CN117471091B - 一种检测(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测(1‑3)‑β‑D葡聚糖的免疫层析试纸及其制备方法和应用。所述免疫层析试纸包括样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述荧光垫包被有荧光微球标记的抗体；所述荧光垫为经过处理的荧光垫，所述处理的方法包括：使用处理液1浸泡荧光垫后烘干。本发明的荧光免疫层析试纸条能够一次性检测真菌(1‑3)‑β‑D葡聚糖，无需加热处理，灵敏度和准确度高，重复性和稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸及其制备方法和应用。
背景技术
(1-3)-β-D葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占真菌细胞干质量的50%以上。由D-葡聚糖聚合而成，以β-1,3糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状β-1,6糖苷键连接的葡萄糖残基作为侧链。除结合菌（主要是根霉菌和毛霉菌）外，所有真菌胞壁成分中都含有(1-3)-β-D葡聚糖，以酵母样真菌含量最高，人体细胞、病毒、原核生物等不含该成分，这一特点使其成为检测深部真菌感染的理想标志物。当真菌侵入人体血液或深部组织并引起深部感染时，真菌细胞被吞噬细胞吞噬消化后，从细胞壁中释出(1-3)-β-D葡聚糖，导致血液及体液中该成分显著增加。而当感染浅部组织及定植真菌时，(1-3)-β-D葡聚糖很少释放到血液中，在体液中的含量不高。(1-3)-β-D葡聚糖有2种存在形式：一种是以单链形式存在的低级结构，另一种是以双股螺旋或三股螺旋形式存在的高级结构(1-3)-β-D葡聚糖呈中性，并含有少量的β-1,6糖苷键连接结构，在分子内多羟基作用下，形成致密的三螺旋结构，具有高免疫活性低溶解度的特点。因此，(1-3)-β-D葡聚糖定量检测是诊断深部真菌感染的有力依据，可用于侵袭性真菌病（Invasive Fungal Disease, IFD）的鉴定。
由于IFD危险性大，发病率高，越来越成为危害人类健康及生命安全的重要因素，特别是免疫功能低下者或伴有严重基础疾病住院患者等。因此，快速准确的早期诊断深部真菌感染具有重要意义。目前，已开发出了多种基于鲎试剂的葡聚糖显色检测试剂盒，具有快速、灵敏、特异性强、重复性好等优点，在临床上已广泛应用。缺点是检测时间较长，并且传统方法生产的鲎试剂易受内毒素干扰，造成假阳性。鲎为国家二级保护动物，因此，基于免疫学检测葡萄糖试剂盒的开发迫在眉睫。如磁微粒化学发光技术，但其弊端为易受样品中生物素的干扰，检测准确度低。
荧光免疫层析法应用于IFD检测，具有操作简便、检测快速，对设备要求不高，插卡式读数，结果易于判断，大大缩短了检测时间。为易感人群的检测提供了一种有效的辅助手段。
综上所述，目前缺少针对于真菌(1-3)-β-D葡聚糖进行检测的免疫层析试纸，现有检测方法及试剂盒的检测准确度低，灵敏性不够高。如何提供一种检测(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸及其制备方法，无需加热处理的同时提高检测的准确性和灵敏性，已成为目前生物技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸及其制备方法和应用，能够一次性检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖，无需加热处理，灵敏度和准确度高，重复性和稳定性好。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述荧光垫包被有荧光微球标记的抗体；所述荧光垫为经过处理的荧光垫，所述处理的方法包括：使用处理液1浸泡荧光垫后烘干，所述处理液1含有硼砂、葡萄糖和牛血清蛋白；
所述硼砂的浓度为10~25 mmol/L；
所述处理液1中葡萄糖的质量百分比为2~4%；
所述处理液1中牛血清蛋白的质量百分比为4~8%；
所述烘干的时间为2~5 h；温度为30~37℃；湿度小于<30%；
所述荧光微球标记的抗体包括真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体和鸡IgY抗体。
本发明的荧光免疫层析试纸条能够一次性检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖，无需加热处理，灵敏度和准确度高，重复性和稳定性好。
上述10~25 mmol/L中的具体点值可以选择10 mmol/L、12 mmol/L、14 mmol/L、18mmol/L、20 mmol/L、21 mmol/L、22 mmol/L、23 mmol/L、24 mmol/L、25 mmol/L等。
上述2~4%中的具体点值可以选择2%、3%、4%等。
上述4~8%中的具体点值可以选择4%、5%、6%、7%、8%等。
上述2~5 h中的具体点值可以选择2 h、3 h、4 h、5 h等。
上述30~37℃中的具体点值可以选择30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃等。
本发明采用双抗体夹心荧光免疫层析技术，检测人血清样本中的真菌(1-3)-β-D葡聚糖。在荧光垫上包埋荧光微球标记的真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体和荧光微球标记的鸡IgY抗体，在检测线（T）和质控线（C）上分别包被真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体和兔抗鸡IgY抗体。若检测样本为阳性，则样本中的真菌(1-3)-β-D葡聚糖与荧光微球标记的真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线（T）时与预包被的真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体反应，形成免疫复合物而呈现荧光条带，荧光标记鸡IgY抗体则在质控线（C）与兔抗鸡IgY抗体结合显现荧光条带。若检测样本为阴性，不会形成免疫复合物，在检测线处不会出现条带，仅在质控线（C）出现条带。质控线（C）在检测样本时均应出现条带，所显现的荧光条带是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。使用荧光免疫分析仪扫描检测区得到荧光信号，显示真菌(1-3)-β-D葡聚糖的浓度值。
优选地，所述荧光微球包括时间分辨荧光微球。
优选地，所述荧光微球表面修饰官能团包括羟基。
优选地，所述硝酸纤维素膜为经过处理的硝酸纤维素膜。
优选地，所述处理的方法包括：处理液2浸泡后烘干。
优选地，所述处理液2含有氯化钠和聚乙烯醇。
优选地，所述处理液2中氯化钠的质量百分比为0.8~1%。
上述0.8~1%中的具体点值可以选择0.8%、0.9%、1%等。
优选地，所述处理液2中聚乙烯醇的质量百分比为0.05~0.1%。
上述0.05~0.1%中的具体点值可以选择0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%等。
优选地，所述浸泡的时间为5~20 min。
上述5~20 min中的具体点值可以选择5 min、6 min、7 min、8 min、10 min、12min、14 min、16 min、20 min。
优选地，所述烘干的时间为2~5 h；温度为30~37℃；湿度小于<30%。
上述2~5 h中的具体点值可以选择2 h、3 h、4 h、5 h等。
上述30~37℃中的具体点值可以选择30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃等。
优选地，所述硝酸纤维素膜包被有测试线T和质控线C。
优选地，所述测试线T包被有真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体。
优选地，所述质控线C包被有兔抗鸡IgY抗体。
优选地，所述样品垫为经过处理的样品垫。
优选地，所述处理的方法包括：处理液3浸泡玻纤后烘干。
优选地，所述处理液3包括蛋白稳定剂。
优选地，所述蛋白稳定剂包括蔗糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、吐温20、聚乙烯醇或聚乙烯砒咯烷酮中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述处理液3包括PBS、甘露糖、吐温20和聚乙烯醇。
优选地，所述PBS的浓度为0.05~0.2 mol/L。
上述0.05~0.2 mol/L中的具体点值可以选择0.05 mol/L、0.06 mol/L、0.07 mol/L、0.08 mol/L、0.10 mol/L、0.12 mol/L、0.14 mol/L、0.16 mol/L、0.18 mol/L、0.2 mol/L等。
优选地，所述处理液3中蛋白稳定剂的质量百分比为0.1~2%。
上述0.1~2%中的具体点值可以选择0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.6%、1.8%、2%等。
优选地，所述烘干的时间为2~5 h；温度为30~37℃；湿度小于<30%。
上述2~5 h中的具体点值可以选择2 h、3 h、4 h、5 h等。
第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的免疫层析试纸的方法，所述方法包括：
使用荧光微球标记抗体，组装样本垫、荧光垫与硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，即得所述荧光免疫层析试纸条。
优选地，所述荧光微球标记抗体的方法包括以下步骤：
（1）荧光微球和缓冲液混合超声，离心，重新加入缓冲液得到得到荧光微球混合液，再次超声；
（2）缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合避光活化，活化后离心，使用清洗液对活化后的微球进行洗涤；
（3）加入抗体，混匀超声，避光标记；
（4）将加入抗体后的混合溶液离心得到沉淀，与封闭液混匀超声，避光封闭；
（5）再次离心得到沉淀，使用荧光微球复溶液重悬超声。
步骤（1）中所述缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-吗啉乙磺酸或3-吗啉丙磺酸中任意一种。
步骤（1）中所述缓冲液浓度为20~50 mmol/L，pH为6~8。
上述20~50 mmol/L中的具体点值可以选择10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25mmol/L、30 mmol/L、35 mmol/L、40 mmol/L、45 mmol/L、50 mmol/L等。
上述pH6~8中的具体点值可以选择6、6.5、7、7.5、8等。
步骤（1）中所述荧光微球和缓冲液体积比为1:（6~10）。
上述6~10中的具体点值可以选择6、7、8、9、10等。
步骤（1）中所述超声的时间为1~5 min。
上述1~5 min中的具体点值可以选择1 min、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min、3.5min、4 min、4.5 min、5 min等。
步骤（1）中所述离心的温度为4~30℃，转速为15000~20000 g，离心10~30min。
上述4~10℃中的具体点值可以选择4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃等。
上述15000~20000 g中的具体点值可以选择15000 g、16000 g、17000 g、18000 g、19000 g、19950 g、20000 g等。
上述10~30 min中的具体点值可以选择10 min、15 min、20 min、25 min、30 min等。
步骤（2）中所述水溶N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10~50 mg/mL。
步骤（2）中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为10~50mg/mL。
上述10~50 mg/mL中的具体点值可以选择10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL、50 mg/mL等。
步骤（2）中所述活化的转速为30~50 r/min，活化的时间为10~20 min。
上述30~50 r/min中的具体点值可以选择30 r/min、34 r/min、36 r/min、38 r/min、40 r/min、44 r/min、46 r/min、48 r/min、50 r/min等。
上述10~20 min中的具体点值可以选择10 min、11 min、12 min、13 min、14 min、15min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min等。
步骤（2）中所述用清洗液对活化后的微球洗涤，次数为1~3次。
上述1~3次中的具体点值可以选择1次、2次、3次等。
步骤（2）中所述用清洗液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-吗啉乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、吐温或S17中任意一种或至少两种的组合，所述清洗液浓度为0.1~0.5%。
上述0.1~0.5%中的具体点值可以选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%等。
步骤（3）中所述标记的转速为30~50 r/min，活化的时间为1~16 h。
上述30~50 r/min中的具体点值可以选择30 r/min、34 r/min、36 r/min、38 r/min、40 r/min、44 r/min、46 r/min、48 r/min、50 r/min等。
上述1~16 h中的具体点值可以选择1 h、2 h、4 h、6 h、16 h等。
步骤（3）中所述微球与抗体的质量比为10:(1~5)。
上述1~5中的具体点值可以选择1、2、3、4、5等。
步骤（4）中所述封闭的转速为30~50 r/min，封闭的时间为30~60 min。
上述30~50 r/min中的具体点值可以选择30 r/min、34 r/min、36 r/min、38 r/min、40 r/min、44 r/min、46 r/min、48 r/min、50 r/min等。
上述30~50 min中的具体点值可以选择30 min、35 min、40 min、45 min、50 min等。
步骤（4）中所述封闭液包括牛血清蛋白、酪蛋白、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇中任意一种，所述封闭液的浓度为0.5-1%；
上述0.5~1%中的具体点值可以选择0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等。
第三方面，本发明提供了一种检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸。
优选地，所述试剂盒还包括样本处理液。
优选地，所述样本处理液包括样本处理液A和样本处理液B；所述样本处理液A包括氢氧化物溶液和氯化物溶液；所述样本处理液B包括缓冲溶液。
优选地，所述氢氧化物溶液包括氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液中任意一种；氯化物溶液包括氯化钾溶液或氯化钠溶液中任意一种。
优选地，所述缓冲溶液包括4-吗啉乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或3-吗啉丙磺酸缓冲液中任意一种。
优选地，所述氢氧化物溶液的浓度为0.1~1 M。
优选地，所述缓冲溶液的浓度为0.1~1 M。
上述0.1~1 M中的具体点值可以选择0.1 M、0.2 M、0.4 M、0.6 M、0.8 M、0.9 M、1M等。
优选地，所述样本、样本处理液A和样本处理液B的体积比(0.5~2):1:1。
上述0.5~2中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸或第三方面所述的检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的试剂盒在检测真菌中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）荧光免疫层析法使用的材料硝酸纤维素膜和玻纤中含有(1-3)-β-D葡聚糖，本发明对这些材料分别用不同的处理液进行二次处理，消除了材料中(1-3)-β-D葡聚糖的干扰，增强了荧光免疫层析检测的敏感性；
（2）本发明中的样本处理液及处理方式也进行了优化，相较于基于鲎试剂的葡聚糖显色检测试剂盒样本碱处理后加热孵育（酶联免疫法、磁微粒化学发光法试剂盒中样本处理常常需要孵育），本发明无需加热处理，加入处理液后涡旋混匀可直接检测，操作简单便捷，提高了荧光免疫层析检测的敏感性和特异性。
附图说明
图1为荧光免疫层析试纸条的结构示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
制备例1
使用荧光微球标记抗体。
（1）荧光微球和50 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液混合超声1 min，10℃，18000 g离心20 min，重新加入50 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液得到得到荧光微球混合液，再次超声1min，荧光微球和缓冲液的体积比是1：9；
（2）50 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和浓度是20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，各加10 μL与荧光微球混合，避光活化15 min，活化后离心，使用清洗液对活化后的微球进行洗涤2次；
（3）微球与抗体质量比10:1混合，混匀超声1 min，避光标记1 h；
（4）将加入抗体后的混合溶液10℃，18000 g离心20 min，加入封闭液混匀超声1min，避光封闭1 h；
（5）10℃，18000 g离心20 min得到沉淀，使用荧光微球复溶液重悬超声1min。
制备例2
（1）荧光微球和50 mmol/L的4-吗啉乙磺酸缓冲液混合超声1 min，30℃，15000 g离心10 min，重新加入50 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液得到得到荧光微球混合液，再次超声1 min，荧光微球和缓冲液的体积比是1:9；
（2）50 mmol/L的4-吗啉乙磺酸缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和浓度是10 mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度，各加10 μL与荧光微球混合，避光活化15 min，活化后离心，使用清洗液对活化后的微球进行洗涤2次；
（3）微球与抗体质量比10:5混合，混匀超声1 min，避光标记1 h；
（4）将加入抗体后的混合溶液10℃，18000 g离心20 min，加入封闭液混匀超声1min，避光封闭1 h；
（5）10℃，18000 g离心20 min得到沉淀，使用荧光微球复溶液重悬超声1min。
制备例3
使用荧光微球标记抗体。
（1）荧光微球和20 mmol/L的3-吗啉丙磺酸缓冲液混合超声1 min，4℃，20000 g离心30 min，重新加入50 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液得到得到荧光微球混合液，再次超声5 min，荧光微球和缓冲液的体积比是1:9；
（2）20 mmol/L的3-吗啉丙磺酸缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度是50 mg/mL，各加10μL与荧光微球混合，避光活化15min，活化后离心，使用清洗液对活化后的微球进行洗涤2次；
（3）微球与抗体质量比10:1混合，混匀超声1 min，避光标记16 h；
（4）将加入抗体后的混合溶液10℃，18000 g离心20 min，加入封闭液混匀超声1min，避光封闭1 h；
（5）10℃，18000 g离心20 min得到沉淀，使用荧光微球复溶液重悬超声1min。
制备例4
与制备例1区别仅在于将50 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度替换为60 mg/mL。
制备例5
与制备例1区别仅在于将50 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度替换为5 mg/mL。
制备例6
与制备例1区别仅在于将清洗液对活化后的微球进行洗涤的次数替换为3次。
制备例7
与制备例1区别仅在于将清洗液对活化后的微球进行洗涤的次数替换为5次。
制备例8
与制备例1区别仅在于将清洗液对活化后的微球不进行洗涤。
制备例9
与制备例1区别仅在于标记过程中的缓冲液替换为25 mmol/L的4-吗啉乙磺酸缓冲液。
测试例1
使用制备例制备的微球标记抗体检样本信噪比（P/N）结果如表1所示。
表1
结果：使用制备例1-3制备的微球标记抗体检样本的信噪比＞30，说明样本区分好，制备例4-5用缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度替换为5 mg/mL、60 mg/mL，结果变差，制备例6将洗涤微球的次数增加到3次，样本区分较好，制备例7-8过多的洗涤微球或者不洗涤微球，结果均较差，制备例9将标记过程中的缓冲液换成25 mmol/L的4-吗啉乙磺酸缓冲液，对试验结果无影响。
实施例1
本实施例制备检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的荧光免疫层析试剂盒。
试纸条各个组分处理液的组成成分如表2所示。
表2
实施例2
本实施例制备检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的荧光免疫层析试剂盒。
试纸条各个组分处理液的组成成分如表3所示。
表3
实施例3
本实施例制备检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的荧光免疫层析试剂盒。
试纸条各个组分处理液的组成成分如表4所示。
表4
实施例4
本实施例与实施例1区别仅在于硝酸纤维素膜处理液中仅含有氯化钠。
实施例5
本实施例与实施例1区别仅在于荧光垫处理液中仅含有硼砂和葡萄糖。
实施例6
本实施例与实施例1区别仅在于荧光垫处理液中仅含有硼砂和牛血清蛋白。
实施例7
本实施例与实施例1区别仅在于样品垫处理液中仅含有PBS和甘露糖。
实施例8
本实施例与实施例1区别仅在于样品垫处理液中仅含有PBS和聚乙烯醇。
实施例9
本实施例与实施例1区别仅在于样品垫处理液中仅含有PBS、吐温和甘露糖。
实施例10
本实施例与实施例1区别仅在于样品垫处理液中仅含有PBS、吐温和聚乙烯醇。
实施例11
本实施例与实施例1区别仅在于硝酸纤维素膜处理液中氯化钠浓度替换为2%。
实施例12
本实施例与实施例1区别仅在于硝酸纤维素膜中聚乙烯醇浓度替换为0.2%。
实施例13
本实施例与实施例1区别仅在于荧光垫处理液中硼砂浓度替换为0.03 mmol/L。
实施例14
本实施例与实施例1区别仅在于荧光垫处理液中葡萄糖浓度替换为5%。
实施例15
本实施例与实施例1区别仅在于荧光垫处理液中牛血清蛋白浓度替换为10%。
实施例16
本实施例与实施例1区别仅在于样品垫处理液中甘露糖浓度替换为2%。
实施例17
本实施例与实施例1区别仅在于样品垫处理液中吐温浓度替换为2%。
实施例18
本实施例与实施例1区别仅在于样品垫处理液中聚乙烯醇浓度替换为2%。
测试例2
进行准确性和重复性检测。
使用实施例1-18得到的试剂盒对参考品进行准确性及重复性检测，结果如表5所示。
表5
结果：利用本发明试剂盒对参考品进行10次重复检测，实施例1-3制备的试剂盒检测参考品重复性CV≤10%，实施例4-6制备的试剂盒硝酸纤维素膜处理液和荧光垫处理液只含其中一种成分，重复性较差，组内/间CV＞15%，实施例7-10制备的试剂盒样本处理液中蛋白稳定剂含有其中一种或两种成分，重复性CV≤10%，说明本发明试剂盒处理液成份具有协同促进作用，实施例11-18处理液成份不在本发明限定的浓度范围内，结果组内/间CV＞10%，重复性较差。
测试例3
不同预处理溶液处理后的相关性。浓度值<70 pg/mL，则判为阴性。70 pg/mL ≤浓度值 ≤ 95 pg/mL，则判为灰区。浓度值>95 pg/mL，则判为阳性。
表6
结果：使用鲎试剂处理液和5种AB液处理液对10例临床样本进行检测，与鲎试剂结果做相关性，数据统计结果显示：5种处理液相关性分别为：98.74%、96.87%、96.82%、81.45%和88.20%。处理液1-3相关性均＞95%，测量准确性较高，处理液4、5种各成分浓度不在限定浓度范围内，相关性差。
测试例4
本发明实施例1试剂盒与市售试剂盒同时检测临床样本阴性样本192例，阳性样本169例，根据检测结果的阴阳性，计算其敏感性和特异性，结果如表7。
表7
结果：使用实施例1-3、7-10提供的荧光免疫层析试剂条检测临床样本，临床符合率＞90%，敏感性高，特异性好，实施例4-6说明本发明中免疫层析试纸硝酸纤维素膜处理液和荧光垫处理液的成份具有协同作用，共同发挥作用促进荧光免疫层析试剂条的敏感性和特异性，实施例11-18说明本发明中的荧光免疫层析试剂条硝酸纤维素膜处理液，荧光垫处理液，样品垫处理液成份精准控制浓度范围才可以发挥促进荧光免疫层析试剂条的敏感性和特异性的作用。
综上所述，本发明的荧光免疫层析试纸条能够一次性检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体，无需加热处理，灵敏度和准确度高，重复性和稳定性好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种检测(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸，其特征在于，所述免疫层析试纸包括样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述荧光垫包被有荧光微球标记的抗体；
所述荧光垫为经过处理的荧光垫，所述处理的方法包括：使用处理液1浸泡荧光垫后烘干；
所述处理液1含有硼砂、葡萄糖和牛血清蛋白；
所述硼砂的浓度为10~25 mmol/L；
所述处理液1中葡萄糖的质量百分比为2~4%；
所述处理液1中牛血清蛋白的质量百分比为4~8%；
所述烘干的时间为2~5 h；温度为30~37℃；湿度小于<30%；
所述荧光微球标记的抗体包括真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体和鸡IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述荧光微球包括时间分辨荧光微球；
所述荧光微球表面修饰官能团包括羟基。
3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜为经过处理的硝酸纤维素膜；
所述处理的方法包括：处理液2浸泡后烘干；
所述处理液2含有氯化钠和聚乙烯醇；
所述处理液2中氯化钠的质量百分比为0.8~1%；
所述处理液2中聚乙烯醇的质量百分比为0.05~0.1%；
所述浸泡的时间为5~20 min；
所述烘干的时间为2~5 h；温度为30~37℃；湿度小于<30%；
所述硝酸纤维素膜包被有测试线T和质控线C；
所述测试线T包被有真菌(1-3)-β-D葡聚糖抗体；
所述质控线C包被有兔抗鸡IgY抗体。
4.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于，所述样品垫为经过处理的样品垫；
所述处理的方法包括：处理液3浸泡玻纤后烘干；
所述处理液3包括蛋白稳定剂；
所述蛋白稳定剂包括蔗糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、吐温20、聚乙烯醇或聚乙烯砒咯烷酮中任意一种或至少两种的组合；
所述处理液3包括PBS、甘露糖、吐温20和聚乙烯醇；
所述PBS的浓度为0.05~0.2 mol/L；
所述处理液3中蛋白稳定剂的质量百分比为0.1~2%；
所述烘干的时间为2~5 h；温度为30~37℃；湿度小于<30%。
5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的免疫层析试纸的方法，其特征在于，所述方法包括：
使用荧光微球标记抗体，组装样本垫、荧光垫与硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，即得所述荧光免疫层析试纸条。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光微球标记抗体的方法包括以下步骤：
（1）荧光微球和缓冲液混合超声，离心，重新加入缓冲液得到得到荧光微球混合液，再次超声；
（2）缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合避光活化，活化后离心，使用清洗液对活化后的微球进行洗涤；
（3）加入抗体，混匀超声，避光标记；
（4）将加入抗体后的混合溶液离心得到沉淀，与封闭液混匀超声，避光封闭；
（5）再次离心得到沉淀，使用荧光微球复溶液重悬超声；
步骤（1）中所述缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-吗啉乙磺酸或3-吗啉丙磺酸中任意一种；
步骤（1）中所述缓冲液浓度为20~50 mmol/L，pH为6~8；
步骤（1）中所述荧光微球和缓冲液体积比为1:(6~10)；
步骤（1）中所述超声的时间为1~5 min；
步骤（1）中所述离心的温度为4~30℃，转速为15000~20000 g，离心时间为10~30 min；
步骤（2）中所述缓冲液溶N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10~50 mg/mL；
步骤（2）中所述缓冲液溶1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为10~50mg/mL；
步骤（2）中所述活化的转速为30~50 r/min，活化的时间为10~60 min；
步骤（2）中所述用清洗液对活化后的微球洗涤的洗涤次数为1~3次；
步骤（2）中所述用清洗液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-吗啉乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、吐温20或S17中任意一种或至少两种的组合；所述清洗液浓度为0.1~0.5%；
步骤（3）中所述标记的转速为30~50 r/min，标记的时间为1~16 h；
步骤（3）中所述微球与抗体的质量比为10:(1~5)；
步骤（4）中所述封闭的转速为30~50 r/min，封闭的时间为30~60 min；
步骤（4）中所述封闭液包括牛血清蛋白、酪蛋白、聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙二醇中任意一种；所述封闭液的浓度为0.5~1%。
7.一种检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本处理液；
所述样本处理液包括样本处理液A和样本处理液B；所述样本处理液A包括氢氧化物溶液和氯化物溶液；所述样本处理液B包括缓冲溶液；
所述氢氧化物溶液包括氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液中任意一种；氯化物溶液包括氯化钾溶液或氯化钠溶液中任意一种；
所述缓冲溶液包括4-吗啉乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或3-吗啉丙磺酸缓冲液中任意一种；
所述氢氧化物溶液的浓度为0.1~1 M；
所述缓冲溶液的浓度为0.1~1 M；
所述样本、样本处理液A和样本处理液B的体积比(0.5~2):1:1。
9.权利要求1-4中任一项所述的检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的免疫层析试纸或权利要求7或8所述的检测真菌(1-3)-β-D葡聚糖的试剂盒在检测真菌中的应用。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008164579A (ja) * | 2006-12-05 | 2008-07-17 | Naohito Ono | 抗β−グルカン抗体測定方法と測定キット |
| CN102305787A (zh) * | 2010-09-08 | 2012-01-04 | 天津市一瑞生物工程有限公司 | 真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法 |
| CN103788190A (zh) * | 2012-10-26 | 2014-05-14 | 沈阳药科大学 | β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用 |
| CN107449898A (zh) * | 2017-07-11 | 2017-12-08 | 中检国研(北京)科技有限公司 | 一种卡那霉素残留荧光免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN109541234A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-29 | 东莞东阳光科研发有限公司 | 一种精确定量检测免疫层析试纸条的制备方法 |
| CN115436639A (zh) * | 2022-07-26 | 2022-12-06 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法 |
| CN115840038A (zh) * | 2023-01-16 | 2023-03-24 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7385296B2 (ja) * | 2019-03-08 | 2023-11-22 | 積水メディカル株式会社 | 生体試料中のβ－Ｄ－グルカンの免疫学的分析方法、及びβ－Ｄ－グルカン分析用キット |
-
2023
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008164579A (ja) * | 2006-12-05 | 2008-07-17 | Naohito Ono | 抗β−グルカン抗体測定方法と測定キット |
| CN102305787A (zh) * | 2010-09-08 | 2012-01-04 | 天津市一瑞生物工程有限公司 | 真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法 |
| CN103788190A (zh) * | 2012-10-26 | 2014-05-14 | 沈阳药科大学 | β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用 |
| CN107449898A (zh) * | 2017-07-11 | 2017-12-08 | 中检国研(北京)科技有限公司 | 一种卡那霉素残留荧光免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN109541234A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-29 | 东莞东阳光科研发有限公司 | 一种精确定量检测免疫层析试纸条的制备方法 |
| CN115436639A (zh) * | 2022-07-26 | 2022-12-06 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种定量检测d-二聚体的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法 |
| CN115840038A (zh) * | 2023-01-16 | 2023-03-24 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 检测(1-3)-β-D-葡聚糖含量的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Nathan P. Wiederhold.Comparison of Lateral Flow Technology and Galactomannan and (133)- -D-Glucan Assays for Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis.CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY.2009,第16卷(第12期),全文. * |
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