CN116970593A - 丝氨酸蛋白酶同系物slp-1及其制备方法和应用 - Google Patents

丝氨酸蛋白酶同系物slp-1及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116970593A
CN116970593A CN202310199195.6A CN202310199195A CN116970593A CN 116970593 A CN116970593 A CN 116970593A CN 202310199195 A CN202310199195 A CN 202310199195A CN 116970593 A CN116970593 A CN 116970593A
Authority
CN
China
Prior art keywords
slp
serine protease
homolog
tag
met
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310199195.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张嵘
王夏璐
张景海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenyang Pharmaceutical University
Original Assignee
Shenyang Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenyang Pharmaceutical University filed Critical Shenyang Pharmaceutical University
Priority to CN202310199195.6A priority Critical patent/CN116970593A/zh
Publication of CN116970593A publication Critical patent/CN116970593A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
    • C12N9/6408—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了丝氨酸蛋白酶同系物SLP‑1及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明利用蛋白分离纯化技术从柞蚕中分离纯化获得天然丝氨酸蛋白酶同系物SLP‑1，解析其一级结构(基因和蛋白质)后利用基因工程技术实现丝氨酸蛋白酶同系物SLP‑1及其衍生物或类似物或部分片段基因在宿主细胞的表达，纯化获得重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP‑1及其衍生物或类似物或部分片段，免疫动物，获得相应的抗体。本发明的天然、重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP‑1以及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体可广泛应用于针对微生物的预防、检测、治疗药物等领域。

Description

丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的结构及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法，以及其在微生物及其相关分子模式检测、诱导昆虫产生抗菌肽、制备丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段抗体等方面的应用。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶及其同系物在昆虫血淋巴中的主要功能是参与先天性免疫反应。从家蚕鉴定的15个蛋白酶基因到烟草天蛾42个再到埃及伊蚊63个，丝氨酸蛋白酶在迄今为止研究的昆虫基因组中已经形成了较大的基因家族(丝氨酸蛋白酶超家族)。在目前对于丝氨酸蛋白酶及其同系物在免疫中的作用的研究报道中，丝氨酸蛋白酶作为一个超基因蛋白家族，在昆虫的各种组织中都有大量的表达，并且依靠蛋白质之间精确地相互作用形成级联反应体系发挥免疫防御的作用。科学家通过对果蝇，烟草天蛾和黄粉虫等模式识别昆虫的研究发现，参与果蝇Toll信号转导途径的丝氨酸蛋白酶有5个；在烟草天蛾中已经至少发现有7种丝氨酸蛋白酶及其同系物可参与到酚氧化酶原激活的过程中，还有一些有明确功能的丝氨酸蛋白酶可参与到Toll途径的激活过程中；黄粉虫中的MSP作为信号通路中第一个丝氨酸蛋白酶，可诱发丝氨酸蛋白酶级联放大反应，最终激活酚氧化酶原。在对丝氨酸蛋白酶的研究中，还发现一些丝氨酸蛋白酶也能在病毒侵染的过程中发挥出抗病毒功能，这也说明这类酶还是一种潜在的抗病毒因子。
先天性免疫是当今免疫学研究的一大热点，酚氧化酶原激活系统及Toll通路是昆虫体内重要的先天性免疫机制，丝氨酸蛋白酶及其同系物是免疫系统中最重要一环，在昆虫抵御病原微生物的入侵和感染相关反应中起着至关重要的作用。目前已知的丝氨酸蛋白酶同系物相对较少，且该类蛋白激活的结构基础，激活机制以及必要的激活条件，与上游分子及下游底物作用机制等生物学功能等方面均未得到系统的阐释，亦未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫丝氨酸蛋白酶同系物的结构、制备、生物学功能的研究。
发明内容：
本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1，研究天然丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所解决的技术问题是提供一种从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中获取一种丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的制备方法、结构、生物学功能及其应用。首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析该目的蛋白的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1基因在宿主细胞的表达，结合蛋白质分离纯化技术获得重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1。同时，利用基因重组技术，获得丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或部分片段。天然、重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物或类似物或部分片段可能特异性识别脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式，并能特异性激活由脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式以及细菌、真菌等微生物所诱导的酚氧化酶原激活系统。本发明的天然、重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体，可广泛应用于针对微生物的预防、检测、治疗药物等领域；同时，利用本发明的天然、重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物或类似物或部分片段作为抗原制备获得的抗体可应用于微生物的预防、检测、治疗药物等领域。
本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
基于上述技术方案，进一步地，所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。
本发明另一方面提供编码所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的基因。
基于上述技术方案，进一步地，所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明另一方面提供所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示全部序列或部分序列，且具有丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的生物学活性。
基于上述技术方案，进一步地，所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段选自Met-SLP-1、Met-His6标签-SLP-1、Met-SLP-1-His6标签、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-SLP-1-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-SLP-1-Flag标签、Met-Flag标签-SLP-1、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1-His6标签序列。
本发明另一方面提供所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的制备方法，天然丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的制备方法，包括：
以昆虫血淋巴作为原料，分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤一种或两种以上的组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的SLP-1。
SLP-1的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；(2)溶液的酸碱度在pH2-pH12，优选pH4-pH10；(3)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液，酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸，碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.6mol/L，优选0.01mol/L-0.2mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响SLP-1的生物活性。
本发明的分离分析方法包含如下一种或两种以上的组合：
1.离子交换层析分离纯化SLP-1
取上述方法所获昆虫血淋巴，按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从0.00mol/L-3mol/L。利用抗SLP-1抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有SLP-1的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征：(1)层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；(3)缓冲液及其浓度选择，按上述SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(5)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl；(6)分离纯化操作温度按上述SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响SLP-1的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。
2.亲和层析分离纯化SLP-1
取上述方法所获昆虫血淋巴，按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至SLP-1的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式，分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗SLP-1抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有SLP-1的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
亲和层析分离纯化的特征：(1)亲和填料的配基选择SLP-1抗体、脂多糖、肝素、刀豆素、甲醛固定后的细菌或真菌、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如苯甲咪)、sepharose CL-4B等；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L，选择尿素的最高浓度为8.0mol/L，选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L；(6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使SLP-1发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得SLP-1。
3.疏水层析分离纯化SLP-1
取上述方法所获昆虫血淋巴，按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至SLP-1的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2-3mol/L浓度，上样于预先用2-3mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2-3mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(3.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用2.5mol/L、2.0mol/L、1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗SLP-1抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有SLP-1的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
4.凝胶层析分离纯化SLP-1
取上述方法所获昆虫血淋巴，按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至SLP-1的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗SLP-1抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有SLP-1的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征：(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75 HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析添料；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。
5.盐析分离纯化SLP-1
取上述方法所获昆虫血淋巴，按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至SLP-1的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到SLP-1仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到SLP-1沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征：(1)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(2)分离纯化操作温度在0℃-45℃，优选0℃；(3)盐析使用的中性盐，选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4或Na2SO4；(4)在使SLP-1处于溶解状态时，选择中性盐在5％-50％，优选25％-40％；(5)在使SLP-1处于盐析沉淀状态时，选择中性盐在45％-90％，优选55％-70％。
6.超滤分离纯化SLP-1以及处理SLP-1溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴，按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至SLP-1的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化SLP-1。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使SLP-1透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使SLP-1得以分离纯化；透过超滤膜的SLP-1溶液，再选择一定规格的超滤膜，使SLP-1被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使SLP-1得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使SLP-1先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使SLP-1透过超滤膜，从而使SLP-1得以分离纯化。
超滤处理SLP-1溶液的目的，是除去SLP-1溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对SLP-1溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使SLP-1被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
超滤分离纯化和处理的特征：(1)透过SLP-1的超滤膜选择分子量为20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa规格的超滤膜，优选20kDa-50kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(2)截留SLP-1的超滤膜选择是分子量为3kDa或10kDa或20kDa或30kDa的超滤膜，优选10kDa-30kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(3)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按SLP-1提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
通过上述方法所获得的SLP-1纯度，有时无法满足相应需要。本发明是从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度SLP-1，并可以达到电泳纯乃至HPLC纯度，可将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或六种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。
本发明按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对SLP-1进行结构解析。包括：(1)利用生物质谱测定天然SLP-1的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对发明内容所获得SLP-1进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得SLP-1分子内多个片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物学技术方法从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNA pool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得SLP-1基因—cDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得SLP-1全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增SLP-1染色体基因，通过基因序列测定分析获得SLP-1染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述1-4所获得SLP-1的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列，彼此相互验证上述结构信息，获得SLP-1DNA序列。
本发明另一方面提供了重组SLP-1的衍生物或类似物的制备
本发明所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段选自Met-SLP-1、Met-His6标签-SLP-1、Met-SLP-1-His6标签、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-SLP-1-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-SLP-1-Flag标签、Met-Flag标签-SLP-1、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1-His6标签序列。
本发明的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段通过如下技术方案实现，包括：⑴将SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物编码DNA重组至表达载体；⑵用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；⑶在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；⑷收获并纯化所得到的目的蛋白。
本发明同时提供上述SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
本发明还提供了SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物的生物学功能及其应用
本发明再一个目的是针对天然、重组SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物体外对病原体相关分子模式及微生物诱导的酚氧化酶原激活系统的激活作用，确定了天然、重组SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物的生物活性。同时，考察SLP-1在机体免疫应答过程的表达，也研究了天然、重组SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物的应用。此外，本发明也研究了天然、重组SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本发明所述的天然、重组SLP-1及其部分片段或衍生物或类似物获得方法常规、简单、产量高；本发明的天然、重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体，可广泛应用于针对微生物的预防、检测、治疗药物等领域；同时，利用本发明的天然、重组丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1及其衍生物或类似物或部分片段作为抗原制备获得的抗体可应用于微生物的预防、检测、治疗药物等领域。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为天然SLP-1的分离纯化，其中，Lane M：Molecular weight markers；lane 1：方法1纯化的天然SLP-1；lane 2：方法2纯化的天然SLP-1；lane 3：方法3纯化的天然SLP-1。
图2为重组SLP-1(原核表达体系)分离纯化电泳图谱，其中，Lane M：Molecularweight markers；lane 1：无标签SLP-1；lane 2：N端前融合组氨酸标签的SLP-1；lane 3：N端前融合组氨酸标签-SUMO标签及凝血酶酶切位点的SLP-1；lane 4：C端后融合组氨酸标签的SLP-1。
图3为重组SLP-1(昆虫表达体系)分离纯化电泳图谱其中，Lane M：Molecularweight markers；lane 1：pFastBac1-sf9昆虫表达体系的重组SLP-1；lane 2：pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系的SLP-1。
图4为SLP-1mRNA表达量与免疫相关性。
图5为外源性重组SLP-1及其多克隆抗体对酚氧化酶原激活系统的影响，其中，HL：柞蚕血淋巴，SLP-1：重组SLP-1蛋白；Ab：重组SLP-1兔源多克隆抗体；误差线为均值±标准差，实验重复3次；*代表t检验具有显著性差异，P<0.1、**代表t检验具有显著性差异，P<0.05、****代表t检验具有显著性差异，P<0.001。
图6为降低内源性SLP-1对酚氧化酶原激活系统的抑制作用，其中，Buffer：注射缓冲溶液对照组；dsEGFP：注射EGFP双链RNA 36h后的血淋巴；dsSLP-1：注射SLP-1双链RNA36h后的血淋巴；误差线为均值±标准差，实验重复3次；**代表t检验具有显著性差异，P<0.05；***代表t检验具有显著性差异，P<0.01。
图7为SLP-1与病原体相关分子模式结合能力分析，其中，A：SLP-1与LPS结合；B：SLP-1与DAP-PGN结合；C：SLP-1与Lys-PGN结合；D：SLP-1与Laminarin结合；E：SLP-1与LTA结合；F：SLP-1与Mannan结合。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1：天然SLP-1的分离纯化
本实施例将柞蚕用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至-5℃条件下收集血淋巴。
1.方法-1
收取血淋巴，经硫酸铵沉淀后收集沉淀，溶解于10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4缓冲溶液中，流经LPS修饰的Sepharose 4B，按下列洗脱条件分别进行洗脱：10mMTris-HCl，500mM NaCl，pH7.4；10mM Tris-HCl，150mM NaCl，4M Urea，pH7.4；10mM Tris-HCl，150mM NaCl，8MUrea，pH7.4，收集目的组分。目的组分经10mM甘氨酸/氢氧化钠pH 8.5透析后流经羟基磷灰石HPLC，平衡缓冲液为10mM，pH8.5甘氨酸/氢氧化钠缓冲液，10-150mM甘氨酸/氢氧化钠pH8.5和150mM-1M甘氨酸/氢氧化钠pH8.5两次线性梯度洗脱。收集组分以10mM Tris-HCl pH7.4透析后流经Mono S HPLC，使用0-0.1M NaCl进行线性梯度洗脱，获得目的蛋白成分。
试验结果如图1，lane1，天然SLP-1的纯度达到电泳纯。
2.方法-2
将溶于昆虫生理盐水(120mM NaCl、0.9mM CaCl2、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mMNaHCO3、1mM NaH2PO4、38.8mM葡萄糖)的真菌(白色念珠菌)、革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰阴性菌(大肠杆菌)混合物(10μl)注射柞蚕体内，诱导24～48小时后收集菌诱导后的血淋巴，用50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5稀释10倍，流经Mono-Q离子交换层析柱，利用0.05-1.5M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5进行线性梯度洗脱。收集目的组分，利用超滤膜浓缩至1mL后上样至凝胶过滤层析(Toyopearl HW-55S，1×30cm)，平衡与洗脱体系均为50mMTris-HCl 150mM NaCl 3mM EDTA pH 7.5，获得目的蛋白成分。
试验结果如图1，lane2，天然SLP-1的纯度达到电泳纯。
3.方法-3
将溶于抗凝缓冲溶液的柞蚕体液离心去除血细胞后进行硫酸铵分级沉淀，取30～45％沉淀组分用硼砂-氢氧化钠缓冲液(0.05mol/L，pH9.0)溶解稀释，上样于SP-Sepharose阴离子交换柱，采用50mM-1.5MNaCl洗涤洗脱；将含有目的蛋白的组分上样于Phenyl-sepharose6-Fast Flow洗涤洗脱；将含有目的物的组分用透析后，在相同条件下上样于肝素层析柱，20mM Tris-HCl，0.3M NaCl pH5.0洗脱；洗脱组分利用超滤除盐，将含有目的片段的组分上样于LPS亲和层析柱Sepharose CL-6B column进一步的分离纯化，从而获得目的蛋白。
试验结果如图1，lane3，天然SLP-1的纯度达到电泳纯。
实施例2：SLP-1结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法与手段，对SLP-1进行结构解析。获得天然SLP-1(也称成熟肽链，在本专利简称SLP-1)的一级结构-氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，编码天然SLP-1的基因序列如SEQ ID NO：2所示。
利用分子生物学技术、方法获得SLP-1全长的cDNA序列，如SEQ ID NO：3所示，SLP-1基因开放阅读框全长1266bp，可编码421个氨基酸残基(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)，其N端包含16个氨基酸残基的信号肽区域。
针对本发明SLP-1的结构进行同源比对结果显示，SLP-1与烟草天蛾serineproteinase-like protein 4的一致性为58％、与烟草天蛾serine proteinase-likeprotein 1b的一致性为55％、与家蚕clip domain serine protease 11的一致性为55％、与棉铃虫serine proteinase-like protein 1的一致性为54％。
实施例3：利用原核生物表达系统获得重组SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
SLP-1衍生物、类似物、活性片段结构
(1)Met-SLP-1氨基酸序列
MQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTY
(2)Met-His6标签-SLP-1氨基酸序列
MHHHHHHQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTY
(3)Met-SLP-1-His6标签氨基酸序列
MQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNG KDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTYHHHHHH
(4)Met-His6标签-凝血酶酶切位点-SLP-1氨基酸序列
MHHHHHHLVPRGSQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTY
(5)Met-GST标签-凝血酶酶切位点-SLP-1氨基酸序列
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYEGDEGDKWGNKKFELGLEFPNLPWYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVP RGSQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTY
(6)Met-SLP-1-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列
MQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNY YDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTYLVPRGSSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYEGDEGDKWGNKKFELGLEFPNLPWYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD
(7)Met-SLP-1-Flag标签氨基酸序列
MQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTYDYKDDDDK
(8)Met-Flag标签-SLP-1氨基酸序列
MDYKDDDDKQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTY
(9)Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1氨基酸序列
MHHHHHHSASGGTGDEDKKPNDQMVHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQMRKLMNAYCDRQSVDMNSIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEEGDEIDAMLHQTGGSCCTCFSNFLVPRGSQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVE VQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTY
(10)Met-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1-His6标签氨基酸序列
MSASGGTGDEDKKPNDQMVHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQMRKLMNAYCDRQSVDMNSIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEEGDEIDAMLHQTGGSCCTCFSNFLVPRGSQGMKLLNEIIKRIFPLPSIETSTTRTTTSSTAKTAMNEIKPTAFVPPLNTNETSCTLNGKDGICVPYYLCDSNNKINVGGEGLVESRSFGPCLSNLDVCCFRPDQISSTEPNIKKMEPLKLQREGCGWANPEGVGMRTTDETDGKTKFGEFPWMVAIVKTESLIDNYPNGPNGTVYVGGGSLIHPSVVLTAAHIIKDRLNLKVRAGEWDTRTTKEIYRHQERDVESIVIHKEFNEETNYYDVAVLFLKSPMDMAPNVGVVCLPSHDDMAYPDTRCFASGWGKDKSTIQGRYSTTLKKVEVQVVAHDTCQASLRTSILSYYFQLHSTFMCASGKPGKDTCKGDGGSPLVCPIQFEKDRYVQNGIVSWGIRCGETGIPGVYVDVSKVRNWIDDEVRGKGYMSEVYTYHHHHHH。
原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.SLP-1基因表达载体的构建
根据SLP-1的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNApool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建SLP-1基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征：1.以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在SLP-1的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在SLP-1的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在亲和层析标签与SLP-1之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然SLP-1蛋白结构一致的重组SLP-1蛋白。
2.重组SLP-1蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的获得
利用基因工程技术，将SLP-1基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB培养基，诱导SLP-1基因的表达，从而获得含有SLP-1的培养液或菌体。菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组SLP-1的原料液备用。
重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.SLP-1基因可表达于细胞内或细胞外；4.存在于细胞内的SLP-1需通过裂解液裂解、超声破碎等方式将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含SLP-1的原料液中分离纯化重组SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如：(1)采用pTYB11构建无标签SLP-1表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，SLP-1表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化SLP-1的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化SLP-1至电泳纯(图2，lane1)。
(2)采用pET-28a构建N端前融合组氨酸标签的SLP-1基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，His-SLP-1表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50mmol/L PBS,0.15mol/L NaCl,50mmol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化SLP-1的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化SLP-1至电泳纯(图2，lane2)。
(3)采用pET-28a-SUMO构建N端前融合组氨酸-SUMO标签及凝血酶酶切位点的SLP-1表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，His-SUMO-凝血酶酶切位点-SLP-1表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液并通过凝血酶水解去除标签的样品作为进一步分离纯化SLP-1的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化SLP-1至电泳纯(图2，lane3)。
(4)采用pET20b构建C端后融合组氨酸标签的SLP-1基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，SLP-1-His表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化SLP-1至电泳纯(图2，lane4)。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得SLP-1，该重组SLP-1的结构与天然SLP-1的结构相同。
实施例4：利用真核生物表达系统获得重组SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明SLP-1及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段
将SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-SLP重组表达质粒，转座大肠杆菌DH10，Bluo-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid，转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组SLP-1在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化SLP-1至电泳纯。表达产物的结构如图4所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3，lane 1。
2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段
将SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段基因连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-SLP-1重组表达质粒，转座大肠杆菌DH5，Bluo-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid，转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组SLP-1在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.5mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度，纯化后的电泳鉴定结果如图3，lane 2。
实施例5：抗SLP-1抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4获得的各种SLP-1作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中SLP-1抗体产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了SLP-1抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有SLP-1抗体的血清中分离纯化不同纯度的SLP-1抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的SLP-1抗体，以适于不同要求的应用。
实施例6：重组及天然SLP-1、衍生物、类似物、活性片段及其抗体的生物活性
本实施例中重组、天然SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段的应用范围。
1.SLP-1与微生物感染的相关性分析
用昆虫生理盐水将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌注射到柞蚕幼虫体内，于0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h后分别收取柞蚕幼虫，提取全虫总RNA，逆转录后，实时定量PCR方法检测SLP-1在mRNA水平表达量变化情况，结果如图4所示，SLP-1在受到三种病原菌诱导后，表达量均逐渐上调，并在诱导18h达到峰值，而后逐渐降低。上述实验结果表明，SLP-1与昆虫先天性免疫防御系统有一定的相关性。
2.SLP-1及其抗体对酚氧化酶原激活系统的影响
(1)外源性重组SLP-1及其多克隆抗体对酚氧化酶原激活系统的影响
采用革兰阴性菌、革兰阳性菌及真菌代表性的PAMPs：DAP-PGN、Lys-PGN和Laminarin分别激活柞蚕血淋巴，随后添加重组SLP-1考察外源性SLP-1对上述激活的影响程度。另一方面，外源添加SLP-1多克隆抗体对血淋巴中内源性表达的SLP-1功能进行封闭，反向考察内源性SLP-1对酚氧化酶原激活系统的影响。以天然血淋巴作为对照组，实验结果如图5所示，与对照组相比，PAMPs能显著激活酚氧化酶级联激活系统。外源重组SLP-1可明显增强该过程，而抗SLP-1多克隆抗体则可显著抑制该过程。上述实验现象表明，血淋巴中SLP-1参与激活PAMPs介导的酚氧化酶原级联系统并诱导PO的产生。
(2)降低内源性SLP-1对酚氧化酶原激活系统的抑制作用
为进一步检测内源性SLP-1对PPO-AS的影响，利用RNAi技术，通过向柞蚕幼虫注射SLP-1双链RNA而下调SLP-1的表达量。以注射缓冲溶液组及dsEGFP组作为对照组，收集干扰36h后的柞蚕血淋巴，在6种PAMPs诱导的情况下，考察各组体液中PPO的激活情况。结果如图6所示，SLP-1干扰组与注射dsEGFP和缓冲溶液组相比，各组PO活力均显著降低，反向说明血淋巴中SLP-1参与激活PAMPs介导的酚氧化酶原级联系统。
3.SLP-1及其类似物、活性片段与微生物相关分子模式的结合特异性
采用微量热泳动仪(MST)检测SLP-1及其类似物、活性片段对6种可溶性的、分别来自不同种微生物的典型分子模式(PAMP)的识别能力。Lys-PGN和LTA属于革兰阳性菌的特异PAMPs，DAP-PGN和LPS属于革兰阴性菌的特异PAMPs，laminarin(可溶性β-1,3葡聚糖)和Mannan属于真菌的特异PAMP。相同浓度的PAMP被包被在探头上，将SLP-1或其类似物、活性片段分别与探头共孵育，通过测定样品在微观温度梯度场中分子的定向运动，检测重组PGRP-SA或其类似物、活性片段与可溶性微生物相关分子模式的结合情况。如图7所示，重组His6-SLP-1与6种可溶性PAMPs均有明显的识别结合作用。采用实施例1、3、4中所述天然SLP-1或重组SLP-1类似物、活性片段可获得相同的实验结果。
上述实验结果表明：本发明专利的天然、重组SLP-1以及其衍生物、类似物、活性片段，能够特异性识别来自不同种微生物的典型分子模式，并显著激活酚氧化酶原激活系统，而抗SLP-1抗体可抑制酚氧化酶原激活系统。
实施例7：天然、重组SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段与抗体的应用
本实施例以SLP-1的生物活性为代表进行描述，SLP-1衍生物、类似物、活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段与抗体的应用范围。
1.SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段用于微生物的检测
如实施例6中所描述，SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段可特异性结合脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式，并作为酚氧化酶原激活系统的有效激活成分，抗SLP-1抗体则可通过封闭SLP-1的活性而作为该过程的抑制剂。
取任何待检测病原微生物，利用天然SLP-1或重组SLP-及其衍生物、类似物、活性片段通过对其所含有的典型分子模式，即脂多糖或β-1,3-葡聚糖或肽聚糖或脂磷壁酸或甘露聚糖的识别，即可进行微生物检查；此外，亦可将待检微生物加入额外补充SLP-1的柞蚕血淋巴中，对照组是将同样剂量的待检测微生物的样品加入未补充SLP-1的柞蚕血淋巴中。在相同时间观察血淋巴中PPO系统的激活情况，实验组与对照组具有显著差异，表明检测样品中含有微生物或其相关分子模式。
2.SLP-1及其类似物、活性片段抗体的应用
针对实施例5获得的SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段作的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用的技术、方法等，通过SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的SLP-1免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备SLP-1过程中免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
在任何待检测微生物的样品中，加入足够剂量的SLP-1抗体，按照本实施例中的SLP-1及其衍生物、类似物、活性片段用于微生物的检测所述方法，进行待检测样品的微生物检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。

Claims (10)

1.一种丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1，其特征在于，所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。
3.编码权利要求1或2所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的基因。
4.根据权利要求3所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.权利要求1或2所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示全部序列或部分序列，且具有丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的生物学活性。
6.根据权利要求5所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段选自Met-SLP-1、Met-His6标签-SLP-1、Met-SLP-1-His6标签、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-SLP-1-凝血酶酶切位点-GST标签、Met-SLP-1-Flag标签、Met-Flag标签-SLP-1、Met-His6标签-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1、Met-SUMO标签-凝血酶酶切位点-SLP-1-His6标签序列。
7.权利要求1或2所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的制备方法，其特征在于，利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴、血液、血细胞裂解物、淋巴液、匀浆液中的一种或两种以上的组合作为原料液，通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中一种或两种以上方法的组合获得电泳纯乃至HPLC纯度的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1；
或者将编码所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1。
8.权利要求5或6所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段的制备方法，其特征在于，将编码所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段的基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，分离纯化后获得重组表达的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段。
9.权利要求1或2所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1或权利要求5或6所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段的抗体，其特征在于，以所述的天然丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1或所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生。
10.权利要求1或2所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1或权利要求5或6所述的丝氨酸蛋白酶同系物SLP-1的衍生物或类似物或活性片段或权利要求9所述的抗体在影响酚氧化酶原激活系统、微生物及其相关分子模式检测中的应用。
CN202310199195.6A 2023-03-03 2023-03-03 丝氨酸蛋白酶同系物slp-1及其制备方法和应用 Pending CN116970593A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310199195.6A CN116970593A (zh) 2023-03-03 2023-03-03 丝氨酸蛋白酶同系物slp-1及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310199195.6A CN116970593A (zh) 2023-03-03 2023-03-03 丝氨酸蛋白酶同系物slp-1及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116970593A true CN116970593A (zh) 2023-10-31

Family

ID=88472005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310199195.6A Pending CN116970593A (zh) 2023-03-03 2023-03-03 丝氨酸蛋白酶同系物slp-1及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116970593A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220018841A1 (en) Method for measuring endotoxin
JP2019000122A (ja) 新規組換えファクターｃ、その製造法、およびエンドトキシンの測定法
CN103833839B (zh) C型凝集素及其制备方法和应用
EP0726944B1 (en) Glycosylated and non-glycosylated bactericidal/permeability increasing proteins, and methods for producing same
CN114698379A (zh) 使用断裂内含肽系统的的蛋白质纯化
CN106478812B (zh) 丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其功能、制备方法和应用
CN106632664B (zh) 载脂蛋白ii/i及其制备方法、生物学功能及应用
CN103788190B (zh) β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用
US20130085111A1 (en) Production of human c1 inhibitor in human cells
CN116970593A (zh) 丝氨酸蛋白酶同系物slp-1及其制备方法和应用
CN116143903B (zh) 肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用
CN101280001A (zh) 人SDF-1α的制备及由此获得的人SDF-1α及其用途
CN116286754A (zh) 甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其制备方法和应用
CN116143903A (zh) 肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用
CN107151267B (zh) 载脂蛋白-ⅲ及其功能、制备方法和应用
TWI531578B (zh) 提高蛋白質可溶性之胜肽及其用途
CN116284332A (zh) 一种肽聚糖识别蛋白-d、制备方法及其应用
JPH04108387A (ja) β―リティック　プロテアーゼ遺伝子及びその遺伝子産物の製造法
CN106749589A (zh) 肽聚糖识别蛋白‑sa及其制备方法、模式识别功能及应用
CN1322128C (zh) 嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）MIP基因克隆、重组、表达和蛋白纯化方法
CN114317504B (zh) 一种鲎因子c截短蛋白及其制备方法和应用
JP2013165669A (ja) 変異型逆転写酵素
Enfors et al. Impact of genetic engineering on downstream processing of proteins produced in E. coli
JP2006345831A (ja) Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法
JP2024516907A (ja) 向上したタンパク質精製

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination