CN103788190A - β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，涉及从鳞翅目昆虫体内提取、分离、纯化获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其结构、获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白的分离纯化制备方法以及利用基因工程技术获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的结构和分离纯化制备方法。此外，也涉及利用天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体及其抗体获得方法。同时，也涉及天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及其抗体，可广泛应用于针对微生物的预防、治疗药物以及相应检测、诊断等领域。

Description

β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及β-1，3-葡聚糖识别蛋白的结构及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备生产方法，以及其在微生物及其相关分子模式检测、诱导昆虫产生抗菌肽、制备β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段抗体等方面的应用。
背景技术：
先天性免疫是一种古老的宿主防御机制，对“非己”的识别策略不在于它们能识别每一个可能的抗原，而是能够识别在微生物(病原体)中普遍存在的高度保守的共有结构。这种不同于获得性免疫系统的识别方式被称为模式识别作用(Pattern recognition)。模式识别作用中包含两种不可或缺的成分，即微生物中普遍存在的高度保守的共有结构—病原体相关的分子模式和宿主体内的先天性免疫识别分子-模式识别受体。
微生物中普遍存在的高度保守的共有结构被称为病原体相关的分子模式，(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。已报道的PAMPs包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)、脂磷壁酸(Lipoteichoic acids，LTA)；分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、甘露聚糖(Mannan)；细菌DNA中未甲基化的CpG模体；RNA病毒中的双链RNA；真菌的葡聚糖(Glucan)；以及许多细菌、病毒、真菌及寄生虫表面的以甘露糖(Man)、乙酰氨基甘露糖(ManNAc)、乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)等为末端糖基的糖结构，等等。尽管这些PAMPs的化学结构极为不同，但它们具有共同的特征：PAMPs由微生物(病原体)产生；PAMPs代表的是对微生物的生存所必需的保守的分子模式；PAMPs为一大组微生物所共有。
先天性免疫系统中能够识别PAMPs的受体称为模式识别受体(Pattern recognitionreceptors，PRRs)，也称模式识别蛋白(识别蛋白)。这些受体通过与特异性PAMPs的结合激活存在于该生物体内的特定蛋白酶类和利用免疫反应组织的细胞内信号转导途径而引起该生物体免疫反应。除此之外，PRRs还可以作为促进吞噬的调理素，或是凝集、黑化及其他蛋白质修饰级联反应等免疫过程的起始因子。
其中，能与β-1，3-葡聚糖发生特异性结合的蛋白被称为β-1，3-葡聚糖识别蛋白，也称β-1，3-葡聚糖模式识别受体(βGRP)。目前在果蝇体内没有发现仅与β-1，3-葡聚糖结合的蛋白质，但在家蚕、烟草天蛾、黄粉虫等许多昆虫体内则发现β-1，3-葡聚糖识别蛋白，并且在与β-1，3-葡聚糖结合后可诱导自身酚氧化酶的活性以及进一步激活Toll信号传递途径。1988年MasaakiAshida等人从家蚕中发现了第一个能够与β-1，3-葡聚糖发生特异性结合的蛋白质，该蛋白的分子量为63k Da，等电点为4.3，并能激活家蚕体内的酚氧化酶原级联放大反应，从而进一步激活Toll信号传递途径。随后，在烟草天蛾、按蚊、黄粉虫中发现的βGRPs在序列特点、组织分布、分子量等方面与家蚕中的βGRP具有相似之处。纯化后的βGRPs可不同程度的与β-1，3-葡聚糖发生特异性的结合而不与肽聚糖结合，其中烟草天蛾βGRP还可以一定程度的与磷壁酸特异性结合。实验证明，这些βGRPs均参与受真菌感染后的酚氧化酶原级联放大反应以及Toll信号传递途径的激活。
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在浅水螯虾中发现了一种βGRP，其特殊之处在于该蛋白与脂多糖、β-1，3-葡聚糖具有相似的结合特异性而与肽聚糖不发生结合。分子量为40kDa。其结构与革兰阴性菌结合蛋白及葡聚糖酶的同源性较高，无葡聚糖酶催化能力。其多克隆抗体可以抑制由β-1，3-葡聚糖所介导的酚氧化酶的激活。
另外，鲎体内凝固因子G是目前发现的唯一一个既可以特异性结合β-1，3-葡聚糖，又具有丝氨酸蛋白酶活性的蛋白质。该蛋白质是由两种不同类型的亚基组成的异源二聚体，参与由β-1，3-葡聚糖引起的鲎血液凝集作用。对两个亚基分别进行研究后发现，β亚基是一个丝氨酸蛋白酶原而α亚基具有与β-1，3-葡聚糖特异性结合的能力。当α亚基与β-1，3-葡聚糖结合后，可引起β亚基的自动激活。
本发明是针对鳞翅目、天(大)蚕蛾科昆虫体内的β-1，3-葡聚糖识别蛋白(βGRP)，研究该天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物或类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
在Genbank中有一种柞蚕β-1，3-葡聚糖识别蛋白的核苷酸及其氨基酸序列(登录号：JN880424.1)，该识别蛋白与本发明专利所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白，不仅在结构具有差异，更主要是与β-1，3-葡聚糖结合的生物活性具有非常显著差异。为了将两者区别开来，本专利将Genbank的β-1，3-葡聚糖识别蛋白(登录号：JN880424.1)称为β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b。目前，还没有见到β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的制备方法、生物学功能等方面的研究报道。
发明内容：
本发明内容的陈述，是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明所解决的技术问题是提供一种从鳞翅目、天(大)蚕蛾科昆虫中获取β-1，3-葡聚糖识别蛋白的制备方法、结构、生物学功能及其应用。首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目、天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析β-1，3-葡聚糖识别蛋白的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因、β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b。同时，利用基因重组技术，获得了β-1，3-葡聚糖识别蛋白的衍生物或类似物或部分片段。天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物或类似物或部分片段以及重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b，均能特异性识别β-1，3-葡聚糖，并在昆虫体内激活酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递途径，通过激活的Toll信号传递途径而使昆虫体内诱导产生抗菌肽。本发明的天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物或类似物或部分片段、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b以及其作为抗原产生抗体，均可广泛应用于针对微生物的预防、检测、诊断、治疗药物等领域。
一、天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的制备
本发明所获得天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白是通过如下技术方案实现的，包括：(1)昆虫血淋巴作为初始原料；昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液；(2)原料分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的β-1，3-葡聚糖识别蛋白。
β-1，3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：1.操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；2.溶液的酸碱度在pH2-pH12，优选pH4-pH10；3.调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液，酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸，碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；4.缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；5.溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.1mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响β-1，3-葡聚糖识别蛋白的生物活性。
将昆虫用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至-5℃条件下收集昆虫血淋巴。为确保β-1，3-葡聚糖识别蛋白的生物活性，其收集及储存过程需要同时满足如下条件：(1)收集过程使用的器械、溶液、容器等均处无菌状态，且不含有微生物相关分子模式；(2)收集后的血淋巴需放置于中性盐溶液、或含有酚氧化酶原激活系统抑制剂的溶液、或含抗凝剂的溶液、或直接收集至液氮或干冰，以及上述条件的任何组合，或利用上述β-1，3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液等收集血淋巴。
1.离子交换层析分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白
取上述方法所获昆虫血淋巴，按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从0.00mol/L-3mol/L。利用抗β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有β-1，3-葡聚糖识别蛋白的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征：1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；3.缓冲液及其浓度选择，按上述β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；4.洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；5.中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl；6.分离纯化操作温度按上述β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响β-1，3-葡聚糖识别蛋白的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。
2.亲和层析分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白
取上述方法所获昆虫血淋巴，按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至β-1，3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式，分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有β-1，3-葡聚糖识别蛋白的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
亲和层析分离纯化的特征：1.亲和填料的配基选择不溶性β-1，3-葡聚糖(如curdlan)、β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体、肝素、刀豆素、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如苯甲咪)；2.分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；3.洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；4.洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；5.洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L，选择尿素的最高浓度为8.0mol/L，选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L；6.如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使β-1，3-葡聚糖识别蛋白发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白。
3.疏水层析分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白
取上述方法所获昆虫血淋巴，按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至β-1，3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有β-1，3-葡聚糖识别蛋白的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；3.分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
4.凝胶层析分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白
取上述方法所获昆虫血淋巴，按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至β-1，3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有β-1，3-葡聚糖识别蛋白的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征：1.层析介质可以选择Sephacryl S-100 HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6 prep grade或Superdex 30 prep grade或Superdex 75 prep grade或Superose 12HR或Superose 6 HR或Superdex Peptide HR或Superdex 75 HR或Superdex peptidePE等凝胶层析添料；2.分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15mol/L及以上。
5.盐析分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白
取上述方法所获昆虫血淋巴，按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至β-1，3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到β-1，3-葡聚糖识别蛋白仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到β-1，3-葡聚糖识别蛋白沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征：1.分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；2.分离纯化操作温度在0℃-45℃，优选0℃；3.盐析使用的中性盐，选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4或Na2SO4；4.在使β-1，3-葡聚糖识别蛋白处于溶解状态，选择中性盐在5％-40％，优选20％-35％；5.在使β-1，3-葡聚糖识别蛋白处于盐析沉淀状态，选择中性盐在45％-85％，优选45％-65％。
6.超滤分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及处理β-1，3-葡聚糖识别蛋白溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴，按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至β-1，3-葡聚糖识别蛋白的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使β-1，3-葡聚糖识别蛋白透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使β-1，3-葡聚糖识别蛋白得以分离纯化；透过超滤膜的β-1，3-葡聚糖识别蛋白溶液，再选择一定规格的超滤膜，使β-1，3-葡聚糖识别蛋白被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使β-1，3-葡聚糖识别蛋白得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使β-1，3-葡聚糖识别蛋白先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使β-1，3-葡聚糖识别蛋白透过超滤膜，从而使β-1，3-葡聚糖识别蛋白得以分离纯化。
超滤处理β-1，3-葡聚糖识别蛋白溶液的目的，是除去β-1，3-葡聚糖识别蛋白溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对β-1，3-葡聚糖识别蛋白溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使β-1，3-葡聚糖识别蛋白被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
超滤分离纯化和处理的特征：1.透过β-1，3-葡聚糖识别蛋白的超滤膜选择分子量为50kDa或60kDa或70kDa或80kDa或90kDa或100kDa规格的超滤膜，优选90kDa-60kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；2.截留β-1，3-葡聚糖识别蛋白的超滤膜选择是分子量为10kDa或20kDa或30kDa或50kDa的超滤膜，优选10kDa-30kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；3.超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按β-1，3-葡聚糖识别蛋白提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
通过上述方法所获得的β-1，3-葡聚糖识别蛋白纯度，有时无法满足相应需要。本方法是从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度β-1，3-葡聚糖识别蛋白，并可以达到电泳纯乃至HPLC纯度。其特征在于，将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)，进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或六种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。
二、β-1，3-葡聚糖识别蛋白结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对β-1，3-葡聚糖识别蛋白进行结构解析。其特征在于，(1)利用生物质谱测定天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对发明内容所获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白分子内的氨基酸序列片段；(3)利用分子生物学技术、方法，从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNA pool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因-eDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增β-1，3-葡聚糖识别蛋白染色体基因，通过基因序列测定分析获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述1-4所获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列，彼此相互验证上述结构信息，获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白序列。本文中所指β-1，3-葡聚糖识别蛋白，为不含信号肽的成熟肽—天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白；本文中所指β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链，为包含信号肽在内的完整的开放阅读框架编码的肽链。
三、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物的制备
本发明的β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物可以利用基因工程表达制备获得，通过如下技术方案实现，包括：(1)将编码β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物DNA重组至表达载体；(2)用步骤(1)的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的目的蛋白。
本发明同时提供上述β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
四、β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物的结合特异性及其应用
本发明再一个目的是针对天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物的体外结合特异性以及对激活酚氧化酶原激活系统和Toll途径的激活情况的对比，确定了天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物，与β-1，3-葡聚糖结合的生物活性。同时，也研究了天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物的应用。
此外，本发明也研究了天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
五、β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的获得方法以及其生物功能、抗体等及其应用
本发明针对β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b，首次开展了β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b)-的基因工程表达生产方法、生物学功能及其应用、作为抗原产生抗体及其应用等方面研究。
本发明所述的天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其部分片段或衍生物或类似物、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b获得方法常规、简单、产量高。
附图说明：
图1为天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的分离结果
A：实施例1分离获得天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的电泳图谱；B：实施例1纯度分析图谱；C：实施例2，3分离获得天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的电泳图谱
图2为β-1，3-葡聚糖识别蛋白序列
A：氨基酸序列；B：核苷酸序列
图3为β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物、类似物、活性片段结构
(1)为Met-组氨酸标签-凝血酶酶切位点-β-1，3-葡聚糖识别蛋白序列。
(2)为Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白序列
(3)为Met-组氨酸标签-β-1，3-葡聚糖识别蛋白序列
(4)为Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白-组氨酸标签序列
(5)为Met-GST标签-β-1，3-葡聚糖识别蛋白序列
(6)为Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白-GST标签序列
(7)为β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长氨基酸序列及其基因序列
A：氨基酸序列；B：核苷酸序列
(8)为Met-组氨酸标签-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链序列
(9)为Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链-组氨酸标签序列
(10)为Met-GST标签—凝血酶酶切位点-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链序列
(11)为Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链-凝血酶酶切位点-GST。
标签序列
图4为分离纯化的重组表达产物(原核表达体系)电泳图谱
1：采用pET-28a构建获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白；2：采用pTYBl1构建获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白；3：采用pGEX-2T构建获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白；4：采用pET20b构建获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白；5：采用pTYB11构建获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b
图5为分离纯化的重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白(昆虫表达体系)电泳图谱1：pFastBac1-sf9昆虫表达体系；2：pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系
图6为分离纯化的重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白(哺乳动物细胞表达体系)电泳图谱
图7为β-1，3-葡聚糖识别蛋白、β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b与β-1，3-葡聚糖的结合实验
A：β-1，3-葡聚糖识别蛋白的结合特异性。1：与curdlan的结合能力；2：与酵母菌的结合能力；3：与大肠杆菌的结合能力；4：与金黄色葡萄球菌的结合能力。
B：β-1，3-葡聚糖识别蛋白、β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b与β-1，3-葡聚糖结合强度的比较。a：β-1，3-葡聚糖识别蛋白；b：β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b。1-3反映β-1，3-葡聚糖识别蛋白与β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的浓度：1：1μg；2：5μg；3：20μg。
图8为由真菌类的酵母菌或β-1，3-葡聚糖引发柞蚕幼虫黑化
A：柞蚕幼虫；B：酵母菌致黑化；C：β-1，3-葡聚糖致黑化；D：酵母菌与β-1，3-葡聚糖识别蛋白复合物致黑化；E：β-1，3-葡聚糖与β-1，3-葡聚糖识别蛋白致黑化；F：酵母菌与β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b复合物致黑化；G：β-1，3-葡聚糖与β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b致黑化
图9为由真菌类的酵母菌或β-1，3-葡聚糖引发柞蚕幼虫抗菌肽的产生
A：柞蚕幼虫；B：酵母菌诱导作用；C：β-1，3-葡聚糖诱导作用；D：酵母菌与β-1，3-葡聚糖识别蛋白复合物诱导作用；E：β-1，3-葡聚糖与β-1，3-葡聚糖识别蛋白诱导作用；F：酵母菌与β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b复合物诱导作用；G：β-1，3-葡聚糖与β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b诱导作用
图10为β-1，3-葡聚糖识别蛋白及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b在酚氧化酶原激活系统中的作用
图11为β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b抗体在酚氧化酶原激活系统中的作用
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1
天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的分离纯化
1.将预冷(0℃)的饱和硫酸铵搅拌并缓慢加入血淋巴中，至硫酸铵浓度为30％，12,000rpm，4℃离心15min取上清液。上清液继续滴加预冷的饱和硫酸铵(0℃)至硫酸铵浓度为50％，12,000rpm，4℃离心15min取沉淀。沉淀用50％硫酸铵洗涤、离心取沉淀，重复5次。
2.将上一步骤所得沉淀溶解于缓冲溶液(50m mol/L柠檬酸缓冲液，5m mol/L EDTA，pH5.0)中超滤除盐。
3.将上一步骤所得样品溶液上样至SP Sepharose F.F，将层析柱用平衡后用0mol/L～1mol/L NaCl(50m mol/L柠檬酸缓冲液，5m mol/L EDTA，pH5.0)梯度洗脱。收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
4.将上一步骤分析获得的样品组分用缓冲溶液20mmol/L Tris-HCl，pH9.0透析过夜，离心取上清液。上样至Q Sepharose F.F，0mol/L～0.5M NaCl(20mmol/L Tris-HCl，pH9.0)梯度洗脱。收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
5.将步骤4分析获得的样品组分用缓冲溶液20mmol/L PBS，pH7.0透析过夜，离心取上清液。上样至凝胶过滤层析填料，洗脱并收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
试验结果如图1-(A)(B)所示，分离纯化所得到的天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的纯度约99.9％以上。
实施例2：
分离纯化天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白
1.将收集于抗凝缓冲溶液(15mmo1·L-1 NaCl；136mmol·L-1柠檬酸钠；26mmol·L-1柠檬酸；20mmol·L-1 EDTA，pH 5.0)的血淋巴原料液，上样至肝素-Sepharose，0mol/L～1mol/LNaCl抗凝缓冲溶液梯度洗脱。收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
2.将上一步骤分析获得的样品组分用抗凝缓冲溶液超滤除盐，离心取上清液上样至SP Sepharose F.F。将层析柱平衡后用pH5.0～pH8.0，1mol/LNaCl抗凝缓冲溶液梯度洗脱。收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
3.将上一步骤分析获得的样品组分上样至辛基疏水柱，1mol/L～0mol/L NaCl抗凝缓冲溶液梯度洗脱。收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
试验结果如图1-(C)泳道1所示，获得电泳纯的天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白。
实施例3：
分离纯化天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白
1.将预冷的饱和硫酸铵搅拌并缓慢加入原料液中，至硫酸铵浓度为30％，12,000rpm，4℃离心15min取上清液。上清液继续滴加预冷的饱和硫酸铵(0℃)至硫酸铵浓度为80％，12,000rpm，4℃离心15min取沉淀。沉淀用20mmol/L PBS，pH 7.0溶解备用。
2.将上一步骤分离获得的样品组分上样至β-1，3-葡聚糖亲和层析柱，0mol/L～3MNaCl，20mmol/L PBS，pH 7.0梯度洗脱。收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
3.将上一步骤分离获得的样品组分用20mmol/L PBS，pH 7.0缓冲溶液超滤除盐，离心取上清液上样至Sephacryl S-100 HR并洗脱。收集各组分采用Western blot检测目的蛋白。
试验结果如图1-(C)泳道2所示，获得电泳纯的天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白。
实施例4：
β-1，3-葡聚糖识别蛋白结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对β-1，3-葡聚糖识别蛋白进行结构解析。具体方法、手段按照发明内容二中所列内容实施。
获得天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白(也称成熟肽链，在本专利简称β-1，3-葡聚糖识别蛋白)的一级结构—氨基酸序列以及编码天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白的基因及其序列(如图2所示)。
利用生物信息学技术、方法等，针对本发明β-1，3-葡聚糖识别蛋白的结构进行同源比对分析，结果表明：本发明的β-1，3-葡聚糖识别蛋白与家蚕、烟草天蛾、黄粉虫等昆虫的β-1，3-葡聚糖识别蛋白属于同一家族。
实施例5：
利用原核生物表达系统获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b
本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段基因，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b基因的构建策略和基本方法。
原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施是为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.表达载体构建
根据β-1，3-葡聚糖识别蛋白(结构如图3)的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNApool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因的表达载体。
同上所述，根据β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b序列，构建β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征：1.以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在目的基因的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在目的基因的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag等；5.可以在亲和层析标签与目的基因之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然目的蛋白一致的重组蛋白。
2.重组目的蛋白的获得
利用基因工程技术，将目的基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导目的基因的表达，从而获得含有目的蛋白的培养液或菌体。含有目的蛋白的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组目的蛋白的原料液备用。
重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因可表达于细胞内或细胞外；3.存在于细胞内的β-1，3-葡聚糖识别蛋白需通过裂解液裂解、超速破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含目的蛋白的原料液中分离纯化重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如：(1)采用pET-28a构建N端前融合组氨酸标签的β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，Met-(His标签)-β-1，3-葡聚糖识别蛋白表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50mmol/L PBS，0.15M NaCl，50mmol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白至电泳纯(图4-泳道1)。
(2)采用pTYB11构建无标签β-1，3-葡聚糖识别蛋白表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，β-1，3-葡聚糖识别蛋白表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白至电泳纯(图4-泳道2)。
(3)采用pGEX-2T构建C端后融合GST标签的β-1，3-葡聚糖识别蛋白表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，β-1，3-葡聚糖识别蛋白-GST表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白至电泳纯(图4-泳道3)。
(4)采用pET20b构建C端后融合组氨酸标签的β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，β-1，3-葡聚糖识别蛋白—His表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白至电泳纯(图4-泳道4)。
(5)采用与(2)相同方法获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b，既采用pTYB11构建无标签β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白b至电泳纯(图4-泳道5)。
上述(1)、(2)、(3)、(4)表达重组的β-1，3-葡聚糖识别蛋白结构如图3所示，分离纯化获得的重组表达产物，经过SDS-PAGE验证其纯度如图4所示。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得β-1，3-葡聚糖识别蛋白，该重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白的结构与天然的β-1，3-葡聚糖识别蛋白的结构相同。
实施例6：
利用昆虫细胞表达系统获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pFastBac1—sf9昆虫表达体系获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段
将β-1，3-葡聚糖识别蛋白成熟肽及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-βGRP重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10，Bluo-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的不溶性β-1，3-葡聚糖(curdlan)层析柱，经过两个不同阶段的pH缓冲液去除大量杂蛋白后，用含0mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液pH8.0)进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如图3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图5-(1)。
2.利用pMIB/V5-His—Sf21昆虫表达体系获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段
将β-1，3-葡聚糖识别蛋白成熟肽及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pMIBN5-His质粒中，构建pMIBN5-His-βGRP重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Bluo-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的pH缓冲液及0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分别充分洗涤5个柱床体积去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如图3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图5-(2)。
实施例7：
利用酵母表达系统获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述酵母细胞表达系统表达本发明β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
酵母细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pPIC9K表达载体、毕赤酵母GS115为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1和实施例2的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将β-1，3-葡聚糖识别蛋白成熟肽基因连接到pPIC9K表达载体中，构建pPIC9K-His6-βGRP(或pPIC9K-βGRP)重组表达质粒，转化大肠杆菌，挑取阳性重组菌中重组质粒，经酶切形成线性分子，利用电转化方法将其转入毕赤酵母GS115中与基因组同源重组，经过初筛、复筛及Mut表型鉴定，筛选出阳性重组子，进行发酵及诱导表达，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组βGRP(或重组βGRP)为分泌型表达。
将重组菌GS115/pPIC9K-His6-βGRP(或GS115/pPIC9K-βGRP)接种于50mIBMGY液体培养基中，于30℃，250rpm/min，震荡培养过夜。3000g、4℃离心5min，收集菌体。用10ml BMMY培养基重悬菌体并开始甲醇诱导表达6h，重组蛋白以分泌表达形式存在于培养基中，12,000g、4℃离心4min，得上清液，并以此为纯化初始液。
如果表达产物是His6-βGRP形式，直接将纯化初始液上样于0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的pH缓冲液及0.02mol/L咪唑(pH8.0)分别充分洗涤5个柱床体积去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-βGRP。
如果表达产物是βGRP形式，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组βGRP。
实施例8：
利用哺乳动物细胞表达系统获得重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述哺乳动物表达系统表达本发明β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
哺乳动物细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pCDNA3.0(neo+)质粒、CHO-K1细胞为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1和实施例2的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将βGRP成熟肽基因连接到pCDNA3.0(neo+)质粒中，构建pCDNA3.0(neo+)-His6-βGRP(或pCDNA3.0(neo+)-βGRP)重组表达质粒。将其转染哺乳动物细胞株CHO-K1，对转染成功细胞株于5％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h，收集细胞及培养液，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组βGRP得以表达。
用15ul重组质粒pCDNA3.0(neo+)-His6-βGRP(或pCDNA3.0(neo+)-βGRP)转染8ml IMDMmedium(含有CHO-K1 cell，2X105 cell/ml），于37℃，15％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h。用0.25％胰蛋白酶消化细胞2～3min，使细胞悬浮，收集细胞。用5ml裂解液(NP40)使细胞裂解，12,000g、4℃离心5min，得上清液作为纯化初始液。
如果表达产物是His6-βGRP形式，直接将纯化初始液上样于0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的pH缓冲液及0.02mol/L咪唑(pH8.0)分别充分洗涤5个柱床体积去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-βGRP。表达产物的结构如图3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图6。
如果表达产物是βGRP形式，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组βGRP。
实施例9：
β-1，3-葡聚糖识别蛋白及β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体的获得
按照常规、通用抗体产生的技术，利用实施例1、2、3、5、6、7、8获得的各种β-1，3-葡聚糖识别蛋白及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体、β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b抗体的产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了β-1，3-葡聚糖识别蛋白或β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的血清中分离纯化不同纯度的β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b抗体，以适于不同要求的应用。
实施例10：
β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段和重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的生物活性
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以β-1，3-葡聚糖识别蛋白的生物活性为代表进行描述，β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物、类似物、活性片段、β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段、β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的生物活性为核心与基础，进一步拓展β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的应用范围。
1.β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段和重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的结合特异性
5μg天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白或重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段或重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b，分别与200μg不溶性β-1，3-葡聚糖(curdlan)或者甲醛固定后的真菌类的酵母菌、或者甲醛固定后的革兰阴性菌类的大肠杆菌、或者甲醛固定后的革兰阳性菌类的金黄色葡萄球菌混合并轻微震荡30分钟。5,000rpm离心15min。去除上清液，将沉淀分别用缓冲溶液平衡后，加入1×电泳上样液，60℃加热5min后，通过SDS/PAGE结合western-blot观察实验结果。如图7-A所示(只展示β-1，3-葡聚糖识别蛋白样品)，β-1，3-葡聚糖识别蛋白能够与curdlan及酵母菌结合，而不能与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌结合。实验结果表明：天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段和重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b能够特异性结合真菌及其分子模式-β-1，3-葡聚糖。
如图7-B，采用间接ELISA方法，分别利用相应的抗体，在不同浓度条件下(1：1μg；2：5μg；3：20μg)，比较本专利重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白(图中所示a样品)与重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b(图中所示b样品)对β-1，3-葡聚糖的结合能力。试验结果表明，β-1，3-葡聚糖识别蛋白较之β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b，与β-1，3-葡聚糖的结合能力更强，其结合能力具有非常显著性差异。
2.参与昆虫的酚氧化酶原激活系统以及激活Toll信号传递途径
(1)昆虫酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递途径激活的活性验证
将真菌类的酵母菌溶液(活菌或死菌)直接注入柞蚕幼虫体内后，均可以使柞蚕幼虫黑化乃至死亡。这是酵母菌的分子模式激活了柞蚕体内酚氧化酶原激活系统的酚氧化酶，由激活的酚氧化酶引发昆虫的黑化(如图8-B、C所示)乃至死亡。同时，可以从黑化乃至死亡的昆虫体内，利用常规、通用方法检测到，因酵母菌激活柞蚕幼虫体内酚氧化酶原激活系统进而激活Toll信号传递途径而诱导产生的抗菌肽(如图9-B、C所示)。
将真菌类的酵母菌(活菌或死菌)溶液加入柞蚕血淋巴后，柞蚕血淋巴发生黑化作用。这是酵母菌的分子模式激活了柞蚕血淋巴中酚氧化酶原激活系统的酚氧化酶，由激活的酚氧化酶引发昆虫血淋巴发生黑化作用。
(2)天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段和β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b参与昆虫酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递途径的激活
将天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段或β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b分别注入柞蚕幼虫体内后，柞蚕均没有发生黑化乃至死亡。同时，也检测不到因激活柞蚕体内酚氧化酶原激活系统进而激活Toll信号传递途径而诱导产生的抗菌肽。同样，将天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段或β-1，3-葡聚糖识别蛋白b加入柞蚕血淋巴后，柞蚕血淋巴均没有发生黑化作用。
将天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段和β-1，3-葡聚糖识别蛋白b分别与真菌(死菌)或真菌的分子模式-β-1，3-葡聚糖混合，洗涤去除没有结合组分，获得复合物。将复合物分别注入柞蚕幼虫体内后，均可以使柞蚕体黑化。β-1，3-葡聚糖识别蛋白作用结果如图8-D、E，β-1，3-葡聚糖识别蛋白b作用结果如图8-F、G。在剂量相同的情况下，β-1，3-葡聚糖识别蛋白所形成复合物引发血淋巴黑化程度，较之不含有识别蛋白的情况(图8-B、C)以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b所形成复合物的情况，具有非常显著差异。同时，也能够检测到，两种模式识别蛋白均可因激活柞蚕体内酚氧化酶原激活系统进而激活Toll信号传递途径而诱导产生抗菌肽(如图9-D、E、F、G所示)。其中，β-1，3-葡聚糖识别蛋白作用结果如图9-D、E，β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b作用结果如图9-F、G，可以看出，两者诱导所产生的抗菌肽的量亦有明显不同。
上述实验结果表明：一方面，本发明专利的天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b是柞蚕体内酚氧化酶原激活系统的成分，作为β-1，3-葡聚糖识别蛋白与β-1，3-葡聚糖结合后，激活了柞蚕体内酚氧化酶原激活系统进而也激活Toll信号传递途径；另一方面，两种模式识别蛋白与真菌及β-1，3-葡聚糖的结合有非常显著性差异，从而导致对酚氧化酶原激活系统以及激活Toll信号传递途径的激活作用亦有明显不同。
实施例11：
天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的应用
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以β-1，3-葡聚糖识别蛋白的生物活性为代表进行描述，β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的生物活性为核心与基础，进一步拓展β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的应用范围。
1.诱导昆虫产生抗菌肽
如实施例10中的2.所描述，利用真菌或结合了β-1，3-葡聚糖的β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b均可以诱导昆虫产生抗菌肽，而且利用了β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白b后，结合了β-1，3-葡聚糖的β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白b，诱导昆虫产生抗菌肽程度，比没有利用β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白b的β-1，3-葡聚糖所诱导昆虫产生抗菌肽程度，具有非常显著的差异(非常显著的上调作用)。基于此，从产生抗菌肽的昆虫体内制备相应的抗菌肽，该抗菌肽可以用于医药领域。
2.用于真菌的检测
如实施例10中所描述，β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b作为酚氧化酶原激活系统的成分-起始激活因子，与真菌或β-1，3-葡聚糖结合后，能够激活柞蚕体内酚氧化酶原激活系统(激活的酚氧化酶引发黑化)进而也激活Toll信号传递途径的生物活性，而且利用β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b后，激活柞蚕体内酚氧化酶原激活系统的强度，比没有利用β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白b的β-1，3-葡聚糖激活酚氧化酶原强度具有非常显著的的差异(非常显著的上调作用)。
同样，如图10所示，利用柞蚕血淋巴替代柞蚕观察血淋巴的黑化程度。试验结果显示，相同检测条件下，添加β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b后，对于检测真菌而言，比没有利用识别蛋白提高了检测灵敏度。同时，本试验也表明，利用β-1，3-葡聚糖识别蛋白和β-1，3-葡聚糖识别蛋白-(b)诱导柞蚕血淋巴的激活，其作用效果有显著性差异。
实施例12：
天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物、类似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体的应用
针对实施例9获得的β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白b的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用的技术、方法等，采用所制备的抗体，用于鳞翅目昆虫(鳞翅目昆虫优选天蚕蛾科(Saturniidae)昆虫的β-1，3-葡聚糖识别蛋白免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫(鳞翅目昆虫优选天蚕蛾科(Saturniidae)昆虫)分离纯化制备β-1，3-葡聚糖识别蛋白过程中免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
将足够剂量的β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体分别首先注入柞蚕幼虫体内，再将酵母菌(死菌)或β-1，3-葡聚糖的溶液分别注入该柞蚕幼虫体内后，此时，酵母菌或β-1，3-葡聚糖并不能引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，如图11所示，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，事先加入足够剂量的β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体也可以阻断柞蚕血淋巴的黑化。同理，将充分结合β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体的β-1，3-葡聚糖注入柞蚕幼虫体内，此时β-1，3-葡聚糖不引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，充分结合β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b抗体的β-1，3-葡聚糖也不引发柞蚕血淋巴的黑化。
在任何待检测真菌的样品，加入足够剂量的β-1，3-葡聚糖识别蛋白抗体或β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b抗体。按照实施例11中β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段用于真菌的检测所述方法，进行待检测样品的真菌检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出真菌的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品真菌检测的阴性对照组加以应用。
上述结果表明：β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的抗体，通过与β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的结合而屏蔽了与β-1，3-葡聚糖的结合生物活性，从而使β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。同样，β-1，3-葡聚糖识别蛋白b抗体也能够屏蔽与β-1，3-葡聚糖的结合生物活性，从而使β-1，3-葡聚糖识别蛋白失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。
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Claims (10)

1.天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白，其特征在于，它包括(1)氨基酸序列如附图2-(A)所示，(2)编码的基因序列如附图2-(B)所示。
2.根据权利要求1所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白，其特征在于，所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白来源于鳞翅目(Lepidoptera)、天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，所述的昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。
3.β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段，其特征在于它包含权利要求1所述的氨基酸序列全序、片段，包括Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白、Met-组氨酸标签-β-1，3-葡聚糖识别蛋白、Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白-组氨酸标签、Met-GST标签-β-1，3-葡聚糖识别蛋白、Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白-GST标签；β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链、Met-组氨酸标签-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链、Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链-组氨酸标签、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链、Met-β-1，3-葡聚糖识别蛋白全长肽链-凝血酶酶切位点-GST标签等，如附图3所示。
4.重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段以及重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b，其特征在于，表达产物具有β-1，3-葡聚糖识别蛋白的生物学活性。
5.如权利要求1所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白的生产方法，其特征在于，利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴，既昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液，原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化β-1，3-葡聚糖识别蛋白活性组分，或通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的β-1，3-葡聚糖识别蛋白，其提取、分离、纯化体系中：1.操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；2.溶液的酸碱度在pH2-pH12，优选pH4-pH10；3.调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液，酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸，碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；4.缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；5.溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.1mol/L。
6.如权利要求1所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白或权利要求3所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段或权利要求4所述β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的基因表达生产方法，其特征在于，它包括(1)利用基因工程技术表达β-1，3-葡聚糖识别蛋白、β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段、β-1，3葡聚糖识别蛋白-b，(2)从上述表达体系中分离纯化重组的β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组的β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b，(3)上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b活性组分，(4)上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段、重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b。
7.根据权利要求6所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白或β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段或β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的基因表达生产方法，其特征在于，所述的基因表达体系包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞，(5)上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达。
8.权利要求1所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白或权利要求3所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段或权利要求4所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的抗体，其特征在于，它包括(1)以天然β-1，3-葡聚糖识别蛋白或重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白以及其衍生物或类似物或活性片段或重组β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b作为抗原，(2)产生β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物或类似物或活性片段以及β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b抗体的生物体为小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛，(3)采用常规方法从产生抗体的生物体血清制备抗体。
9.权利要求1所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白或权利要求3所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白衍生物或类似物或活性片段以及权利要求4所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的应用，其特征在于，它包括(1)激活酚氧化酶原激活系统，(2)诱导昆虫产生抗菌肽，(3)在微生物及其相关分子模式检测中的应用。
10.权利要求1所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白或权利要求3所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白的衍生物或类似物或活性片段或权利要求4所述的β-1，3-葡聚糖识别蛋白-b的抗体的应用。
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