JP3337214B2 - 電離線による遺伝子発現の調節 - Google Patents
電離線による遺伝子発現の調節Info
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Description
現を調節する方法に関する。本発明は、更に、標的組織
を破壊し、変化させまたは失活させる方法および組成物
に関する。これらの組織は疾患に関係した、例えば、腫
瘍若しくは血餅であることがあるし、またはそれらが代
謝欠損若しくは代謝異常を有することがある。本発明の
態様は、放射線応答性遺伝的構築物を標的組織に対して
送達することおよびその組織に外部から電離線を照射す
ることによって該構築物中の遺伝子を活性化させること
である。
質に対する細胞性応答においてある役割を果たしている
ことがある。例えば、メタロチオネインIおよびII、コ
ラゲナーゼ並びにプラミノーゲン活性化因子は紫外線照
射後に誘導される(エンジェル(Angel)ら、1986;198
7;フォネイス(Fornace)ら、1988aおよびb;ミスキン
(Miskin)ら、1981)。B2ポリメラーゼIII転写物は、
熱ショックによる処置後に増加する(フォネイスら、19
86;1989a)。更に、DNAポリメラーゼβ mRNAの濃度はD
NAを損傷する物質による処置後に増加するが、この転写
物は照射後に未変化であり、特異的にDNAを損傷する物
質が遺伝子発現を特異的に調節することを示唆している
(フォネイスら、1989b)。プロトオンコジーンc−fos
RNA濃度は紫外線、熱ショックまたは化学的発がん物
質による処置後に増加する(アンドルーズ(Andrews)
ら、1987;ホランダー(Hollander)ら、1989a)。この
ことに関して、熱ショックの際のfos転写の相対比率は
未変化であり、このストレスが転写後機序によってc−
fos RNAを増加させたことを示唆している(ホランダー
ら、1989b)。
は低酸素症による放射線致死の改変に的がしぼられてい
た(バヌラ(Banura)ら、1976;モールダー(Moulder)
ら、1984)。原核生物および下等真核生物において、電
離線はいくつかのDNA修復遺伝子の発現を誘導すること
が分かった(リトル(Little)ら、1982);しかしなが
ら、電離線による遺伝子発現の誘導は、哺乳動物細胞に
おいては記載されていなかった。X線以外のDNAを損傷
する物質は、高等真核生物において種々の遺伝子の発現
を誘導する(フォネイスら、1988,1989;ミスキンら、19
81)。
および細胞致死が起こることである。多数の実施例にお
いて、その作用は線量率に比例する。電離線は、DNAと
の直接的相互作用によってまたはDNA損傷をもたらす遊
離基種の生成によって多数の生物学的作用を誘導すると
仮定されてきた(ホール(Hall)、1988)。これらの作
用としては、遺伝子突然変位、悪性形質転換および細胞
致死がある。電離線は若干の原核細胞および下等真核細
胞においてある種のDNA修復遺伝子の発現を誘導するこ
とが実証されてきたが、哺乳動物遺伝子発現の調節に対
する電離線の作用についてはほとんど知られていない
(ボレク(Borek)、1985)。いくつかの研究は、哺乳
動物細胞の照射後に観察されたタンパク質合成のパター
ンの変化を記載していた。例えば、ヒト悪性黒色腫細胞
の電離線処置は、いくつかの未確認のタンパク質の誘導
に関係している(ブースマン(Boothman)ら、1989)。
サイクリンおよび補助調節的(coregulated)ポリペプ
チドの合成は、ラットREF52細胞においては電離線によ
って抑制されるが、癌遺伝子に形質転換されたREF52細
胞系では抑制されない(ランバート(Lambert)および
ボレク、1988)。他の研究は、ある種の成長因子または
サイトカインがX線に誘導されたDNA損傷に関与するこ
とがあるということを実証した。このことに関して、血
小板に誘導された成長因子は照射後の内皮細胞から放出
される(ウィッテ(Witte)ら、1989)。
おける重要な制御点であり、特異的DNA配列に対するあ
る種の転写調節因子の結合に依存する。しかしながら、
真核細胞における電離線照射による転写制御の調節につ
いてはほとんど知られていない。哺乳動物遺伝子発現の
転写後調節に対する電離線の作用も知られていない。
破壊、変化若しくは失活から、または失活している若し
くは異常な遺伝子生成物の置換によって得るところがあ
る考えられる。ある種の状況において、冒された細胞は
認識しうる組織に集中している。これらの組織を捜し出
し且つ破壊することまたは必要な遺伝子生成物をそれら
に送達することを試みる現在の治療方法は重大な制限を
有する。ある種の疾患、例えば、癌に対して、電離線は
療法として有用である。放射線を増大させ、それによっ
て必要な線量を減少させる方法は、癌患者に極めて有益
であろう。したがって、遺伝子発現に対する放射線の作
用を研究することによって放射線作用を増大させる方法
および組成物が探求された。目的は、放射線を用いる新
規の種類の療法を提供することおよび放射線の他の使用
法を探求することであった。
よる遺伝子発現全体に及ぶ制御は電離線に対して応答性
であり、遺伝子生成物を独特の組織標的に対して選択的
に導入するスイッチとして用いられ、標的組織中の細胞
の治療的破壊、変化または失活の機会を与える。これら
のプロモーター−エンハンサー領域は、放射線トリガー
の適用によって遺伝子発現を制御する。
壊、変化または失活が疾患または症状を緩和すると考え
られる疾患および症状を治療する方法および組成物に関
する。その方法は、遺伝的構築物を宿主組織の細胞に対
して送達し、引き続きその組織に電離線を照射すること
を含む。遺伝的構築物のある領域は電離線によって誘導
されることができる。組織に電離線を照射することは、
したがって、遺伝的構築物の発現を誘導する。次に、遺
伝子生成物は組織中の細胞を破壊し、変化させまたは失
活させることができる。因子の欠損または異常の処置用
に選択された遺伝子生成物は、正常な因子nを提供する
ものである。
ンハンサー−プロモーター領域と、少なくとも1種類の
構造遺伝子を含む領域との組合わせを含む。エンハンサ
ー−プロモーター領域は、宿主の疾患または症状に適当
なリポーター−エファクター遺伝子の形で構造遺伝子を
発現させる。
−エンハンサー領域および構造遺伝子領域を含む。代表
的な実施態様において、プロモーターは構造遺伝子領域
に対して5′である。この実施態様において、最終応答
の増幅は生じない。むしろ、放射線感受性領域および構
造遺伝子の調節の間には直接的相互関係がある。誘導領
域は放射線照射によって現れるが、放射線照射を止めた
後のある時点に消失する。構造遺伝子領域の発現は、照
射時間および発現領域の固有の定量的限界によって制限
される。
幅し且つ照射時間を越えて発現を延長するために、一連
のプロモーターおよび発現遺伝子、例えば、2種類のプ
ラスミドが考えられる。第一のプラスミドは、適当な転
写因子の放射線感受性プロモーター5′を含む。転写因
子の実施態様において、第一のプラスミドは、例えば、
ヘルペスウイルスVP16から得られたものである強力な活
性化ドメインを含む。このドメインは多数の陰電荷残基
を有する。キメラタンパク質は、VP16活性化ドメインお
よびlacリプレッサーなどの既知のタンパク質のDNA結合
性ドメインを含むこの実施態様において考えられる。キ
メラタンパク質/遺伝子構築物(融合遺伝子)は放射線
感受性プロモーターから作動する。
は、lacリプレッサーDNA結合性ドメインのためのいくつ
かの結合性部位を含む。これらの結合性部位はリポータ
ー−エフェクター遺伝子、例えば、TNFの上流に位置す
る。或いは、上記の2種類のプラスミドを一つの構築物
中に融合することができた。
的構築物としての使用は、いくつかの利点を有する。
き続き遺伝的カスケードの作用によって与えられるの
で、プロモーターは強力な活性化を提供する必要はない
し; (2)いくつかの遺伝子は構築物中に含まれて一層複雑
なまたは一層広範囲の作用を提供することができる。代
表的な実施態様において、いくつかの毒素生産性遺伝子
は適当なDNA結合性部位の3′に位置していてよい。多
数の遺伝子構築物の実施態様は、細胞成長の種々の調節
を生じるいくつかの遺伝子を伴って、lacリプレッサー
のDNA結合性ドメインを含み;そして (3)最初の電離線による効果は一時的に延長すること
ができ;すなわち、キメラlacリプレッサータンパク質
の半減期が、プロモーターRNAが放出される間の放射線
照射時間と比較して長く、例えば、数時間または一日で
ある場合、遺伝的構築物の細胞に対する効果は延長され
る。
法によっても、標的組織の細胞中に、その望ましい発現
および放射線によるその発現全体の制御を阻害すること
なく組込まれる。これらの方法は、エレクトロポレーシ
ョン、リポフェクションまたはレトロウイルス方法論を
含む。
用いられるレトロウイルスは、3′LTR(直鎖転移領
域)が失活したウイルスである。すなわち、宿主細胞中
への生産的感染後に3′LTRは5′末端に転移し且つ双
方のウイルスLTRが転写活性に関して不活性であるの
で、これらはしばしばSIN(自己失活性ウイルス)と称
されるエンハンサーレス(enhancerless)3′LTRであ
る。当業者に周知のこれらのウイルスの使用は、クロー
ン化された遺伝子の調節要素を二つのLTR間の空間に挿
入するために遺伝子をクローン化することである。ウイ
ルス感染システムの利点は、それが適当な受容体細胞、
例えば、LAK細胞中への極めて高水準の感染を可能にす
ることである。
ば、リンホカイン遺伝子の5′である放射線応答性エン
ハンサー−プロモーターまたは転写活性化因子はウイル
スでクローン化することができる。
に本発明で用いた構築物の特性を保存するいずれの方法
によっても宿主中に送達される。これらの方法は、静脈
内注射、標的組織中への直接注射または、宿主から取出
された細胞中への組込みによって構築物を送達すること
を含む。後者の場合、受容体細胞中への構築物のインビ
トロの組込み後に、その構築物を含む細胞を宿主中に再
導入する。受容体細胞の種類に応じて、宿主中の細胞の
分布は変化し、例えば、細胞が腫瘍または血餅に向けら
れている若干の場合には特定の部分に集中し、他の場合
には骨髄などの完全なシステムじゅうに拡散している。
遺伝的構築物を有する細胞が宿主の広範囲の部分にわた
って分散したとしても、標的組織に対する構築物の所望
の作用を集中させることは、構築物のスイッチをいれる
のに用いられる電離線をある限定された部分に対して向
けることによって提供することができる。ビームの範囲
内の細胞のみが反応し且つ構築物遺伝子の発現を引き起
こす。
生体領域中に回帰させるもう一つの方法は、構築物に放
射性同位体または他の標識を付け、そしてその標識を地
理学的に検出することによって構築物含有細胞が標的組
織に到達した時を決定することである。構築物が標的に
到達した時に放射線を出し、そして標識された方向に向
ける。
体細胞の種類は、処置の目的に基いて選択される。代表
的な実施態様において、LAK細胞は、腫瘍に向けられた
攻撃が主要な目的である患者に対して用いられる。もう
一つの実施態様では、内皮細胞を用いて、例えば、代謝
欠損または代謝異常のある遺伝的に異常な胎児を治療す
る遺伝子療法のための遺伝子を送達させる。抹消血液由
来の細胞も適当な受容体細胞である。
中の構造遺伝子の発現をもたらすいくつかの段階があ
る。これらの構築物中には、転写因子の発現を引き起こ
す(作動させる)放射線感受性プロモーターが存在す
る。転写因子は、宿主の疾患または症状に適当なエフェ
クターを含むリポーター構築物を活性化する。エフェク
ター遺伝子の発現生産は治療的方法において標的組織外
の病気の、不完全なまたは異常な細胞と相互作用する。
プロモーター−エンハンサー領域および構造遺伝子領域
を含むベクターを細胞中に組込むことによって、腫瘍細
胞を死滅させることができる毒素をLAK細胞または他の
細胞/分子伝達体中に入れる。放射線応答性プロモータ
ー−エンハンサー領域の例は、例えば、c−junまたはT
NF−α由来のものを含む。構造遺伝子の例は、腫瘍壊死
因子(TNF)、リシンまたは、制限されないがIL−1−
6、PDGF(血小板由来成長因子)若しくはFGF(繊維芽
細胞成長因子)を含む各種成長因子として発現されるも
のを含む。構築物のこの実施態様が有用である疾患は癌
を含む。この治療形態から恩恵をうけるであろう癌の種
類は、固体および血液学的悪性疾患を含む。具体的な癌
としては頭部および頸部腺癌がある。
ば、β−ガラクトシダーゼに結合した放射線感受性プロ
モーターを含む。構築物は受容体細胞に移される。概し
て、多数の受容体細胞をこの方法で調製する。次に、受
容体細胞を哺乳動物中に導入する。代表的な実施例にお
いて、内皮細胞を受容体細胞として用いる。次に、これ
らの細胞を、細胞内の構築物の作用が望まれる適当な血
管中に植え付ける。その血管を含む生体部分に対して放
射線を送達させる。β−ガラクトシダーゼの発現をXgal
などの発色検定によって監視する。
遺伝子の実施態様は、腫瘍壊死因子(TNF)として発現
されるものを含む。X線照射後のヒト肉腫による増加し
たTNF−α生産は、このポリペプチドのヒト腫瘍細胞に
対する直接的細胞障害作用に関して明らかである(シュ
ガーマン(Sugarman)、1985;オールド(Old)、198
5)。照射された腫瘍細胞中のTNF−αの細胞内生産は、
X線照射後の細胞の致死を引き起こし、これは電離線の
みの直接的作用によって生じる致死よりも多い。
相乗作用は、後者は照射前にTNFが与えられる場合に生
じるが、臨床的放射線療法においてTNF−αを用いるの
に可能な用途を支持する。TNF−αは細胞性免疫応答を
有効にする(ベベラクタ(Bevelacqua)ら、1989;セル
サ(Sersa)ら、1988)。インビボの研究により、同系
の腫瘍を植え込まれたマウスでのX線による腫瘍制御を
TNF−αが宿主の免疫系の増大によって増強することが
分かった(セルサら、1988)。したがって、TNF−α
は、しばしば放射線療法に伴う免疫抑制を逆転すること
がある。更に、TNF−αは繊維芽細胞の増殖および内皮
破壊を引き起こし、腫瘍によるTNF−α生産が周囲の正
常な組織での遅れた放射線作用の原因となる一つの成分
であるらしいということを示唆している。遺伝的構築物
中のこの遺伝子を照射によって出現させることは、罹患
した組織に対する直接的攻撃を可能にする。
に加えて、目的は、癌または他の療法の際に、標的組織
に隣接する正常な組織を放射線作用および種々の細胞毒
素の有害な作用から保護することである。固体および血
液学的悪性疾患および無形成貧血は、これが心配される
症状である。この保護目的に適当である本発明の遺伝的
構築物の構造領域中の遺伝子としては、リンホカイン、
GCSF、CMSFおよびエリトロポイエチンがある。
とのみならず転移を阻害することである。この目的に関
して、遺伝的構築物中に包含するのに適当な遺伝子の一
つはNM23である。
である二次的悪性疾患の防止には、腫瘍サプレッサー遺
伝子を含む構築物を用いる処置が助けとなる。
凝血障害を有する患者に対して、血餅形成の複雑な過程
に必要な因子VIIIまたは他の因子を、欠失因子に関して
不完全な細胞中に導入することができる。
の症状において、本発明の遺伝的構築物によって導入さ
れた抗凝血因子を用いて血餅を溶解する。このような遺
伝子の発現生成物の実施態様としては、ストレプトキナ
ーゼおよびウロキナーゼがある。
たは症状の他の種類としては、正常ヘモグロビンを生産
する遺伝子が治療用構築物中に含まれる、鎌状赤血球貧
血などの異常血色素症;神経発育因子として発現される
遺伝子が構築物中に含まれる、アルツハイマー病などの
神経変性疾患;およびインスリン生産性遺伝子が構築物
中に含まれることができる糖尿病がある。
って引き起こされる遺伝的疾患、例えば、毛細血管拡張
性運動失調、色素性乾皮症は、ERCC−1またはXRCC−1
などの遺伝子の導入によって治療される。
がある物質である放射線の照射を必要とするが、その線
量は比較的低く、短時間投与され、そして集中される。
本発明が適用される多数の疾患および症状に対して、放
射線治療は標準的であり、そして本発明の実施は必要な
線量を減少し、放射性治療自体の危険性を低減する。通
常は放射線を必要としない疾患に対して、本発明におい
て記載した方法での放射線の使用はもう一つの療法に取
って代わるものである。本発明の使用の決断は危険性/
利益の分析に基く。
いてその発現生成物が所望の効果を生じる遺伝子。
ーターの利用を増大させ、そしてプロモーターに関して
両方向およびいずれの部位でも(上流または下流)機能
することができるシス作用核酸配列。
に関与したDNAの領域。
るマーカーとして容易に検出可能であり且つ役立つ遺伝
子。
ードする遺伝子。このタンパク質は酵素、毒素、特定の
受容体に対するリガンド、受容体、核酸結合性タンパク
質または抗原であることができた。更に、タンパク質は
電離線によって誘導を監視するためのリポーターとして
役立つことができた。これらのタンパク質をコードする
遺伝子は真核生物または原核生物由来であることができ
た。
むことによっておよび図面の論及によって明らかになる
ものであり、ここにおいて、 図1は、エフェクター遺伝子を作動させる放射線感受
性プロモーターを含む基本的な遺伝的構築物の略図であ
る。
も複雑な遺伝的構築物の略図である。
ルス態様の基本的システムを含む略図である。
る。
性ヒト腫瘍細胞の放射線致死に対するTNF−αの効果で
ある。
る電離線の効果である。
芽細胞中のc−jun RNA濃度に対する電離線の効果であ
る。
効果である。
mRNA濃度に対するシクロヘキシミドの効果である。
mRNA濃度に対する電離線の効果である。
量率の効果である。
るが、その具体的な実施態様は図面での実施例によって
示されたものであり、本明細書中において詳細に記載さ
れる。しかしながら、それが開示された特定の形態に本
発明を制限するためのものではないということは理解さ
れるべきであり、その意味は、請求の範囲に定義の本発
明の精神および範囲内にある変更、同等物および代替物
全部を包含することである。
伝子の発現を調節する方法および組成物に関する。調節
される遺伝子は、好ましくは、電離線に対して感受性で
ある領域を含む遺伝的構築物中に組込まれる。このよう
な構築物の略図を図1に示し、そこにおいて、放射線応
答遺伝子のエンハンサー−プロモーター領域10、例え
ば、c−junは、構造遺伝子、例えば、TNF14などのリポ
ーター−エフェクター遺伝子の発現を作動する16。次
に、構造遺伝子発現生成物は、それを組込んだ細胞に作
用して、細胞に対する所望の効果を生じることができ
る。
いて、放射線応答性遺伝子のエンハンサー−プロモータ
ーを含む領域20は、例えば、LACリプレッサー遺伝子のD
NA結合性ドメイン26および、例えば、VP16から転写因子
を生じる遺伝子24の発現を作動する28。その融合遺伝子
40、42の発現の結果得られたキメラタンパク質は、図2B
に図示したDNA配列30に対して結合しうる。転写因子4
0、42によるこの配列の結合は、構造遺伝子36、例え
ば、TNFなどのリポーター−エフェクター遺伝子を活性
化する38。CCAATおよび、例えば、c−fos癌遺伝子から
のTATAボックスを有する「最小プロモーター」32は、結
合性配列30および発現される遺伝子36の間に位置する。
遺伝子生成物34は、遺伝的構築物を組込んだ細胞に作用
して所望の効果を生じることができる。
2に示す。この図は、種々の異なる細胞種における転写
水準での電離線によるc−jun遺伝子の強力な誘導に基
いている。jun遺伝子からの大型断片の5′ゲノム配列
は、β−ガラクトシダーゼなどの適当なリポーターに連
結される。次に、このような構築物を受容体細胞中にト
ランスフェクトし且つ放射線応答性に関して検査する。
この最初の大型の5′断片を様々に切断することができ
る。
レーション、リポフェクションおよびウイルス感染を含
む。この後者の方法は、二つのLTR50、56を有するSIN
(自己失活性ウイルス)を含む。LTR間に位置するの
が、放射線感受性要素52および構造遺伝子領域54を含む
遺伝的構築物である。U3エンハンサー欠失を58で示す。
胞性免疫応答のポリペプチド媒介物および放射線の組合
わせは相乗作用を生じ且つ臨床的癌療法に有用である。
TNF−αは血管内皮に直接的に作用して、炎症性経過中
に白血球の付着力を増大させる(ベベラクアら、198
9)。TNF−αに対するこのインビボの応答は、出血性壊
死並びに植え込み可能なマウスおよびヒト腫瘍の後退に
応答性であることが示唆された(カースウェル(Carswe
ll)、1975)。更に、TNF−αはインビトロのヒト癌細
胞に対して直接作用して、細胞死および成長阻害を引き
起こす(シュガーマンら、1985;オールド、1985)。TNF
−αの細胞障害作用は遊離基生成、DNAフラグメント化
および微小管破壊と相互関係を示す(マチュース(Matt
hews)ら、1988;ルビン(Rubin)ら、1988;スカンロン
(Scanlon)ら、1989;ヤマウチ(Yamauchi)ら、1989;
マチュースら、1982;ニール(Neale)ら、1988)。TNF
−αによる酸化的損傷に対して耐性である細胞系は、更
に、増大した遊離基緩衝能を有する(ツィンマーマン
(Zimmerman)ら、1989;ウォング(Wong)ら、1988)。
においてヒドロキシル基を生産させる(マチュースら、
1987)。TNF−αによって生じた酸化的損傷に対して感
受性である細胞系は、TNF−αを加えた後に遊離基緩衝
能が低減した(ヤマウチら、1989)。低濃度のヒドロキ
シル基は、TNF−α致死に対して感受性の細胞と比較し
た場合、TNF−α細胞障害性に対して耐性の細胞におい
て測定された(マチュースら、1987)。
線による処置後に増加する。TNF−α mRNAの増加はTNF
−αタンパク質の増大した生産によって達成される。
胞障害性タンパク質の誘導は、ある種のヒト肉腫細胞系
の被照射培養物からデカントされた培地がこれらの細胞
並びに他の腫瘍細胞系に対して細胞障害性である場合に
考えられた。被照射腫瘍培養物中のTNF−α濃度は、エ
ライザ法によって分析した場合、非被照射細胞のそれを
越えて増大した(サリボン(Saribon)ら、1988)。引
き続きの研究により、照射後に増大したTNF−αタンパ
ク質は、特異な従来記載されなかった機序によって細胞
のX線致死を有効にすることが分かった(実施例1を参
照されたい)。
示する。非処理細胞(対照)および被照射細胞からのRN
Aを寸法で分別し且つ32P標識TNF−α(STSAR−13)およ
びPE4プラスミド含有TNF−α cDNA(STSAR−48)にハ
イブリッド形成した。オートラジオグラムは、細胞系ST
SAR−13において照射して3時間後および細胞系STSAR−
48において6時間でTNF−α mRNAの増加の増大した発
現を示した。7S RNAは、等重量の列のパターンを示す
ようにハイブリッド形成した。これらの結果による結論
は、放射後にTNF−α遺伝子発現が増大するということ
である。
ような効果を与えるかということであった。図5は、TN
F−α生産性ヒト肉腫およびTNF−α非生産性ヒト腫瘍細
胞の放射線致死に対するTNF−αの効果を示す。実線は
放射線のみの効果を示し、破線はTNF−αおよび照射双
方の効果を示す。細胞系STSAR−33の代表的な生存デー
タを左のAのグラフに示す。下方の破線は、撒種効率
(PE)30%に補正された、TNF−αが1000単位/mlでの細
胞の生存を示す。TNF−α(10単位/mlおよび1000単位/m
l)と一緒に照射されたヒト上皮腫瘍細胞(SQ−20B)の
生存を真中のグラフBに示す。SQ−20Bの生存データ
は、TNF−α(1000単位/ml)の添加剤効果を示す。TNF
−αによる生存は、TNF−αのみによる致死85%に補正
される。HNSCC−68の放射線生存データを右のCのグラ
フに示す。TNF−αの非致死量(10単位/ml)を照射の24
時間前に加えた。
かるように、腫瘍壊死因子αはX線による処置後に増加
する。mRNAおよびTNF−αタンパク質双方が増加した。
び哺乳動物遺伝子の発現を誘導することが観察された
が、TNF−α遺伝子は、電離線の照射後に発現を増大さ
せたことが見出された最初の哺乳動物遺伝子である。こ
の遺伝子はDNA修復遺伝子として分類されていない。
ている機序を決定するために、ランオン転写検定を単離
された核において行なった。作用遺伝子は陽性対照とし
ての被処理HL−6細胞において構成要素であるように転
写された(図8)。
れた。図8で示したように、低水準のc−jun転写は、
放射線によって処理されていないHL−60において検出可
能であった。劇的に増加した転写(7.2倍)は、電離線
の照射後に生じた。この研究による結論は、電離線が少
なくとも部分的には転写機序によってc−jun発現を誘
導したということであった。
mRNA濃度に対するシクロヘキシミドの効果を図示す
る。XRTと記した列は、細胞の20Gy放射線照射後のmRNA
の発現を示す。列CHXにはシクロヘキシミドを加えた。C
HXおよびCHX/XRTの添加剤効果は、XRTのみと比較して発
現が3.6倍増加している。
度に対するシクロヘキシミドの効果。HL−60細胞は、電
離線(XRT)20Gyおよび/またはシクロヘキシミド(CH
X)5μg/mlで処理された。全細胞性RNA(20μg/列)を
1時間、3時間および6時間後に単離し、そして32P標
識c−junまたはアクチンプローブへのハイブリダイセ
ーションによって分析した。
度に対する電離線の効果。(A)HL−60細胞を、様々な
線量の電離線(XRT)または32nM 12−O−テトラデカ
ノイルフォルボル−13−アセテート(TPA;陽性対照)で
3時間処理した。全細胞性RNA(20μg)を32P標識c−
fosプローブにハイブリッド形成した。(B)HL−60細
胞を電離線20Gyで処理した。全細胞性RNA(20μg/列)
を指定した時間に単離し且つ32P標識jun−Bプローブへ
のハイブリダイセーションによって分析した。
率の効果。HL−60細胞を、指定した線量率での電離線10
または20Gyで処理した。3時間後に全細胞性RNA(20μ
g)を単離し且つ32P標識c−junプローブにハイブリッ
ド形成した。
ためのの標的組織 問題の用途に応じて、受容体細胞は様々な方法で的が
しぼられる。代表的な実施態様において、LAK細胞は、
周知のように生体中においてそれ自体他の位置にも分布
するが、ある程度優先して問題の腫瘍部分に回帰しがち
であり、それらを標的腫瘍に対して用いることができ
る。実際に、放射線誘導システムの最も重要な利点の一
つは、放射線の場にあるこれらのLAK細胞のみが活性化
し且つそれらの外部から導入された活性化したリンホカ
イン遺伝子を有する。したがって、LAK細胞の場合、更
に的をしぼる特別な必要性はない。他の用途において、
問題の適当な細胞は、それらに導入された単クローン性
抗体からの適当な遺伝子または細胞融合などの他の手段
によってそれらの細胞表面上に発現された適当な抗体を
有していた。例えば、これらの単クローン性抗体は生体
中の特定の細胞に対して集中し、したがって、受容体細
胞をその特定の領域に回帰させるので、次に、それらの
中の適当な毒素を活性化するのに放射線を用いることが
できた。これは「薬剤」の局所送達を可能にし、ここに
おいて、「薬剤」とは放射線応答性遺伝的構築物中の遺
伝子の発現生成物として定義される。放射線誘導構築物
の種類およびそれらの用途の代表的な実施態様を表1お
よび実施例4に示す。
mRNAの上昇 A. タンパク質生産 X線照射後のTNF−αタンパク質生産を検討するため
に、ヒト腫瘍細胞系と繊維芽細胞の培地中のTNF−αレ
ベルを、500cGY X線の被曝前後にエライザ法で(サリボ
ンら、1988)定量した(表1)。照射後に13のヒト骨お
よび柔軟組織ガン細胞系(STSAR−5,−13,−33,−43お
よび−48)のうちの5つが培地中にTNF−αを放出した
が、照射に被曝後も正常ヒト繊維芽細胞系(GM−1522お
よびNHF−235)、および4つのヒト上皮腫瘍細胞系(HN
−SCC−68,SCC−61,SCC−25およびSQ−20B)からの上澄
み中のTNF−αレベルは上昇しなかった。アッセイでは
ミリリットル当たりの0.1から2.0単位の間のTNF−αレ
ベル(2.3×106単位/mg)を正確に測定する(サリボン
ら、1988)。腫瘍細胞系STSAR−13はX線照射前には検
出できない量のTNF−αを、そしてX線照射後は0.35単
位/mlのTNF−αを生産した。細胞系STSAR−5および−3
3は、TNF−αの濃度が5−から10−倍以上に上昇してX
線照射に応答した;しかし2単位/mlより上の量は、ア
ッセイの範囲を越えた(サリボンら、1988)。細胞系ST
SAR−43および−48は、TNF−αの1.5−から3−倍の上
昇を示した(表1)。培地中のTNF−αタンパク質は、
初めにX線処理の20時間後に上昇し、3日後に最大に達
し、5日以上上昇したままであった。さらに、照射した
ものからの上澄み(しかし対照STSAR−33ではない)はT
NF−α−感受性細胞系SQ−20Bに対して細胞障害性であ
った。
比較した照射後のTNF−α−生産ガン細胞系について検
出された(図4)。例えば、TNF−α転写物は照射して
いないSTSAR−13および−48細胞系に存在した。細胞系S
TSAR−13中のTNF−α mRNAレベルは、500cGYに被曝3時
間後にデンシトメトリーで測定されたように>2.5−倍
まで上昇し、そして次に6時間後までにベースラインに
減少した(図4)。これらの転写物は、照射6時間後ま
で細胞系STSAR−48では上昇し、これはTNG−α遺伝子発
現の動力学における細胞系統間でのある種の異質性を指
示する。これとは対照的に、照射は7S RNAレベル(図
4)またはポリメラーゼβ遺伝子の発現には検出しうる
影響を及ぼさなかった。
毒性に対するTNF−αの影響を検討するために、組換え
ヒトTNF−αを照射前の培養物に添加した(図5)。組
換えヒトTNF−α(1000単位/ml)(2.3×106単位/mg)
は5つのTNF−α生産腫瘍のうちの4つに細胞毒性であ
った(STSAR−5,−13,−33および−43)。これらの系で
は、1000単位/mlで撒種効率(plating efficiency:PE)
が60−90%減少した。細胞系STSAR−33の照射−生存分
析をTNF−α(10単位/ml)で行った。放射線感受性
(D0)(生存曲線の末端勾配の逆比で定義される)は、
STSAR−33細胞系については80.4cGYであった。TNF−α
が照射の20時間前に添加された時、D0は60.4cGYであっ
た。生存分画は減少したPEがTNF−αで修正された。し
たがってSTSAR−33細胞のTNF−αと照射との間の相互作
用は相乗的であった(デウェイ、1989)。細胞系STSAR
−33において致死量以下の濃度のTNF−α(10単位/ml)
は、照射により致死を強め、TNFの放射線感受性効果を
示唆する。100−700cGYでの細胞系STSAR−5の生存画分
は、TNF−αとX線での別個の致死から期待されるもの
より低かったが、Do値は同様であった。したがってSTSA
R−5細胞でのTNF−αと照射との相互作用は付加的であ
る(デウェイ,1979)。細胞系STSAR−13およびSTSAR−4
3は、X線とTNF−αで別個に殺され、相互作用は観察さ
れなかった。
相互作用の可能性を決定するために、ヒト上皮腫瘍細胞
(SQ−20BおよびHNSCC−68)はTNF−αの添加後、20時
間照射された。これらの細胞系は電離線に応答してTNF
−αを生産しない。TNF−α(1000単位/ml)はSQ−20B
およびSCC−61細胞に対して細胞障害性で、PEを60−80
%減少した。TNF−αの有無におけるSQ−20B細胞の照射
生存を図5に表す。細胞系SQ−20BのDoは239cGYであ
る。TNF−α(1000単位/ml)をX線の24時間前に加える
と、Do値は130.4cGYであった。これゆえに、この細胞系
でTNF−αとX線との間の相乗的相互作用(ドウエイ、1
979)が実証された。照射後のTNF−αの添加によって
は、細胞系SQ−20Bの照射による細胞致死を強めなかっ
た。非致死量濃度のTNF−α(10単位/ml)は細胞系HNSC
C−68の照射致死を強め(図5)、TNF−αが間葉腫瘍細
胞系と同様にある種の上皮細胞をも照射に感受性にする
であろう証明を提供した。
ヒゼルバーム(Weichselbaum)ら1986;1988)に記載さ
れいる。上皮腫瘍細胞用の培養培地は72.5%ダルベッコ
改良イーグル培地/22.5%ハムズ栄養素混合物F−12[D
MEM/F−12(3:1)]5%ウシ胎児血清(FBS),5μg/ml
のトランスフェリン/10-10Mコレラトキシン/1.8x10-4M
アデニン、0.4μg/mlのヒドロコルチゾン/2x10-11Mのト
リオード−L−チロニン/100単位/mlのペニシリン/100
μg/mlのストレプトマイシンであった。ガン細胞の培養
培地は、DMEM/F−12(3:1)/20%FBS,ペニシリン100単
位/ml/ストレプトマイシン100μg/ml。
うに培養し、コンフルエンシーにまで増殖させた。培地
のTNF−αを供給3日後と照射1−3日後に再度分析し
た。13の樹立したヒト腫瘍細胞系が500−センチグレイ
(cGY)のX線照射を250kVのマキシトロン ジェネレー
タ(Maxitron generator)で受けた。TNF−αを2つの
モノクローナル抗体でのエライザで測定し、これはTNF
−αタンパク質についての別個のエピトープを有した
(サリボンら、1988);アッセイでは0.1から20.1単位/
mlのTNF−αを検出する。
リチウムクロライド法(カサラ(Cathala)ら、1983)
を使用して単離した。RNAをホルムアルデヒド−1%ア
ガロースゲル電気泳動により大きさで分画し、ナイロン
膜(ジーンスクリーンプラス、ニューイングランドヌク
レアー:GeneScreenPlus,New England Nuclear)に写し
取り、すでに述べたようにTNF−αcDNAを含有するPE4プ
ラスミドの1.7キロベース(kb)BamH I断片にハイブリ
ダイズさせ(19,23),16日間、−85℃で増感スクリーン
を用いてオートラジオグラフィーを行った。ノーザンブ
ロットでは、7S rRNAとβ−ポリメラーゼプラスミドに
対しても上記のようにハイブリダイズした(フォネイス
ら、1989)。エチジウムブロマイドの染色により、各レ
ーンに等量のRNAが添加されたことが分かった。TNF−α
のRNAブロットハイブリダイゼーションは、500cGYで細
胞照射した後分析された。細胞を冷却したリン酸塩緩衝
液で洗浄し、氷上に各時間おいた。RNAは照射、3,6およ
び12時間後に単離された。
ーを使用して照射した。コロニー形成アッセイを細胞生
存を測定するために使用した(ワイヒゼルバームら、19
88)。多標的モデルの生存曲線は、シングル−ヒット
(single−hit)多標的モデル[S=1−(−e-DlDO)
n]に適した。組換えヒトTNF−α(10単位/ml)(2:3X
106単位/mg)と(1000単位/ml)(アサヒ化学、ニュー
ヨーク:Asahi Chemical))濃度を照射24時間前に加え
た。
よび関連遺伝子に由来する。電離線の照射はc−junが
ん原遺伝子および関連するc−fosとjun−βの発現も制
御する。c−junのタンパク質産物は、転写因子のファ
ミリーメンバーに共通するDNA結合領域を含む。照射後
の発現レベルは投与依存性である。c−jun遺伝子はAP
−1タンパク質複合体の成分をコードし、これは種々の
細胞機能が関与する初期のシグナリングにおいて重要で
ある。AP−1はがん原遺伝子c−junの産物であり、特
異的DNA配列を認識し、これと結合し、特定の成長因子
とホルボールエステルに応答する遺伝子の転写を刺激す
る(ボーマン(Bohmann)ら1987;アンゲル(Angel)ら1
988)。c−junがん原遺伝子の生成物は、高度に保存さ
れたjun−β,jun−D,c−fos,fos−β,fra−1および酵
母GCN4タンパク質を含む哺乳類転写因子のファミリーに
共通なDNA結合性ドメインを含有する。
un転写体は照射された細胞中で不安定なタンパク質によ
り転写後分解される。遺伝子の発現の転写後の制御は、
シャーマン(Sherman)ら、1990に記載されている。
に基づく予想に反して、線量率の減少(例えば14.3Gy/
分から0.67Gy/分)は、c−jun転写物の誘導の上昇に関
連していた。
電離線の効果。
細胞で行った全細胞RNAレベルのノーザンブロット分
析。ハイブリダイゼーションは32P−標識c−junまたは
アクチンDNAプローブを使用した。(B)HL−60細胞
は、指示した電離線の線量で処理した。RNAを3時間後
に単離し、32P標識c−junまたはβ−アクチンDNAプロ
ーブで行った。標識HL−60のカラムは、未処理細胞から
のRNAを表す。標識HL−60のカラムは、未処理細胞から
のRNAを表す。
された(図6B)。
球性白血病(図7A)および正常ヒトAG−1522二倍体繊維
芽細胞(図7B)においても観察された。AG−1522細胞の
電離線処理もまた、より少ない3.2kb c−jun転写物の出
現と関連していた。
単球性白血病細胞(両方ともアメリカンタイプカルチャ
ーコレクションから)およびAG−1522包皮繊維芽細胞
(国立加齢細胞保存研究所、カムデン、ニュージャージ
ー)を標準法で増殖させた。細胞は0.35−mm Cuフィル
ターを装備したフィリップRT 250アクセレーターを250k
V,14mAで、またはガンマセル1000(カナダのオーミック
エナジー、オタワ)でデンシトメトリーで決定したよ
うに14.3Gy/分の固定投与量の発する137Csのいずれかを
使用して照射された。対照細胞は、照射なしで同様な条
件下においた。
に単離した。RNA(レーン当たり20μg)をアガロース
/ホルムアルデヒドゲル中で分離し、ニトロセルロース
フィルターに写し取り、次の32P−標識DNAプローブとバ
ブリダイズさせた:(i)1.8−キロベース(kb)BamH
I/EcoR I c−jun cDNA(30);(ii)エキソン3および
4を含む0.91−kb Sca I/Nco I c−fos DNA(31);(i
ii)p465.20プラスミドから単離された1.8kb EcoR I ju
n−B cDNA(32);そして(iv)pA1から精製した2.0−k
b Pst I β−アクチンcDNA(33)。オートラジオグラム
は、LKBウルトラスキャンXLレーザーデンシトメーター
を使用し、LKBゲルスキャンXLソフトウェアパッケージ
を使用して分析した。c−junハイブリダイゼーション
の強度は、β−アクチン発現に対して標準化された。
時間後に単離した。新たに伸長した32P−標識RNA転写物
を、次の制限酵素で処理した後の種々のクローン化挿入
物を含有するプラスミドDNAとハイブリダイズさせた:
(i)ニワトリβ−アクチンpA1プラスミドの2.0−kb P
st I断片(陽性対照);(ii)ヒトβ−グロビン遺伝子
の1.1−kb BamH I挿入物(陰性対照、34参照);および
(iii)pBluescript SK(+)プラスミドからのヒトc
−jun DNAの1.8−kb BamH I/EcoR I断片。消化したDNA
を1%アガロースゲルで泳動し、サザンの方法によりニ
トロセルロースフィルターに写し取った。ハイブリダイ
ゼーションを、ハイブリダイゼーション緩衝液1mlあた
り107cpmの32P−標識RNAで42-℃で72時間行った。オー
トラジオグラフィーを3日間行い、オートラジオグラム
をすでに記載したようにスキャンした。
(JUN、EGR1)に対するごく初期の応答の各種クラスへ
のmRNA発現が増加した。シクロヘキシミドとあらかじめ
インキュベーションすると、X線照射した細胞内でJUN
とEGR1の超誘導が見られた。照射前にTPAで長期に刺激
するか、あるいはプロテインキナーゼ阻害剤H7によって
プロテインキナーゼC(PKC)活性を阻害すると、EGR1
およびJUN転写物の増加が減衰した。これらのデータ
は、EGR1およびJUNが放射線障害に対する細胞性応答に
おける単一のトランスデューサーであることを意味し、
この効果がプロテインキナーゼC(PKC)依存経路によ
って部分的に仲介されることを示唆する。
種のプロモーター領域のAP1部位に結合することにより
転写を制御する[キュラン(Curran)およびフランザ
(Franza)、1988参照]。JUNおよびFOS遺伝子がヒト骨
髄白血病細胞中でX線暴露により誘導されることは、電
離線に対する細胞応答に核のシグナルトランスデューサ
ーが関与していることを示唆する。
も知られる)[クリスティ(Christy)ら、1988;ミルブ
ラント(Milbrant)、1987;レメーレ(Lemaire)ら、19
88;リム(Lim)ら、1987]は、ウイルムス(Wilms)の
腫瘍感受性遺伝子[ゲスラー(Gessler)、1990]中の
対応するドメインと特に相同なCys2−His2ジンクフィン
ガーモチーフをもつ核リンタンパク質をコードする。EG
R1タンパク質は亜鉛依存的にDNA配列CGCCCCCGCと高親和
性で結合する[クリスティ(Christy)およびナサンズ
(Nathans)、1989;カオ(Cao)、1990]。EGR1は組織
損傷中に誘導されるごく初期の遺伝子を表し、細胞増殖
および分化におけるシグナル形質導入に関与する。
のドゥノボ合成の非存在下で迅速かつ一時的に発現され
る。EGR1およびJUNはX線照射に続くシグナル形質導入
に最も関与するらしい。TPAおよびH7によるPKCの抑制調
節は、電離線によるEGR1およびJUN遺伝子誘導の減衰と
関連し、これはPKCの活性化とそれに続くEGR1およびJUN
遺伝子の誘導が、電離線損傷に対する哺乳動物細胞の表
現型応答を開始させるシグナルを送ることになることを
示唆する。
出可能なレベルのEGR1およびJUN転写物を示した。これ
とは対照的に、照射細胞では線量依存的にEGR1の発現が
増加した。3Gy後のレベルは低いけれども検出可能なレ
ベルであり、10および20Gy後には線量依存的に増加し
た。転写物が容易に検出できるように、遺伝子発現の経
時的変化を試験するには20Gyを用いた。この経時的試験
ではトリパン染料排除試験で検定したところ、細胞は生
存し続けた。EGR1およびJUNのmRNAレベルの経時的増加
が観察された。照射30分までに、SQ−20B細胞がEGR1お
よびJUNの発現において同等の増加を示し、これは3時
間以内にベースラインに戻った。対照的に、EGR1転写物
のレベルは3時間経っても基準値以上であったが、JUN
はAG1522において1時間で増加し、3時間で基準値に戻
った。293細胞でJUNレベルは6時間まで増加したが、EG
R1は3時間で増加して6時間までに基準値に戻った。
与しているのか否かを決定するために、X線暴露後の細
胞系統293およびSQ−20Bを用いて、CHIによるタンパク
質合成阻害の効果を研究した。CHI処理のみではEGR1に
おいて低いが検出可能な増加となり、JUN転写物は7Sに
正常化した。CHIの非存在下ではEGR1およびJUNの発現は
ベースラインに戻った。これとは対照的に、CHIで前処
理したSQ−20B細胞は3時間でEGR1が持続的に増加した
が、293細胞では照射後6時間でJUN mRNAの持続的増加
が見られ、これはこれらの転写物の超誘導を示唆する。
の後に経時的かつ線量依存的に増加した。電離線による
EGR1およびJUN誘導の重要性は、PDGFアルファ鎖のX線
誘導が血管性内皮細胞の増殖を刺激するという最近の知
見[ウイッテ(Witte)ら、1989]によって支持されて
いる。PDGFはAP−1およびEGR1結合ドメインをもち、一
方TNFはAP−1およびEGR1標的配列に似た要素をもつ
[ロースマン(Rorsman)ら、1989;エコノモウ(Econom
ou)ら、1989]。PDGFおよびTNFのX線誘導はEGR1およ
びJUNによって制御されていると思われる。
を抑制調節し、次いでTPA、血清、またはX線(20Gy)
で刺激した。対照として、TPAによる前処理なしのX
線、TPA前処理なしのTPA(50nM)および非処理細胞を含
む。1時間後にRNAを単離してEGR1にハイブリダイズし
た。SQ−20B細胞を100μM H7[1−(5−イソキノリ
ニルスルフォニル)−2−メチルピペラジン]または10
0μM HA1004(N−[2−メチル−アミノ]エチル)
−5−イソキノリンスルフォンアミド、Seikagaku Ame
rica,Inc.,St.Petersberg,FL)とともに30分間プレイン
キュベートするか、またはTPAで40時間前処理(1μ
M)して次いで20GyのX線照射を行った。同じ条件であ
るが、阻害剤の非存在下で処理した陽性対照細胞も20Gy
の照射を行ったが、陰性細胞はH7もX線照射も行わなか
った。阻害剤なしで20Gy照射の1時間後にRNAを抽出し
た。EGR1または7Sにノーザンブロッティングをハイブリ
ダイズした。上記阻害剤で前処理した293細胞を照射
し、3時間後にRNAを抽出し、JUNおよび7Sプローブにノ
ーザンブロッティングをハイブリダイズした。
療、並びに治療用X線のためのプロトコル 頭部および頸部腫瘍をもつ患者の治療には以下の工程
を用いた: 1.図1または図2に示す一般式の遺伝的構築物を用意す
る。
り、これはlacリプレッサーが結合するDNA配列とカップ
リングしており、かつ腫瘍壊死因子の遺伝子とカップリ
ングしている。この構築物を本実験の目的では“構築物
A"と呼ぶ。
入れる(図3参照)。
をもつレトロウイルスで感染する。この細胞は頭部およ
び頸部にある悪性細胞に向かうはずである。
術を提供し、あるいは本明細書で使用する方法、技術お
よび/または組成物を教示する限りにおいて、参照とし
て本明細書に包含される。
Claims (10)
- 【請求項1】放射線応答性のEgr−1エンハンサー−プ
ロモーター領域と、該エンハンサー−プロモーターによ
り制御される少なくとも一つの構造遺伝子からなる領域
を含む遺伝構築物であって、組織中の細胞または組織へ
と移動する細胞に送達され、そして構造遺伝子発現に効
果的な線量の電離線が組織に暴露されることにより、細
胞中で少なくとも一つの構造遺伝子を発現させるのに使
用される遺伝構築物。 - 【請求項2】構造遺伝子領域が、腫瘍壊死因子、リシン
およびストレプトキナーゼの少なくとも一つを発現する
遺伝子からなる、請求項1記載の構築物。 - 【請求項3】構造遺伝子領域が、DNA結合性ドメイン、
リプレッサー遺伝子、該リプレッサーの結合領域および
構造遺伝子からなる、請求項1記載の構築物。 - 【請求項4】線量が150から300ラドである、請求項1記
載の構築物。 - 【請求項5】線量が約200ラドである、請求項4記載の
構築物。 - 【請求項6】組織が代謝欠損の特徴を有する、請求項1
記載の構築物。 - 【請求項7】放射線応答性のEgr−1エンハンサー−プ
ロモーター領域および細胞に送達されるべき構造遺伝子
を含むベクターであって、上記の領域および構造遺伝子
は宿主の組織に由来し、そして、ベクターをインビトロ
において細胞に送達し;細胞を宿主に再導入し;そして
有効な発現誘導線量の照射に組織を暴露することにより
ベクター内で構造遺伝子を活性化することにより、宿主
内で構造遺伝子を発現するために使用されるベクター。 - 【請求項8】放射線照射を約200ラドで行う、請求項7
記載のベクター。 - 【請求項9】放射線応答性Egr−1エンハンサー−プロ
モーター領域と構造遺伝子を含むベクター。 - 【請求項10】発現すべき構造遺伝子と電離線により誘
導可能な哺乳類遺伝子のEgr−1プロモーター−エンハ
ンサー領域を含む遺伝構築物であって、該遺伝構築物に
構造遺伝子発現を誘導するのに十分な線量の電離線を照
射することにより構造遺伝子の発現が制御される遺伝構
築物。
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- 1995-06-07 US US08/486,338 patent/US5817636A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
Title |
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Proceedings of the American Association for Cancer Research,Vol.31(Mar.1990),p.13 |
Proceedings of the American Association for Cancer Research,Vol.31(Mar.1990),p.75 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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