CN100535115C - 文昌鱼半乳糖凝集素AmphiGAL13基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及文昌鱼AmphiGAL13基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备一种新的生物黏附剂的应用。本发明通过cDNA文库构建和大规模测序的方法，从文昌鱼消化道中分离得到文昌鱼AmphiGAL13基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的蛋白(P_GAL13)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本发明通过GST融合表达重组文昌鱼GST-P_GAL13蛋白，经EK酶消化后得到的具有凝集素的一般功能，能够作为一种天然的小分子的生物黏附微粒制剂的开发和应用。

Description

文昌鱼半乳糖凝集素AmphiGAL13基因及其应用

技术领域

本发明涉及文昌鱼半乳糖凝集素(AmphiGAL13)基因及其编码的蛋白P_GAL13，以及该蛋白作为一种潜在的生物黏附微粒制剂的应用。

背景技术

文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)，属于脊索动物门(Chordata)，头索动物亚门(cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，也是脊椎动物祖先的模型，是海洋中较原始的动物类。

凝集素是一种结合特异糖类的蛋白质或糖蛋白。凝集素介导的生物黏附现象是由“凝集素-糖基”相互作用产生的。这种相互作用可以分为两类：(1)外源性凝集素与内源性糖基结合。上皮细胞表面具有多糖蛋白复合物的细胞，因此在其表面可以暴露许多糖残基。凝集素是一种蛋白质或非免疫源性糖蛋白，可以特异性识别糖分子，与糖基化膜成分结合，再通过结合的特异性黏附配体把生物信号传达给细胞进行胞吞或胞饮。这种相互作用不仅导致黏附，而且使其通过不同的途径内化(溶酶体或非溶酶体)。(2)内源性凝集素与外源性糖基结合。机体本身所含凝集素能与外来的糖基特异性结合，原理与第一类相似。目前药剂学上应用较多的为第一类。

不同的凝集素具有不同的配体，相应具有不同的作用位点。凝集素的作用部位主要在M细胞和肠细胞。这些细胞抗原结构的特异性和强的胞饮能力使其在吸收大分子和微粒方面很有效。而且作用点是药物特定的吸收窗或局部病变区域，如某些癌细胞分泌的非正常糖蛋白具有特异的糖基，有利于凝集素发挥作用。凝集素作为一种生物黏附剂开发有较大的前景。关于凝集素介导的黏附微粒给药体系在鼻腔、口腔和眼部的应用都已有报道动物。实验结果表明，利用凝集素产生的黏附性可以提高鼻腔给药的有效性。Nicholls等证实凝集素能与在体小鼠眼球表面上皮细胞快速、稳定地结合(结合的时间在10秒之内)。Schaeffer等进一步证实凝集素介导的药物给药体系能有效的穿过角膜上皮层。这些结果都清楚地表明，适当结合凝集素可延长药物在眼球表面的停留时间而提高药物吸收。在凝集素众多的给药系统中，对胃肠道给药系统的研究最为深入。凝集素经胃肠道给药后，体内会产生一种受体介导的内吞作用，总体上有三大优点：(1)凝集素的特异结合活性能延长微粒在肠内的滞留时间，包裹的药物能从骨架内缓慢释放，生物利用度提高；(2)凝集素的特异结合活性能将微粒靶向至肠道上皮细胞的特定位点，然后药物通过凝集素介导的内吞被细胞内化，对靶点上皮细胞产生效应，这是将水溶性药物靶向肠道癌细胞的理想方式；(3)受体介导的内吞导致了药物的胞饮作用和胞吞转运作用，可用于提高水溶性多肽、蛋白类药物的吸收。

生物黏附给药系统是近年发展较快的新给药系统，凝集素介导的生物黏附微粒给药系统又是进入20世纪90年代以后该给药系统的一种新拓展。这一给药系统在改善吸收差、体内不稳定药物特别是肽类、蛋白质和疫苗的生物利用度方面具有重要意义。其不仅可以防止蛋白类药物被蛋白分解酶降解，而且可以增加大分子药物透过上皮细胞层进入血循环的量。

凝集素微粒给药系统要成为一个成熟的给药系统尚有许多问题有待解决。目前就凝集素本身而言，一个较有前景的研究方向是设计合成一些分子结构更小、毒性和免疫源性更低、但又保持凝集素活性部位的凝集素类似物。

文昌鱼是一种介于脊椎动物和无脊椎动物之间的过渡的一种生物，它既保留了无脊椎动物的一些特性，又具有脊椎动物的某些特点。在文昌鱼中发现的半乳糖凝集素分子已经具有了脊椎动物凝集素分子的基本结构和凝集活性，而相对于脊椎动物而言分子结构比较原始，毒性和免疫源性更低，作为一种的天然的生物黏附微粒制剂进行开发利用具有很大的开发前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的文昌鱼AmphiGAL13基因及其编码的蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述基因的P_GAL13蛋白作为一种新型的生物黏附微粒制剂的利用。

本发明通过cDNA文库的构建和大规模测序的方法，从文昌鱼消化道中分离得到消化道AmphiGAL3基因，其DNA序列如序列表<400>1序列所示。

上述本发明基因AmphiGAL13所编码的蛋白(命名为P_GAL13)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；等电点为8.68，分子量为16,985道尔顿。

该蛋白通过表达载体pGEX-AmphiGAL13在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。

所述表达载体pGEX-AmphiGAL13是建立以谷胱甘肽转移酶为融合伴体，中间插入凝血酶和肠激酶识别位点的高效表达载体，该系统使P_GAL13在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。

本发明所选择的青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)采集于山东省沙子口水域。

青岛文昌鱼消化道cDNA文库的构建：提取消化道总RNA，通过反向PCR合成一链DNA，然后通过LD-PCR合成双链DNA，经Sfi I酶切后，与pcDNA3.0连接转化E.coli，构建cDNA文库。

本发明通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码文昌鱼Galectin的克隆，命名为AmphiGAL13(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码154个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为8.68，分子量为16,985道尔顿，具有保守的Galectin与结合的活性位点。

本发明还提供了融合蛋白的表达方法，包括步骤(1)重组表达载体pGEX-AmphiGAL13的构建；(2)将pGEX-AmphiGAL13转化大肠杆菌BL21(DE3)；(3)对转化的大肠杆菌BL21(DE3)进行培养。具体为通过设计了一对引物，将编码新基因AmphiGAL13克隆到原核融合表达载体pGEX-4T上，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体pGEX-AmphiGAL13以GST为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，表达的GST融合蛋白可以通过glutathione-Sepharose亲和层析进行纯化。载体上含有凝血酶的酶切位点，由于本实验室构建有高效的肠激酶(EK)的生产系统，在所设计的上游引物含有EK酶的位点，都可以利于外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，P_GAL13融合蛋白的表达量较高，大部分处于可溶状态。

本发明还摸索和优化了重组P_GAL13蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经glutathione-Sepharose亲和色谱层析，得到融合蛋白，融合蛋白经EK酶切割和lacytosyl-sepharose亲和色谱层析，可得到纯度在90％以上的P_GAL13蛋白。

本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl₂的方法将质粒转化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100mg/L)的2×TY培养基培养转化菌株，碱法提取质粒。

附图说明

图1为本发明的文昌鱼PGAL13蛋白和其它物种Galectin蛋白的比较结果，其中“*”表示相同；“：”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同。

图2为文昌鱼消化道总RNA。

图3双链cDNA电泳结果。

图4为基因AmphiGAL13的重组表达质粒pGEX-AmphiGAL13构建图。

图5为重组PGAL13蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。1，经IPTG诱导的pGEX-AmphiGAL13菌体总蛋白；2，诱导菌超声上清总蛋白；3，诱导菌超声沉淀；4，5，6，7，分别为10mM的谷胱苷肽洗脱蛋白的纯化PGAL13。

图6为经不同剂量EK酶消化的成熟的PGAL13蛋白电泳图。2-7，为分别加入2-7μlEK酶消化GST-AmphiGAL13融合蛋白后成熟蛋白的得率，箭头所示处为得到的成熟的PGAL13。0，为不加入EK酶消化GST-AmphiGAL13融合蛋白的对照；GST示意用7μl EK酶消化GST蛋白的阴性对照。

图7为重组PGAL13成熟蛋白红细胞凝集活性检测。A，加入PGAL13蛋白的红细胞凝集为网状结构；B，加入PB的空对照红细胞没有发生凝集作用，而沉积在管底。

具体实施方式

以下实施将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：文昌鱼消化道总RNA的提取和cDNA的合成

总RNA的提取和cDNA合成；收集文昌鱼消化道，采用Trizol试剂法提取消化道总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质，获得文昌鱼消化道总RNA，其A₂₆₀/A₂₈₀＝1.828，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的18s和28s两条带，比值＞1(见图2)，表明总RNA完整性较好、纯度也较高。取1ug总RNA，以SMART III olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3′)进行逆转录合成第一链，得到10μl一链cDNA产物。

取2ulcDNA一链产物，以5’PCR Primer(5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)和3’PCR Primer(5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)为引物进行LD-PCR合成二链cDNA。

实施例2：文昌鱼消化道AmphiGAL13基因序列的测定和分析

将二链cDNA连接至pcDNA3.0载体(购自Invitrogen公司)，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了编码全长AmphiGAL13基因的EST序列，基因长度都是465bp，编码154个氨基酸的Galectin蛋白，是1个新的Galectin蛋白。

用ClustalW分析软件，对已报导的人中的原型Galectin蛋白序列比较，结果如示。从图1可以看出，Galectin的糖识别结构域在所有Galectin中是较为保守的。

实施例3：重组PGAL13表达质粒的构建

依据AmphiGAL3基因的两端序列合成一对引物，上游引物含BamH I和Eenterkinase切割位点，下游引物含Not I切割位点。

上游引物(P1)：

5′-CG

ACGACGACGACAAAATGG CGT ACC CAG GAT T-3′；

BamH I    Eenterkinase

下游引物(P2)：

5′-ATA AGA ATTT ATG TGA AGC GGA TCT GCT-3′；

Not I

以含AmphiGAL 13基因的pcDNA3.0质粒(购自Invitrogen公司)为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在460bp左右。将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pGEX-4T上(购自Amersham Bioscience公司)，得到重组表达载体pGEX-AmphiGAL13(其构建过程如图4所示)。表达载体pGEX-AmphiGAL13中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含EK酶蛋白酶切割位点，以便切除融合伴侣GST。

实施例4：文昌鱼PGAL13融合蛋白的表达

将pGEX-AmphiGAL3转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNA TOOLS6.0预测的理论值44kD相符(图5)。

对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索得出。基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml氨苄抗性LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物10ml接种于1L的氨苄抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD₆₀₀＝0.6(扩大培养约4h)，加入100mM IPTG至终浓度分别为0.2mM，18℃，250rpm诱导培养20h后离心收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下PGAL13融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的70％以上，处于70％的可溶状态(图5)。

实施例五：重组文昌鱼PGAL13融合蛋白的纯化

将总菌体用50mM PB(pH6.8)洗涤，再用50mM PB(pH6.8)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Glutathione Sepharose亲和色谱层析纯化，SDS-PAGE分析融合蛋白的表达和层析的结果(图5)。从SDS-PAGE结果可以得出：GST-PGAL13能被Glutathione Sepharose柱所吸附，用10mM的谷胱苷肽(50mM Tris.cl，pH8.0)洗Glutathione Sepharose柱时，能把目的蛋白GST-PGAL13洗下(图5)。

重组蛋白的洗脱峰液过G25凝胶柱换50mM TB(pH8.0)，1mM CaCl₂ EK酶切缓冲液，然后，在37℃进行GST-P_GAL13融合蛋白的EK酶(1∶1000)酶切过夜，酶切后的蛋白(图6)溶液经G25换成Iactosyl sepharose柱的50mM PB(pH6.8)，4mM EDTA，8mM β-ME平衡缓冲液，进行lactosyl sepharose柱的上柱纯化。

实施例6：PGAL13重组蛋白红细胞凝集活性分析

取兔全血，用3.8％(M/M)构橼酸钠溶液抗凝，各抗凝血2000rpm离心十分钟除去血浆，加10倍体积的PB溶液(Ph6.8，4mM EDTA，8mM巯基乙醇β-ME)充分洗涤，然后经1000rpm离心3min去上清液，重复四次，最后经2500rpm离心3min，配成2％(V/V)的PB红细胞悬浮液。阴性对照为PB。活力测定在1.5ml离心管中进行.先在每管中加入的2％(V/V)的PB红细胞悬浮液，再往A管中凝集素蛋白样品，B管中假如PB，温和混匀，在室温下放置1-2h，肉眼观察。仅加入PB的红细胞不发生凝集则在管底沉积，而加入重组的PGAL13的离心管则发生了凝集，红细胞之间形成一似网络扩散的红斑块(图7)。

实施例7：PGAL13重组蛋白红细胞凝集活性及糖抑制活性分析

蛋白浓度测定用Bio-Rad Protein分析染色试剂测定，BSA为对照。兔红细胞处理如实施例6。活力测定在96孔V型血凝板中进行。先在每孔中加入25μl的PB溶液，再往第一孔中凝集素蛋白样品，混匀后再从第一孔中吸取25μl的溶液到第2孔，依此类摧倍比稀释。最后在每孔中加入25μl的红细胞悬浮液，混匀，在室温下放置1-2h，肉眼观察。记录引起细胞凝集所需的最小蛋白量。试验用的糖为D-果糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，乳糖以及蔗糖。每孔加入25μl的糖溶液，混匀后再从第一孔中吸取25μl的溶液到第2孔，依此类摧倍比稀释。最后在每孔中加入25μl的红细胞悬浮液，混匀，在室温下放置1-2h，肉眼观察。记录红细胞不发生凝集作用的最低糖浓度。研究发现25mM的蛋白就可以引起凝集反应，而乳糖和半乳糖能够特异抑制这种活性。结果如表1所示。

表1 为重组的PGAL13成熟蛋白红细胞凝集活性及糖抑制活性检测。

序列表

<110>中山大学

<120>文昌鱼半乳糖凝集素AmphiGAL13基因及其应用

<140>200610035329.7

<141>2006-04-30

<160>2

<210>1

<211>465

<212>DNA

<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)

<220>

<221>peptide

<222>(1)...(465)

<400>1

atg gcg tac cca gga ttt gga gga atg ccg act ccg gtt gtg aac ccg    48

Met Ala Tyr Pro Gly Phe Gly Gly Met Pro Thr Pro Val Val Asn Pro

1               5                   10                  15

ggt atc cca tat atc gga gag atc cag gga gga ctg cag cct ggg aag    96

Gly Ile Pro Tyr Ile Gly Glu Ile Gln Gly Gly Leu Gln Pro Gly Lys

            20                  25                  30

atg atc act atc cag ggg ttt gtg ata cct gga gct gac agg ttc cat    144

Met Ile Thr Ile Gln Gly Phe Val Ile Pro Gly Ala Asp Arg Phe His

        35                  40                  45

gtg aac ctg cag tgt ggt gcc agt act gct ccg cgt gct gac atc gcc    192

Val Asn Leu Gln Cys Gly Ala Ser Thr Ala Pro Arg Ala Asp Ile Ala

    50                  55                  60

ctg cag ttc aac ccc agg ttc gct gcc cgt gcc gtc gtc cgc aat gcc    240

Leu Gln Phe Asn Pro Arg Phe Ala Ala Arg Ala Val Val Arg Asn Ala

65                  70                  75                  80

ctc atc aac aac ggg tgg ggg gga gag gag aag gac acg ccc tat ttc    288

Leu Ile Asn Asn Gly Trp Gly Gly Glu Glu Lys Asp Thr Pro Tyr Phe

                85                  90                  95

ccc ttc atg cca ggc cag cca ttt gag ttg atg gtg ctg tgt cag cag    336

Pro Phe Met Pro Gly Gln Pro Phe Glu Leu Met Val Leu Cys Gln Gln

            100                 105                 110

gac agc ttt aag gtt gct gtg aat ggc cag cac ttc acc gag ttc cgc    384

Asp Ser Phe Lys Val Ala Val Asn Gly Gln His Phe Thr Glu Phe Arg

        115                 120                 125

cac cgc atc cag ccc ctg acc cgc gtg gac aca ctg gtc gtt gaa ggc    432

His Arg Ile Gln Pro leu Thr Arg Val Asp Thr Leu Val Val Glu Gly

    130                 135                 140

aaa gtt agc ctg cag cag atc cgc ttc aca taa                        465

Lys Val Ser Leu Gln Gln Ile Arg Phe Thr＊

145                 150

<210>2

<211>154

<212>PRT

<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)

<220>

<221>peptide

<222>(1)...(154)

<400>2

Met Ala Tyr Pro Gly Phe Gly Gly Met Pro Thr Pro Val Val Asn Pro

1               5                   10                  15

Gly Ile Pro Tyr Ile Gly Glu Ile Gln Gly Gly Leu Gln Pro Gly Lys

            20                  25                  30

Met Ile Thr Ile Gln Gly Phe Val Ile Pro Gly Ala Asp Arg Phe His

        35                  40                  45

Val Asn Leu Gln Cys Gly Ala Ser Thr Ala Pro Arg Ala Asp Ile Ala

    50                  55                  60

Leu Gln Phe Asn Pro Arg Phe Ala Ala Arg Ala Val Val Arg Asn Ala

65                  70                  75                  80

Leu Ile Asn Asn Gly Trp Gly Gly Glu Glu Lys Asp Thr Pro Tyr Phe

                85                  90                  95

Pro Phe Met Pro Gly Gln Pro Phe Glu Leu Met Val Leu Cys Gln Gln

            100                 105                 110

Asp Ser Phe Lys Val Ala Val Asn Gly Gln His Phe Thr Glu Phe Arg

        115                 120                 125

His Arg Ile Gln Pro leu Thr Arg Val Asp Thr Leu Val Val Glu Gly

    130                 135                 140

Lys Val Ser Leu Gln Gln Ile Arg Phe Thr＊

145                 150

Claims (3)

1.一种基因AmphiGAL13，其DNA序列如序列表<400>1所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白P_GAL13，其氨基酸序列如序列表<400>2所示。

3.权利要求2所述的蛋白在生物黏附微粒制剂的应用。

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