CN103484470A - 管状蠕虫半乳糖凝集素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

管状蠕虫半乳糖凝集素及其制备方法，涉及管状蠕虫半乳糖凝集素基因的核苷酸序列以及其所编码的氨基酸序列。通过提取管状蠕虫Ridgeia piscesae的总RNA，进行逆转录，通过引物扩增和鉴定了半乳糖凝集素基因rpgal。通过pET-His构建了重组原核表达载体，在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白表达，纯化后的蛋白纯度高、活力好，为该蛋白的实际应用提供了基础。通过同源重组表达半乳糖凝集素，可以克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、农业等研究领域奠定基础。

Description

管状蠕虫半乳糖凝集素及其制备方法

技术领域

本发明涉及管状蠕虫（Ridgeia piscesae）半乳糖凝集素基因的核苷酸序列以及其所编码的氨基酸序列，尤其是涉及管状蠕虫（Ridgeia piscesae）半乳糖凝集素及其制备方法。

背景技术

凝集素是自然界广泛存在的一类选择性识别糖结构并与其非共价结合的蛋白质，根据来源可分为动物凝集素、植物凝集素和微生物凝集素。半乳糖凝集素（Galectin)是动物凝集素家族中的一员，存在于多种动物体内，参与细胞粘附、生长调节和免疫反应等多种生物学过程。到目前为止，已在多种脊椎、无脊椎动物中发现多个半乳糖凝集素家族成员。从哺乳动物体内克隆得到的共14个成员，按结构不同分为3类：单一型、串联重复型、嵌合型。这些成员在结构上均具有保守的糖识别结构域（CRD），并对β-半乳糖苷有特殊亲和力，在机体的多种生理和病理过程中发挥重要作用。研究发现，从海洋无脊椎动物中发现的多种凝集素，它们不仅作为一种非特异性识别因子，识别自身和异己成分；还具有凝集细胞，抑制肿瘤细胞增殖，抑制血小板凝集，细胞毒性，催化活性等作用。

深海热液区的环境特征是：黑暗、高压、氧浓度低、寡营养以及温度、盐度、pH值等急剧变化。在如此恶劣的生活环境下，使得以管状蠕虫为代表的热液区生物具备了适应极端环境的特殊机制（如耐盐性、耐高温、耐高压和高渗透性等）。独特的适应性机制，使其在生理代谢过程中形成了各种生物活性物质，与陆地资源相比更具特殊性，是极具潜在应用价值的资源。

发明内容

本发明的第一个目的是提供管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因；

本发明的第二个目的是提供管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素蛋白序列；

本发明的第三个目的是提供管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素；

本发明的第四个目的是提供管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的制备方法。

本发明的第五个目的是提供管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RpGal在生物学活性分析中的应用。

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因，其编码管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的核苷酸序列，记作rpgal。

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因rpgal的分子类型为DNA，序列特征：长度为1092bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因rpgal的序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

1      ATGATGAACG CACCAGGAAT GGCTGTCAGA CCAGAAACCG TTATCATAAA CCCACCAATT

61     CCATACAATG GACAAATCCC AAGCTTAAAA GTTGACTCCT TGATTACGAT ACAAGGGACT

121    ATATCTCCCA ATGTGCAGAG GTTCGCCATC AACCTGAGCA CGTCAGCGCT GCCGAACTGC

181    GACATTGCAC TCCACGTGAA TCCTCGTTTT GAGGGGACAT TCGTCATTGT GCGGAACACT

241    TACAAACAGG GCAACTGGGG TGATGAGGAG AGGGATGGAC CCTCTTTCCC CCTCATGCCG

301    GGCACCCCCT TCAACTGTAG CATTCTTGTG ACAAATGAAT GTTACAAGAT TGCGTTCAAC

361    AGCGTCCATT TCTGTGACTA CGCTCATCGG GTCAACAAAG ACCTTGTGAG CTACATCTCA

421    ATCAGTGGTG ACGTCAACCT GGCTAACATC AGCATCAAAG GAAACAAAGA GGTGTCACAG

481    ATAGGCATGG CTGCCTTCAT GCCTCAGGCC AATTCCCCGC CCCCACCGTA TTCACCATAT

541    TCACACCCAG GGATGGCACC AGGAATGCCA CCACACCCAG GGATGGCACC AGGAATGCCA

601    CCACACCCAG GGATGGCACC AGGAATGCCA CCACACCCAG GGATGGCACC GGGAATGGCA

661    CCCGGAATAG GGGCAATGGT GTACCCCCCT TCACCCCCTG CAGTGCCATA TTCTGCCCCC

721    TTTCCTGGTG GTATGCGGGT CGGGTGCATG ATCTTCATCA GTGGAAAAGT AAAGAAGTCG

781    CCAGACAAAT TTGCTGTTGA CCTGCTGTTT GAGGGAGGTA TTGCCTTCCA TTTCAACCCA

841    CGATTGAACG GATCTGTCGT TGTCTGTAAC ACGCTGGAGG GCGACAACTG GGGACCAGAA

901    GAGCGAACCA GCACGTTCCC CTTCAAAGCT CAGGAGAATT TTGAGATCAT AATCATGTGC

961    GAGCAGGACA AATTTAAGGT GGCTGTCGGT GGGCGCCATC TACTGGAATA CAAGCATCGC

1021   ATCCCGTACC AAACTGTGAC AAAGTTCAGC ATCCATGGCG ACATCAGCCT TACACATGTC

1081   CGCGTCCAAT GA。

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因，其核苷酸序列采用以下方法获得：提取管状蠕虫Ridgeia piscesae的RNA，并将RNA反转录成cDNA，进一步以cDNA为模板，经PCR扩增得到SEQ ID No.1的序列；相关的核苷酸序列通过预测获得基因编码的多肽SEQ ID No.2，然后进行原核表达载体构建获得重组表达蛋白。

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素包括具有凝集活性的管状蠕虫Ridgeiapiscesae半乳糖凝集素RPGAL。

本发明所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因的核苷酸序列可采用以下方法获得：提取管状蠕虫Ridgeia piscesae的RNA，并将RNA反转录成cDNA，进一步以cDNA为模板，分别以合成序列SEQ ID No.3，SEQ ID No.4作为引物，经PCR扩增得到了SEQ IDNo.1的序列。然后通过重组表达rpgal基因，纯化rpgal基因的表达产物，生物学方法证明rpgal基因编码的多肽（SEQ ID No.2）具有半乳糖凝集素活性；

所述合成序列SEQ ID No.3：CGCGGATCCATGATGAACGCACCAGGAATGGCTG；

所述合成序列SEQ ID No.4：CTAGCTAGCTCATTGGACGCGGACATGTGTAAGG;

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RPGAL的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为363aa，类型为氨基酸，所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RPGAL的序列如下所示，记为SEQ ID No.2：

1      MMNAPGMAVR PETVIINPPI PYNGQIPSLK VDSLITIQGT ISPNVQRFAI NLSTSALPNC

61     DIALHVNPRF EGTFVIVRNT YKQGNWGDEE RDGPSFPLMP GTPFNCSILV TNECYKIAFN

121    SVHFCDYAHR VNKDLVSYIS ISGDVNLANI SIKGNKEVSQ IGMAAFMPQA NSPPPPYSPY

181    SHPGMAPGMP PHPGMAPGMP PHPGMAPGMP PHPGMAPGMA PGIGAMVYPP SPPAVPYSAP

241    FPGGMRVGCM IFISGKVKKS PDKFAVDLLF EGGIAFHFNP RLNGSVVVCN TLEGDNWGPE

301    ERTSTFPFKA QENFEIIIMC EQDKFKVAVG GRHLLEYKHR IPYQTVTKFS IHGDISLTHV

361    RVQ。

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素，其蛋白具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽；或将SEQ ID No.2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似功能的多肽。

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的制备方法，包括以下步骤：

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae总RNA的提取的步骤；

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae cDNA反转录的步骤；

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的PCR扩增和序列分析的步骤；

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的重组表达的步骤。

所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RpGal可在生物学活性分析中应用。

本发明通过提取管状蠕虫Ridgeia piscesae的总RNA，进行逆转录，通过引物扩增和鉴定了半乳糖凝集素基因rpgal。通过pET-His构建了重组原核表达载体，在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白表达，纯化后的蛋白纯度高、活力好，为该蛋白的实际应用提供了基础。通过同源重组表达半乳糖凝集素，可以克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、农业等研究领域奠定基础。

附图说明

图1为RPGAL重组表达的SDS-PAGE电泳图谱。M:蛋白Marker；1：重组载体pET-His-rpgal在菌株BL21的诱导表达后超声破碎后上清；2：重组载体pET-His-rpgal在菌株BL21的诱导表达后超声破碎后包涵体；3：重组载体pET-His-rpgal在菌株BL21的诱导表达；4：重组载体pET-His-rpgal在菌株BL21的未诱导表达；5：空载体pET-His在菌株BL21的诱导表达对照。

图2为RPGAL表达纯化的SDS-PAGE电泳图谱。M:蛋白Marker；1：经钴柱介质纯化所得的目的蛋白RPGAL。

图3为温度对重组半乳糖凝集素RPGAL的影响图谱。横坐标表示不同温度；纵坐标表示凝集效价。

图4为pH对重组半乳糖凝集素RPGAL的影响图谱。横坐标表示不同pH；纵坐标表示凝集效价。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册（1、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：

1.管状蠕虫Ridgeia piscesae总RNA的提取

取100mg管状蠕虫Ridgeia piscesae组织样品，加入1mL TRI Reagent（MRC公司），用电动匀浆机彻底分散组织，室温静置5min裂解细胞；加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置10min；4℃，12000g离心15min；将上层液体转移至一新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃，12000g离心10min；倒去液体，加入1mL75%乙醇漂洗；4℃，7500g离心5min；倒去液体，RNA沉淀稍加干燥后溶于适量的DEPC处理过的水中；用紫外分光光度计测量总RNA在OD₂₃₀，OD₂₆₀，OD₂₈₀的吸光度，判定总RNA的浓度与纯度。

2.管状蠕虫Ridgeia piscesae cDNA反转录

在0.5mL离心管制备cDNA反转录反应液，包括2μg总RNA，1μL Oligo(dT)₂₀（50μM），1μL dNTP（10mM），用DEPC处理过的H₂O将总体积补至13μL；反应体系65℃处理5min，立即放入冰浴中1min；稍离心，加入下列组分：4μL5×First-Strand Buffer，1μLDTT（0.1M），1μL RNase Inhibitor（40U/μL）（TaKaRa公司）和1μL SuperScriptTM III reversetranscriptase（200U/μL）（Invitrogen公司）；反应体系轻弹混匀，稍离心；50℃温育60min；70℃处理15min终止反应。

3.管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因的PCR扩增和序列分析

以管状蠕虫Ridgeia piscesae cDNA为模板，用引物F和R扩增半乳糖凝集素rpgal基因。

F：CGCGGATCCATGATGAACGCACCAGGAATGGCTG（SEQ ID No.3）；

R：CTAGCTAGCTCATTGGACGCGGACATGTGTAAGG（SEQ ID No.4）；

划线部分GGATCC代表BamH I酶切位点，GCTAGC代表Nhe I酶切位点。

在20μL的反应体系中含1μL模板，1μL引物F（20μM），1μL引物R（20μM）,1.5μL dNTP（各2.5mM），4μL5×PrimerSTAR^TM Buffer，0.2μL PrimerSTAR^TM HS DNAPolymerase（2.5U/μL）（TaKARa公司），用H₂O将总体积补至20μL。PCR反应条件为：98℃10s、60℃15s、72℃70s（30cycles）；4℃保存。PCR产物经纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，菌落PCR后选取有DNA片段的阳性克隆测序。

根据扩增获得的核苷酸序列推导出RPGAL的氨基酸序列，即含有363个氨基酸的多肽，其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。

4.管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因的表达和纯化

将含有rpgal基因的质粒用BamH I和Nhe I酶切，胶回收rpgal基因片段，同时将质粒pET-His也用相同的酶进行酶切。将两者连接过夜（12～16h）。连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞TOP10中，提取质粒，测序验证。

将测序正确的质粒pET-His-rpgal转化BL21，37℃生长15小时后菌落PCR验证质粒转化的正确性。挑选转化正确的菌落，接种到5mL含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇培至A₆₀₀＝0.5时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1mM，30℃诱导7～8h，将菌液收集至200mL的离心管中，5000g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在30mL磷酸缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液，300mM氯化钠，pH=7.4）中，超声波处理至菌液成半透明，再18000g离心20分钟，上清与预先用磷酸缓冲液平衡的His介质Metal Affinity Resins（Takara公司）混匀，4℃结合20min，纯化过程按照纯化试剂盒说明进行。纯化的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳分析，其纯度达90％以上（参见图1和2）。

5.重组半乳糖凝集素RPGAL的生物学活性分析

5.1.RPGAL对不同动物血细胞的凝集活性分析

采集不同动物的血液，按血液：抗凝剂=1:4体积混匀，4℃条件下1000g离心5分钟弃上清，将血细胞用TBS（10mM Tris,150mM NaCl,pH=7.4)温和洗涤3～4次后，配成1%（v/v）细胞悬液，放于4℃保存备用。在96孔凝集板中，第1孔加入25μl重组的半乳糖凝集素，然后分别用TBS和TBS-Ca（10mM Tris,150mM NaCl,10mM CaCl₂，pH=7.4)溶液将样品倍比稀释至第12孔，浓度分别为2^-1～2^-12倍，同时用TBS和BSA作为阴性对照；每孔加入25μl血细胞悬液，轻弹板框混匀，室温静置1h后观察凝集效果（参见表1）。

表1

表1为重组蛋白RPGAL对不同动物血细胞的凝集活性分析。表1中显示的数值结果为RPGAL的最小凝集浓度。可以看出RPGAL对家兔血细胞的凝集作用最强，其最小凝集浓度为1.6μg/ml。说明：Ca+：凝集体系含Ca²⁺，浓度为10mM；Ca-：凝集体系不含Ca²⁺。RPGAL的最高浓度为206μg/ml。

5.2.不同糖类对RPGAL凝集小鼠血细胞的抑制作用分析

预先使用TBS配制好初始浓度为100mM的各类糖（脂多糖、肽聚糖、酵母多糖为1mg/ml）。在96孔凝集板中，将不同糖用TBS倍比稀释后（20μl/孔），每孔加入等体积的RPGAL样品，轻弹混匀，室温反应15～20min，然后加入40μl血细胞悬液，混匀后，室温1h后观察凝集效果（参见表2）。

表2为不同糖类对重组蛋白RPGAL凝集小鼠血细胞的抑制作用分析。表2中显示的数值结果为糖的最小抑制浓度。可以看出乳糖和脂多糖的最小抑制浓度分别为12.5μg/ml和0.004μg/ml。说明：实验的糖的最高浓度为100mM（其中，脂多糖、肽聚糖和酵母多糖为1.0mg/ml）；RPGAL的作用浓度为25.75μg/ml；“---”表示在试验浓度范围内未观察到凝集抑制作用。

表2

5.3.RPGAL对不同微生物的凝集活性分析

将微生物划线，培养过夜后挑取单个菌落接种于液体培养基中，37℃，振荡培养过夜；按1:100体积比接种5ml液体培养基中，37℃振荡培养至OD=0.6；4℃下4000g离心5min，然后用TBS温和洗涤3次，重悬于TBS中；在96孔凝集板中，用TBS和TBS-Ca分别倍比稀释RPGAL样品，30μl/孔；然后每孔加入30μl微生物悬液，混匀室温静置1h后显微镜观察凝集效果（参见表3）。

表3

表3为重组蛋白RPGAL对不同微生物的凝集活性分析。表3中显示的数值结果为RPGAL的最小凝集浓度。说明：Ca+：凝集体系含Ca²⁺，浓度为10mM；Ca-：凝集体系不含Ca²⁺；RPGAL最高浓度为206μg/ml；“---”表示在试验浓度范围内未观察到凝集作用。

5.4.温度对重组半乳糖凝集素RPGAL的影响

首先将RPGAL样品分别在温度为10℃到100℃的10个温度梯度水浴中处理1h，然后将处理好的样品，室温冷却后，在96孔凝集板中使用TBS进行倍比稀释，30μl/孔；再在每孔中加入30μl小鼠红细胞悬液，轻弹混匀，室温1h后观察凝集效果（图3）。

5.5.pH对重组半乳糖凝集素RPGAL的影响

在96孔凝集板中，将RPGAL样品使用TBS倍比稀释，20μl/孔；然后取20μl不同PH的缓冲液（pH为4～11，共8个梯度），分别加入相应的孔中，室温静置1～2h；最后加入40μl小鼠红细胞悬液，室温混匀并静置1h后观察凝集效果（图4）。

Claims (8)

1.管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因，其特征在于编码管状蠕虫Ridgeiapiscesae半乳糖凝集素的核苷酸序列，记作rpgal。

2.如权利要求1所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因，其特征在于所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因rpgal的分子类型为DNA，序列特征：长度为1092bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因rpgal的序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

1      ATGATGAACG CACCAGGAAT GGCTGTCAGA CCAGAAACCG TTATCATAAA CCCACCAATT

61     CCATACAATG GACAAATCCC AAGCTTAAAA GTTGACTCCT TGATTACGAT ACAAGGGACT

121    ATATCTCCCA ATGTGCAGAG GTTCGCCATC AACCTGAGCA CGTCAGCGCT GCCGAACTGC

181    GACATTGCAC TCCACGTGAA TCCTCGTTTT GAGGGGACAT TCGTCATTGT GCGGAACACT

241    TACAAACAGG GCAACTGGGG TGATGAGGAG AGGGATGGAC CCTCTTTCCC CCTCATGCCG

301    GGCACCCCCT TCAACTGTAG CATTCTTGTG ACAAATGAAT GTTACAAGAT TGCGTTCAAC

361    AGCGTCCATT TCTGTGACTA CGCTCATCGG GTCAACAAAG ACCTTGTGAG CTACATCTCA

421    ATCAGTGGTG ACGTCAACCT GGCTAACATC AGCATCAAAG GAAACAAAGA GGTGTCACAG

481    ATAGGCATGG CTGCCTTCAT GCCTCAGGCC AATTCCCCGC CCCCACCGTA TTCACCATAT

541    TCACACCCAG GGATGGCACC AGGAATGCCA CCACACCCAG GGATGGCACC AGGAATGCCA

601    CCACACCCAG GGATGGCACC AGGAATGCCA CCACACCCAG GGATGGCACC GGGAATGGCA

661    CCCGGAATAG GGGCAATGGT GTACCCCCCT TCACCCCCTG CAGTGCCATA TTCTGCCCCC

721    TTTCCTGGTG GTATGCGGGT CGGGTGCATG ATCTTCATCA GTGGAAAAGT AAAGAAGTCG

781    CCAGACAAAT TTGCTGTTGA CCTGCTGTTT GAGGGAGGTA TTGCCTTCCA TTTCAACCCA

841    CGATTGAACG GATCTGTCGT TGTCTGTAAC ACGCTGGAGG GCGACAACTG GGGACCAGAA

901    GAGCGAACCA GCACGTTCCC CTTCAAAGCT CAGGAGAATT TTGAGATCAT AATCATGTGC

961    GAGCAGGACA AATTTAAGGT GGCTGTCGGT GGGCGCCATC TACTGGAATA CAAGCATCGC

1021   ATCCCGTACC AAACTGTGAC AAAGTTCAGC ATCCATGGCG ACATCAGCCT TACACATGTC

1081   CGCGTCCAAT GA。

3.如权利要求1所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素基因，其特征在于其核苷酸序列采用以下方法获得：提取管状蠕虫Ridgeia piscesae的RNA，并将RNA反转录成cDNA，进一步以cDNA为模板，经PCR扩增得到SEQ ID No.1的序列；相关的核苷酸序列通过预测获得基因编码的多肽SEQ ID No.2，然后进行原核表达载体构建获得重组表达蛋白。

4.管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素，其特征在于包括具有凝集活性的管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RPGAL。

5.如权利要求4所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素，其特征在于所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RPGAL的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为363aa，类型为氨基酸，所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RPGAL的序列如下所示，记为SEQ ID No.2：

1      MMNAPGMAVR PETVIINPPI PYNGQIPSLK VDSLITIQGT ISPNVQRFAI NLSTSALPNC

61     DIALHVNPRF EGTFVIVRNT YKQGNWGDEE RDGPSFPLMP GTPFNCSILV TNECYKIAFN

121    SVHFCDYAHR VNKDLVSYIS ISGDVNLANI SIKGNKEVSQ IGMAAFMPQA NSPPPPYSPY

181    SHPGMAPGMP PHPGMAPGMP PHPGMAPGMP PHPGMAPGMA PGIGAMVYPP SPPAVPYSAP

241    FPGGMRVGCM IFISGKVKKS PDKFAVDLLF EGGIAFHFNP RLNGSVVVCN TLEGDNWGPE

301    ERTSTFPFKA QENFEIIIMC EQDKFKVAVG GRHLLEYKHR IPYQTVTKFS IHGDISLTHV

361    RVQ。

6.如权利要求5所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素，其特征在于所述蛋白具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽；或将SEQ ID No.2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相似功能的多肽。

7.如权利要求4所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae总RNA的提取的步骤；

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae cDNA反转录的步骤；

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的PCR扩增和序列分析的步骤；

一个管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素的重组表达的步骤。

8.如权利要求4所述管状蠕虫Ridgeia piscesae半乳糖凝集素RpGal在生物学活性分析中的应用。

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