CN109266623A

CN109266623A - 一株疫苗株rSHA-△200及其构建方法和应用

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Publication number: CN109266623A
Application number: CN201811168804.7A
Authority: CN
Inventors: 彭大新; 石宝兰; 陈素娟; 张伟; 秦涛; 王泽源; 乔依漪; 苏湘; 李卓恬; 沈海峰; 刘雷
Original assignee: Vacbio Co Ltd; Yangzhou University
Current assignee: Vacbio Co Ltd; Yangzhou University
Priority date: 2018-10-08
Filing date: 2018-10-08
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-10-08
Also published as: CN109266623B

Abstract

本发明提供一株疫苗株rSHA‑△200及其构建方法和应用，涉及流感疫苗领域。所述疫苗株rSHA‑△200包括不含有NRT糖基化位点的HA基因。本发明通过分析，找出其HA蛋白上潜在的糖基化位点，并通过定点突变技术缺失糖基化位点，构建多个糖基化位点缺失的HA表达质粒，利用8质粒反向遗传技术获得重组疫苗株，并制备抗血清，通过对比发现：本发明得到的rSHA‑△200具有良好的交叉免疫能力和血清交叉中和能力，是一种理想的H9亚型AIV灭活疫苗候选株。

Description

一株疫苗株rSHA-△200及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及流感疫苗技术领域，尤其涉及一株疫苗株rSHA-△200及其构建方法和应用。

背景技术

H9亚型AIV引起的通常为低致病性禽流感，引发的禽类死亡率较低，但由于其分布范围广和传播速度快，感染后会使蛋鸡产蛋量急剧下降，肉鸡生长缓慢，降低料肉比，对家禽养殖业造成了巨大的经济损失。H9亚型AIV感染后容易导致禽类自身免疫力的急剧下降，从而出现其他细菌或病毒的并发或继发感染导致死亡率的升高。H9亚型AIV还会作为其他亚型流感病毒内部基因的供体，为新型流感病毒株的产生提供条件，引发新流感疫情的爆发，对公共卫生安全造成潜在威胁，如H9N2亚型AIV为2013年以来在我国流行的新型H7N9病毒提供了6个内部基因片段。

H9亚型AIV在环境和疫苗的选择压力下不断发生变异，HA蛋白上糖基化位点的改变是抗原性改变的一种模式。研究表明，HA上的糖基化位点能够通过调节HA的生物活性来影响流感病毒的毒力，并使病毒躲避抗体的识别。糖基化位点所处位置不同会产生不同的影响，裂解位点附近的糖基化，会干扰宿主细胞蛋白酶的裂解能力使病毒的致病性降低；位于抗原表位附近的糖基化，则可能遮蔽抗原位点，干扰抗体识别病毒，导致免疫逃逸；受体结合位点附近的糖基化，则会改变受体结合特性；HA茎部的糖基化位点，可能影响HA蛋白的融合活性。

Wang C等在对H5N1亚型AIV的研究中发现，具有不同长度糖链结构HA蛋白的病毒，免疫结果显示，病毒HA蛋白截短糖链结构后比HA蛋白具有完整糖链结构的病毒产生了中和性和交叉反应性更好的抗体。Wang W发现两株H5N1亚型弱毒活疫苗HA蛋白158位的糖基化位点影响了疫苗的免疫效果，导致机体产生的免疫应答水平较低。

疫苗免疫是预防H9亚型禽流感发生与传播的有效手段之一。早期主要采用Ck/SD/6/9和Ck/SH/F/98等毒株制备的灭活疫苗对鸡群进行免疫以防控H9N2亚型禽流感。由于H9毒株抗原变异速度快，流行株常表现出与疫苗株不同的抗原特性，因此需要不断升级疫苗株以应对H9N2亚型禽流感的抗原变异。尽管如此，H9亚型的禽流感疫苗免疫失败在免疫鸡群中时有发生，甚至在免疫鸡群中爆发疫情。针对禽流感病毒的不断变异，目前需要一种对H9亚型AIV病毒免疫性强并且交叉免疫性好的疫苗株。

发明内容

本发明为了解决现有H9亚型AIV病毒不断变异的问题，提供了一种免疫性强且交叉免疫性好的H9亚型AIV的疫苗株rSHA-△200。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株疫苗株rSHA-△200，包括不含有NRT糖基化位点的HA基因。

优选的，所述不含有NRT糖基化位点的HA基因是以NRA替换NRT编码基因。

优选的，所述疫苗株rSHA-△200还包括来源于供体病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段。

优选的，所述供体病毒为H1N1亚型流感病毒。

优选的，所述供体病毒为A/Puerto Rico/8/34病毒株。

本发明还提供了上述技术方案所述疫苗株rSHA-△200的构建方法，包括以下步骤：

(1)以流感病毒的HA片段通用引物对H9N2亚型AIV病毒进行扩增，得到HA基因片段；

(2)以pHW2000为载体，将HA基因片段插入pHW2000载体的多克隆位点，得到表达质粒pHW-HA；

(3)以点突变引物对pHW-HA表达质粒进行点突变，得到NRT糖基化位点缺失的表达质粒pHW-HA-△200；

所述点突变引物包括上游引物200-F和下游引物200-R，所述上游引物200-F具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述下游引物200-R具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列：

(4)采用8质粒拯救系统将表达质粒pHW-HA-△200与含有来源于供体病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M或NS基因片段的7个质粒进行重组，得到疫苗株rSHA-△200。

优选的，所述步骤(1)中，流感病毒的HA片段通用引物中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

优选的，所述步骤(1)中的H9N2亚型AIV病毒通过对多个H9N2亚型AIV病毒进行血凝试验，选取血凝效价最高的H9N2亚型AIV病毒得到。

优选的，所述步骤(4)中，供体病毒包括H1N1流感病毒和/或H9N2禽流感病毒。

本发明前述技术方案所述疫苗株rSHA-△200或上述技术方案所述的制备方法制备得到的疫苗株rSHA-△200在制备广谱H9亚型AIV疫苗中的应用。

本发明取得的有益效果：

本发明提供一株疫苗株rSHA-△200，包括不含有NRT糖基化位点的HA基因。本发明通过血凝试验和生物学试验综合筛选出H9N2亚型目前的流行株毒株A/Chicken/Fujian/Shengnong/2014(H9N2，简称SN)作为研究对象，通过分析，找出其HA蛋白上潜在的糖基化位点，并通过定点突变技术缺失糖基化位点，构建多个糖基化位点缺失的HA表达质粒，利用8质粒反向遗传技术分别将缺失不同糖基化位点的HA质粒与A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的其余7个片段重组，拯救疫苗候选株病毒，并制备抗血清，通过对比发现，本发明得到的rSHA-△200对CZ02(A/chicken/Jiangsu/CZ02/2012)、WJ100(A/chicken/Jiangsu/WJ100/2014)、TX(A/chicken/TaiXing/10/2010)以及YZ4(A/chicken/Jiangsu/YZ4/2012)等病毒的血凝抑制价均高于其他缺失糖基化位点的重组病毒和野生型rSN免疫血清；中和试验也表明，rSHA-△200免疫血清对Y280-Like病毒SN以及F98-Like病毒YZ4的中和效价均高于其他缺失糖基化位点的重组病毒以及野生型rSN病毒，差异极显著。因而确定含有HA基因中的NRT糖基化位点缺失的病毒rSHA-△200具有良好的交叉免疫能力和血清交叉中和能力，是一种理想的H9亚型AIV灭活疫苗候选株。

附图说明

图1为实施例1中的HA基因PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一株疫苗株rSHA-△200，包括不含有NRT糖基化位点的HA基因。本发明研究表明，带有NRT糖基化位点的rSN野生型病毒与本发明所述疫苗株rSHA-△200相比，HA基因上不带有NRT糖基化位点的疫苗株rSHA-△200交叉免疫性和血清中和能力有显著差异。

本发明所述疫苗株rSHA-△200通过以下方法筛选得到：

S1、通过PCR扩增获得H9N2亚型AIV病毒的HA基因序列，分析得到的HA基因序列上潜在的糖基化位点；

S2、根据S1对潜在糖基化位点的分析结果，分别构建缺失某一潜在糖基化位点的HA基因表达质粒；以S1扩增得到的HA基因序列构建对照表达质粒；

S3、利用8质粒拯救系统分别将S2得到的缺失某一潜在糖基化位点的HA基因表达质粒构建为重组病毒；利用8质粒拯救系统将对照表达质粒构建为重组对照病毒；

S4、将S3得到的各重组病毒与重组对照病毒分别进行血清交叉反应和血清中和反应检测，若某一重组病毒的血清交叉反应和血清中和反应结果均显著高于重组对照病毒，即得H9亚型AIV的疫苗候选病毒。

本发明利用上述方法，通过血凝试验和生物学试验综合筛选出H9N2亚型目前的流行株毒株A/Chicken/Fujian/Shengnong/2014(H9N2，简称SN)找出其HA蛋白上潜在的糖基化位点，并通过定点突变技术缺失糖基化位点，构建多个糖基化位点缺失的HA表达质粒，利用8质粒反向遗传技术，分别将缺失不同糖基化位点的HA质粒与A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的其余7个片段重组，拯救疫苗候选株病毒，并制备抗血清，所得血清交叉中和能力好的毒株即为rSHA-△200。

在本发明中，所述NRT糖基化位点是指能够禽流感病毒HA基因上，能够编码“N-R-T”氨基酸片段的核苷酸序列；所述N-R-T即指“天冬氨酸-精氨酸-苏氨酸”。

在本发明中，所述不含有NRT糖基化位点的HA基因优选的通过点突变得到；更优选的通过点突变将HA基因上的NRT糖基化位点突变为NRA(天冬氨酸-精氨酸-丙氨酸)。本发明优选的采用点突变试剂盒对NRT糖基化位点进行点突变。本发明优选的，所述点突变时采用的点突变引物中，上游引物200-F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，下游引物200-R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示：

上游引物200-F：5’-GAAATAAATAGGGCCTTCAAACCGTTGATAGGACCAAGACCT-3’；

下游引物200-R：5’-CGGTTTGAAGGCCCTATTTATTTCTTCTGTTGCAACACTTGT-3’；

在本发明中，所述疫苗株rSHA-△200除HA基因外，还包括来源于一种或多种供体病毒的其他7个基因片段。A型流感病毒的基因组为负链RNA，分为8个片段，包括PB2(聚合酶B2)、PB1(聚合酶B1)、PA(聚合酶A)、HA(血凝素)、NP(核蛋白)、NA(神经氨酸酶)、M(基质蛋白)和NS(非结构蛋白)。本发明优选的，所述疫苗株rSHA-△200包括不含有NRT糖基化位点的HA基因和来源于供体病毒的PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、NA基因、M基因和NS基因。在本发明中，所述PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、NA基因、M基因和NS基因可以来源于一个或多个供体病毒。在本发明中，所述供体基因优选为H1N1亚型流感病毒，更优选为A/Puerto Rico/8/34病毒株(PR8病毒)。

本发明提供的具体实施例表明，疫苗株rSHA-△200的免疫血清对SN(A/chicken/Fujian/SN/2014)、CZ02(A/chicken/Jiangsu/CZ02/2012)、WJ100(A/chicken/Jiangsu/WJ100/2014)、XZ01(A/chicken/Jiangsu/XZ01/2014)、TX(A/chicken/TaiXing/10/2010)、以及YZ4(A/chicken/Jiangsu/YZ4/2012)等多种H9N2亚型AIV病毒具有交叉血凝抑制性，并且交叉免疫性显著优于rSN野生型毒株以及含有缺失其他糖基化位点的HA基因的病毒株；疫苗株rSHA-△200的免疫血清对Y280-Like病毒SN、F98-Like病毒YZ4的中和效价均高于其他菌株，并且差异极为显著，表明本发明提供的疫苗株rSHA-△200具有优异的免疫性能。

所述点突变引物：

上游引物200-F：5’-GAAATAAATAGGGCCTTCAAACCGTTGATAGGACCAAGACCT-3’(SEQ IDNo.20)；

下游引物200-R：5’-CGGTTTGAAGGCCCTATTTATTTCTTCTGTTGCAACACTTGT-3’(SEQ IDNo.21)；

(4)采用8质粒拯救系统将表达质粒pHW-HA-△200与来源于供体病毒PB2、PB1、PA、NP、NA、M或NS基因片段的7个质粒进行重组，得到疫苗株rSHA-△200。

本发明以流感病毒的HA片段通用引物对H9N2亚型AIV病毒进行扩增，得到HA基因片段。本发明扩增得到的HA基因片段约为1700bp左右。

本发明参照Hoffmann对流感病毒的8个片段设计的通用引物(Hoffmann E,StechJ,Guan Y,Webster RG,Perez DR.Universal primer set for the full-lengthamplification of all influenza A viruses[J].Archives of virology.2001；146(12):2275-89.)，所述流感病毒的HA片段通用引物的序列如下所示，其中的划线部分为限制性内切酶BsmB I的酶切位点：

Bm-HA-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’(SEQ ID No.1)；

Bm-HA-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’(SEQ ID No.2)。

在本发明中，所述H9N2亚型AIV病毒优选为H9N2禽流感病毒分离株SN。本发明优选的通过对多个H9N2亚型AIV病毒进行血凝试验，选取血凝效价最高的H9N2亚型AIV作为HA基因的供体，灭活后，抗原浓度高，可以降低生产成本。

具体的，本发明以所述流感病毒的HA片段通用引物进行PCR扩增时的体系如下：

10×PCR buffer 12.5μL

dNTP(10Mm) 0.5μL

上游引物Bm-HA-F(25μmol/μL) 0.5μL

下游引物Bm-HA-R(25μmol/μL) 0.5μL

高保真酶 0.5μL

DNA模板 2μL

ddH2O 8.5μL。

本发明以所述流感病毒的HA片段通用引物扩增HA片段的PCR扩增程序优选为：95℃预变性15s，以95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸1.5min为循环，进行35个循环，72℃延伸10min。

本发明将PCR扩增的产物进行纯化回收，得到HA基因片段。

得到HA基因片段后，本发明以pHW2000为载体，将HA基因片段插入pHW2000载体的多克隆位点，得到表达质粒pHW-HA。本发明对所述构建质粒表达载体的方式无特殊限定，采用本领域常规技术手段即可。

得到表达质粒pHW-HA后，本发明以点突变引物对pHW-HA表达质粒进行点突变，得到NRT糖基化位点缺失的表达质粒pHW-HA-△200；所述点突变引物：

200-F：5’-GAAATAAATAGGGCCTTCAAACCGTTGATAGGACCAAGACCT-3’(SEQ ID No.20)；

200-R：5’-CGGTTTGAAGGCCCTATTTATTTCTTCTGTTGCAACACTTGT-3’(SEQ ID No.21)。

本发明通过点突变的方式将HA基因中的糖基化位点“NRT”中编码“T(苏氨酸)”替换为编码“A(丙氨酸)”的碱基，从而得到不含有NRT糖基化位点的HA基因。除了将“NRT”替换为“NRA”外，本发明还可以将“NRT”糖基化位点替换为任何不能够编码“NRT”和“NRS”氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还可以利用其他方式使HA基因上的“NRT”糖基化位点缺失，也能够得到不含有NRT糖基化位点的HA基因。本发明研究表明，缺失了HA基因上NRT糖基化位点后流感病毒的交叉反应性以及血清中和能力均有显著提高。本发明对所述点突变的方式没有特殊限定，采用本领域已知手段即可，比如利用点突变试剂盒进行。

得到表达质粒pHW-HA-△200后，本发明采用8质粒拯救系统将表达质粒pHW-HA-△200与供体病毒除HA基因外的其他基因的质粒重组，得到疫苗株rSHA-△200。

本发明利用所述8质粒拯救系统的反向遗传技术构建H9亚型的疫苗株，利用8质粒拯救系统技术将不含有NRT糖基化位点的HA基因重组到病毒中，从而获得交叉免疫性好且免疫活性强的H9亚型AIV疫苗株。

在本发明中，8质粒拯救系统进行病毒重组的方法优选的包括以下步骤：

A1、将293T和MDCK细胞混合培养至细胞汇合度70～80％，得到混合宿主细胞；

A2、将表达质粒pHW-HA-△200与含有来源于供体病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段的7个质粒分别与含有PolyJet^TM转染试剂的无抗无血DMED培养基混合，孵育，将8个质粒转染所得混合液进行混合，得到PolyJet^TM-质粒复合物；

A3、将PolyJet^TM-质粒复合物与A1所述混合宿主细胞混合，培养8～12h后加入TPCK胰酶，继续培养至72h，反复冻融，取上清液，即得细胞上清；

A4、将细胞上清接种到10日龄的鸡胚中，培养72h后对鸡胚的尿囊液进行血凝试验检测，取有HA效价的尿囊液，分离纯化，得到疫苗株rSHA-△200。

在本发明中，所述A1中293T和MDCK细胞的个数比优选为2～4:1，更优选为3:1。在本发明中，培养所述293T和MDCK混合细胞的培养基优选为含有10％(质量分数)胎牛血清的DMEM培养基。对293T和MDCK细胞进行先期培养的目的是为了复苏和扩大细胞数量。

在本发明中，所述来源于供体病毒的非HA基因的7个基因片段质粒包括PB2基因片段质粒、PB1基因片段质粒、PA基因片段质粒、NP基因片段质粒、NA基因片段质粒、M基因片段质粒和NS基因片段质粒。非HA基因的7个基因片段的质粒载体优选为pHW2000，本发明所述供体病毒包括但不限于H1N1流感病毒和/或H9N2禽流感病毒。在本发明中，所述供体病毒提供的7个基因片段主要用于构建重组病毒，获得完整流感病毒疫苗。本发明优选的，所述H1N1流感病毒优选为PR8(A/Puerto Rico/8/34)，PR8是一株鸡胚适应病毒株,目前也是鸡胚高产毒株之一，流感疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的表面基因HA和NA基因重组(6+2模式)。本发明优选使用PR8作为供体病毒的目的是提高获得广谱性的疫苗候选株的效价。

在本发明中，所述pHW-HA-△200、PB2基因片段质粒、PB1基因片段质粒、PA基因片段质粒、NP基因片段质粒、NA基因片段质粒、M基因片段质粒和NS基因片段质粒的数量比例优选为1:1:1:1:1:1:1:1。

在本发明中，所述含有PolyJet^TM转染试剂的无抗无血DMED培养基是由PolyJet^TM转染试剂与无抗无血DMED培养基按照体积比50:1～5。

在本发明中，所述步骤A3中的培养条件：培养温度优选为37℃；所述培养优选的在CO₂细胞培养箱中进行，所述CO₂浓度优选为5％。

在本发明中，所述步骤A3中，所述反复冻融的冷冻温度优选为-75～-65℃，更优选为-70℃；融解温度优选为35℃；所述冻融次数优选为3次。

在本发明中，所述TPCK胰酶的添加终浓度为2μg/mL。

在本发明中，所述步骤A4中，所述细胞上清按照0.15～0.5ml/胚的接种量接种。

本发明还提供了一种前述技术方案所述疫苗株rSHA-△200在制备广谱H9亚型AIV疫苗中的应用。具体的，所述广谱H9亚型AIV疫苗包括但不限于灭活疫苗、减毒疫苗或亚单位疫苗。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.血凝试验筛选候选疫苗毒株

选取不同亚系不同年份的H9N2禽流感病毒分离株A/chicken/Jiangsu/CZ02/2012(H9N2，简称CZ02)、A/chicken/Fujian/SN/2014(H9N2，简称SN)、A/chicken/Shandong/QD5/2012(H9N2，简称QD5)、A/chicken/Anhui/FY040/2014(H9N2，简称FY040)、A/chicken/Jiangsu/WJ100/2015(H9N2，简称WJ100)和A/chicken/Jiangsu/YZ4/2012(H9N2，简称YZ4)作为候选株。对候选毒株进行血凝试验，测定各候选H9N2亚型AIV的HA效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其HA基因表达质粒。

结果显示见表1，SN株的HA效价为9 log2，大于其他5株候选病毒。根据血凝试验结果选择SN株构建HA基因表达质粒。

表1 H9N2亚型AIV毒株血凝效价

2.HA片段表达质粒的构建

2.1引物设计

参照Hoffmann(Hoffmann E,Stech J,Guan Y,Webster RG,Perez DR.Universalprimer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J].Archives of virology.2001；146(12):2275-89.)对流感病毒的8个片段设计的通用引物，设计HA片段全长扩增引物(见表2)，带下划线处为相应限制性酶的识别位点。

表2 HA全长扩增引物

^aBm是限制性内切酶BsmBⅠ的缩写；^c下划线处是添加的限制性内切酶位点

2.2病毒RNA的提取及cDNA反转录

根据Trizol Reagent试剂说明提取病毒RNA。将病毒尿囊液8000rpm离心10min取250μL加入RNase-free的离心管中。加入500μL Trizol Reagent，充分混匀后，放置5min。加入200μL三氯甲烷，剧烈混匀后，13000rpm离心10min。将上步中离心上清液450μL加入新的离心管中，再加入900μL异丙醇，混匀后放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min。弃上清，加入1mL 75％DEPC水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min，弃上清。

根据HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行病毒cDNA的反转录。反转录好的cDNA，于-20℃保存备用。

2.3目的片段的扩增及纯化

使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以病毒cDNA为模板，扩增HA及NA基因片段。25μL PCR体系如下

10×PCR buffer 12.5μL

dNTP(10Mm) 0.5μL

上游引物(25μmol/μL) 0.5μL

下游引物(25μmol/μL) 0.5μL

高保真酶 0.5μL

DNA模板 2μL

ddH₂O 8.5μL

反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR产物通过1％琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸Marker GeneRuler 1kb DNA Ladder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了SN株HA基因片段(片段大小约为1700bp)，命名为SN-HA(如图1)。

产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度。

2.5目的片段与T载体的连接

参照pEASY-Blunt3 Cloning Kit和Trans1-T1感受态细胞使用说明，将其克隆至T载体，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，挑斑小提质粒，经EcoRI酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用。

2.6 HA片段及真核表达载体的酶切与连接

将鉴定为阳性克隆的HA质粒测定浓度后，分别用BsmB I、Bsa I限制性内切酶进行酶切，将pHW2000载体用BsmB I酶切。酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用T4连接酶将酶切后的pHW2000载体和目的产物连接。连接产物转化感受态细胞Trans-T 1，于37℃培养箱培养12-14h。挑取单个菌落于15mL氨苄LB液体培养基中培养过夜，菌落PCR鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用QIAGEN试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μL以上，OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒保存备用。

3.SN株HA基因糖基化位点分析

使用在线生物信息学工具NetNGlyc1.0 server，以N-X-S/T(“X”为非P氨基酸)氨基酸序列，对SN株病毒的HA基因序列进行分析，对其HA上潜在糖基化位点进行预测，见表3。

所述非P是指：氨基酸“P”为脯氨酸，缩写为Pro(P)，即非脯氨酸。

表3 HA蛋白潜在糖基化位点分析

*去除信号肽后的H9序号

4.点突变扩增引物设计

以将N-X-S/T序列中氨基酸S/T替换为A的方式进行突变，针对每个潜在糖基化位点分别设计定点突变引物，见表4。

表4点突变扩增引物

5.点突变表达质粒的构建及鉴定

使用定点突变试剂盒Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2以pHW-SN-HA表达质粒为模板，分别用设计的点突变引物进行PCR扩增。扩增体系为：

10×PCR buffer 12.5μL

dNTP(10mM) 0.5μL

上游引物(25μmol/μL) 0.5μL

下游引物(25μmol/μL) 0.5μL

高保真酶 0.5μL

质粒≤0.5μL

ddH₂O 补足25μL

反应后取上述PCR扩增产物5μL进行电泳检测，确保目标质粒正确。分别取上述PCR扩增产物20μL与0.5μL Dpn I混合，37℃水浴1h，即得消化后产物。

将所述消化后产物进行重组反应。在冰水浴中按照如下体系进行重组：

5×CE II buffer 4μL

Exnase II2μL

Dpn I消化产物50-400ng

ddH₂O补足20μL

轻轻混匀后，37℃水浴30min。

反应结束后，将产物转化感受态细胞Trans1-T1，涂板，待长出菌落后挑菌进行鉴定。

6.糖基化位点缺失病毒的拯救

分别将构建好的SN株HA片段糖基化位点缺失表达质粒SN-HA-△11、SN-HA-△123、SN-HA-△127、SN-HA-△200、SN-HA-△280、SN-HA-△287、SN-HA-△295、SN-HA-△474和SN-HA-△533与PR8(A/Puerto Rico/8/34)其他7片段质粒共转染293T和MDCK混合细胞。

细胞用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基提前复苏并扩大培养，在转染前一天，将293T细胞及MDCK细胞以3:1的比例混匀铺于35mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70％-80％时，可以进行转染，转染之前1h将细胞培养液换成1mL的无抗无血DMEM培养基。转染用每片段质粒量应为300ng，转染质粒总用量为2.4μg。取9只无菌1.5mL指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM，再将质粒按照重组方案分别加入9个离心管中，用微量移液器轻轻吹匀。另取9只无菌指形管，分别加入50μL无抗无血DMEM和3μL PolyJet^TM转染试剂，轻轻混匀。混匀后立即分别加入上述质粒溶液中，轻轻吹吸混匀，室温孵育10-15min以形成PolyJet^TM–DNA复合物，孵育结束后将混合液逐滴加入培养皿中，边加边轻微晃动以混匀。然后移入CO2细胞培养箱中静置培养。转染8-12h后，加入终浓度为2μg/mL的TPCK胰酶。转染后72h将培养皿置于-70℃反复冻融三次，收取细胞上清，接种10日龄的SPF鸡胚，0.2mL/胚，检测重组病毒拯救是否成功。每12h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚。培养72h后收取鸡胚的尿囊液，并用血凝试验测定HA效价，收取有HA效价的澄清尿囊液。最终成功拯救出7株糖基化位点缺失病毒，分别命名为rSNHA-△11、rSNHA-△200、rSNHA-△280、rSNHA-△287、rSNHA-△295、rSNHA-△474和rSNHA-△533。同时构建野生型重组病毒作为对照，命名为rSN。

将收获的尿囊液提取RNA进行反转录并PCR，测序鉴定各序列是否正确。将血凝阳性且鉴定正确的病毒尿囊液用四抗PBS稀释10000倍，用10日龄SPF鸡胚传至第5代，测定各代次尿囊液的血凝效价，结果显示该重组转染病毒能在鸡胚中稳定传代。将第5代病毒尿囊液提取RNA并反转录进行序列测定，结果显示并未发生突变，序列完全正确，可进行后续试验。

7.候选株病毒血清交叉反应性

7.1病毒灭活及血清制备

取各糖基化位点缺失的重组病毒及野生重组病毒rSN，以8000r/min离心10min后取上清测定病毒灭活前HA效价，病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24h。取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价(血凝效价>4 log2时满足要求)。

在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗。用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄SPF鸡，0.2mL/只，每组注射5只SPF鸡。免疫后，测定血清HI效价≥7 log2时可采集鸡血，若未达到则在一免后21d加强免疫一次，二免后测定血清HI效价≥7 log2时采集鸡血，分离血清，冻存于-70℃冰箱中备用。

7.2交叉血凝抑制试验

测定各病毒尿囊液HA效价，将病毒HA价调至2 log2(4单位病毒)，在96孔血凝板中加入25μL PBS，每行第1孔加入各个重组病毒的抗血清，并将各血清倍比稀释后，再加入配好的4单位病毒，37℃条件下作用15min，作用后加入1％鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用10min后观察结果。

选取不同亚系不同年份的H9N2禽流感病毒分离株A/chicken/Jiangsu/CZ02/2012(H9N2，简称CZ02)、A/chicken/Jiangsu/WJ100/2015(H9N2，简称WJ100)、A/chicken/TX/10/2010(H9N2，简称TX)、A/chicken/Jiangsu/XZ01/2014(H9N2，简称XZ01)、和A/chicken/Jiangsu/YZ4/2012(H9N2，简称YZ4)进行交叉血凝抑制试验。其中CZ02、WJ100、TX和XZ01株属于Y280-Like，YZ4株为F98-Like。结果显示，疫苗候选株rSNHA-△200免疫血清对各病毒的血凝抑制价均高于其他6株糖基化位点缺失的重组病毒免疫血清以及野生型rSN免疫血清(见表5)。

表5不同H9N2病毒与候选株抗血清间的交叉血凝抑制性

7.3血清中和试验

选取SN及YZ4毒株，测定EID50。进行中和试验时，将病毒稀释成200个EID50，使其与稀释好的血清等量混合后，每个接种剂量中含有100个EID50。选取重组病毒及rSN抗血清，先将血清灭活处理(56℃处理30min)，随后将血清用四抗PBS从1:10开始进行2倍连续稀释。将定量好的两种病毒分别与等体积稀释好的各组血清混合均匀，并在37℃作用1h，作用后迅速将混合物接种10日龄SPF鸡胚，每个混合物接种4个鸡胚。同时，将稀释为100个EID50的病毒接种SPF鸡胚，作为阳性对照。接种后每日观察，4天后检测鸡胚感染情况，根据Reed-Muench法计算血清中和效价。

中和试验结果显示，候选株rSNHA-△200免疫血清对Y280-Like病毒SN及F98-Like病毒YZ4的中和效价均高于rSNHA-△11、rSNHA-△280、rSNHA-△295、rSNHA-△474、rSNHA-△533免疫血清及rSN组抗血清对SN和YZ4的中和效价，且差异极显著；候选株rSNHA-△287免疫血清对Y280-Like病毒SN及F98-Like病毒YZ4的中和效价均高于rSNHA-△11、rSNHA-△280、rSNHA-△295、rSNHA-△474、rSNHA-△533免疫血清及rSN组抗血清对SN和YZ4的中和效价，且差异显著，rSNHA-△200是一株理想的疫苗候选株。具体见表6。

表6候选株血清中和效价

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

国药集团扬州威克生物工程有限公司

<120> 一株疫苗株rSHA-△200及其构建方法和应用

<130> 11569C18FP00359

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tattcgtctc agggagcaaa agcagggg 28

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaacaaact ccgcagaaac tgtagacaca ctaacagaaa acaatg 46

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acagtttctg cggagtttgt tgattggtag ccgatgcaga t 41

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggaatgtg gcttacaatg gaacaagcaa agcatgttc 39

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<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttccattgt aagccacatt ccagattgtg tctgggaaaa t 41

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caatggagca agcaaagcat gttcagattc attctacaga ag 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaataaata gggccttcaa accgttgata ggaccaagac ct 42

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggtttgaag gccctattta tttcttctgt tgcaacactt gt 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggtggtttaa acacagcatt gccattccaa aatgtaagt 39

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ggcaatgctg tgtttaaacc acctttttct gtctgacat 39

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ccaaaatgta gctaagtatg catttggaaa ctgctcg 37

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gcatacttag ctacattttg gaatggcaat gttgtgttt 39

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggaaactgcg cgaaatatgt tggaataaag agtctcaaac 40

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<212> DNA

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ccaacatatt tcgcgcagtt tccaaatgca tacttactt 39

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gaacggggcc tacaacagga ggaagtatca agaggaat 38

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tcctgttgta ggccccgttc cgaattgtct ccatg 35

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gtccaatggg gcttgcagat gcaacatttg tatataatta gc 42

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<212> DNA

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atctgcaagc cccattggac atggcccaga acaaaaag 38

Claims

1.一株疫苗株rSHA-△200，其特征在于，包括不含有NRT糖基化位点的HA基因。

2.根据权利要求1所述疫苗株rSHA-△200，其特征在于，所述不含有NRT糖基化位点的HA基因是以NRA替换NRT编码基因。

3.根据权利要求1所述疫苗株rSHA-△200，其特征在于，所述疫苗株rSHA-△200还包括来源于供体病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS基因片段。

4.根据权利要求3所述疫苗株rSHA-△200，其特征在于，所述供体病毒为H1N1亚型流感病毒。

5.根据权利要求3或4所述疫苗株rSHA-△200，其特征在于，所述供体病毒为A/PuertoRico/8/34病毒株。

6.权利要求1～5任意一项所述疫苗株rSHA-△200的构建方法，包括以下步骤：

所述点突变引物包括上游引物200-F和下游引物200-R，所述上游引物200-F具有SEQID No.1所示的核苷酸序列，所述下游引物200-R具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列：

7.根据权利要求6所述疫苗株rSHA-△200的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，流感病毒的HA片段通用引物中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

8.根据权利要求6或7所述疫苗株rSHA-△200的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的H9N2亚型AIV病毒通过对多个H9N2亚型AIV病毒进行血凝试验，选取血凝效价最高的H9N2亚型AIV病毒得到。

9.根据权利要求6所述疫苗株rSHA-△200的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中，供体病毒包括H1N1流感病毒和/或H9N2禽流感病毒。

10.权利要求1～5任意一项所述疫苗株rSHA-△200或权利要求6～9任意一项所述的制备方法制备得到的疫苗株rSHA-△200在制备广谱H9亚型AIV疫苗中的应用。