CN108752455A - 一种真菌防御素的重组制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种真菌防御素的重组制备方法及其应用。本发明通过Overlap PCR构建了四种真菌防御素的基于pET‑32a载体框架的重组表达载体，成功表达出融合蛋白Trx‑Bldesin、Trx‑Atesin‑1、Trx‑Arbesin、Trx‑micasin‑1；通过Trx‑Bldesin结合酶切和HPLC纯化实验，成功获得Bldesin小肽。活性检测显示，重组Bldesin小肽具有抗菌、抑制丝氨酸蛋白酶和抑制Kv1.3钾通道等多种功能，具有潜在应用价值。本发明所述真菌防御素的重组制备方法克服了现有技术中真菌防御素重组表达困难的技术障碍，为真菌防御素的工业化生产奠定基础。

Description

一种真菌防御素的重组制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程、生物工程和生物医药领域，具体涉及一种真菌防御素的重组制备方法及其应用。

背景技术

防御素广泛分布于生物界，富含半胱氨酸，是内源抗菌肽中的一个家族成员，一般由29-54个氨基酸残基构成小分子多肽，有6-8个半胱氨酸，通过二硫键使多肽形成反向平行的β-折叠，有些防御素还有α-螺旋结构。防御素具有多种生物学活性，可以杀死真菌、细菌、病毒等微生物，还有免疫调节、细胞毒性、神经损伤修复等生物学功能。根据半胱氨酸之间二硫键的形成方式，防御素可以分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、植物防御素和昆虫防御素等5大类。

近年来，一种与动物毒素具有相似结构的防御素类多肽(DLP)从一种腐生真菌中分离出来，其具有有效的治疗作用，并且毒性低，在血清中有较高的稳定性，因此成为一种很有吸引力的抗感染试剂的候选药物。根据序列比对、结构和生物系统学分析，可以将DLP分为三个家族：Plectasin、Micasin、Eurocin(Wu,Gao et al.2014)。

Plectasin是第一个从真菌中分离出来的防御素类多肽，具有抗菌活性，它由40个氨基酸组成，分子内六个半胱氨酸形成3对二硫键，Cys1-Cys5,Cys2-Cys4,Cys3-Cys6，具有植物和动物的防御素类抗菌肽中保守的CSαβ三级结构。Plectasin尤其对革兰氏阳性菌有较好的抑制作用，可以抑制诸如链球菌和金黄色酿脓葡萄球菌(MRSA)(Saido-Sakanaka,Ishibashi et al.2004)。Plectasin可以结合于细菌细胞壁的二类亚型脂质体，插入细菌细胞壁中，破坏细胞壁的形成，从而抑制细菌的增殖(Schneider,Kruse et al.2010)，类似于万古霉素和青霉素对细菌的抑制作用。

Micasin从皮肤真菌中分离得到，具有治疗活性，三级结构也是二硫键结合稳定的经典的CSαβ模式，可以抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，尤其是在微摩尔浓度时能够杀死两种甲氧西林抗性的金黄色酿脓葡萄球菌和绿脓杆菌。Micasin在不破坏细胞膜时作用于细菌3小时，可以杀死将近100％的细菌，显示了极低的溶血作用和在血清中的高度稳定性(Zhu,G ao et al.2012)。

还有两种真菌防御素，一种从阿姆斯特丹散囊菌中分离出来的Eurocin(Oeemig,Lynggaar d et al.2012)和从酱油酿造菌米曲霉中分离出来的Oryzeasin，它们不抑制酶促反应，但也结合于细菌细胞壁的二类亚型脂质体上，破坏细菌细胞壁的形成，抑制细菌增殖。

真菌防御素具有良好的水溶性、安全无毒、且抑菌谱广、具备保健作用，逐渐成为天然防腐剂研究应用的一个重要方面。然而，真菌防御素在生物体中含量低，难以天然提取，而化学合成方法成本高，无法满足工业化生产的需求，因此，借助于基因工程手段是大规模生产防御素的一条经济有效的途径。但是由于防御素本身具有抗菌功能，因此，利用原核生物重组制备真菌防御素的难度较大，重组多肽的抗菌活性也难以保证，这是目前制约防御素重组制备的两个关键因素。

发明内容

基于上述现有技术存在的缺陷，本发明通过Overlap PCR构建了四种真菌防御素的基于p ET-28a、pET-32a、pGEX-6p-1、pGEX-4T-1载体框架的多种重组表达载体，通过蛋白小试、S DS-PAGE凝胶电泳摸索表达条件，发现真菌防御素与pET-32a重组表达载体在沉淀和上清中，成功表达出融合蛋白Trx-Bldesin、Trx-Atesin-1、Trx-Arbesin、Trx-micasin-1。据此，通过EK酶和TEV酶等不同的蛋白酶切割融合蛋白，然后再根据表达的蛋白标签纯化蛋白，最后过HP LC分离纯化蛋白，成功获得Bldesin小肽。活性检测显示，重组Bldesin小肽具有抗菌、抑制丝氨酸蛋白酶和抑制Kv1.3钾通道等多种功能，具有潜在应用价值。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种真菌防御素，所述真菌防御素包含具有选自SEQ ID NO.1-4之一的氨基酸序列的多肽。

本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述真菌防御素；优选的，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO.5-8之一的核苷酸序列。

本发明提供了一种载体，所述载体包含上述分离的核酸分子；优选的，所述载体基于pE T-32a载体框架构建。

本发明提供了一种非人细胞，所述细胞包含编码上述真菌防御素的所述分离的核酸分子或上述重组载体。

本发明提供了一种真菌防御素的重组制备方法，包括如下步骤：

(1)获得编码本发明所述真菌防御素的核酸分子；

(2)构建包含步骤(1)所述核酸分子的表达载体，优选pET-32a载体框架；

(3)IPTG诱导重组真菌防御素表达；

(4)纯化重组真菌防御素多肽。

进一步的，编码本发明所述真菌防御素的核酸分子可通过化学合成或PCR的方式获得；优选overlap PCR；更优选使用SEQ ID NO.9-40所示引物序列进行扩增。

进一步的，构建重组表达载体时，编码本发明所述真菌防御素的核酸分子携带蛋白酶识别位点的编码核酸，还携带有蛋白纯化标签；蛋白酶优选TEV和EK。

进一步的，所述纯化步骤包括：1)半透膜透析步骤；2)酶切步骤；3)HPLC纯化步骤。

进一步的，本发明还提供了所述编码真菌防御素的核酸分子、所述载体和/或所述细胞在制备重组真菌防御素中的应用。

进一步的，本发明还提供了本发明所述真菌防御素、所述编码真菌防御素的核酸分子、所述载体和/或所述细胞在制备抗菌组合物中的应用，所述抗菌组合物优选为抑菌剂。

本发明的有益效果是：

1、选择了恰当的重组表达载体重组表达真菌防御素Bldesin、Atesin-1、Arbesin和micasin-1，使重组融合蛋白释放至培养液上清，便于蛋白纯化，为真菌防御素的工业化生产奠定基础和提供帮助。

2、验证了重组真菌防御素的抗菌功能，为抗菌/抑菌剂的开发提供新的活性分子。

附图说明

图1.真菌防御素目的片段扩增产物凝胶电泳检测：A.Bldesin的DNA凝胶电泳图谱；B.真菌防御素Atesin-1、Arbesin和micasin-1的pET-32a载体TEV酶切位点的DNA凝胶电泳图谱；C.真菌防御素Atesin-1、Arbesin和micasin-1的pET-32a载体EK酶切位点的DNA凝胶电泳图谱。

图2.真菌防御素Bldesin HPLC纯化的峰图和MS质谱检测：A.真菌防御素Bldesin原始核酸序列和对应蛋白序列；B.真菌防御素Bldesin的HPLC分离纯化；C.真菌防御素Bldesin的质谱鉴定。

图3.真菌防御素Bldesin的功能检测(细菌和离子通道Kv1.3)：A.真菌防御素Bldesin抗革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的检测；B.真菌防御素Bldesin抗革兰氏阴性细菌大肠杆菌的检测；C.真菌防御素Bldesin抗革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的生长曲线检测；D，真菌防御素Bldesin抑制钾通道Kv1.3功能检测。

图4.真菌防御素Bldesin的功能检测(丝氨酸蛋白酶)：A.真菌防御素Bldesin的APTT检测；B.真菌防御素Bldesin的PT检测；C.真菌防御素Bldesin的plasmin抑制活性检测；D.真菌防御素Bldesin的trypsin抑制活性检测；E.真菌防御素Bldesin的chymotrypsin抑制活性检测；F.真菌防御素Bldesin的elastase抑制活性检测。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。

实施例1：防御素重组表达载体的构建

在NCBI基因数据库中，预测获得4个真菌防御素的全序列信息，它们都有前导肽、信号肽和成熟肽，通过序列比对，发现这些真菌防御素成熟肽的一级结构有较高的相似性，它们都有3对二硫键，通过Cys1-Cys4，Cys2-Cys5，Cys3-Cys6方式连接固定，形成稳定的CSαβ结构。上述4个真菌防御素未见功能研究和制备的报道，成熟多肽的氨基酸序列信息如下：

Bldesin：GWGCNIFGGNDYRCHRHCKSISGYKGGYCKLGGICKCY(SEQ ID NO.1)

Atesin-1：GYGCPNDYSCSNYCSSIGRNGGYCGGFLWQTCKCNEKK(SEQ ID NO.2)

Arbesin：GFGCPLNERECHAHCLSIGRKFGYCGGSLRLTCICGKE(SEQ ID NO.3)

micasin-1：DVGCPSAPKQCDHHCRSMGKAFGYCDDFKFQKCLCA(SEQ ID NO.4)

通过大肠杆菌密码子优化，优化后的编码核酸序列如下：

Bldesin(SEQ ID NO.5)：

GGCTGGGGCTGCAACATTTTTGGCGGCAACGATTATCGCTGCCATCGCCATTGCAAAAGCATTAGCGGCTATAAAGGCGGCTATTGCAAACTGGGCGGCATTTGCAAATGCTAT

Atesin-1(SEQ ID NO.6)：

GGCTATGGCTGCCCGAACGATTATAGCTGCAGCAACTATTGCAGCAGCATTGGCCGCAACGGCGGCTATTGCGGCGGCTTTCTGTGGCAGACCTGCAAATGCAACGAAAAAAAA

Arbesin(SEQ ID NO.7)：

GGCTTTGGCTGCCCGCTGAACGAACGCGAATGCCATGCGCATTGCCTGAGCATTGGCCGCAAATTTGGCTATTGCGGCGGCAGCCTGCGCCTGACCTGCATTTGCGGCAAAGAA

micasin-1(SEQ ID NO.8)：

GATGTGGGCTGCCCGAGCGCGCCGAAACAGTGCGATCATCATTGCCGCAGCATGGGCAAAGCGTTTGGCTATTGCGATGATTTTAAATTTCAGAAATGCCTGTGCGCG

1、Overlap PCR

采用Overlap PCR构建重组载体，每个克隆设计四条引物，引物2和引物3有15个碱基互补配对，第一轮PCR反应先用引物2和引物1搭桥扩增出产物1，第二轮PCR以产物1为模板，用引物3和引物4最终扩增出最后的目的片段。

EK酶切位点是：DDDDK，TEV酶切位点是：ENLYFQ/G，因此在设计引物时，如果成熟肽序列靠近3’端第一个氨基酸是G，就要删掉一个TEV酶切序列末端的G，否则TEV蛋白酶切后成熟肽将会多一个G，如果成熟肽序列靠近3’端第一个氨基酸不是G，就不需要删掉G。

(1)引物设计如下表所示：

(2)将设计好的引物发送至武汉天一辉远合成。

(3)PCR扩增：将合成好的引物加超纯水溶解至浓度为10μM，用PCR产物扩增酶Phemta Max Super-Fidelity DNA Ploymerase来扩增产物。反应体系如下：

PCR反应条件如下：

2、琼脂糖凝胶电泳鉴定

PCR扩增DNA后，取出5μL产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。

3、酶切

将鉴定为阳性的DNA扩增产物取出，用限制性内切酶Xho I、KPN I分别切割DNA产物片段和pET-32a载体质粒，37℃酶切过夜，酶切体系(40μL)如下：

4、琼脂糖凝胶回收酶切产物

使用康为世纪的胶回收试剂盒，步骤如下：

1)配制1％和2％的DNA凝胶，分别进行酶切质粒和酶切片段的凝胶电泳；

2)切下单一DNA目的条带，电子天平上称重；

3)向切下的胶块加入3体积Buffer PG(凝胶重50mg，体积视为50μL)；

4)50℃水浴10分钟，使胶块充分溶解；

5)柱平衡：向吸附柱中加入200μL Buffer PS，13000rpm/min，离心2分钟，弃废液；

6)吸取步骤3中的溶液700μL到平衡后的吸附柱中，室温放置2分钟，13,000rpm/min，离心1分钟，倒掉废液；

7)吸附柱里加500μL Buffer PG，13000rpm/min，离心1分钟，倒掉废液；

8)向吸附柱里加700μL漂洗液Buffer PW，13000rpm/min，离心1分钟，倒掉废液；

9)将收集管里的吸附柱13000rpm/min，离心2分钟，将吸附柱放进到新的1.5mL离心管中，室温放置10分钟；

10)往吸附膜中央加40μL ddH₂O，室温放置5分钟，13,000rpm/min，离心2分钟。

5、连接

将回收的DNA目的片段和质粒用T4DNA连接酶连接，22℃连接2小时。

T4 DNA连接酶的连接体系(10μL)为：

6、重组载体转化大肠杆菌

将连接后的重组载体转化到DH5α的感受态中，冰浴30分钟，再42℃热激90s,加入无抗培养基500μl，180rpm/min,37℃摇床中摇菌1小时，用涂布棒将菌液在倒有固体培养基的平板上涂匀。

7、阳性克隆鉴定

每个重组载体挑5-10个斑，进行PCR菌落鉴定。菌落PCR鉴定体系与普通PCR一样，用Phemta Max Super-Fidelity DNA Ploymerase，以1μL菌液为模板进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定出阳性菌落。鉴定为阳性的菌送往武汉天一辉远测序鉴定。鉴定结果正确后进行下一步实验。

8、结果：

用Overlap PCR搭桥扩增出了真菌防御素Bldesin、Atesin-1、Arbesin和micasin-1成熟肽的目的片段，通过DNA凝胶电泳鉴定(如图1所示)，设计的片段包括：Bldesin-6p-1-EK，以pEGX-6p-1载体，重组肠激酶EK为蛋白酶切位点的重组表达质粒；Bldesin-32a-EK，以pET-32a为载体，EK酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒；Bldesin-32a-TEV，以pET-32a为载体，TEV酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒(图1中A)；Atesin-1-32a-EK，以pET-32a为载体，EK酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒；Atesin-1-32a-TEV，以pET-32a为载体，TEV酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒(图1中C和B)；Arbesin-32a-EK，以pET-32a为载体，EK酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒；Arbesin-32a-TEV，以pET-32a为载体，TEV酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒；micasin-1-32a-EK，以pET-32a为载体，EK酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒；micasin-1-32a-TEV，以pET-32a为载体，TEV酶为蛋白酶切位点的重组表达质粒(图1中C和B)，一共9个克隆子。

将鉴定为阳性的菌送往测序公司测序，鉴定其序列正确性。将所得序列与NCBI上获得的原始序列进行比对后，发现目的片段和连接的蛋白酶切位点序列均正确。Bldesin重组载体的序列全部正确，包括TEV蛋白酶切位点序列和EK酶切位点序列。真菌防御素Atesin-1、Arbesin和micasin-1pET-32a载体EK酶切位点的序列和TEV酶切位点的序列也完全正确。

真菌防御素Bldesin、Atesin-1、Arbesin和micasin-1重组表达载体pET-28a和Atesin-1、Arbesin和micasin-1重组表达载体pEGX-4T-1的构建参照上述方法进行，筛选阳性克隆测序后完全正确。

实施例2：防御素的重组表达和纯化

1、质粒提取

将鉴定的阳性菌保存后，接菌，快速提取质粒，质粒提取试剂盒购自康为世纪，该试剂盒提取的质粒不去内毒素，属粗提。步骤如下：

(1)将37℃摇过夜的菌液收集到10mL离心管中，8,000rpm/min,离心10分钟，倒掉上清。

(2)向离心管中加入500μl Buffer P1(使用前加入RNase A)，重悬菌液。

(3)往上述菌液加入500μl Buffer P2，轻缓上下颠倒5-6次，裂解菌液。

(4)再加入700μl Buffer N3，轻缓上下颠倒5-6次，沉淀细胞里的蛋白，12,000rpm/mim,离心10分钟。

(5)活化吸附柱。

(6)将步骤4中的上清取出700μl到吸附柱中，12,000rpm/mim,离心1分钟，倒掉废液，如此重复，直至将样品取完。

(7)往吸附柱中加入500μl Buffer PB，12,000rpm/mim,离心1分钟，倒掉废液。

(8)向吸附柱中加入700μl漂洗液Buffer PW(使用前加入无水乙醇)，离心1分钟，倒掉废液。

(9)将放在收集管中的吸附柱13,000rpm/min离心2分钟，取出吸附柱，打开盖子，放在新的离心管中，室温放置10分钟，去除乙醇。

(10)往吸附膜中加入100μl超纯水洗脱DNA产物，放置2分钟，12,000rpm/mim,离心2分钟，获得粗提质粒。

2、转化E.coli/Rosseta菌

将粗提的质粒转化到E.coli/Rosseta表达菌中，挑斑后摇菌，准备后续的表达实验。

3、蛋白制样小试

(1)接菌20μl于10mL液体LB培养基中，37℃，250rpm/mim培养过夜。

(2)分别取500μl菌液接入两支10mL LB培养基的试管A、B中，37℃，250rpm/mim培养。

(3)1.5-2.0小时后测菌液浓度，OD值为0.2时，B试管中加入5mM的IPTG诱导液，在放入摇床中，28℃，250rpm/mim培养4小时。

(4)收菌：将菌液8,000rpm/min,离心10分钟，倒掉上清。

(5)往菌体沉淀的离心管中加入450μl冰PBS或者McAc 20，重悬菌液，转移至1.5mL离心管。

(6)把重悬的菌液进行超声破碎，超声破碎仪工作时间为6s，间歇时间为2s，菌液破碎3-4次，即可破碎彻底。

(7)将破碎好的菌液在4℃，12,000rpm/mim，离心15分钟，取出上清至新的离心管中，再用450μl冰PBS或者McAc 20重悬沉淀。

(8)将上清与重悬沉淀的菌液分别加入450μl 2×蛋白loading，再加入20μlβ-巯基乙醇，盖好盖子，放到水浴锅中煮沸10分钟，完成蛋白制样。

4、SDA-PAGE蛋白凝胶电泳

(1)根据配方配制SDA-PAGE蛋白胶，插入11个齿15mm宽的梳子。

(2)等胶凝固后，拔下梳子，正确倒入阴极液和阳极液，与电泳仪连接电极。

(3)上样：蛋白Marker上5μl的样，蛋白样品上20-30μl的样。

(4)跑凝胶电泳，至loading到凝胶最下方。

(5)拆下凝胶架子，将蛋白胶转移至平皿中。

(6)加入固定液，水平摇床摇30分钟。

(7)倒掉固定液，加入SDS-PAGE染色液，水平摇床摇1小时染色。

(8)倒掉染色液，加入洗脱液，洗脱过夜。

(9)将洗脱好的蛋白胶在凝胶成像仪中成像。

5、GST柱纯化蛋白

(1)取50μl表达菌，接到10mL含抗性的液体LB培养基中，37℃培养过夜。

(2)取出3mL菌，接到1L的液体LB培养基中，37℃培养2小时左右，用酶标仪测定菌液浓度，OD值在光波长600nm处为0.2时可以诱导。

(3)诱导表达：1L菌液中加入1mL IPTG诱导液，温度改到28℃，培养4小时。

(4)收菌：取4个离心杯，清洗干净，将菌液倒入其中，4℃，8000rpm/min，6min离心，倒掉上清。

(5)超声破碎菌液：将收集到的菌体用冰PBS重悬，转移到50mL离心管中，加入PBS到40mL，超声波破碎仪破碎菌液，工作时间2s，间隔时间5s，破碎99次，菌液破碎时需放在冰水中。

(6)破碎好的菌液4℃，12，000rpm/min，离心15分钟，取出上清转移至新的离心管中。

(7)过GST柱子：先用200mL PBS冲洗GST柱子，再上蛋白样，接着用PBS洗杂，再用洗脱液GSH液洗脱样品，用一个新的管子收集洗脱下来的蛋白，将洗脱下来的蛋白用10KD的超滤管超滤，4000g，离心45分钟，将超滤下来的蛋白样品转移至1.5mL的离心管，12,000rpm，离心15分钟，取出上清，移至新的离心管。

(8)用重组肠激酶EK酶切蛋白

酶切体系(1mL)：酶3μl，酶切Buffer 100μl(10×)，蛋白样品900μl，22℃酶切过夜。

(9)HPLC纯化蛋白：将酶切的蛋白12,000rpm，离心15分钟，取出上清，移至新的离心管，然后过HPLC。

(11)将纯化的蛋白放在-80℃冰箱中6小时，然后用蛋白冻干机冻干蛋白，备用。

6、镍柱透析法表达纯化蛋白

(1)取50μl表达菌，接到10mL含抗性的液体LB培养基中，37℃培养过夜。

(2)取出3mL菌，接到1L含抗性的液体LB培养基中，37℃培养2小时左右，用酶标仪测定菌液浓度，OD值在光波长600nm处为0.2时可以诱导。

(3)诱导表达：1L菌液中加入1mL IPTG诱导液，温度改到25℃，诱导培养过夜。

(4)收菌：取6个离心杯，清洗干净，将菌液倒入其中，4℃，8000rpm/min，6min离心，倒掉上清。

(5)超声破碎菌液：将收集到的菌体用冰McAc 20重悬，转移到50mL离心管中，加入McAc 20到40mL，超声波破碎仪破碎菌液，工作时间2s，间隔时间5s，破碎99次，菌液破碎时需放在冰水中。

(6)破碎好的菌液4℃，12，000rpm/min，离心15分钟，取出上清转移至新的离心管中。

(7)连接好镍柱，先用50mL McAc 20冲洗GST柱子，再上蛋白样，接着用McAc 20洗杂，再用McAc 250液洗脱样品，用一个新的管子收集洗脱下来的蛋白。

(8)透析和超滤：剪一段透析膜，水浴锅中煮沸10分钟，然后往透析袋中加入洗脱下来的蛋白样品，用线捆好密封，放入透析Buffer中，用磁力搅拌器搅拌液体，透析1小时左右，吸出透析袋中的蛋白，用10KD的超滤管超滤到5mL左右。

(9)将透析超滤后的蛋白用TEV酶或者EK酶酶切，22℃酶切过夜。

(10)HPLC纯化蛋白：将酶切的蛋白12,000rpm/min，离心15分钟，取出上清，移至新的离心管，然后过HPLC。

(11)将纯化的蛋白放在-80℃冰箱中6小时，然后用蛋白冻干机冻干蛋白，备用。

(12)取出少量经HPLC纯化的蛋白，进行质谱检测蛋白分子量。

7、结果：

防御素蛋白表达与许多因素有关，比如pH值、诱导表达的温度、诱导剂、表达载体、蛋白酶切位点等，都会影响到表达成功与否。为了摸索到合适的表达条件，进行了真菌防御素蛋白的表达小试，表达条件均为加IPTG诱导剂和不加IPTG诱导剂，28℃摇菌4小时，诱导表达，首先以pET-28a为表达载体，结果Bldesin在大肠杆菌E.coli菌体沉淀和上清中都未表达出来，其它真菌防御素Atesin-1、Arbesin和micasin-1在菌体沉淀和上清中未有表达。因此换了表达载体pGEX-6p-1，Bldesin在以pGEX-6p-1为表达载体时，菌体沉淀和上清中均有蛋白表达出来，但是其它真菌防御素Atesin-1、Arbesin和micasin-1在以pGEX-4T-1为表达载体时，菌体沉淀中有蛋白表达，上清中则没有蛋白表达出来，由于pGEX-4T-1含有GST标签序列，需要用GST柱离子交换亲和层析法才能分离出蛋白，但是该方法一般用于融于上清中的蛋白分离，因此仍需寻找更适于真菌防御素生产制备的表达载体。当以pET-32a为载体时，IPTG，28℃诱导表达4小时，Bldesin在菌体沉淀上清中均有蛋白表达出来，Atesin-1、Arbesin和micasin-1在菌体沉淀和上清中也有蛋白表达出来，由此可知真菌防御素pET-32a重组表达载体，加IPTG诱导剂，28℃诱导表达4小时，可以表达出真菌防御素的重组融合蛋白。

在4个防御素中，重点研究了真菌防御素Bldesin。继续摸索其无融合标签小肽表达纯化条件，经多次探索性的工作尝试，两种标签GST和Trx，两个蛋白酶切方式TEV和EK均获得了成功。以GST和EK酶的组合，作为结果展示。半透膜透析后的融合蛋白用蛋白酶酶切后，经高效液相色谱仪HPLC纯化，用95％的B液和5％的D液进行线性洗脱，在23-24分钟左右，得到了一个单峰(如图2中B所示)，用干净的离心管收集单峰蛋白，取出20μL准备送质谱鉴定蛋白分子量大小，从质谱公司返回的质谱结果可知，与Bldesin理论分子量一致(图2中C)。取出少量过HPLC后的样品进行蛋白制样，通过SDS-PAGE胶凝胶电泳进行蛋白检测，首先取出200μL冻干前的蛋白制蛋白样，进行SDS-PAGE胶凝胶电泳检测，其余放在-80℃冻存6小时以上，然后用高真空冷冻冻干机进行冻干干燥，再取出200μL制蛋白样，进行SDS-PAGE胶凝胶电泳检测正确。

实施例3：防御素功能验证

1、重组防御素对菌的最小抑菌浓度测定

(一)标准菌株

(1)取保藏的标准菌株按1:1000的比例接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，摇床转速250rpm。将活化后菌液按照1:100的比例接种于LB液体培养基，37℃培养至菌株进入对数生长期约12小时，OD600约为0.6，摇床转速250rpm。然后用无抗LB液体培养基稀释菌液至每毫升菌液约10⁴个菌落形成单位(即将OD600＝0.6的菌液用无抗LB液体培养基稀释100倍)。

(2)无菌96孔板中每孔加入80μl上述菌液，然后向每孔分别加入2倍梯度稀释的待筛选重组防御素20μl，初始最高终浓度1mg/ml(终浓度为0.25mg/ml)，设置8个浓度梯度，同时设置阴性对照：生理盐水；阳性对照：5MIC Kan+和5MIC Amp+，每个浓度设置3个平行对照。

(3)于37℃培养12-16小时，摇床转速250rpm。

(4)酶标仪测定96孔板各孔在630nm波长下的吸光值，选择与阳性对照一致无明显光吸收的最小浓度为最小抑菌浓度。

(二)临床耐药菌

(1)取保藏的临床耐药菌于血平板划线分单菌，注意防止杂菌污染。于37℃培养16小时后，挑取单菌落接种于10mlLB液体培养基，37℃培养16个小时，摇床转速250rpm。

(2)用无抗LB液体培养基稀释菌液至0.5麦氏浓度，在无菌96孔板中每孔加入80μl上述稀释好的菌液，然后向每孔分别加入2倍梯度稀释的待筛选重组防御素20μl，初始最高终浓度1.0mg/ml，设置8个浓度梯度，同时设置阴性对照：生理盐水；阳性对照：5MIC Kan+和5MIC Amp+，每个浓度设置3个平行对照。

(3)于37℃培养12-16小时，摇床转速250rpm。

(4)酶标仪测定96孔板各孔在630nm波长下的吸光值，选择与阳性对照一致无明显光吸收的最小浓度为最小抑菌浓度。

2、重组防御素抑制细菌生长曲线

(1)取保藏的标准菌(AB94004)按1:1000的比例接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，摇床转速250rpm。将活化后菌液按照1:100的比例接种于LB液体培养基，37℃培养至菌株至OD600约为0.1，摇床转速250rpm。

(2)无菌96孔板中每孔加入80μl上述菌液，然后向每孔待筛选抗菌肽溶液20μl使终浓度分别为1×MIC、2×MIC、5×MIC，同时设置阴性对照：生理盐水；阳性对照：终浓度14μM卡纳青霉素和57μM氨苄青霉素，每个浓度设置3个平行对照。

(3)于37℃培养12-16小时，摇床转速250rpm。自加药后的0到9个小时中，前2个小时，每30分钟测定一次OD630；后7个小时，每小时测定一次OD630。

(4)根据实验结果，以时间(h)为横坐标，吸光值为纵坐标绘制加入待筛选抗菌肽后菌株的生长曲线。

3、膜片钳实验和数据分析

电生理膜片钳实验一般在22-25℃下进行，实验所用电极由Sutter公司P30垂直拉制仪器制成。使用前电极要先进行抛光处理，使尖端光滑圆润，直径1μm左右，细胞灌充内液以后，电极在水中电阻为3-5MΩ，如果需要离子通道药理学研究，则配制的药物中还需要加入0.01％BSA，防止药物非特异性吸附于给药系统壁，影响药物实际浓度的检测。

Kv1.3钾离子通道电生理记录实验采取全细胞记录模式，293T细胞置于哺乳类Ringer溶液中，测试多肽加入到有0.01％BSA的Ringer溶液，膜片钳放大器购自德国HEKA公司，采用EPC10单通道记录仪，记录软件是Patchmaster。

电流刺激方法为：细胞刺激电压在400ms内从-120mV升至+60mV，以Ramp模式上升，钳制电压为-40mV，电流间隔时间为5s，每个药物浓度平行重复测试3次及以上。

数据分析和作图软件为：Origin、Patchclamp、Sigmaplot10，防御素半数抑制浓度IC50以浓度为横坐标，电流归一化为纵坐标，用Hill4方程拟合：

Itoxin/Icontrol＝1/(1+([toxinpeptide]/IC50)

I值为-120mV处稳定电流值，Icontrol为未加药时稳定电流值，Itoxin为加药(重组防御素)后电流值大小，IC50值是毒素半数抑制浓度，拟合曲线时，采用不少于四个不同的浓度，IC50值以平均值±标准差表示出来。

4、丝氨酸蛋白酶抑制活性测定方法

采用抑制剂多肽抑制丝氨酸蛋白酶水解人工合成发光底物的方法来检测待测重组防御素多肽的活性(以Trypsin为例，其它丝氨酸蛋白酶条件方法均与Trypsin类似)。

A.多肽抑制活性检测：

1)在96孔板排孔中各加入50μL1600nM的Trypsin溶液(终浓度为400nM)和50μL不同浓度的的多肽蛋白溶液，阴性对照为抑制剂Buffer，阳性对照为BPTI；

2)Trypsin溶液与不同浓度多肽蛋白溶液混合后与发光底物[S](800μM)一同置于37℃摇床低速温育30min；

3)取出96孔板，向各孔[E]-[I]混合物中同时加入100μL发光底物，置于酶标仪下，用405nm波长连续检测各孔5min内每分钟的吸光值；

4)计算抑制百分率(以[I]＝0nM为100％)，以BPTI作阳性对照，BSA作阴性对照。

5、结果：

活性检测显示，重组Bldesin小肽具有抗菌、抑制丝氨酸蛋白酶和抑制Kv1.3钾通道等多种功能，具体见图3和图4。其中，抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球的MIC为9μg/ml(图3中A)；生长曲线测试显示，1倍MIC，2倍MIC和4倍MIC浓度的Bldesin可以完全抑制革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的生长，这种抑制效果和对照的氨苄青霉素和卡那霉素一致；相对于生理盐水，0.5倍MIC和0.25倍MIC浓度的Bldesin可以部分抑制金黄色葡萄球菌的生长(图3中C)。除此之外，重组Bldesin小肽抑制离子通道Kv1.3的半数抑制浓度约为1μM(图3中D)，抑制胰凝乳蛋白酶的半数抑制浓度约为2500μM(图4中E)。由此可见，重组Bldesin小肽具有潜在的抗菌应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北医药学院

<120> 一种真菌防御素的重组制备方法及其应用

<130> CP11802173C

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 38

<212> PRT

<213> Bldesin

<400> 1

Gly Trp Gly Cys Asn Ile Phe Gly Gly Asn Asp Tyr Arg Cys His Arg

1 5 10 15

His Cys Lys Ser Ile Ser Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Lys Leu Gly

20 25 30

Gly Ile Cys Lys Cys Tyr

35

<210> 2

<211> 38

<212> PRT

<213> Atesin-1

<400> 2

Gly Tyr Gly Cys Pro Asn Asp Tyr Ser Cys Ser Asn Tyr Cys Ser Ser

1 5 10 15

Ile Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Cys Gly Gly Phe Leu Trp Gln Thr Cys

20 25 30

Lys Cys Asn Glu Lys Lys

35

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> Arbesin

<400> 3

Gly Phe Gly Cys Pro Leu Asn Glu Arg Glu Cys His Ala His Cys Leu

1 5 10 15

Ser Ile Gly Arg Lys Phe Gly Tyr Cys Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr

20 25 30

Cys Ile Cys Gly Lys Glu

35

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> micasin-1

<400> 4

Asp Val Gly Cys Pro Ser Ala Pro Lys Gln Cys Asp His His Cys Arg

1 5 10 15

Ser Met Gly Lys Ala Phe Gly Tyr Cys Asp Asp Phe Lys Phe Gln Lys

20 25 30

Cys Leu Cys Ala

35

<210> 5

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggctggggct gcaacatttt tggcggcaac gattatcgct gccatcgcca ttgcaaaagc 60

attagcggct ataaaggcgg ctattgcaaa ctgggcggca tttgcaaatg ctat 114

<210> 6

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggctatggct gcccgaacga ttatagctgc agcaactatt gcagcagcat tggccgcaac 60

ggcggctatt gcggcggctt tctgtggcag acctgcaaat gcaacgaaaa aaaa 114

<210> 7

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggctttggct gcccgctgaa cgaacgcgaa tgccatgcgc attgcctgag cattggccgc 60

aaatttggct attgcggcgg cagcctgcgc ctgacctgca tttgcggcaa agaa 114

<210> 8

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgtgggct gcccgagcgc gccgaaacag tgcgatcatc attgccgcag catgggcaaa 60

gcgtttggct attgcgatga ttttaaattt cagaaatgcc tgtgcgcg 108

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgggtaccga aaacctgtat tttcagggct ggggctgcaa catttttgg 49

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caacattttt ggcggcaacg attatcgctg ccatcgccat tgcaaaag 48

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgcccagttt gcaatagccg cctttatagc cgctaatgct tttgcaatg 49

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgctcgagtt catagcattt gcaaatgccg cccagtttgc aatagccgc 49

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgggtaccga tgacgatgac aagggctggg gctgcaacat ttttggcgg 49

<210> 14

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caacattttt ggcggcaacg attatcgctg ccatcgccat tgcaaaagc 49

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgcccagttt gcaatagccg cctttatagc cgctaatgct tttgcaatg 49

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgctcgagtt catagcattt gcaaatgccg cccagtttgc aatagc 46

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgggtaccga aaacctgtat tttcagggct atggctgccc gaacgatta 49

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctgcccgaac gattatagct gcagcaacta ttgcagcagc tatggccgc 49

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tctgccacag aaagccgccg caatagccgc cgttgcggcc atagctgct 49

<210> 20

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgctcgagtt attttttttc gttgcatttg caggtctgcc acagaaagc 49

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctgggtaccg atgacgatga caagggctat ggctgcccga acgattata 49

<210> 22

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcccgaacga ttatagctgc agcaactatt gcagcagcta tggccgcaa 49

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ggtctgccac agaaagccgc cgcaatagcc gccgttgcgg ccatagctg 49

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gtgctcgagt tatttttttt cgttgcattt gcaggtctgc cacagaaa 48

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgggtaccga aaacctgtat tttcagggcg atgtgggctg cccgagcg 48

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgggctgccc gagcgcgccg aaacagtgcg atcatcattg ccgcagca 48

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

taaaatcatc gcaatagcca aacgctttgc ccatgctgcg gcaatgat 48

<210> 28

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tgctcgagtt acgcgcacag gcatttctga aatttaaaat catcgcaat 49

<210> 29

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctgggtaccg atgacgatga caaggatgtg ggctgcccga gcgcgcc 47

<210> 30

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ctgcccgagc gcgccgaaac agtgcgatca tcattgccgc agcatgg 47

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tttaaaatca tcgcaatagc caaacgcttt gcccatgctg cggcaat 47

<210> 32

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gtgctcgagt tacgcgcaca ggcatttctg aaatttaaaa tcatcgca 48

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgggtaccga aaacctgtat tttcagggct ttggctgccc gctgaacga 49

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ctgcccgctg aacgaacgcg aatgccatgc gcattgcctg agcattggc 49

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggcgcaggct gccgccgcaa tagccaaatt tgcggccaat gctcaggca 49

<210> 36

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tgctcgagtt attctttgcc gcaaatgcag gtcaggcgca ggctgccgc 49

<210> 37

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ctgggtaccg atgacgatga caagggcttt ggctgcccgc tgaacgaac 49

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gcccgctgaa cgaacgcgaa tgccatgcgc attgcctgag cattggccg 49

<210> 39

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

caggcgcagg ctgccgccgc aatagccaaa tttgcggcca atgctcagg 49

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gtgctcgagt tattctttgc cgcaaatgca ggtcaggcgc aggctgcc 48

Claims (10)

1.一种真菌防御素，其特征在于，所述真菌防御素包含具有选自SEQ ID NO.1-4之一的氨基酸序列的多肽。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述真菌防御素；优选的，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO.5-8之一的核苷酸序列。

3.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述分离的核酸分子；优选的，所述载体基于pET-32a载体框架构建。

4.一种非人细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述分离的核酸分子或权利要求3所述载体。

5.一种真菌防御素的重组制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得编码权利要求1所述真菌防御素的核酸分子；

(2)构建包含步骤(1)所述核酸分子的表达载体，优选pET-32a载体框架；

(3)IPTG诱导重组真菌防御素表达；

(4)纯化重组真菌防御素多肽。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，编码权利要求1所述真菌防御素的核酸分子可通过化学合成或PCR的方式获得；优选overlap PCR；更优选使用SEQ ID NO.9-40所示引物序列进行扩增。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，构建表达载体时，编码权利要求1所述真菌防御素的核酸分子携带蛋白酶识别位点的编码核酸，还携带有蛋白纯化标签；蛋白酶优选TEV和EK。

8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，纯化步骤包括：1)半透膜透析步骤；2)超滤步骤；3)酶切步骤；4)HPLC纯化步骤。

9.权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述载体和/或权利要求4所述细胞在制备重组真菌防御素中的应用。

10.权利要求1所述真菌防御素、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述载体和/或权利要求4所述细胞在制备抗菌组合物中的应用，所述抗菌组合物优选为抑菌剂。