CN106749589A - 肽聚糖识别蛋白‑sa及其制备方法、模式识别功能及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，涉及肽聚糖识别蛋白‑SA的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域中的应用。具体地说，本发明涉及肽聚糖识别蛋白‑SA及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、诱导昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备肽聚糖识别蛋白‑SA及其类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。本发明所述的天然、重组PGRP‑SA及其部分片段或类似物获得方法常规、简单、产量高。

Description

肽聚糖识别蛋白-SA及其制备方法、模式识别功能及应用
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及肽聚糖识别蛋白-SA的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域中的应用。具体地说，本发明涉及肽聚糖识别蛋白-SA及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、诱导昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备肽聚糖识别蛋白-SA及其类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。
背景技术：
肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein，PGRP)是一种能够特异性识别微生物细胞壁表面多糖类病原相关分子模式(pathogen-associated molecularpattern，PAMPs)，并能够进一步激活宿主体内的免疫分子，引起免疫应答的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRRs)。PGRP家族(PGRP family)成员众多，并且成员之间分子量差异较大，在组织细胞中所处位置也不尽相同。根据分子量大小不同，PGRP一般分为两种类型，短型类免疫球蛋白(PGRP-S)和长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)。PGRP-S含有信号肽，是一类小分子(18-20KD)的胞外蛋白。PGRP-L存在形式比较多样，可以是胞内蛋白，或胞外蛋白，或是跨膜蛋白，其基因要比PGRP-S复杂。
1996年，日本科学家Ashida在家蚕体内发现了一种对肽聚糖(Peptideglycan，PGN)具有高度亲和力，并能够介导PGN依赖的酚氧化酶原级联反应(ProphenoloxidaseCascade)从而使局部伤口愈合或黑化的19kDa蛋白质，命名为肽聚糖识别蛋白。此后，研究者们先后在蛾、果蝇、大鼠、小鼠及人类等生物当中得到PGRP的基因和蛋白，并对它们的功能和结构有了进一步的发现。PGRPs的空间结构具有高度保守性，均由3个外围的α螺旋(α1～α3)和5个中心的β折叠片组成，其中4个平行β折叠片(β3，β4，β6和β7)，1个反平行β折叠片(β5)，在空间上形成一个非常对称的花篮状结构。大多数PGRPs在PGRP结构域中部都具有两个空间位置相近并且保守的半胱氨酸(Cys)残基，它们可以形成二硫键，这是PGRPs活性所必须的。所有的具有酰胺酶活性的PGRPs都具有保守的Zn2+结合位点。对PGRPs功能的研究在昆虫、贝类、哺乳动物等生物中普遍展开，随着研究的深入，研究者发现PGRPs能够特异性识别PGN，这种特异性识别作用能够启动下游信号通路，有些成员还具有酰胺酶活力，甚至还可作为效应分子杀死或抑制外源微生物。
综上所述，肽聚糖识别蛋白是为数不多的从低等动物到高等动物都非常保守的模式识别蛋白。作为模式识别受体，PGRP可以识别PGN，有些成员还具有酰胺酶活力。
目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫肽聚糖识别蛋白的结构、制备、模式识别学功能及其应用的相关研究。
发明内容：
本发明所解决的技术问题是提供一系列肽聚糖识别蛋白-SA及其制备方法。
所述的肽聚糖识别蛋白-SA的氨基酸序列如SEQ ID：1所示；
编码所述肽聚糖识别蛋白-SA的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：2所示。
本发明还提供了所述天然肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA或其类似物或活性片段。
所述的肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段包括SEQ ID：1或SEQ ID：2所述的序列。
所述的肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段的序列如SEQ ID：3-16所示。
本发明进一步提供了所述天然肽聚糖识别蛋白-SA，重组肽聚糖识别蛋白-SA及其类似物或活性片段，以天然肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA及其类似物或活性片段作为抗原的抗体在生物领域中的应用，包括1.针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；2.针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；3.针对天然肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用；4.诱导昆虫抗菌肽合成及其获得的抗菌肽在生物医药领域应用。
本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的PGRP-SA，研究天然PGRP-SA的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组PGRP-SA及其类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组PGRP-SA及其类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然PGRP-SA。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析PGRP-SA的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现PGRP-SA基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组PGRP-SA。同时，利用基因重组技术，获得PGRP-SA的类似物或部分片段。天然、重组PGRP-SA以及其类似物或部分片段，能特异性识别脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多种微生物相关分子模式以及细菌、真菌等微生物。上述结合，一方面激活昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活系统，另一方面激活昆虫细胞免疫，诱导抗菌肽的合成。本发明的天然、重组PGRP-SA以及其类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域；同时，利用本发明的天然、重组PGRP-SA以及其类似物或部分片段诱导昆虫大量表达抗菌肽，由此制备获得的抗菌肽可应用于微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。
本发明的PGRP-SA，其氨基酸序列如SEQ ID：1所示。
其制备方法如下：
一、天然PGRP-SA的制备
本发明所获得天然PGRP-SA是通过如下技术方案实现的，包括：
以昆虫血淋巴作为原料，分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的PGRP-SA。
其中，昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液，用缓冲溶液或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去不溶杂质得到的抽提液。
PGRP-SA的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：(1)溶液的酸碱度在pH2～pH10，优选pH4-pH9；(2)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液。酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸。碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂；(3)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合；(4)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L～0.8mol/L，优选0.01mol/L～0.3mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响PGRP-SA的生物活性。
昆虫血淋巴的收集：将昆虫用蒸馏水或去离子水反复清洗，采用常规方法，如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等，在10℃至～5℃条件下收集昆虫血淋巴。
本发明的分离分析方法包含如下中的两种或两种以上的组合：
1.离子交换层析分离纯化PGRP-SA
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度为0.00mol/L～3mol/L。利用抗PGRP-SA抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-SA的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐，或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征：(1)层析介质选择阳离子交换层析填料，如CM-离子交换层析填料或SP-离子交换层析填料或S-离子交换层析填料等阳离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析填料，如Q-离子交换层析填料或DEAE-离子交换层析填料或QAE-离子交换层析填料等离子交换层析填料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；(3)缓冲液及其浓度选择，按上述PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(5)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl；(6)分离纯化操作温度按上述PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响PGRP-SA的生物活性，又不影响活性成分的分离纯化。
2.亲和层析分离纯化PGRP-SA
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-SA的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式，分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗PGRP-SA抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-SA的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
亲和层析分离纯化的特征：(1)亲和填料的配基选择PGRP-SA抗体、肝素、刀豆素、甲醛固定后的细菌或真菌、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如苯甲咪)、sepharose CL-4B、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖、葡聚糖等；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度；(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍；(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L，选择尿素的最高浓度为8.0mol/L，选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L；(6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使PGRP-SA发生变性作用，可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得PGRP-SA。
3.疏水层析分离纯化PGRP-SA
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-SA的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2mol/L浓度，上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式，可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脱；也可以采用盐浓度阶段洗脱方式，分别采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗PGRP-SA抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-SA的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征：(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析填料或正辛烷-疏水层析填料-或己烷-疏水层析填料-或丁烷-疏水层析填料；(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
4.凝胶层析分离纯化PGRP-SA
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-SA的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱，利用抗PGRP-SA抗体检测目的蛋白的存在情况，将含有PGRP-SA的洗脱液合并储存备用；也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征：(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析填料；(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征，此外洗脱液的浓度，优选在离子浓度大于0.15M及以上。
5.盐析分离纯化PGRP-SA
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-SA的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐，至浓度达到PGRP-SA仍处于溶解状态，而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到PGRP-SA沉淀状态。离心弃上清，沉淀溶于PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用；沉淀的溶解液，也可以采用常规、通用透析或超滤方法，除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理，储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征：(1)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择，是按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征；(2)盐析使用的中性盐，选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4或Na2SO4；(3)在使PGRP-SA处于溶解状态时，选择中性盐在5％—45％，优选10％—40％；(4)在使PGRP-SA处于沉淀状态时，选择中性盐在40％—90％，优选45％—75％。
6.超滤分离纯化PGRP-SA以及处理PGRP-SA溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴，按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件的特征，用酸性溶液或碱性溶液调pH至PGRP-SA的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法，分离纯化PGRP-SA。一种方案，选择一定规格的超滤膜，使PGRP-SA透过超滤膜，而一些杂蛋白则被超滤膜截留，从而使PGRP-SA得以分离纯化；透过超滤膜的PGRP-SA溶液，再选择一定规格的超滤膜，使PGRP-SA被截留，而一些杂蛋白则透过超滤膜，从而使PGRP-SA得以分离纯化。另一种方案，是选择一定规格的超滤膜，使PGRP-SA先被超滤膜截留，随后再选择一定规格的超滤膜，使PGRP-SA透过超滤膜，从而使PGRP-SA得以分离纯化。
超滤处理PGRP-SA溶液的目的，是除去PGRP-SA溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外，对PGRP-SA溶液进行浓缩。处理方法同上所述，选择一定规格的超滤膜，使PGRP-SA被超滤膜截留，而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜，从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
超滤分离纯化和处理的特征：(1)透过PGRP-SA的超滤膜选择分子量为20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa规格的超滤膜，优选20kDa～50kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(2)截留PGRP-SA的超滤膜选择是分子量为3kDa或10kDa或20kDa或30kDa的超滤膜，优选10kDa～30kDa的超滤膜，大于或小于优选规格的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；(3)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择，是按PGRP-SA提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
通过上述任何一种方法所获得的PGRP-SA纯度，有时无法满足相应需要。
本发明是从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度PGRP-SA，并可以达到电泳纯乃至HPLC纯度。其特征在于，将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤)，进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合，纯化方法自由组合及其顺序重排组合，直至样品纯度得到预期要求。
本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明所述的肽聚糖识别蛋白-SA、肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段是利用基因工程表达获得，包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞。上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备肽聚糖识别蛋白-SA、肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段的来源。
所述“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所指微生物以及其相关分子模式是真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以及其相关分子模式。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明，以毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等作为微生物(真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌)代表来描述下面的内容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作为微生物相关分子模式代表来描述下面的内容，而选择上述具体的微生物或具体的微生物相关分子模式作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
二、PGRP-SA结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对PGRP-SA进行结构解析。包括：(1)利用生物质谱测定天然PGRP-SA的分子量；(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件，针对发明内容所获得PGRP-SA进行降解，通过HPLC分离降解片段，利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，从而获得PGRP-SA分子内许多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物学技术、方法，从昆虫脂肪体提取总RNA，利用RACE技术构建昆虫cDNA pool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列，设计引物，PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得PGRP-SA基因—cDNA，通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得PGRP-SA全长一级结构；(4)利用分子生物学技术、方法等，从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物，以昆虫染色体基因为模板，PCR扩增PGRP-SA染色体基因，通过基因序列测定分析获得PGRP-SA染色体基因中的内含子、外显子序列；(5)通过上述所获得PGRP-SA的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列，彼此相互验证上述结构信息，获得PGRP-SA全长一级结构序列、天然PGRP-SA或称成熟PGRP-SA一级结构序列(参见SEQ ID:1和ID:2)。
三、重组PGRP-SA及其部分片段或类似物的制备
本发明还包含具有PGRP-SA序列的重组PGRP-SA及其部分片段或类似物。
所述的重组PGRP-SA及其类似物或活性片段选自Met-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-PGRP-SA成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-PGRP-SA成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-His6标签-PGRP-SA全序列氨基酸序列、Met-PGRP-SA全序列-His6标签氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-PGRP-SA全序列氨基酸序列、Met-PGRP-SA全序列-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-PGRP-SA成熟肽-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-PGRP-SA全序列-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-PGRP-SA全序列氨基酸序列(参见SEQ ID：3-16)。
本发明的重组PGRP-SA及其部分片段或类似物通过基因工程表达制备获得，通过如下技术方案实现，包括：(1)将PGRP-SA及其部分片段或类似物编码DNA重组至表达载体；(2)用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的目的蛋白。
本发明同时提供上述重组PGRP-SA及其部分片段或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合，从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
四、PGRP-SA及其部分片段或类似物的结合特异性及其应用
本发明再一个目的是针对天然、重组PGRP-SA其部分片段或类似物的体外结合特异性、对微生物的结合与凝集作用以及对激活酚氧化酶原激活系统的激活情况、对抗菌肽合成的激活作用的对比，确定了天然、重组PGRP-SA及其部分片段或类似物的生物活性。同时，考察PGRP-SA在机体免疫应答过程的表达，也研究了天然、重组PGRP-SA及其部分片段或类似物的应用。
此外，本发明也研究了天然、重组PGRP-SA及其部分片段或类似物作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
本发明所述的天然、重组PGRP-SA及其部分片段或类似物获得方法常规、简单、产量高。
附图说明：
图1为分离纯化天然PGRP-SA电泳图谱
泳道1：实施例1中方法-1分离获得天然PGRP-SA的电泳图谱；
泳道2：实施例1中方法-2所获天然PGRP-SA的电泳图谱；
泳道3：实施例1中方法-3所获天然PGRP-SA的电泳图谱；
泳道4：实施例1中方法-4所获天然PGRP-SA的电泳图谱。
图2为分离纯化重组PGRP-SA(原核表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例2中方法-(1)所获得重组PGRP-SA的电泳图谱；
泳道2：实施例2中方法-(2)所获重组PGRP-SA的电泳图谱；
泳道3：实施例2中方法-(3)所获重组PGRP-SA的电泳图谱；
泳道4：实施例2中方法-(4)所获重组PGRP-SA的电泳图谱。
图3为分离纯化重组PGRP-SA(真核表达体系)电泳图谱
泳道1：实施例3中方法-1所获得重组PGRP-SA的电泳图谱(昆虫表达体系)；
泳道2：实施例3中方法-2所获重组PGRP-SA的电泳图谱(昆虫表达体系)；
泳道3：实施例4中方法所获得重组PGRP-SA的电泳图谱(酵母表达体系)；
泳道4：实施例5中方法所获天然PGRP-SA的电泳图谱(哺乳动物细胞表达体系)。
图4为天然PGRP-SA与微生物及其相关分子模式的结合特异性
4-A：天然PGRP-SA与微生物的结合特异性；
4-B：Western-blot方法检测天然PGRP-SA与微生物相关分子模式的结合特异性；
4-C：ELISA方法检测天然PGRP-SA与微生物相关分子模式的结合特异性。
图5为重组PGRP-SA及其类似物、活性片段与微生物及其相关分子模式的结合特异性
5-A：重组PGRP-SA及其类似物、活性片段与微生物的结合特异性；
5-B：ELISA方法检测重组PGRP-SA及其类似物、活性片段与微生物相关分子模式的结合特异性；
5-C：MST方法检测重组PGRP-SA及其类似物、活性片段与微生物相关分子模式的结合特异性。
图6为天然PGRP-SA以及重组PGRP-SA及其类似物、活性片段对酚氧化酶原激活系统的作用。
图7为PGRP-SA对抗菌肽合成的影响
7-A：PGRP-SA干扰对金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)诱导的抗菌肽合成的抑制作用；
7-B：PGRP-SA干扰对大肠杆菌(革兰阴性菌)诱导的抗菌肽合成的抑制作用；
7-C：PGRP-SA干扰对白色念珠菌(真菌)诱导的抗菌肽合成的抑制作用。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1
天然PGRP-SA的分离纯化
1.方法-1
收取血淋巴，迅速与pH6.5饱和硫酸铵混合并激烈震荡，12000rpm离心20min后在沉淀中加入pH6.50.2M磷酸钾(含有1mM EDTA，1mM邻二氮杂菲，1mM PMSF，5mM苯硫脲和1％乙醇)，溶液流经PGN修饰的Sepharose 4B，按下列洗脱条件进行洗脱：0.1M磷酸钾pH6.5；0.1M磷酸钾pH6.5，0-2M KCl线性梯度；2M KCL，5mM MES pH5.5；2M KCl，5mM醋酸缓冲液pH3.5。目的组分经10mM甘氨酸/氢氧化钠pH 8.5透析后流经羟基磷灰石HPLC，平衡缓冲液为10mM，pH8.5甘氨酸/氢氧化钠缓冲液，10-150mM甘氨酸/氢氧化钠pH8.5和150mM-1M甘氨酸/氢氧化钠pH8.5两次线性梯度洗脱。收集组分以10mM Tris-HCl pH7.0透析后流经MonoQ HPLC，使用0-0.1M NaCl进行线性梯度洗脱，获得目的蛋白成分。
试验结果如图1泳道1，天然PGRP-SA的纯度达到电泳纯。
2.方法-2
将溶于昆虫生理盐水的真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌混合物(10ul)注射柞蚕体内，诱导24～48小时后收集菌诱导后的血淋巴，用50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5稀释10倍，流经Mono-Q离子交换层析柱，利用0-1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液pH5.5进行线性梯度洗脱。收集目的组分，利用超滤膜分离浓缩至1mL后上样至凝胶过滤层析(Toyopearl HW-55S，1×30cm)，平衡与洗脱体系均为50mM Tris-HCl150mMNaCl 3mM EDTA pH 7.5。将目的组分超滤浓缩至1mL，用10mM磷酸钠缓冲液pH4.5稀释10倍，流经Octyl-sepharose4-Fast Flow，利用10-500mM硫酸钠缓冲液pH4.5进行线性洗脱，获得目的蛋白成分。
试验结果如图1泳道2，天然PGRP-SA的纯度达到电泳纯。
3.方法-3
将溶于抗凝缓冲溶液的柞蚕体液离心去除血细胞，以不含有血细胞的柞蚕血淋巴作为纯化PGRP-SA的样品。将200ml样品进行硫酸铵分级沉淀，取30～35％沉淀组分用硼砂-氢氧化钠缓冲液(0.05mol/L，Ph9.0)溶解稀释，上样于SP-Sepharose阴离子交换柱，采用50mM-1MNaCl洗涤洗脱；将含有目的蛋白的组分上样于Phenyl-sepharose6-Fast Flow洗涤洗脱；将含有目的物的组分用透析后，在相同条件下上样于肝素层析柱，20mM Tirs-HCl，0.3M NaCl pH5.0洗脱；洗脱组分利用超滤除盐，20mM Tirs-HCl，pH5.0上样于DEAE-Sepharose阳离子交换柱，20mM Tirs-HCl，1M NaCl pH5.0洗涤洗脱，将含有目的片段的组分上样于凝胶过滤层析柱Sepharose CL-6B column进一步的分离纯化，从而获得目的蛋白。
试验结果如图1泳道3，天然PGRP-SA的纯度达到电泳纯。
4.方法-4
收集柞蚕血淋巴，加入终浓度为0.5mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂DFP处理1h。以50mMTris，3mMEDTA，pH6.0作为透析缓冲液4℃透析12～14h，3000rpm离心20min后取上清。将血淋巴与甲醛固定后的细菌4℃共孵育30min，采用50mM Tris，3mMEDTA，3M NaCl pH6.0洗脱；将洗脱液利用20mM Tris，3mMEDTA，pH8.0透析，并上样至凝胶过滤层析柱TSK gelG2000HPLC分离；将含有目的物的组分流经疏水层析柱Hydroxyl apatite柱分离，20mM-500mM NaCl洗脱收集目的蛋白。
试验结果如图1泳道4，天然PGRP-SA的纯度达到电泳纯。
实施例2：
PGRP-SA结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段，对PGRP-SA进行结构解析。具体方法、手段按照发明内容二中所列内容实施。
获得PGRP-SA完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID:1和ID:2所示)。
实施例3：
利用原核生物表达系统获得重组PGRP-SA及其类似物、活性片段
本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明PGRP-SA及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施是为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.PGRP-SA的表达载体构建
根据天然PGRP-SA的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列；以昆虫脂肪体cDNA pool为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒，在DNA连接酶的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞；经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法，构建PGRP-SA基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征：1。以大肠杆菌为宿主，表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在PGRP-SA的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；3.可以在PGRP-SA的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag)；4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在亲和层析标签与PGRP-SA之间，添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列，如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等，以获得与天然PGRP-SA蛋白结构一致的重组PGRP-SA蛋白。
2.重组PGRP-SA蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的获得
利用基因工程技术，将PGRP-SA基因表达载体转化大肠杆菌，挑取单菌落后接种至含抗生素的LB，诱导PGRP-SA基因的表达，从而获得含有PGRP-SA的培养液或菌体。含有PGRP-SA的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎，释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组PGRP-SA的原料液备用。
重组目的基因表达的特征：1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法；2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导；3.PGRP-SA基因可表达于细胞内或细胞外；3.存在于细胞内的PGRP-SA需通过裂解液裂解、超速破碎等方式，将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等，从上述含PGRP-SA的原料液中分离纯化重组PGRP-SA及其衍生物、类似物、活性片段至需要的纯度，直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如：(1)采用pTYB11构建无标签PGRP-SA表达载体，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经IPTG诱导，PGRP-SA表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-SA的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-SA至电泳纯(图2-泳道1)。
(2)采用pET-28a构建N端前融合组氨酸标签的PGRP-SA基因，热转化大肠杆菌，经IPTG诱导，His-PGRP-SA表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-SA的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-SA至电泳纯(图2-泳道2)。
(3)采用pGEX-2T构建C端后融合GST标签的PGRP-SA表达载体，热转化大肠杆菌，经加温诱导表达，PGRP-SA-GST表达于胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体，进行超声破碎，离心获得上清液作为进一步分离纯化PGRP-SA的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-SA至电泳纯(图2-泳道3)。
(4)采用pET20b构建C端后融合组氨酸标签的PGRP-SA基因，采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞，经加温诱导表达，PGRP-SA-His表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等，分离纯化PGRP-SA至电泳纯(图2-泳道4)。
上述表达重组的PGRP-SA结构如SEQ ID：3所示，分离纯化获得的重组表达产物，经过SDS-PAGE验证其纯度如图2所示。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表达产物中的融合肽段，再经分离纯化从而获得PGRP-SA，该重组PGRP-SA的结构与天然的PGRP-SA的结构相同。
实施例3：
利用昆虫细胞表达系统获得重组PGRP-SA及其类似物、活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明PGRP-SA及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法，采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组PGRP-SA及其类似物、活性片段
将PGRP-SA及其类似物、活性片段基因连接到pFastBac1质粒中，构建pFastBac1-PGRP-SA重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10，Blu-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9，Western blot验证重组PGRP-SA在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗PGRP-SA抗体—sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如SEQ ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道1。
2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组PGRP-SA及其类似物、活性片段
将PGRP-SA及其类似物、活性片段基因连接到pMIB/V5-His质粒中，构建pMIB/V5-His-PGRP-SA重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5，Blue-gal和IPTG诱导后，蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21，Western blot验证重组PGRP-SA在细胞内表达。
收集细胞，用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。表达产物的结构如SEQ ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道2。
实施例4：
利用酵母表达系统获得重组PGRP-SA及其类似物、活性片段
本实施例列举描述酵母细胞表达系统表达本发明PGRP-SA及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
酵母细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pPIC9K表达载体、毕赤酵母GS115为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将PGRP-SA基因连接到pPIC9K表达载体中，构建pPIC9K-His6-PGRP-SA(或pPIC9K-PGRP-SA)重组表达质粒，转化大肠杆菌，挑取阳性重组菌中重组质粒，经酶切形成线性分子，利用电转化方法将其转入毕赤酵母GS115中与基因组同源重组，经过初筛、复筛及Mut表型鉴定，筛选出阳性重组子，进行发酵及诱导表达，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组PGRP-SA为分泌型表达。
将重组菌GS115/pPIC9K-His6-PGRP-SA(或GS115/pPIC9K-PGRP-SA)接种于50mlBMGY液体培养基中，于30℃，250rpm/min，震荡培养过夜。3000g、4℃离心5min，收集菌体。用10ml BMMY培养基重悬菌体并开始甲醇诱导表达6h，重组蛋白以分泌表达形式存在于培养基中，12,000g、4℃离心4min，得上清液，并以此为纯化初始液。
如果表达产物是His6-PGRP-SA，直接将纯化初始液上样于0.05M Tris-HCl(pH8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-PGRP-SA。表达产物的结构如SEQ ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道3。
如果表达产物是PGRP-SA，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组PGRP-SA。
实施例5：
利用哺乳动物细胞表达系统获得重组PGRP-SA及其类似物、活性片段
本实施例列举描述哺乳动物表达系统表达本发明PGRP-SA及其类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。
哺乳动物细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略，均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以pCDNA3.0(neo+)质粒、CHO-K1细胞为代表进行描述。
对于表达产物的分离纯化方法，是采用实施例1和实施例2的方法、原理、策略等。
利用常规、通用的基因工程技术，将PGRP-SA基因连接到pCDNA3.0(neo+)质粒中，构建pCDNA3.0(neo+)-His6-PGRP-SA(或pCDNA3.0(neo+)-PGRP-SA)重组表达质粒。将其转染哺乳动物细胞株CHO-K1，对转染成功细胞株于5％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h，收集细胞及培养液，经Western blot验证，N末端带有His6-tag的重组PGRP-SA得以表达。
用15ul重组质粒pCDNA3.0(neo+)-His6-PGRP-SA(或pCDNA3.0(neo+)-PGRP-SA)转染8ml IMDM medium(含有CHO-K1cell，2X105cell/ml)，于37℃，15％CO2培养箱中，37℃贴壁培养72h。用0.25％胰蛋白酶消化细胞2～3min，使细胞悬浮，收集细胞。用5ml裂解液(NP40)使细胞裂解，12,000g、4℃离心5min，得上清液作为纯化初始液。
如果表达产物是His6-PGRP-SA，直接将纯化初始液上样于0.05M Tris-HCl(pH8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分别充分洗涤去除大量杂蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH8.0)进行洗脱并收获该洗脱液。该表达产物为His6-PGRP-SA。表达产物的结构如SEQ ID：3所示，纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道4。
如果表达产物是PGRP-SA，采用实施例1的方法、原理、策略等分离纯化获得重组PGRP-SA。
实施例6：
PGRP-SA抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术，利用实施例1、3、4、5获得的各种PGRP-SA作为抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法，检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中PGRP-SA抗体产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生了PGRP-SA抗体后，采用常规、通用的动物血清采集与存储方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储，该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术，如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等，从存储的含有PGRP-SA抗体的血清中分离纯化不同纯度的PGRP-SA抗体，直至获得电泳纯或HPLC纯的PGRP-SA抗体，以适于不同要求的应用。
实施例7：
重组以及天然PGRP-SA及其类似物、活性片段的模式识别活性
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。本实施例中天然PGRP-SA、重组PGRP-SA及其类似物、活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以天然PGRP-SA、重组PGRP-SA及其类似物、活性片段的生物活性为核心与基础，进一步拓展天然PGRP-SA、重组PGRP-SA及其类似物、活性片段的应用范围。
1.天然PGRP-SA与微生物及其相关分子模式的结合特异性
(1)天然PGRP-SA与微生物的结合特异性
采用western blotting方法考察天然PGRP-SA与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)和真菌(白色念珠菌)的结合特性。利用天然PGRP-SA-S分别与等量的微生物孵育，充分洗涤去除未结合组分后，在高温条件下2％SDS洗脱结合组分，利用PGRP-SA-S多克隆抗体间接检测天然PGRP-SA-S与不同种类微生物的结合情况。结果如图4-A所示，天然PGRP-SA-S与三种类别的微生物均具有结合特性。
(2)天然PGRP-SA与微生物相关分子模式的结合特异性
分别以革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌的典型分子模式β-1,3-D-葡聚糖、Lys-PGN和DAP-PGN分别作为三类微生物的代表，按照上述western blotting方法进行试验，结果如图4-B所示，天然PGRP-SA-S对三种PAMPs均具有结合特性。
采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测天然PGRP-SA对6种可溶性的，分别来自不同种微生物的典型分子模式(PAMP)的识别能力。Lys-PGN和LTA属于革兰阳性菌的特异PAMPs，DAP-PGN和LPS属于革兰阴性菌的特异PAMPs，laminarin(可溶性β-1,3葡聚糖)和Mannan属于真菌的特异PAMP。不同浓度的PAMPs被包被在96孔板上，依次将天然PGRP-SA，兔源抗PGRP-SA-S多克隆抗血清(一抗)以及偶联有辣根过氧化酶的山羊抗兔IgG(二抗)加入96孔板孵育并彻底洗涤未结合组分，最后加入辣根过氧化酶底物，检测在450nm下底物显色的光吸收情况。如如图4-C所示，天然PGRP-SA对6种可溶性PAMPs均有结合，并具有一定的浓度依赖性(依次选择500ug/ml、100ug/ml、10ug/ml、1ug/ml、)，属于特异性结合。
上述实验说明，天然PGRP-SA能够通过特异性识别典型分子模式而与革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌发生特异性结合。
2.重组PGRP-SA及其类似物、活性片段与微生物及其相关分子模式的结合特异性
(1)重组PGRP-SA及其类似物、活性片段与微生物的结合特异性
按照实施例7中1-(1)中所述western blotting方法考察天然PGRP-SA与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)和真菌(白色念珠菌)的结合特性。以重组PGRP-SA－GST为例，结果如图5-A所示，重组PGRP-SA－GST与三种类别的微生物均具有结合特性。
(2)重组PGRP-SA及其类似物、活性片段与微生物相关分子模式的结合特异性
按照实施例7中1-(2)间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测重组PGRP-SA及其类似物、活性片段对上述6中PAMPs的结合特定。以重组PGRP-SA为例，如图5-B所示，重组PGRP-SA对6种可溶性PAMPs均有结合，并具有一定的浓度依赖性，显示重组PGRP-SA与天然PGRP-SA具有相同的生物学活性。采用实施例3、4、5中所述重组PGRP-SA类似物、活性片段可获得相同的实验结果。
采用微量热泳动仪(MST)检测重组PGRP-SA及其类似物、活性片段对上述除Mannan以外的5种代表性、可溶性微生物相关分子模式的识别能力。相同浓度的微生物相关分子模式被包被在探头上，将重组PGRP-SA或其类似物、活性片段分别与探头共孵育，通过测定样品在微观温度梯度场中分子的定向运动，检测重组PGRP-SA或其类似物、活性片段与可溶性微生物相关分子模式的结合情况。以重组His6-PGRP-SA为例，如图5-C所示，与阴性对照淀粉相比，重组His6-PGRP-SA与5种可溶性PAMPs均有明显的识别结合作用。采用实施例3、4、5中所述重组PGRP-SA类似物、活性片段可获得相同的实验结果。
3.天然PGRP-SA以及重组PGRP-SA及其类似物、活性片段对昆虫酚氧化酶原激活系统的作用
以重组PGRP-SA－Flag为例，考察PGRP-SA对pro-PO系统的影响，如图6所示：缓冲溶液、BSA与重组PGRP-SA－Flag与血淋巴孵育均对血淋巴pro-PO系统无影响，而加入重组蛋白后，PO活力激活程度均远远高于血淋巴被单纯病原体相关分子模式激活产生PO活力的程度。说明，在微生物及微生物相关分子模式存在下，重组PGRP-SA－Flag能够显著提高pro-PO系统的激活程度。采用天然PGRP-SA或重组PGRP-SA及其类似物、活性片段可获得相同的实验结果。
4.PGRP-SA对抗菌肽合成的影响
分别将重组PGRP-SA、微生物细胞(大肠杆菌)以及重组PGRP-SA和大肠杆菌的共孵育混合物分别注射5龄期柞蚕幼虫体内，经24h诱导后，提取各组柞蚕血淋巴，将诱导血淋巴与生长于固体LB培养基中的大肠杆菌共孵育，通过管碟法检测诱导血淋巴产生抑菌圈的大小，从而鉴定各组诱导血淋巴中抗菌(抑菌)物质含量的多少。实验结果显示，作为阴性对照，单纯柞蚕血淋巴及昆虫生理盐水诱导的血淋巴几乎不存在抗菌物质；重组PGRP-SA和微生物细胞(大肠杆菌)分别诱导产生的血淋巴的抑菌活性与单纯血淋巴产生的抑菌活力相比，均有明显提高；而重组PGRP-SA和大肠杆菌的共孵育混合物所诱导产生的血淋巴抑菌活力与其他组产生的抑菌活力相比，抑菌效果更为显著。
以dsEGFP为阴性对照，采用显微注射法将PGRP-SA特异性dsRNA导入柞蚕幼虫体内，再将微生物-金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌分别注射入柞蚕幼虫体内，经24h诱导后，收集脂肪体，测定抗菌物质的mRNA含量以判断PGRP-SA对抗菌肽合成的影响。如图7-A、B、C所示，将PGRP-SA特异性dsRNA导入柞蚕幼虫体内可显著降低PGRP-SA的合成，且PGRP-SA表达量的降低能够显著抑制Attacin、Cecropin B、Lysozyme等抗菌物质的合成。
上述实验结果表明：本发明专利的天然、重组PGRP-SA以及其类似物、活性片段作为昆虫体内模式识别蛋白与微生物及其分子模式结合后，可以激活昆虫体内酚氧化酶原激活系统，也可促进抗菌肽的合成。
实施例8：
天然、重组PGRP-SA以及其类似物、活性片段及其抗体的应用
为使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围，本实施例以PGRP-SA的生物活性为代表进行描述，PGRP-SA类似物、活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以PGRP-SA及其类似物、活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础，进一步拓展PGRP-SA及其类似物、活性片段及其抗体的应用范围。
1.PGRP-SA及其类似物、活性片段诱导昆虫产生抗菌肽
如实施例7中所描述，利用微生物或结合了微生物相关分子模式的PGRP-SA及其类似物、活性片段可以诱导昆虫产生抗菌肽。基于此，从产生抗菌肽的昆虫体内制备相应的抗菌肽，该抗菌肽可以用于医药领域。
2.PGRP-SA及其类似物、活性片段用于微生物的检测
如实施例7中所描述，PGRP-SA及其类似物、活性片段作为酚氧化酶原激活系统的成分—起始激活因子，与微生物或其分子模式结合后，能够激活昆虫体内酚氧化酶原激活系统(激活的酚氧化酶引发黑化)。
取任何待检测真菌的样品，首先与PGRP-SA包括及其类似物、活性片段混合，注入柞蚕幼虫体内，在一定时间观察柞蚕黑化程度和死亡率；对照组是将同样剂量的待检测微生物的样品注入柞蚕幼虫体内，在相同时间观察柞蚕黑化程度和死亡率。实验组与对照组具有显著差异，表明检测样品中含有微生物或其相关分子模式。
同样，利用柞蚕血淋巴替代柞蚕观察血淋巴的黑化程度或酚氧化酶的活性强弱。在一定时间，实验组与对照组的黑化程度及酚氧化酶的活性具有显著差异；或血淋巴黑化程度达到同一程度所需时间缩短并具有显著差异。表明，检测样品中含有微生物或其相关分子模式。
3.PGRP-SA及其类似物、活性片段抗体的应用
针对实施例6获得的PGRP-SA及其类似物、活性片段作的抗体，利用免疫学以及分子生物学等常规、通用技术、方法等，通过PGRP-SA及其活性片段的抗体，用于鳞翅目昆虫样品的PGRP-SA免疫检测。同样，也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备PGRP-SA过程中的免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组PGRP-SA及其类似物、活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
将足够剂量的PGRP-SA抗体首先注入柞蚕幼虫体内，再将脂磷壁酸、脂多糖、DAP-肽聚糖、Lys-肽聚糖、葡聚糖、甘露聚糖等微生物分子模式分别注入该柞蚕幼虫体内后，上述分子模式并不能引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，事先加入足够剂量的PGRP-SA抗体也可以阻断柞蚕血淋巴的黑化。同理，将充分结合PGRP-SA抗体的微生物分子模式注入柞蚕幼虫体内，微生物分子模式不引发柞蚕的黑化乃至死亡；同样，用柞蚕血淋巴替代柞蚕，充分结合PGRP-SA抗体的微生物分子模式也不引发柞蚕血淋巴的黑化。说明PGRP-SA抗体可以抑制由微生物及其相关分子模式诱导的酚氧化酶原激活系统的激活。
在任何待检测微生物的样品中，加入足够剂量的PGRP-SA抗体。按照本实施例中的PGRP-SA及其衍生物、类似物、活性片段用于微生物的检测所述方法，进行待检测样品的微生物检测。同上结果，即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果)，此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。
上述结果表明：PGRP-SA及其类似物、活性片段的抗体，通过与PGRP-SA及其类似物、活性片段的结合而屏蔽了与微生物及其相关分子模式的结合生物活性，从而使PGRP-SA及其类似物、活性片段失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 沈阳药科大学
<120> 肽聚糖识别蛋白SA及其功能、制备方法和应用
<160> 16
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> 柞蚕（Antheraea pernyi）
<220>
<221> mRNA
<222> (1)...(690)
<220>
<221> CDS
<222> (32)...(613)
<220>
<221> 5'UTP
<222> (1)...(31)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (32)...(94)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (95)...(613)
<220>
<221> 3'UTP
<222> (614)...(690)
<220>
<221> PolyA_site
<222> (676)...(690)
<400> 1
cttgttctgt gtagctgtaa aaaataacaa a atg gag aat tta ttt tgt ttt gtc 55
Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val
-20 -15
tgt atg tta ttt atc ata aaa tac gga gcg gtt aat gct gac tgc gga att 106
Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile
-10 -5 1
gtt agc aaa gat gat tgg gac ggt ctg act ccg gtt cac gtg gaa tat cta 157
Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu
5 10 15 20
aac cgt cca gtg cag tta gtt ata atc cag cac acg gac act cct ccc tgc 208
Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys
25 30 35
ttg acg gac aat gca tgc tct gct cgt gtc agg agc atc cag gat tat cat 259
Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His
40 45 50 55
atg gat acc tta aaa tat tgg gat att ggt tca gca ttc cta att ggt gga 310
Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly
60 65 70
aac gca aaa gta tac gaa gga tct ggt tgg gtg cac gtt agt gtt cct act 361
Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr
75 80 85
cac gcg tac aac aga aaa gct ctt aga atc aca ttg ata gga aac tac aat 412
His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn
90 95 100 105
tcc cat caa cca aca aca gag caa atc gac gca ctg aaa tct tta ctt aga 463
Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Ser His Gln Pro Thr Thr
110 115 120
tgc gga gtg agt aat gga cat cta gat tca aat tac aaa ata gtg ggc cac 514
Glu Gln Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His
125 130 135 140
aga caa cta atg gct act gat agt ccc ggg cga aaa ctt tac aac ttg atc 565
Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile
145 150 155
aga cga tgg ccc gaa tgg ctc gaa aat gtt gac agt tat aaa caa 610
Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln
160 165 170
taatttaact tctgttgaat tgaaagagga tgatcattat tatccaaata cattgaaaaa 670
aaacaaaaaa aaaaaaaaaa 690
<210> 2
<211> 516
<212> DNA
<213> 柞蚕（Antheraea pernyi）
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(516)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)...(172)
<400> 2
gac tgc gga att gtt agc aaa gat gat tgg gac ggt ctg act ccg gtt cac 51
Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His
1 5 10 15
gtg gaa tat cta aac cgt cca gtg cag tta gtt ata atc cag cac acg gac 102
Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp
20 25 30
act cct ccc tgc ttg acg gac aat gca tgc tct gct cgt gtc agg agc atc 153
Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile
35 40 45 50
cag gat tat cat atg gat acc tta aaa tat tgg gat att ggt tca gca ttc 204
Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe
55 60 65
cta att ggt gga aac gca aaa gta tac gaa gga tct ggt tgg gtg cac gtt 255
Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val
70 75 80 85
agt gtt cct act cac gcg tac aac aga aaa gct ctt aga atc aca ttg ata 306
Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile
90 95 100
gga aac tac aat tcc cat caa cca aca aca gag caa atc gac gca ctg aaa 357
Gly Asn Tyr Asn Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Ser His
105 110 115
tct tta ctt aga tgc gga gtg agt aat gga cat cta gat tca aat tac aaa 408
Gln Pro Thr Thr Glu Gln Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys
120 125 130 135
ata gtg ggc cac aga caa cta atg gct act gat agt ccc ggg cga aaa ctt 459
Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu
140 145 150
tac aac ttg atc aga cga tgg ccc gaa tgg ctc gaa aat gtt gac agt tat 510
Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr
155 160 165 170
aaa caa 516
Lys Gln
<210> 3
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<400> 3
Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro
1 5 10 15
Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln
20 25 30
His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg
35 40 45
Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp
50 55 60
Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly
65 70 75 80
Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys
85 90 95
Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr
100 105 110
Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser
115 120 125
Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu
130 135 140
Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg
145 150 155 160
Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln
165 170
<210> 4
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(7)
<223> 人工增添组氨酸标签
<400> 4
Met His His His His His His Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val
20 25 30
Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp
35 40 45
Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp
50 55 60
Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn
65 70 75 80
Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr
85 90 95
His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr
100 105 110
Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu
115 120 125
Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile
130 135 140
Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu
145 150 155 160
Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser
165 170 175
Tyr Lys Gln
<210> 5
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (174)...(179)
<223> 人工增添组氨酸标签
<400> 5
Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro
1 5 10 15
Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln
20 25 30
His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg
35 40 45
Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp
50 55 60
Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly
65 70 75 80
Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys
85 90 95
Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr
100 105 110
Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser
115 120 125
Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu
130 135 140
Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg
145 150 155 160
Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln His His His
165 170 175
His His His
<210> 6
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (5)...(10)
<223> 人工增添组氨酸标签
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14)...(19)
<223> 人工增添组凝血酶酶切位点
<400> 6
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp
20 25 30
Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu
35 40 45
Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala
50 55 60
Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu
65 70 75 80
Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys
85 90 95
Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala
100 105 110
Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser
115 120 125
His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly
145 150 155 160
His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn
165 170 175
Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys
180 185 190
Gln
<210> 7
<211> 391
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(209)
<223> 人工增添GST-标签
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (210)...(215)
<223> 人工增添组凝血酶酶切位点
<400> 7
Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe Asp Gly Phe Gly Arg Gly Glu
1 5 10 15
Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu Gly Gln Glu Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys Glu Lys Thr Ser Gly Val Ala
35 40 45
Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln Ile Asp Gly His Asn Leu Val
50 55 60
Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu
65 70 75 80
Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln Asp Glu Ser Leu Val Gly Tyr
85 90 95
Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala Lys Phe Val Phe Val Asp Lys
100 105 110
Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn Gln Glu Gln Leu Pro Glu Lys
115 120 125
Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Pro Ser Asn Thr His Ser Val
130 135 140
Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe Val Leu Phe Gln Phe Ile His
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala Glu Gln Leu Arg Pro Ile Leu
165 170 175
Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln Phe Ala Asp Asn Phe Lys Asn
180 185 190
Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ala Thr Arg Ala Glu Ser Gln
195 200 205
Phe Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp
210 215 220
Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val
225 230 235 240
Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp
245 250 255
Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp
260 265 270
Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn
275 280 285
Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr
290 295 300
His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr
305 310 315 320
Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu
325 330 335
Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile
340 345 350
Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu
355 360 365
Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser
370 375 380
Tyr Lys Gln Ala Ala Ala Ser
385 390
<210> 8
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (174)...(179)
<223> 人工增添凝血酶酶切位点
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (180)...(388)
<223> 人工增添组GST-标签
<400> 8
Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro
1 5 10 15
Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln
20 25 30
His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg
35 40 45
Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp
50 55 60
Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly
65 70 75 80
Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys
85 90 95
Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr
100 105 110
Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser
115 120 125
Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu
130 135 140
Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg
145 150 155 160
Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln Leu Val Pro
165 170 175
Arg Gly Ser Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe Asp Gly Phe Gly
180 185 190
Arg Gly Glu Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu Gly Gln Glu Phe
195 200 205
Glu Asp Tyr Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys Glu Lys Thr Ser
210 215 220
Gly Val Ala Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln Ile Asp Gly His
225 230 235 240
Asn Leu Val Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Leu Arg Arg Ala
245 250 255
Gly Leu Leu Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln Asp Glu Ser Leu
260 265 270
Val Gly Tyr Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala Lys Phe Val Phe
275 280 285
Val Asp Lys Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn Gln Glu Gln Leu
290 295 300
Pro Glu Lys Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Pro Ser Asn Thr
305 310 315 320
His Ser Val Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe Val Leu Phe Gln
325 330 335
Phe Ile His Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala Glu Gln Leu Arg
340 345 350
Pro Ile Leu Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln Phe Ala Asp Asn
355 360 365
Phe Lys Asn Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ala Thr Arg Ala
370 375 380
Glu Ser Gln Phe
385
<210> 9
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(7)
<223> 人工增添组氨酸标签
<220>
<221> SIGNAL
<222> (8)...(27)
<223> 信号序列的范围（前肽）
<400> 9
Met His His His His His His Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met
1 5 10 15
Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val
20 25 30
Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu
35 40 45
Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro
50 55 60
Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp
65 70 75 80
Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu
85 90 95
Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val
100 105 110
Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala
130 135 140
Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro
165 170 175
Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu
180 185 190
Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln
195
<210> 10
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> SIGNAL
<222> (2)...(21)
<223> 信号序列的范围（前肽）
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (194)...(199)
<223> 人工增添组氨酸标签
<400> 10
Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp
20 25 30
Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu
35 40 45
Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala
50 55 60
Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu
65 70 75 80
Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys
85 90 95
Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala
100 105 110
Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser
115 120 125
His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly
145 150 155 160
His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn
165 170 175
Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys
180 185 190
Gln His His His His His His
195
<210> 11
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(209)
<223> 人工增添GST-标签
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (210)...(215)
<223> 人工增添组凝血酶酶切位点
<220>
<221> SIGNAL
<222> (216)...(236)
<223> 信号序列的范围（前肽）
<400> 11
Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe Asp Gly Phe Gly Arg Gly Glu
1 5 10 15
Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu Gly Gln Glu Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys Glu Lys Thr Ser Gly Val Ala
35 40 45
Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln Ile Asp Gly His Asn Leu Val
50 55 60
Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu
65 70 75 80
Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln Asp Glu Ser Leu Val Gly Tyr
85 90 95
Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala Lys Phe Val Phe Val Asp Lys
100 105 110
Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn Gln Glu Gln Leu Pro Glu Lys
115 120 125
Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Pro Ser Asn Thr His Ser Val
130 135 140
Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe Val Leu Phe Gln Phe Ile His
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala Glu Gln Leu Arg Pro Ile Leu
165 170 175
Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln Phe Ala Asp Asn Phe Lys Asn
180 185 190
Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ala Thr Arg Ala Glu Ser Gln
195 200 205
Phe Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys
210 215 220
Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile
225 230 235 240
Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr
245 250 255
Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro
260 265 270
Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln
275 280 285
Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe
290 295 300
Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His
305 310 315 320
Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr
325 330 335
Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp
340 345 350
Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp
355 360 365
Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser
370 375 380
Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu
385 390 395 400
Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln
405
<210> 12
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> SIGNAL
<222> (2)...(21)
<223> 信号序列的范围（前肽）
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (254)...(259)
<223> 人工增添组凝血酶酶切位点
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (260)...(408)
<223> 人工增添GST-标签
<400> 12
Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp
20 25 30
Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu
35 40 45
Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala
50 55 60
Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu
65 70 75 80
Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys
85 90 95
Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala
100 105 110
Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser
115 120 125
His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly
145 150 155 160
His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn
165 170 175
Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys
180 185 190
Gln Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe
195 200 205
Asp Gly Phe Gly Arg Gly Glu Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu
210 215 220
Gly Gln Glu Phe Glu Asp Tyr Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ser Gly Val Ala Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln
245 250 255
Ile Asp Gly His Asn Leu Val Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu
260 265 270
Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln
275 280 285
Asp Glu Ser Leu Val Gly Tyr Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala
290 295 300
Lys Phe Val Phe Val Asp Lys Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn
305 310 315 320
Gln Glu Gln Leu Pro Glu Lys Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn
325 330 335
Pro Ser Asn Thr His Ser Val Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe
340 345 350
Val Leu Phe Gln Phe Ile His Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala
355 360 365
Glu Gln Leu Arg Pro Ile Leu Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln
370 375 380
Phe Ala Asp Asn Phe Lys Asn Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu
385 390 395 400
Ala Thr Arg Ala Glu Ser Gln Phe
405
<210> 13
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (174)...(181)
<223> 人工增添Flag标签
<400> 13
Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro
1 5 10 15
Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln
20 25 30
His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg
35 40 45
Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp
50 55 60
Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly
65 70 75 80
Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys
85 90 95
Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr
100 105 110
Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser
115 120 125
Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu
130 135 140
Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg
145 150 155 160
Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln Asp Tyr Lys
165 170 175
Asp Asp Asp Asp Lys
180
<210> 14
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(9)
<223> 人工增添Flag标签
<400> 14
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys
1 5 10 15
Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg
20 25 30
Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu
35 40 45
Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His
50 55 60
Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val
85 90 95
Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly
100 105 110
Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys
115 120 125
Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr
130 135 140
Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg
145 150 155 160
Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val
165 170 175
Asp Ser Tyr Lys Gln
180
<210> 15
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (194)...(201)
<223> 人工增添Flag标签
<220>
<221> SIGNAL
<222> (2)...(21)
<223> 信号序列的范围（前肽）
<400> 15
Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp
20 25 30
Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu
35 40 45
Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala
50 55 60
Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu
65 70 75 80
Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys
85 90 95
Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala
100 105 110
Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser
115 120 125
His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly
145 150 155 160
His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn
165 170 175
Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys
180 185 190
Gln Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
195 200
<210> 16
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(9)
<223> 人工增添Flag标签
<220>
<221> SIGNAL
<222> (10)...(30)
<223> 信号序列的范围（前肽）
<400> 16
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe
1 5 10 15
Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys
20 25 30
Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val
35 40 45
Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp
50 55 60
Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser
65 70 75 80
Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser
85 90 95
Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp
100 105 110
Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg
115 120 125
Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln
130 135 140
Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His
145 150 155 160
Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr
165 170 175
Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu
180 185 190
Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln
195 200

Claims (11)

1.天然肽聚糖识别蛋白-SA，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID：1所示。
2.如权利要求1所述的天然肽聚糖识别蛋白-SA，其特征在于：编码氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：2所示。
3.天然肽聚糖识别蛋白-SA或重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段，其特征在于：包含SEQ ID：1所示的序列或全序或片段，优选：Met-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽氨基酸序列、Met-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽氨基酸序列、Met-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-His6标签-肽聚糖识别蛋白-SA全序列氨基酸序列、Met-肽聚糖识别蛋白-SA-His6标签氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-肽聚糖识别蛋白-SA全序列氨基酸序列、Met-肽聚糖识别蛋白-SA全序列-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-肽聚糖识别蛋白-SA成熟肽氨基酸序列、Met-肽聚糖识别蛋白-SA全序列-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-肽聚糖识别蛋白-SA全序列氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的天然肽聚糖识别蛋白-SA的制备方法，其特征在于：利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴，以昆虫血液或血细胞裂解物和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液；该原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化肽聚糖识别蛋白-SA活性组分；再通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合，分离纯化获得肽聚糖识别蛋白-SA的纯度可以到达电泳纯乃至HPLC纯，所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；(2)溶液的酸碱度在pH2-pH10，优选pH4-pH9；(3)调节溶液酸碱度的试剂为是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液，酸或酸溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或它们的溶液，碱或碱溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或它们的溶液；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L，优选0.01mol/L-0.1mol/L。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的鳞翅目天蚕蛾科昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，所述的昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。
6.权利要求1或2所述的天然肽聚糖识别蛋白-SA或权利要求3所述的肽聚糖识别蛋白-SA及其类似物或活性片段的重组表达产物的基因表达方法，其特征在于，它包括(1)利用基因工程技术表达肽聚糖识别蛋白-SA、肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段(2)从上述表达体系中分离纯化重组的肽聚糖识别蛋白-SA、重组的肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段，上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物活性组分，上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯至HPLC纯度的重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段。
7.如权利要求6所述的基因表达方法，其特征在于，所述的基因表达体系包括(1)原核生物系统的表达载体，表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞，(2)酵母细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为酵母细胞，(3)昆虫细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为昆虫细胞，(4)哺乳动物细胞系统的表达载体，表达宿主细胞为哺乳动物细胞，上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达，上述表达体系中的表达产物作为制备重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段的来源。
8.权利要求1或2所述的天然肽聚糖识别蛋白-SA或权利要求3所述的重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段的抗体，其特征在于，以肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段作为抗原。
9.权利要求1或2所述的天然肽聚糖识别蛋白-SA或权利要求3所述的重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物及活性片段的生物学功能，所述的功能为：(1)特异性识别与结合革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌及其相关分子模式，(2)激活酚氧化酶原激活系统，(3)诱导昆虫抗菌肽合成及其获得的抗菌肽。
10.权利要求1或2所述的天然肽聚糖识别蛋白-SA或权利要求3所述的重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物、活性片段的应用，所述的应用为(1)在微生物及其相关分子模式检测中的应用，(2)肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段的检测与追踪。
11.权利要求8所述的肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段作为抗原所产生抗体的应用，所述的应用为：(1)肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA、重组肽聚糖识别蛋白-SA类似物或活性片段的检测与追踪，(2)所述的抗体在特异性识别结合并屏蔽抗原中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375131A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 西南大学 Seroin蛋白的截短体及其应用
CN116143903A (zh) * 2023-03-03 2023-05-23 沈阳药科大学 肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101139599A (zh) * 2007-08-07 2008-03-12 西南大学 家蚕肽聚糖识别蛋白基因
CN103788190A (zh) * 2012-10-26 2014-05-14 沈阳药科大学 β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101139599A (zh) * 2007-08-07 2008-03-12 西南大学 家蚕肽聚糖识别蛋白基因
CN103788190A (zh) * 2012-10-26 2014-05-14 沈阳药科大学 β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI SHANG DAI ET AL: "Characterization and function of a short peptidoglycan recognition protein from the Chinese oak silkworm, Antheraea pernyi", 《JOURNAL OF ASIA-PACIFIC ENTOMOLOGY》 *
WANG,Y. ET AL: "AME17978.1", 《GENBANK》 *
WANG,Y. ET AL: "KT725231.1", 《GENBANK》 *
吕成伟等: "肽聚糖识别蛋白", 《免疫学杂志》 *
戴立上: "柞蚕模式识别受体PGRP-A的序列分析及重组表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375131A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 西南大学 Seroin蛋白的截短体及其应用
CN116143903A (zh) * 2023-03-03 2023-05-23 沈阳药科大学 肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用
CN116143903B (zh) * 2023-03-03 2024-06-07 沈阳药科大学 肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用

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