CN101353668A - 鼠β-防御素1的重组质粒、多肽及其用途与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过基因工程技术构建鼠β－防御素1基因(mBD－1)的原核重组质粒和真核重组质粒，将原核重组质粒转入工程菌进行诱导高效表达鼠β－防御素1多肽(mBD－1)并进行表达产物的提取、纯化和肠激酶酶切释放出成熟有活性的mBD－1。本发明通过实验证明了mBD－1多肽和稳定转染真核重组质粒的MDCK细胞株具有抗流感病毒的作用，以便开发出一类治疗或预防流行性感冒的新型药物。

Description

鼠β-防御素1的重组质粒、多肽及其用途与制备方法

技术领域

本发明涉及重组鼠β-防御素1的重组质粒、多肽及其用途与制备方法。

背景技术

β-防御素是近几年来发现的一类广泛存在于动物体内具有广泛抗微生物活性的阳离子多肽，主要分布在上皮细胞中，包括皮肤、呼吸道、尿道、肠道和口腔粘膜上皮细胞等。通过基因组学分析，已发现了29种编码β-防御素的基因(DEFB)，已经克隆的有人β-防御素(hBD)1-5，6和鼠β-防御素(mBD)1-8，12，29。研究发现，鼠β-防御素1基因(mBD-1)(来自GenBank，#AA065510)上游序列中缺乏NF-κB、IL-6和STAT等的结合位点，不能受LPS和促炎细胞因子诱导表达，属于固有性表达。目前，国内外β-防御素的制备以合成为主，造价昂贵且不能保证多肽的生物学活性。

流行性感冒病毒(influenza virus，简称流感病毒)是流行性感冒(influenza，简称流感)的病原体。流感一直是人类急性呼吸道传染病的主要疾病之一，20世纪发生的4次全球性流感大流行给个人和社会造成无法估量的损失。而从1997年至今禽流感的肆虐更给人们敲醒了警钟。世界卫生组织(WHO)警告，一场全球性的流感大流行将会导致200万-700万人丧命。最近几年高致病性禽流感(Avian influenza)在亚洲肆虐之后，以十分惊人速度在世界传播，蔓延至欧洲诸国，导致暴发地区蒙受巨大经济损失。目前治疗流感有四种抗病毒药物，但世卫组织披露流感病毒(H1N1)在18个国家已发现突变体，可以抵制最好的抗病毒药物达菲(Tamiflu)的作用。流感病毒容易突变，流感疫苗的制备非常耗费时间，而且流感疫苗的开发速度远远跟不上流感病毒易突变发生的步伐。因此，不断开发新型的抗流感药物势在必行。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供制备重组鼠β-防御素1多肽的新方法，并证明鼠β-防御素1多肽对流行性感冒病毒具有抑制作用，以便开发出一类治疗或预防流行性感冒的新型药物。

本发明所述重组鼠β-防御素1基因(mBD-1)已在GenBank注册，注册号AA065510，其cDNA碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。

本发明所述重组鼠β-防御素1多肽(mBD-1)，其制备方法为：由序列表中SEQ IDNO.1所述的鼠β-防御素1基因与原核载体构建原核重组质粒，再将原核重组质粒在工程菌中表达、分离纯化，并采用肠激酶酶切，具体步骤依次如下：

(1)通过RT-PCR反应，获得mBD-1基因；

(2)将上述扩增的mBD-1基因片段插入到原核载体构建原核重组质粒，再将重组质粒转染至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

(3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析；

(4)将正确克隆原核重组质粒转染入工程菌中进行表达，分离纯化表达的多肽即获得重组鼠β-防御素1多肽；

(5)采用sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)和Western blot鉴定重组鼠β-防御素1多肽的正确性；

(6)采用肠激酶酶切释放出成熟有活性的重组鼠β-防御素1多肽。

原核载体为pGEX-4T-1、pGEX-4T、pET32a(+)中的一种。

本发明所述重组鼠β-防御素1多肽(mBD-1)，还可以由序列表中SEQ ID NO.1所述的鼠β-防御素1基因与真核载体构建真核重组质粒，将真核重组质粒在细胞中表达获得，制备真核重组质粒的具体步骤依次如下：

(1)通过RT-PCR反应，获得mBD-1基因；

(2)将上述扩增的mBD-1基因片段插入到真核载体构建真核重组质粒，再将重组质粒转染至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

(3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析。

真核载体为pIRES2-EGFP、pcDNA3.1/mys-HisA、pcDNA3.1(+)中的一种。

本发明通过实验证明：重组鼠β-防御素1多肽(mBD-1)可以直接抑制流感病毒包膜与宿主细胞膜的融合；具有趋化中性粒细胞、树突状细胞到炎症部位，提高CD8⁺T细胞参与调节免疫反应的特性(见实施例3及图14)；mBD-1成熟肽对流感病毒攻击的小鼠很好的发挥了其抗病毒作用，减弱了肺部受损伤的程度，与对照组相比，提高了生存率(见实施例4及图16-17)。病理切片显示，治疗组与未治疗组比较，治疗组无明显病理改变，未治疗组可见肺间质性充血水肿，有较多淋巴细胞，单核细胞浸润，致使肺泡间隔明显增宽，肺泡壁组织发生变性坏死，(见实施例4及图15)。综上所述，重组鼠β-防御素1多肽(mBD-1)具有临床应用前景，可在研制治疗或预防流行性感冒病毒所致疾病的新型药物中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、由于重组鼠β-防御素1多肽(mBD-1)抗流感病毒可直接抑制流感病毒包膜与宿主细胞膜的融合，使得流感病毒不能产生抗药性，因而比其它抗流感病毒药物具有更大的优越性，为流感的治疗提供了一类疗效好的新药品。

2、实验表明，重组鼠β-防御素1多肽能直接阻断流感病毒对呼吸系统细胞的吸附，具有直接的抗流感病毒活性；具有趋化中性粒细胞、树突状细胞到炎症部位，提高CD8⁺T细胞参与调节免疫反应的特性。

3、本发明所提供的重组鼠β-防御素1多肽的制备方法不仅易于获得纯度高的产品，而且相对于现有的合成方法可缩短制备时间，降低成本，有利于工业化生产。

附图说明

图1为本发明所述鼠β-防御素1的原核载体pET32a(+)的结构示意图。

图2为本发明所述鼠β-防御素1的原核重组质粒pET32a(+)/mBD1的结构示意图。

图3为本发明所述鼠β-防御素1的真核载体pcDNA3.1(+)的结构示意图。

图4为本发明所述鼠β-防御素1的真核重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1的结构示意图。

图5为本发明所述鼠β-防御素1的原核重组质粒pET32a(+)/mBD1的测序图。

图6为本发明所述鼠β-防御素1的真核重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1的测序图。

图7为本发明所述鼠β-防御素1的cDNA序列和多肽序列，图中，cDNA序列中的139-252为原核重组质粒所含序列，其对应的下划线部分为mBD-1成熟肽序列；cDNA序列中的43-252为真核重组质粒所含序列，其对应部分包括mBD-1的前信号肽和成熟肽序列。

图8为原核重组质粒pET32a(+)/mBD1的酶切鉴定图谱。琼脂糖凝胶电泳结果，在约150bp处出现一条条带，与预期产物大小相符，图中泳道2为阴性对照；泳道3为pET32a(+)质粒；泳道4为pET32a(+)/mBD1质粒Kpn I和Xho I双酶切产物；泳道1、5为DNA Marker DL2000，λ-ECOT14I Digestion Marker。

图9为真核重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1的酶切鉴定图谱。琼脂糖凝胶电泳结果，在约230bp处出现一条条带，与预期产物大小相符，图中泳道2为pcDNA3.1(+)真核载体；泳道3为pcDNA3.1(+)/mBD1质粒EcoR I和Xho I双酶切产物；泳道1，4为DNA MarkerDL2000，λ-ECOT14I Digestion Marker。

图10为纯化的融合蛋白TrxA-mBD1及用肠激酶酶切释放成熟肽mBD-1的SDS-PAGE电泳结果图，在21.2kDa处出现一条条带，与预期融合蛋白的分子量相符，表明融合蛋白诱导成功；在4.07kDa处有一条条带，与成熟肽mBD-1的分子量相符，表明肠激酶很好切开了融合蛋白并完全释放出成熟肽mBD-1；图中，泳道1为纯化的融合蛋白TrxA-mBD1，泳道3为超滤纯化的mBD-1，泳道4为肠激酶切TrxA-mBD1后混合物，泳道5为肠激酶切TrxA-mBD1穿柱液，泳道2、6为超低分子量蛋白Marker。

图11为Western-blot鉴定图，在21.2kDa处有融合蛋白的目的条带，在4.07kDa处有成熟mBD-1多肽的目的条带，表明成功获得了融合蛋白TrxA-mBD1和成熟mBD-1多肽；泳道1为融合蛋白TrxA-mBD1，泳道3为成熟mBD-1多肽，泳道2为超低分子量蛋白Marker。

图12为真核重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1在MDCK细胞中稳定表达的免疫荧光鉴定图，放大倍数×200，图中，A为转染pcDNA3.1(+)/mBD1质粒的MDCK光学片，B为转染pcDNA3.1(+)/mBD1质粒的MDCK荧光片，C为转染pcDNA3.1(+)真核载体的MDCK光学片，D为转染pcDNA3.1(+)真核载体的MDCK荧光片。

图13为细胞上清流感病毒滴度比较图，图中，A为MDCK细胞，B为MDCK/pcDNA，C为MDCK/mBD1。

图14为CD8⁺T％细胞的比较图，图中，A为PBS对照组(病毒攻击和未攻击)，B为真核载体pcDNA3.1(+)组(病毒攻击和未攻击)，C为真核重组质粒pCDNA3.1(+)/mBD1(病毒攻击和未攻击)。

图15为小鼠肺部病理切片(HE染色)图，图中，A为mBD-1高剂量组；B为病毒唑组；C为mBD-1变性蛋白组；D为PBS对照组。

图16为肺指数抑制率比较图，图中，A为mBD-1变性蛋白组，B为mBD-1低剂量组；C为mBD-1中剂量组，D为mBD-1高剂量组，E为病毒唑组。

图17为小鼠的生存率比较图，图中，A为病毒唑组，B为mBD-1高剂量组，C为mBD-1中剂量组，D为mBD-1低剂量组，E为mBD-1变性蛋白组，F为PBS对照组。

具体实施方式

实施例1：重组鼠β-防御素1多肽(mBD-1)的制备

1、获取小鼠mBD-1基因

(1)用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)按以下步骤提取小鼠肺总RNA

1)无菌条件下取小鼠肺组织100mg。

2)加1ml Trizol。

3)匀浆(要彻底，后转至EP管，组织匀浆量＞100mg时分装，1ml/每EP管)。

4)颠倒混匀10下，室温静置5min。

5)加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)。

6)颠倒混匀10下，室温静置5min。

7)4℃，离心12000g，15min。

8)转上层水相(约400μl)于另一1.5ml EP管中。

9)加等体积异丙醇(约400μl)，混匀室温静置10min。

10)4℃，离心12000g，10min。

11)弃上清。

12)加冰预冷的75％乙醇1ml，用二乙基焦磷酰胺(diethylpyrocarbonate，DEPC)水配。

13)4℃，离心7500g，5min。

14)弃上清，超净台内空气干燥5-10min(不能完全干燥)。

15)溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl，可在55-60℃水中，＜10min助溶)。

(2)单链cDNA的合成

1)在冰上预混下列溶液，充分混匀并高速离心3～5s后将反应物置PCR仪中，70℃孵育5min；

2)从PCR仪中取出反应物，置冰上冷却，离心3～5s；

3)再依次加入下列溶液，充分混匀并离心3～5s，将反应物置PCR仪中，37℃孵育5min；

4)于冰盒上给反应管内加反转录酶1μL，充分混匀并离心3～5s，将反应物置PCR仪42℃孵育60min、70℃孵育10min；

5)从PCR仪中取出反应物，置冰上冷却，离心3～5s，收集反应液待用。

(3)cDNA的PCR反应

1)反应体系如下：

2)PCR扩增引物：

上游引物：5’-gcg ggt acc gac gac gac gac aag GAT CAA TAC AAA TGC CTT C-3’(5’端设有Kpn I酶切位点，并在酶切位点后加上了编码肠激酶的序列及保护碱基

下游引物：5’-gcg ctc gag TCA GCT CTT ACA ACA GTT GGG CT-3’(5’端设有Xho I酶切位点加保护碱基，含终止密码子TGA)

3)PCR反应条件：

94℃预变性4min，94℃变性30s、58℃复性40s、72℃延伸40s，30个循环，72℃延伸10min。

(4)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析

2、原核载体的预处理

原核载体选用pET32a(+)(Novagen公司)

(1)用限制性内切酶Kpn I及Xho I双酶切原核载体pET32a(+)(见图1)，反应体积20μl(其中含有Kpn I酶1μl、Xho I酶1μl、10×M buffer₂ 2μl、pET32a(+)原核载体DNA 10μl、ddH₂O 6μl)，37℃过夜(限制性内切酶均购自TaKaRa公司)；

(2)反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下，按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收大片段。

3、mBD-1基因与pET32a(+)原核载体的连接及转化

(1)将上述步骤中所获得的载体片段及插入片段粗略定量后，按插入片段：载体分子摩尔比＝1～3∶1的连接反应原则进行连接实验；

(2)反应体系如下，整个反应过程在T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)作用下在PCR仪中16℃反应过夜。连接反应时应分别设立无插入片段和无载体的对照管。使上述扩增的mBD-1基因片段插入到pET32a(+)原核载体中，所构建的重组原核质粒pET32a(+)/mBD1见图2。

(3)将连接产物分别转化大肠杆菌JM109(Takara公司)的感受态细胞(按《分子克隆操作指南》自制)。连接产物的转化方法主要步骤如下：

1)取连接产物8μl加入感受态细胞50μl置于1.5ml Ep管中，阴性对照为感受态细胞50μl置于1.5ml Ep管中。

2)置于冰上30min。

3)42℃循环水浴90s。

4)快速将管转至冰浴中，冷却1-2min。

5)加0.3ml SOC培养基(10ml SOC+50μl 2mol/L MgCl₂)，置于冰上。

6)37℃，50rpm振摇1h。

7)取50μl转化细胞+5μl 0.1g/ml Amp，均匀涂布于含Amp的平板，置37℃孵箱培养过夜。

4、PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析

PCR扩增产物获得大小约150bp(理论值141bp)的目的条带；原核重组质粒(pET32a(+)/mBD1)酶切鉴定结果见图8，图8显示，在约150bp处出现一条条带，与预期产物大小相符；原核重组质粒测序(上海英俊公司)结果见图5，图5表明，所构建的原核表达质粒不仅含有完整的mBD-1序列，而且阅读框架也正确无误，目的序列测序结果提交GenBank进行核酸BLAST比对，结果显示所克隆的mBD-1基因与本实施例引物设计所用的mBD-1基因序列完全相同，没有碱基突变，原核重组质粒中所含碱基序列如SEQ ID NO.1所述。

5、重组原核mBD-1融合蛋白(TrxA-mBD1)的诱导表达及鉴定

将鉴定正确的原核重组质粒pET32a(+)/mBD1转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)，即重组菌为BL21(DE3)/pET32a/mBD1，异丙基β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导重组质粒的表达：采用优化条件2×YT(胰化蛋白胨16g/l，酵母提取物10g/l，NaCl 5g/l)培养基，培养温度为34℃，在菌体对数生长中期添加终浓度为的0.4mM IPTG，诱导后6h表达终止发酵。

SDS-PAGE、Western-blot鉴定pET32a-mBD1融合蛋白的表达情况。将变性后的蛋白质marker和重组mBD-1多肽在5％的浓缩胶和15％的分离胶中进行SDS-PAGE电泳。电泳完备后，进行Western-blot鉴定，将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素滤膜上，电转移后的膜用封闭液(约5％的PBST脱脂奶粉)室温摇床震摇封闭处理1h；再加入mBD-1多克隆抗体(兔抗-mBD1，Santa公司产品)应用液，4℃过夜；充分洗涤后再加入酶标二抗(羊抗兔IgG)，室温摇床震摇作用1h；充分洗涤后加底物显色。

Western-blot鉴定结果见图11，图11显示，pET32a-mBD1融合蛋白分子质量约21.2kD，表明成功获得了融合蛋白TrxA-mBD1。

6、融合蛋白TrxA-mBD1的纯化

原核载体pET-32a(+)N端带有6个连续组氨酸残基(6×His Tag)的识别位点，所表达的融合蛋白可以用金属螯合亲和层析方法纯化，并且洗脱后仍能保持其活性，所以采用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白。具体步骤如下：

(1)重组菌BL21(DE3)/pET32/mBD1菌体超声破碎(功率：300W；超声时间：5s；间隔时间：5s；工作次数：20次；冰浴：10min；重复4次)，离心收集可溶蛋白；

(2)融合蛋白的纯化：用His Trap FF Crude纯化柱(GE公司)和AKTApurifier蛋白纯化仪(BOX-900)，采用亲和层析从中分离目标融合蛋白。先将亲和柱用30mM咪唑平衡液平衡，至基线走平约3CV后，1ml/min进样可溶蛋白进行吸附，再用平衡液(30mM咪唑)洗柱子约3CV后，用洗脱液(300mM咪唑)进行洗脱，收集被洗脱的目标蛋白(TrxA-mBD1)。将收集的样品在5％的浓缩胶和15％的分离胶中进行SDS-PAGE分析，电泳结果见图10，图10显示，在21.2kDa处出现一条条带，与预期融合蛋白的分子量相符。

7、成熟mBD-1多肽的释放

以TrxA-mBD1为底物(100ug/ml)，加入6His纯化标签肠激酶(广东中大南海海洋生物公司)。酶切条件：25℃，20Mm Tris-HCL，100Mm NaCL，pH8.0，16h。以SDS-PAGE电泳酶切产物，酶切结果见图10，图10显示，在约4.0kDa处有一条条带，与成熟肽mBD-1的分子量(理论值：4.07KD)相符，表明肠激酶很好切开了TrxA-mBD1融合蛋白并完全释放出成熟的mBD-1多肽。成熟mBD-1多肽的序列见图7中的下划线部分。

实施例2：小鼠β-防御素1(mBD-1)真核重组质粒的构建

1、获取小鼠mBD-1基因

与实施例1的操作相同。与实施例1的不同点是PCR扩增引物及酶切位点。

上游引物：5’-GCG GAA TTC ATG AAA ACT CAT TAC TTT CTC CTG G-3’

(5’端设有EcoR I酶切位点及保护碱基)

下游引物：5’-GCG CTC GAG TCA GCT CTT ACA ACA GTT GGG CT-3’

(5’端设有Xho I酶切位点加保护碱基，含终止密码子TGA)

2、真核载体的预处理

真核载体选用pCDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司)

(1)用限制性内切酶EcoR I及Xho I双酶切真核载体pcDNA3.1(+)，反应体积20μl(其中含有EcoR I酶1μl、Xho I酶1μl、10×M buffer₂ 2μl、pcDNA3.1(+)真核载体10μl、ddH₂O 6μl)，37℃过夜；

(2)反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下，按胶回收试剂盒的说明书操作回收大片段。

3、mBD-1基因与pCDNA3.1(+)真核载体的连接及转化

(1)反应体系如下

(2)将连接产物分别转化大肠杆菌JM109的感受态细胞，步骤同原核重组质粒的转化。

4、PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析

PCR扩增产物获得大小约230bp的目的条带；重组质粒酶切鉴定结果见图9，图9显示，在约230bp处出现一条带，与预期产物大小相符(理论值228bp)；重组质粒测序(上海英俊公司)结果见图6。图6表明所构建的真核重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1不仅含有mBD-1序列，而且阅读框架也正确无误，目的序列测序结果提交GenBank进行核酸BLAST比对，结果显示所克隆的mBD-1基因与本实施例引物设计所用的mBD-1基因序列完全相同，没有碱基突变，真核重组质粒中所含碱基序列如SEQ ID NO.1所述。

5、真核重组质粒在MDCK(犬肾细胞)中的表达

(1)在转染前24h，将MDCK细胞(北京博大泰克公司)接种于六孔培养板中，每孔细胞约1×10⁶，置于37℃ 5％CO₂孵箱培养。

(2)待细胞长满至约80-90％融合后，分别以pcDNA3.1(+)真核载体、pcDNA3.1(+)/mBD1真核重组质粒转染犬肾细胞MDCK，具体操作按Wisegen公司GenEscort^TM I基因转染试剂盒中的说明书进行。

(3)对转染的细胞按每孔600μg/mL的G418进行稳定筛选，直到未转染质粒的MDCK细胞全部死亡。以浓度400μg/mL G418继续维持培养30d。将筛选出的阳性克隆转至细胞培养瓶中进行扩大培养，获得稳定表达pcDNA3.1(+)/mBD1、pcDNA3.1(+)细胞株，依次命名为MDCK/mBD1、MDCK/pcDNA，并对各组细胞进行冻存和免疫荧光法鉴定。鉴定结果见图12，鉴定结果显示：经免疫荧光染色后在倒置荧光显微镜下可观察到重组质粒转染组细胞有较强的红色荧光，而对照组均未见有红色荧光出现，证实稳定筛选得到的MDCK/mBD1细胞株含有mBD-1基因，并能正确表达。

实施例3：体外抗流感病毒实验

1、流感病毒TCID50的测定：

流感病毒选用A/PR/8/34株(H1N1)，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所国家流感中心提供。

(1)于感染病毒前，将培养瓶中的MDCK细胞用0.25％的胰酶消化，分至24孔板中，用含10％小牛血清及抗生素的生长液培养成单层细胞。

(2)将制备好的流感病毒悬液用无菌PBS作系列10倍稀释准备感染MDCK细胞。

(3)将24孔板中的生长液吸出，用无菌PBS冲洗两次，尽量除去牛血清，因牛血清中含有流感病毒的非特异性抑制素，会影响流感病毒的复制。

(4)滴加稀释病毒于细胞表面，轻轻晃动平板使加入的病毒溶液均匀地铺在细胞表面上。每个稀释度做四个复孔，每孔滴加病毒约50μL。

(5)将感染细胞置于5％CO₂培养箱中。37℃培养48h后，观察细胞病变。以引起细胞病变的最低稀释度计算出每个样本的病毒滴度，以TCID50表示(郭元吉，《流行性感冒病毒及其实验技术》)。TCID50的测定结果见表1。

表1TCID50的测定结果

TCID50＝高于50％死亡的病毒最高稀释度的对数+距离比例＝4+0.767＝4.767

2、稳定转染MDCK/mBD1细胞的抗流感病毒感染

(1)分别培养MDCK/mBD1(实施例2制备)、MDCK/pcDNA(实施例2制备)、MDCK，当细胞生长达70～80％瓶底面积时，弃培养液。

(2)每种细胞做四个复孔，每孔加入100μl 10 TCID50流感病毒。感染培养基(无血清DMEM，0.3％牛血清白蛋白，10mM Hepes，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，室温孵育1h。

(3)每孔加入含4μg/ml胰酶的感染培养基，37℃，5％CO₂培养48h。

(4)在倒置显微镜下观察各孔MDCK细胞感染情况。

(5)用高压灭菌的EP管分别收集各孔培养液，再分别进行血凝实验(操作见表2)，检测各孔细胞培养液中流感病毒滴度，病毒滴度的倒数值取1g见表3并以表3中的数据作图(见图13)。数据用ANOVA统计，计算P值，以α＝0.05为检验水准。

表2流感病毒的血凝试验

表3细胞上清病毒滴度倒数的1g(X)比较

F＝65.727 P＜0.001

用单因素方差统计学方法分析可知，MDCK/mBD1与MDCK/pcDNA及MDCK细胞比较有显著性差异，而MDCK/pcDNA与MDCK细胞之间比较无差异。表明MDCK/mBD1具有抗流感病毒的作用，见图13。

3、流式细胞仪测定CD8⁺T细胞

选取16～18g雌性BALB/c小鼠(SPF级，四川大学华西医学实验动物中心提供)，用真核重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1免疫：共接种2次，间隔2周，双侧股四头肌注射pcDNA3.1(+)/mBD1质粒，每侧50μL(1μg/μL)，共100μL，同时设真核载体pcDNA3.1(+)组及PBS对照组，每组10只。

(1)细胞的准备

采用密度梯度离心法提取小鼠的脾细胞：

①无菌取脾脏，至200目不锈钢网上边研磨边加2-3ml冷PBS冲洗；

②取2ml NycoPrep TM分离液(Oslo，Norway，Axis-Shield公司)，将2-3ml脾细胞悬液缓慢小心的加到NycoPrep TM 1.077A分离液上；

③室温2000rpm，离心20min；

④小心吸取中间白膜层，冷PBS1800rpm离心，洗1-2遍；

⑤将细胞悬起，用RPMI1640将容积恢复至1mL。计数细胞，调整细胞浓度5×10⁶/mL。

(2)流式细胞仪测定对免疫细胞的影响

按BD Pharmingen公司的CD8⁺T间接标记染色方案操作，流式细胞仪(BD FACSAria)检测并记录结果，检测结果见表4、表5：

表4各组CD8⁺T％均数和标准差

表5 CD8⁺T％3×2析因设计方差分析表

3×2析因设计方差分析表明；重组质粒pCDNA3.1(+)/mBD1组与空质粒pCDNA3.1(+)组、PBS组比较CD8⁺T％细胞数目，P＜0.01，有统计学意义，而空质粒pCDNA3.1(+)组与PBS组之间无统计学意义。表明pCDNA3.1(+)/mBD1免疫的动物有提高CD8⁺T细胞参与调节免疫反应的特性，见图14。

实验例4小鼠体内抗流感病毒实验

1、小鼠分组病毒攻击与mBD1多肽的治疗

(1)A/PR/8/34(H1N1)对BALB/c小鼠的半数致死量(LD₅₀)测定(金奇主编，《医学分子病毒学》)

取出流感病毒A/PR/8/34株(H1N1)培养液，用灭菌PBS将病毒从10^-1开始连续10倍稀释至10^-8，冰浴待用。选取16～18g雌性BALB/c小鼠，每组6只，每个稀释度为一组，共8组48只。用乙醚使小鼠全身麻醉后，每只小鼠滴鼻20μL相应的流感病毒稀释液。接种流感病毒后，观察并记录小鼠死亡情况。凡在实验的第一个24h内死亡的为非特异性死亡，不予统计。每天观察，直至感染后21d，计算死亡百分率和LD50，其结果见表6。

表6 LD50的测定结果

LD50＝高于50％死亡的病毒最高稀释度的对数+距离比例＝3+0.27＝3.27，即将所用的病毒悬液稀释成10^-3.27时，可使小鼠鼻腔内滴入50μL后有50％的死亡。

(2)攻击与治疗实验

BALB/c雌性小鼠，16～18g，70只，随机分为mBD-1多肽高剂量组(330μg/只)，中剂量组(165μg/只)，低剂量组(55μg/只)，病毒唑治疗组(1.5mg/只)，阴性对照组(变性的mBD-1(330μg/只)，处理方法为加入终浓度20％的β-巯基乙醇，摇动1h，超滤)，PBS空白对照组以及高剂量(330μg/只)不被流感病毒攻击组(用于检测重组mBD-1多肽是否有致敏反应)，每组10只。mBD-1多肽为实施例1制备的成熟多肽。

各组动物用20×LD50 A/PR/8/34(H1N1)病毒悬液通过滴鼻法攻击小鼠(50μl/只)。2h后腹腔注射高、中、低剂量mBD-1多肽，变性的mBD-1多肽及病毒唑，12h补加一次，共治疗7天。

2、治疗效果检测

(1)肺部病毒滴度检测

①肺的采集

于病毒攻击后第3d，将随机选取的4只动物眼球采血放血后，颈椎脱臼处死小鼠。将鼠浸入消毒液(3％来苏儿或1‰新洁尔灭)内消毒5～10min。取出用大头针固定在小块木板上，腹部朝上，用碘酒消毒胸、腹部皮肤。在无菌条件下，用无菌小镊子将腹部皮肤夹起，用消毒剪剪开皮肤至颈部，钝性剥离皮下组织与肌肉，把皮肤往两侧翻开暴露出胸部，用另一把消毒小剪刀往两侧肋骨各剪一刀，把肋骨和胸骨往上翻开，然后另一把无菌镊子从肺与气管连结处放入，把整个肺托出。

②肺组织的病理切片及悬液制备

将右侧肺中叶浸入4％多聚甲醛，保存在4℃准备制作病理切片。左侧肺叶在砂网上研磨，然后加入1ml灭菌的生理盐水，配成10％的悬液，用吸管吸入试管中，1500rpm，离心10mm，除去杂质和细胞碎片，收上清即为肺的悬液。用血凝素凝集实验检测肺悬液中流感病毒效价(作法同实施例3)。

③检测结果

肺部病毒滴度比较见下表7。

表7肺部病毒滴度倒数的1g(X)比较

F＝7.680 P＝0.001

用单因素方差统计学方法分析可知，mBD-1高剂量组与病毒唑组之间无显著性差异，而mBD-1高剂量组与PBS、mBD-1变性、mBD-1低剂量组之间比较有显著性差异；PBS、mBD-1变性和mBD-1低剂量组之间无明显的差异；mBD-1高剂量组与中剂量组无显著性差异。表明mBD-1高剂量和中剂量组有抗流感病毒的作用。

小鼠肺组织切片用HE染色显示，其图片见图15，图15表明：对照组小鼠肺组织镜下可见肺间质性充血水肿，有较多淋巴细胞，单核细胞浸润，致使肺泡间隔明显增宽，肺泡壁组织发生变性坏死，而实验组mBD-1高剂量组和病毒唑组小鼠无明显病理改变。

(2)对小鼠肺指数和肺抑制率影响的检测

①肺称重

将取出的各组肺组织放入无菌平皿中，用灭菌生理盐水把肺清洗2～3次，摘除气管、肺门淋巴结等组织，用灭菌的吸水纸吸干表面水分，称重。

②按以下公式算出各组的肺指数和肺指数抑制率：

肺指数和肺指数抑制率见表8。

表8 mBD-1多肽对小鼠肺指数和肺指数抑制率的影响

F＝4.441  P＝0.008

用单因素方差统计学方法分析肺指数的比较，mBD-1高剂量、病毒唑组与mBD-1低剂量、mBD-1变性多肽组和PBS组之间有显著性差异(p＜0.05)。mBD-1高剂量组获得了41.7％肺抑制率，略低于病毒唑(51.0％)，中剂量组和低剂量组分别为34.4％和21.8％(见图16)。表明mBD-1高剂量组具有较强的抗流感病毒作用，减弱了肺部受损伤的程度，mBD-1中剂量组和mBD-1低剂量组也有一定程度的抗流感病毒作用。

同时，实验表明，mBD-1高剂量病毒未攻击组未出现过敏反应，说明mBD-1高剂量没有毒性。

(4)小鼠生存率的比较

在流感病毒攻击后，mBD-1高剂量、中剂量和病毒唑组小鼠无明显流感症状，在第5天开始体重轻微下降，有轻微寒战和活动力下降，第11天左右均逐渐恢复正常。mBD-1低剂量组、mBD-1变性蛋白组和对照组小鼠在第5天开始出现体重明显下降，寒战，食欲下降。各实验组和对照组小鼠的存活情况见图17，从图17可以看出，在14天时，mBD-1高剂量组的小鼠生存率为66.7％，mBD-1中剂量组的小鼠生存率为50.0％，病毒唑组的小鼠生存率为83.3％，表明mBD-1高剂量组和中剂量组均具有较强的抗流感病毒作用。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>鼠β-防御素1的重组质粒、多肽及其用途与制备方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>444

<212>DNA

<213>小鼠

<400>1

tttcacatcc tctctgcact ctggaccctg gctgccacca ctatgaaaac tcattacttt  60

ctcctggtga tgatatgttt tcttttctcc cagatggagc caggtgttgg cattctcaca 120

agtcttggac gaagaacaga tcaatacaaa tgccttcaac atggaggatt ctgtctccgc 180

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tgtaagagct gacagtagtt tgaagaatga gcataaagga cgagcgatgg attgtaaaat 300

tagtgtttta ataaatgaaa tgtttttgaa gtttatttac atcatatcaa gataaatttt 360

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agaaaatcca gaacatctgc ctgg                                        444

Claims (10)

1、鼠β-防御素1的原核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO.1所述的鼠β-防御素1基因与原核载体构建而成。

2、根据权利要求1所述的鼠β-防御素1的原核重组质粒，其特征在于原核载体为pGEX-4T-1、pGEX-4T、pET32a(+)中的一种。

3、鼠β-防御素1的原核重组质粒所表达的重组鼠β-防御素1多肽在制备治疗或预防流行性感冒病毒所致疾病的药物中的应用。

4、鼠β-防御素1的真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO.1所述的鼠β-防御素1基因与真核载体构建而成。

5、根据权利要求4所述的鼠β-防御素1的真核重组质粒，其特征在于真核载体为pIRES2-EGFP、pcDNA3.1/mys-HisA、pcDNA3.1(+)中的一种。

6、鼠β-防御素1的真核重组质粒在制备治疗或预防流行性感冒病毒所致疾病的药物中的应用。

7、一种重组鼠β-防御素1多肽的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)通过RT-PCR反应，获得鼠β-防御素1基因；

(2)将上述扩增的鼠β-防御素1基因片段插入到原核载体构建原核重组质粒，再将重组质粒转染至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

(3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析；

(4)将正确克隆原核重组质粒转染入工程菌中进行表达，分离纯化表达的多肽即获得重组鼠β-防御素1多肽；

(5)采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组鼠β-防御素1多肽的正确性；

(6)采用肠激酶酶切释放出成熟有活性的重组鼠β-防御素1多肽。

8、根据权利要求7所述的重组鼠β-防御素1多肽的制备方法，其特征在于原核载体为pGEX-4T-1、pGEX-4T、pET32a(+)中的一种。

9、一种鼠β-防御素1真核重组质粒的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)通过RT-PCR反应，获得鼠β-防御素1基因；

(2)将上述扩增的鼠β-防御素1基因片段插入到真核载体构建真核重组质粒，再将重组质粒转染至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

(3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析。

10、根据权利要求9所述的鼠β-防御素1真核重组质粒的制备方法，其特征在于真核载体为pIRES2-EGFP、pcDNA3.1/mys-HisA、pcDNA3.1(+)中的一种。

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