 다음과 같은 식으로 행했다.
특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치(mean)±SEM로 나타내고 있다. 데이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석 또는 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 듀넷 다중 비교 시험 또는 본페로니 포스트-시험을 가지고 평가했다. P치의 <0.05는 통계적으로 유의하다고 생각된다.
[결과]
결과를 도 51(갈렉틴 9 개변체) 및 도 52(덱사메타손)에 도시한다. 갈렉틴 9 개변체는, 30 ㎍/마우스에서도 발증의 억제 효과가 확인되었다.
실시예 29
1. 아쥬반트 관절염 모델에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 진통 작용
[방법]
[기계 자극에 의한 통증(Randall-Selitto test=수직 가압에 의한 통각 임계치의 측정)]
미코박테리움·부티리쿰(Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, 미시간, 미국)는 그 공급업자로부터 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하여, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. 암컷의 루이스 래트(5주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다. 갈렉틴 9 개변체의 작용 효과를 조사하기 위해서, 아쥬반트의 주사 전후의 0 내지 22일에 있어서, 래트에 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 「Gal-9」라고 약기) 30-300 ㎍/body(PBS 중)를 정맥내 투여했다. 포지티브 대조군으로서 인도메타신(Indo)을 3 mg/kg 투여했다.
[아쥬반트 관절염]
암컷의 루이스 래트(5주령)의 체중을 측정하고, 꼬리에 표를 붙여, 9마리의 동물로 이루어지는 군으로 나누었다. 아쥬반트의 주사 전에(day O), 체중과 양쪽 뒷다리의 족척의 용적을 기록했다. 이어서, 각각의 래트의 우측 뒷다리에 아쥬반트를 주사했다. 아쥬반트를 주사하지 않은 군을 정상 대조군(normal age-matched controls(sham))으로 했다. 아쥬반트 주사 후의 다른 날 각각에 있어서, 래트를 희생시키기 전에 각 군의 래트의 체중과 발의 용적을 기록했다.
[아쥬반트의 프로토콜]
미코박테리움·부티리쿰(Mycobacterium butyricum)을 유발(乳鉢) 속에서 으깨어 아쥬반트를 조제하고, 오일과 섞어, 최종 농도 10 mg/ml로 했다. 27-게이지의 0.5-인치의 바늘을 사용하여 래트의 우측 뒷다리의 발 뒤에 0.2 ml의 아쥬반트를 주사했다.
[기계적 자극에 의한 통증의 해석]
란달 및 셀리토(Randall-Selitto)의 수법을 개변하여, 갈렉틴 9 개변체(human null galectin-9, h-G9NC(null))가, 외부로부터의 압박에 대한 급성 염증 조직 또는 비염증 조직에서의 말초성의 과민증을 경감한다고 하는 진통 활성이 있는지의 여부가를 조사했다. 즉, 암컷의 루이스 래트(5주령)의 우측 뒷다리에 프로인트의 완전 아쥬반트(Complete Freund's Adjuvant)를 피하 주사하여, 급성 및 만성의 염증을 유발했다. 아쥬반트의 주사 2일 전 및 아쥬반트 주사 5일 후에, 외부로부터의 압박에 대한 급성 염증 조직 또는 비염증 조직에서의 말초성의 과민증을 란달 및 셀리토 테스트에 의해 측정하고, 그리고 25일째(days 25)까지 모니터했다(1 회/주). 관찰자가 컨트롤하면서 디지털식 포스 게이지(Imada, Aichi, 일본)를 가지고 염증이 있는 측의 족척 및 그것과 다른 측의 비염증의 족척의 양방에 외부로부터의 압박을 서서히 걸었다(0-200 g). 통각 임계치(pain threshold)를 동물이 맨 처음에 통증을 느끼고 있는 징후를 보였을 때의 압으로 정의했다. 그 징후란, 손가락이 퍼졌을 때 및/또는 발을 당겨 넣거나, 우는 소리를 낸 맨 처음 시간에 의해 표시되는 것이다.
* 통계적인 해석은 실시예 28과 같은 식으로 행했다. 즉, 특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치(mean)±SEM로 나타내고 있다. 데이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석 또는 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 듀넷 다중 비교 시험 또는 본페로니 포스트-시험을 가지고 평가했다. P치의 <0.05는 통계적으로 유의하다고 생각된다.
[결과]
결과를 도 58(갈렉틴 9 개변체, Gal-9) 및 도 59(인도메타신)에 도시한다. 도면 중, 각각의 값은 각각 나타나 있는 포인트에서의 동물(도 58: 8-9마리(n=8-9), 도 59: 9마리(n=9))의 평균치±SEM을 나타내고 있다. 통계상의 차이는, 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 본페로니 포스트-시험을 사용하여 평가했다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). 갈렉틴 9 개변체를 투여하면 농도 의존성으로 염증을 일으키고 있는 부위뿐 아니라 염증을 일으키고 있지 않은 부위에 대해서도 통각 자극에 대한 임계치가 상승한다(도 66 좌측 참조). 즉 갈렉틴 9 개변체는 전신성으로 통각의 임계치를 올린다.
2. 카라게닌 유발 급성 염증 모델: Carraeenan-induced Paw Edema in rats
[방법]
카라게닌(carrageenan, Izushi kagaku, 일본)은 그 공급업자로부터 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하여, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. 암컷의 루이스 래트(5주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다. 갈렉틴 9 개변체의 작용 효과를 조사하기 위해서, 카라게닌 주사 10분 전에, 래트에게 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), 「gal-9」라고 약기; 30-300 ㎍/body(PBS 중)를 정맥내 투여했다. 포지티브 대조군으로서 덱사메타손(Dex)을 3 mg/kg, 7 mg/kg 투여했다.
[기계적 자극에 의한 통증의 해석]
란달 및 셀리토의 수법을 개변하여, 갈렉틴 9 개변체(human null galectin-9, h-G9NC(null))가, 외부로부터의 압박에 대한 급성 염증 조직 또는 비염증 조직에서의 말초성의 과민증을 경감한다고 하는 진통 활성이 있는지의 여부를 조사했다. 즉, 암컷의 루이스 래트(5주령)의 우측 뒷다리에 카라게닌을 피하 주사하여, 급성 및 만성의 염증을 유발했다. 카라게닌의 주사 하루 전 및 카라게닌 주사한 후 6시간 후에, 외부로부터의 압박에 대한 급성 염증 조직 또는 비염증 조직에서의 말초성의 과민증을 란달 및 셀리토 테스트에 의해 측정하고, 그리고 75 h까지 모니터했다(1 회/일). 관찰자가 컨트롤하면서 디지털식 포스 게이지(Imada, Aichi, 일본)로써 염증이 있는 측의 족척 및 그것과는 다른 측의 비염증의 족척의 양쪽에 외부로부터의 압박을 서서히 걸었다(0-200 g). 통각 임계치를 동물이 맨 처음에 통증을 느끼고 있는 징후를 보일 때의 압으로 정의했다. 그 징후란, 손가락이 퍼졌을 때 및/또는 발을 당겨 넣거나, 우는 소리를 낸 맨 처음 시간에 의해 표시되는 것이다.
통계적인 해석은 실시예 28과 같은 식으로 행했다. 즉, 특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치(mean)±SEM로 나타내고 있다. 데이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석 또는 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 듀넷 다중 비교 시험 또는 본페로니 포스트-시험을 가지고 평가했다. P치의 <0.05는 통계적으로 유의하다고 생각된다.
[결과]
결과를 도 60(갈렉틴 9 개변체, gal-9) 및 도 61(덱사메타손)에 도시한다. 도면 중, 각각의 값은 각각 나타나 있는 포인트에서 9마리(n=9) 동물의 평균치±SEM을 나타내고 있다. 통계상의 차이는, 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 본페로니 포스트-시험을 사용하여 평가했다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). 갈렉틴 9 개변체를 투여하면 농도 의존성으로 염증을 일으키고 있는 부위뿐 아니라 염증을 일으키고 있지 않은 부위에 대해서도 통각 자극에 대한 임계치가 상승한다. 즉 갈렉틴 9 개변체는 전신성으로 통각의 임계치를 올린다.
실시예 30
[인간 관절액 중에 있어서의 갈렉틴 9 개변체의 안정성]
반응 조건
인간 류마티스 관절약 표본 160 ㎕
G9NC(null) 또는 G9(S)(5 ㎕ in PBS) 40 ㎕
즉, 80% 관절액 속에서 갈렉틴-9를 37℃에서 24시간 또는 96시간(도중 6, 24, 48, 72시간에 샘플링) 인큐베이트
SDS 처리와 웨스턴 블롯
샘플 4.5 ㎕
H2O 40.5 ㎕
샘플 완충액(4×, +2-ME) 15 ㎕
SDS-PAGE는 12.5%(10 ㎕/lane).
결과를 도 62에 도시한다. 프로테아제 활성이 높은 관절액 중에서도 갈렉틴 9 개변체[G9NC(null)]는 갈렉틴 9S[G9(S)]보다 안정적인 것이 밝혀졌다.
실시예 31
[관절염 모델]
1. 항체 칵테일 야기 모델: 갈렉틴 9 개변체(정맥내 투여)
[방법]
DBA/1J 암컷 마우스(7∼8주령)를 이용하여, 관절염 야기용 모노클로날 항체 칵테일(Chondrex사, No. 62100)을 동물의 꼬리 정맥에 2 mg/0.5 ml/body 투여한다. 그 3일 후에 50 ㎍/0.2 ml의 LPS(SIGMA, L6511)를 복강내에 투여했다. 또한 갈렉틴 9 개변체(h-Gal9NC(null), 「Gal-9」라고 약기)를 30 ㎍/200 ㎕를 동물의 꼬리 정맥에 투여했다. 실험군은 PBS 투여군과 h-Gal9NC(null) 투여군으로 하여, Day O(LPS 투여일) 1회 투여군과 Day 0에서부터 연일 투여군(Day 10까지, 투여 회수 11회)의 합계 3군으로 했다. 각 군은 하루 1회 좌우 앞/뒷다리의 관절 종창을 측정하여, 스코어화를 했다.
[결과]
결과를 도 63에 도시한다. 항체 칵테일 투여한 후, LPS로 관절염을 야기한다. 관절염은, 갈렉틴 9 개변체의 정맥내 투여에서도 억제되었다. 또한 1회 투여라도 발증의 억제 효과가 확인되었다.
2-1. CIA(콜라겐 감작) 모델: 갈렉틴 9 개변체(복강내 투여)
[방법]
소 콜라겐 II형(Bovine Collagen type II)(BC II: 콘드렉스사 cat no 2002-1)를 완전 아쥬반트(CFA: Difco cat no 263810)에 용해, 에멀젼을 제작하여 마우스(DBA/1J 7-8주령, 암컷)의 미근부에 100 ㎕씩 피내 주사한다(BC II 0.1 mg/100 ㎕/마우스). 감작 21일 후에 부스터 주사를 하여, 사지를 주 3회 스코어링한다. 부스터 후, 즉시 갈렉틴-9 개변체(「Gal-9」라고 약기; 30 ㎍/마우스) 또는 PBS를 복강내에 투여하고, 이후 연일 투여를 행했다.
참 마우스 스코어링(관절염 소견)은 각 마우스의 사지를 복수인이 관찰하여, 사지의 합계 개수를 산출(최고 16점)하여, 평균 스코어를 산출한다.
① 손가락이 1개 종창: 1점
② 손가락이 2개 이상 종창: 2점
③ 손(발)의 등까지 종창: 3점
④ 심한 종창, 변형: 4점
[결과]
결과를 도 64에 도시한다. 갈렉틴 9 개변체에 의해 발증 억제 효과가 확인되었다.
2-2. CIA(콜라겐 감작) 모델: 갈렉틴-9 개변체(정맥내 투여)
[방법]
소 콜라겐 II형(BC II: 콘드렉스사 cat no 2002-1)를 미리 Mycobacterium Tuberculosas H37 Ra, desiccated.(H37 Ra: Difco)를 가한 프로인트의 불완전 아쥬반트(imcomplete Freund's Adjuvant)(IFA: Difco)와 용해, 에멀젼을 제작하여 마우스(DBA/1J 7-8주령, 암컷)의 미근부에 100 ㎕씩 피내 주사한다(BC II 0.2 mg/H37 Ra 0.2 mg/100 ㎕/마우스). 감작 21일 후에 부스터 주사를 하여, 사지를 주 3회 스코어링한다. 마우스 스코어링(관절염 소견)은 각 마우스의 사지를 복수인이 관찰하여, 사지의 합계 개수를 산출(최고 16점)하여, 평균 스코어를 산출한다.
부스터 후, 즉시 갈렉틴-9 개변체(Gal-9라 약기; 30 ㎍/마우스: N=15) 또는 PBS(N=10)을 꼬리 정맥내에 투여하여, 이후 28일간 연일 투여를 행했다.
참고 문헌: Enhancement of collagen-induced arthritis in mice genetically deficient in extracellular superoxide dismutase.
Ross AD, Banda NK, Muggli M, Arend WP. Arthritis Rheum. 2004 Nov; 50(11): 3702-11.
[결과]
결과를 도 65에 도시한다. 갈렉틴-9 개변체의 정맥내 투여에 있어서도 발증의 억제가 확인되었다.
3. 아쥬반트 관절염(AIA) 모델: 갈렉틴-9 개변체(정맥내 투여)
[방법]
미코박테리움·부티리쿰(Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, 미시간, 미국)은 그 공급업자로부터 입수했다. 동물에의 투여를 위해서는, 모든 실험에서 담체로서 PBS(-)를 사용하여, 화합물을 그것에 현탁하여 행했다. 암컷의 루이스 래트(5주령)는 SLC(시즈오카, 일본)로부터 구입하여, 실시예 19와 같은 식으로 사육했다. 갈렉틴 9 개변체의 작용 효과를 조사하기 위해서, 아쥬반트 주사 전후의 0 내지 22일에 있어서, 래트에 갈렉틴 9 개변체(h-G9NC(null), Gal-9라 약기; 30-300 ㎍/body(PBS 중)를 정맥내 투여했다.
[아쥬반트 관절염]
암컷의 루이스 래트(5주령)의 체중을 측정하고, 꼬리에 표를 붙여, 9마리의 동물로 이루어지는 군으로 나누었다. 아쥬반트 주사하기 전에(day O), 체중과 양쪽 뒷다리 족척의 용적을 기록했다. 이어서, 각각의 래트의 우측 뒷다리에 아쥬반트를 주사했다. 아쥬반트를 주사하지 않은 군을 정상 대조군(normal age-matched controls(sham))으로 했다. 아쥬반트 주사한 후의 다른 날 각각에, 래트를 희생으로 하기 전에 각 군의 래트의 체중과 발의 용적을 기록했다.
[발의 용적]
발의 용적을 수은 치환형 호흡 기능 해석 장치(mercury displacement plethysmography; Muromachi, 동경, 일본)를 사용하여 측정했다. 발의 용적의 변화를 day 0과 각각의 일과의 사이의 차이로서 계산했다.
[임상상의 평가]
각 발의 관절염의 정도를, 앞다리 또는 뒷다리의, 1. 지절골 관절 및 손가락, 2. 등 또는 바닥, 3. 복사뼈 관절 또는 리스트부에 대해서, 다음과 같이 0∼3의 스케일로 나눠 평가했다: 0, 아무런 홍반도 종창도 없음; 1, 가벼운 정도의 붉은 홍반 또는 종창; 2, 복사뼈 관절 또는 리스트부의 중간 정도의 홍반 또는 종창; 3, 심각한 정도의 홍반 또는 종창.
다른 래트군에서, 병상 스코어 붙이기를 했다. 등급화된 족척 관절염의 스코어의 합을 취하여, 각 래트의 매일의 관절염 스코어의 토탈을 취득했다.
[아쥬반트의 프로토콜]
미코박테리움·부티리쿰(Mycobacterium butyricum)을 유발 속에서 으깨어 아쥬반트를 조제하고, 오일과 섞어, 최종 농도 10 mg/ml로 했다. 27-게이지의 0.5-인치의 바늘을 사용하여 래트의 우측 뒷다리의 발 뒤에 0.2 ml의 아쥬반트를 주사했다.
통계적인 해석은, 실시예 28과 같은 식으로 행했다. 즉, 특별히 명시하지 않는 경우에는, 데이터는 평균치(mean)±SEM로 나타내고 있다. 데이터 세트의 통계상의 차이는, 일원 배치 분산 분석 또는 이원 배치 분산 분석을 사용하여 해석했다. 그리고 군 사이의 차이는 시판되는 통계 소프트(GraphPad Software, Inc., 샌 디에고, 미국)를 사용하여 듀넷 다중 비교 시험 또는 본페로니 포스트 시험을 가지고 평가했다. P치의 <0.05는 통계적으로 유의하다고 생각된다.
[결과]
결과를 도 66(갈렉틴 9 개변체, Gal-9) 및 도 67(인도메타신, Indo)에 도시한다. 아쥬반트 관절염은 주로 자연 면역과 T 세포가 관여한 획득 면역에 의한 염증이다. 갈렉틴 9 개변체는 어느 쪽의 염증도 억제하지만, 주로 획득 면역에 의한 염증을 강하게 억제한다. 또한, 체중의 증감은 인도메타신 투여군 및 갈렉틴-9 개변체 투여군에서는 동일한 경향을 보였다.
실시예 32
[래트 CIA(콜라겐 감작) 모델: 갈렉틴-9 개변체(정맥내 투여)]
[방법]
소 타입 II 콜라겐(콜라겐기술연수회)를 프로인트의 불완전 아쥬반트(IFA: Difco)에 용해, 에멀젼을 제작하여 래트(DA/S1c 11주령: 일본에스엘씨)의 등 부분 피부내에 500 ㎕씩 피내 주사(콜라겐 50 ㎍/500 ㎕/마우스)하여 일차 감작한다. 그 일주일 후에 동 콜라겐 에멀젼액(콜라겐 50 ㎍/500 ㎕/마우스)을 동물의 미근부에 투여하여, 이차 감작했다. 사지를 주 3회 스코어링한다. 부스터 후, 즉시 갈렉틴-9 개변체(null human galectin-9=h-G9NC(null); 3, 10, 30 ㎍/1 ml/마우스), 음성 대조 물질인 PBS(1 ml/마우스)을 정맥내에, 양성 대조 물질인 프레드니졸론(3 mg/10 ml/kg: SIGMA)은 경구 투여를, 매일 1회, 38일까지의 32일간 행한다.
콜라겐 일차 감작일(0일), 일차 감작한 후 7, 15, 18, 22, 26, 30, 35 및 39일에 좌우 뒷다리의 발 용적을 측정하여, 다음 식에 따라서 부종율(%)을 산출한다.
부종율(swelling)(%)=[감작 후의 족척 용적(ml)-감작 전의 족척 용적(ml)]/[감작 전의 족척 용적(ml)]×10O
통계학적 처리는 다음과 같은 식으로 행했다. 좌우 뒷다리의 가산을 개체치로 한, 부종율(%)의 평균치 및 표준 오차로 나타낸다. PBS군과 프레드니졸론군과의 사이에서 F 검정에 의해 등분산성을 검정하여, 등분산인 경우에는 Student의 t 검정을, 부등분산의 경우에는 아스핀-웨치(Aspin-Wech)의 t 검정을 한다. 이어서 PBS군과 갈렉틴 9 개변체군과의 사이에서 바틀렛(Bartlet) 검정에 의해 등분산성을 검정하고, 등분산성의 경우에는 파라메트릭 듀넷 시험를, 부등분산성인 경우에는 논파라메트릭 듀넷 시험를 행한다. 모두 유의적인 수준은 5% 미만(p<0.05)을 유의하다고 하고, 5% 미만 및 1% 미만(p<0.01)으로 나눠 표시한다. 얻어진 결과를 도 68 및 표 3에 도시한다. 표 3에서, 각각의 값은 평균치±SEM을 나타내고 있다. ##: 대조군으로부터의 유의적인 차이(15, 18, 22 Day: Student의 t 검정, *p<0.05, **p<0.01: 대조군으로부터의 유의적인 차이(18, 22 Day: 파라메트릭 듀넷 시험; 15 Day: 논파라메트릭 듀넷 시험). 갈렉틴 9 개변체에 의해 발증의 억제가 확인되었다.
Figure pat00002
본 갈렉틴 9 개변체(안정화 갈렉틴 9, 예컨대, h-G9NC(null) 등)는 다음과 같은 생물 활성:
종양 세포의 응집: 많은 종양 세포에서의 응집 효과
접착 저해: 세포외 매트릭스에의 접착 저해 효과
아포토시스, 세포 상해: 많은 종양 세포에서 아포토시스 유도
수상 세포(DC)의 활성화: DC 분화 유도
NK, NKT 활성화: 동원 촉진
통증의 억제: 캅사이신에 의한 통증의 억제
로부터 기대되는 항종양 효과를 보인다.
본 발명자들의 그룹은, 유방암 조직에 있어서의 갈렉틴 9의 발현을 검토하여, 갈렉틴 9 양성예에서는 원격 전이 빈도가 낮음을 확인했다. 그리고, 현재, 전이 예지 진단 키트의 개발을 진행시키고 있다(Clin Cancer Res, 2005 in press, Galectin-9 as a prognostic factor with anti-metastatic potential in breast cancer). 그리고, 갈렉틴 9 유전자 도입 인간 유방암 세포주가 시험관내로 높은 응집성을 나타내고, 누드 마이스 체내에서도 동일한 응집성을 나타내는 것도 확인했다. 또한, 혈구계 악성 종양을 포함하여, 많은 세포계에 대한 세포 장해 활성이 거기에 확인되고, 그 대부분은 아포토시스의 유도에 의한 것도 확인되고 있다(Int J Cancer. 2002 20; 99(6): 809-816, Possible role of galectin-9 in cell aggregation and apoptosis of human melanoma cell lines and its clinical significance; J immunol. 2003 1; 170(7d): 3631-3636, Galectin-9 induces apoptosis through the carcium-calpain-caspase-1 pathway). 또한, 갈렉틴 9 투여 국소에는 NK/NKT 세포, Mφ계 세포 등의 동원이 확인되어, 세포성 암 면역 기구 유도의 가능성이 시사되고 있다.
이상의 점에서, 안정화 갈렉틴 9(본 발명의 갈렉틴 9 개변체, 예컨대, h-G9NC(null) 등)는 백혈병 등의 혈구계 악성 종양, 수술후 유리 암 세포에 대한 살세포 효과, 암 세포의 응집·암 세포의 혈관벽 접착이나 다른 조직에의 침윤을 저해함으로써 전이 억제, 암성 복막염 발증의 억제 효과, 또한 종양 주변 부위에의 이펙터 세포의 동원에 의한 종양 면역 활성의 항진 등 효과를 갖는 것, 나아가서는 바람직한 작용 효과를 기대할 수 있어, 부작용이 적은 신규 항암 물질이 될 것으로 기대된다.
현재 개발중인 생물 제제(모노클로날 항체 등)는, 면역 세포 표면 분자, 세포내 기능 분자나 염증성 시토킨을 표적으로 하고 있다. 즉 저해 효과를 가지고 약리 작용으로 하는 약제이다. 한편, 본 안정화 갈렉틴 9 분자 제제는, 활막 세포나 활성화 T 세포의 아포토시스 유도와 골 파괴의 억제 작용에 의해, 생체가 원래 가지고 있는 면역 조절 작용, 항염증 작용이나 뼈·연골 조직의 재생도 기대된다, 항시토킨 요법 등과는 완전히 발상이 다른 새로운 개발 어프로치이다. 통증은 관절 류마티스의 주요 소견으로, 상기 실시예에서 사용하고 있는 캅사이신은 신경성 염증에 있어서의 염증성 동통을 야기하는 중요한 미디에이터이며, 안정화 갈렉틴 9는 캅사이신 도포에 의한 이개종창을 억제한다. 즉, 부작용이 적은 새로운 전신성 자기면역 질환의 치료약으로서 기대된다. 본 안정화 갈렉틴 9는 신규 작용 기작에 의한 부작용이 적은 항류마티스제가 될 수 있다. 본 안정화 갈렉틴 9는, 염증 억제와 관절 조직의 수복, 통증의 억제라고 하는 임상 효과상의 특징을 지니고, (1) 활성화 T 세포의 아포토시스의 유도, (2) 활막 세포의 아포토시스, (3) 아라키돈산 캐스케이드, (4) 골 파괴 억제 등과 같은 메카니즘을 기대할 수 있어 류마티스 치료약으로서 유망하다. 실제, 관절염(CIA, 항체 칵테일) 모델에 있어서의 발증 억제가 확인되고 있는 것이다.
갈렉틴 9 개변체는, 야생형의 것보다도 효소에 대하여 저항성이 있으므로, 갈렉틴 9가 나타내는 다면적인 작용·기능을 유효하게 이용하는 데에 도움이 된다. 야생형 갈렉틴 9는, 종양에 대한 직접 작용(종양 세포의 세포간 접착과 아포토시스를 유도하는 활성), 면역계를 통한 작용에 의해, 암의 전이 억제와 퇴축을 유도하는 것이 시사되어 있는데, 본 갈렉틴 9 개변체는, 동일한 활성을 나타내는 보다 유리한 활성 물질, 예컨대, 항종양약 등으로서 기대할 수 있다. 야생형 갈렉틴 9는, 비활성화 림프구에는 작용하지 않고, 활성화 T 세포, 특히 과잉 면역 반응의 원인이 되는 CD4 양성 T 세포의 아포토시스를 유도하므로, 본 갈렉틴 9 개변체는, 동일한 활성을 나타내는 보다 유리한 활성 물질, 예컨대, 항염증약, 항알레르기약, 골다공증약으로서 기대할 수 있다. 야생형 갈렉틴 9는, 류마티스에 있어서 관절의 변형 등에 관여하는 활막 세포에 대하여 강력한 아포토시스 유도능을 가지는 것이 명백하므로, 본 갈렉틴 9 개변체는, 동일한 활성을 나타내는 보다 유리한 활성 물질로서 기대할 수 있다. 이와 같이 암 치료약이나 난치성의 자기면역 질환(류마티스를 포함함), 알레르기 질환, 염증 질환, 골 대사에 관한 질환에 대한 치료약의 개발·갈렉틴 9의 기능 해명·연구 개발에 이용할 수 있다.
본 발명은, 전술한 설명 및 실시예에 특별히 기재된 것 이외에도 실행할 수 있음은 명백하다. 전술한 교시를 감안하여, 본 발명의 많은 개변 및 변형이 가능하며, 따라서 이들도 본건 첨부의 청구의 범위의 범위 내의 것이다.
<서열표 프리텍스트>
SEQ ID NO: 1, Description of Artificial Sequence: Polynucleodide for galectin-9 mutein, G9NC(null)
SEQ ID NO: 2, Description of Artificial Sequence: Polynucleodide for galectin-9 mutein
SEQ ID NO: 5, galectin-9 medium isoform
SEQ ID NO: 10, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 11, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 12, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 13, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQUENCE LISTING <110> GALPHARMA Co., Ltd. <120> Novel Galectin-9 Muteins and Use Thereof <130> GL-05PCT <150> JP 2004-94401 <151> 2004-03-29 <150> JP 2004-287005 <151> 2004-09-30 <150> JP 2005-43156 <151> 2005-02-18 <160> 13 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleodide for galectin-9 mutein <220> <221> CDS <222> (1)..(891) <223> G9NC(null) <400> 1 atg gcc ttc agc ggt tcc cag gct ccc tac ctg agt cca gct gtc ccc 48 Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 ttt tct ggg act att caa gga ggt ctc cag gac gga ctt cag atc act 96 Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr 20 25 30 gtc aat ggg acc gtt ctc agc tcc agt gga acc agg ttt gct gtg aac 144 Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn 35 40 45 ttt cag act ggc ttc agt gga aat gac att gcc ttc cac ttc aac cct 192 Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro 50 55 60 cgg ttt gaa gat gga ggg 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Claims (1)

  1. 갈렉틴 9 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 보유하는 단백질의 링크 펩티드 또는 그의 근방영역이 개변된 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그의 염.
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