CN103614345A - 一种流感病毒疫苗株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流感病毒疫苗株。本发明公开的一种病毒，其PB2蛋白、PB1蛋白、PA蛋白、NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白和HA蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.33、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32和SEQ ID No.16所示。本发明公开的重组病毒可以在MDCK细胞中快速、高产、稳定的增殖，与利用鸡胚制备疫苗的方法相比具有明显的优势，并且该重组病毒的灭活疫苗可以用于保护动物免受流感病毒的侵染。
Description
技术领域
本发明涉及一种流感病毒疫苗株。
背景技术
H9N2亚型禽流感病毒主要感染鸡、鸭、火鸡、鹌鹑、野鸭等多种禽类，可以引起低的死亡率和轻度的呼吸道感染或产蛋率下降等临床症候群。H9N2亚型禽流感病毒虽然为低致病性禽流感病毒，但可造成蛋鸡的产蛋量严重下降，肉鸡和青年鸡的复合型呼吸道疾病和死淘率升高，往往造成严重的经济损失。值得注意的是，H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽，而且无需经过中间宿主即可突破种间屏障感染哺乳动物和人。自1998年全球首次发现人感染H9N2亚型禽流感病例后，人感染H9N2亚型禽流感病毒的病例时有发生。目前H9N2亚型禽流感病毒已成为流行于我国鸡群中的主要流感病毒亚型，且广泛分布于世界各地。因此H9N2亚型禽流感病毒不仅给养禽业带来巨大的经济损失，对人类健康也构成了重大威胁。研制出高效、安全、工艺简单、价格低廉的禽流感疫苗势在必行。
传统的禽流感疫苗多用鸡胚毒制备而成，通过在鸡胚中连续的传代将疫苗毒弱化，因此疫苗株的生产周期长，且经常缺乏高质量鸡胚的供应，影响疫苗的免疫原性，当发生流感大流行的时候，鸡胚供应不足会直接影响疫苗的生产，无法及时有效的应对流感疫情。
MDCK细胞表面既具有α-2,3SA受体，又具有α-2,6SA受体，对多种不同类型流感病毒敏感，流感病毒在该细胞中复制能力较强，因此该细胞作为流感病毒培养的基质在世界各地广泛应用于公共卫生监测程序、临床病毒学及研究型实验室。
人H1N1流感病毒A/Puerto Rico/8/34（简称PR8）作为常规工具病毒在细胞、鸡胚、小鼠中都能有效的复制。因此，可以将其他病毒与PR8的基因片段进行重排，提高病毒的复制力。传统的基因工程疫苗就是利用病毒与PR8进行重排制备出的。
传统的基因工程重排疫苗的重排方式仅定向的将流行毒株的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸（neuraminic acid,NA）基因与人H1N1流感病毒A/Puerto Rico/8/34（简称PR8）的内部基因进行重排（2+6），没有比较具有其他基因重排方式的病毒的复制力。
发明内容
本发明的目的是提供一种流感病毒疫苗株。
本发明提供的一种病毒，该病毒的PB2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.26所示，PB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.34所示，PA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.33所示，NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.29所示，M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示，M2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.28所示，NS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.31所示，NS2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.32所示，HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
上述病毒中，所述PB2蛋白的编码基因如SEQ ID No.9所示，所述PB1蛋白的编码基因如SEQ ID No.15所示，所述NA蛋白的编码基因如SEQ ID No.11所示，所述PA蛋白的编码基因如SEQ ID No.14所示，所述HA蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示，所述NP蛋白的编码基因如SEQ ID No.6所示，所述M1蛋白的编码基因如SEQ IDNo.10中自5’末端起第1位至第759位核苷酸所示，所述M2蛋白的编码基因如SEQ IDNo.10中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸所示，所述NS1蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第693位核苷酸所示，所述NS2蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸所示。
一种疫苗也属于本发明的保护范围，该疫苗由上述任一所述的病毒经灭活制成。
一种制备上述任一所述的病毒的方法也属于本发明的保护范围，该方法是将SEQID No.26所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.34所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.33所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.21所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.29所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.27所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.28所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.31所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.32所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.16所示蛋白的编码基因导入293T细胞和MDCK细胞中，得到重组病毒。
上述方法中，所述293T细胞和MDCK细胞的数量比为5:1。
上述任一所述的方法中，所述SEQ ID No.26所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.9所示，所述SEQ ID No.34所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.15所示，所述SEQ ID No.29所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.11所示，所述SEQ ID No.33所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.14所示，所述SEQ ID No.16所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示，所述SEQ ID No.21所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.6所示，所述SEQ ID No.27所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第759位核苷酸所示，所述SEQ ID No.28所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸所示，所述SEQ ID No.31所示蛋白的编码基因如SEQID No.13中自5’末端起第1位至第693位核苷酸所示，所述SEQ ID No.32所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸所示。
一种病毒也属于本发明的保护范围，该病毒的PB2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.26所示，PB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，PA蛋白的氨基酸序列如SEQID No.33所示，NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示，M2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.28所示，NS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.31所示，NS2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.32所示，HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
上述病毒中，所述PB2蛋白的编码基因如SEQ ID No.9所示，所述PB1蛋白的编码基因如SEQ ID No.4所示，所述NA蛋白的编码基因如SEQ ID No.2所示，所述PA蛋白的编码基因如SEQ ID No.14所示，所述HA蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示，所述NP蛋白的编码基因如SEQ ID No.6所示，所述M1蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第759位核苷酸所示，所述M2蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸所示，所述NS1蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第693位核苷酸所示，所述NS2蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸所示。
一种疫苗也属于本发明的保护范围，该疫苗由上述任一所述的病毒经灭活制成。
一种制备上述任一所述的病毒的方法也属于本发明的保护范围，该方法是将SEQID No.26所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.19所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.33所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.21所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.17所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.27所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.28所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.31所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.32所示蛋白的编码基因，SEQ ID No.16所示蛋白的编码基因导入293T细胞和MDCK细胞中，得到重组病毒。
上述方法中，所述293T细胞和MDCK细胞的数量比为5:1。
上述任一所述的方法中，所述SEQ ID No.26所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.9所示，所述SEQ ID No.19所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.4所示，所述SEQ ID No.17所示蛋白的编码基因SEQ ID No.2所示，所述SEQ ID No.33所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.14所示，所述SEQ ID No.16所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示，所述SEQ ID No.21所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.6所示，所述SEQ ID No.27所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第759位核苷酸所示，所述SEQ ID No.28所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸所示，所述SEQ ID No.31所示蛋白的编码基因如SEQID No.13中自5’末端起第1位至第693位核苷酸所示，所述SEQ ID No.32所示蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸所示。
上述任一所述的疫苗在制备提高动物血清中血凝抑制抗体水平的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述血凝具体是由流感病毒血凝素蛋白凝集红细胞引起的。
上述任一所述的疫苗在制备预防和/或治疗流感病毒引起的动物疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述病毒为禽流感病毒；
所述禽流感病毒具体为H9N2亚型禽流感病毒。
上述任一所述的应用中，所述动物为禽或除禽以外的其他动物。
本发明具有以下优点：
（1）利用反向遗传操作技术共转染两株病毒的15个基因片段，只固定H9N2亚型禽流感病毒的HA基因，其他不同来源的基因片段可在293T细胞中进行随机组合，增加了基因片段的组合方式，使得疫苗株的选择范围更为广泛。
（2）本发明挑选出的疫苗候选株可以在MDCK细胞中快速、高产、稳定的增殖，与利用鸡胚制备疫苗的方法相比具有明显的优势。
（3）利用MDCK细胞生产疫苗可有效的避免鸡胚供应不足导致疫苗生产滞后的弊端，减少了对鸡胚的依赖。
（4）使用MDCK细胞进行疫苗的制备还减免了对鸡胚残体的后期处理过程，降低了生产成本以及环境污染。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
H1N1亚型人流感病毒（A/Puerto Rico/8/34，简称PR8）在文献“Abt.M,deJongeJ,et al.Improvement of H5N1influenza vaccine viruses:Influence of internalgene segments of avian and human origin on production and hemagglutinincontent.Vaccine.2011,29(32):5153-62”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
H9N2亚型禽流感病毒（A/chicken/Shandong/16/05）在文献“Jingjing Wang etal.Mouse-Adapted H9N2Influenza A Virus PB2Protein M147L and E627K MutationsAre Critical for High Virulence.Plos one.2102.7(7):e40752.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
Uni12：序列为5’-AGCAAACGACC-3’，为北京擎科新业生物技术有限公司合成。
RNasin购自fermentas，产品目录号为EO0381。
AMV反转录酶购自Promega，产品目录号为M5101。
LA Taq购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111。
pLLB-G载体和pLLB-A载体的构建方法在授权公告号为CN101343636B，发明名称为“用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用”（申请号：200810119705.X）中说明书第2页第3行至第17行公开过。
293T细胞购自北京协和医院。
MDCK细胞购自北京协和医院。
TranslT-LT1Transfection Reagent购自Mirus，产品目录号为MIR2300。
TPCK-胰酶购自INVIVOGEN，产品目录号为LS003740。
固定液：由无水乙醇和丙酮按体积比3:2的比例混匀制成。
一抗为抗流感病毒NP蛋白的单克隆抗体，购自Abcam，产品目录号为ab20343。
二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG，购自sigma，产品目录号为F4137。
1%红细胞悬液：用生理盐水配制的1%鸡红细胞，鸡红细胞与生理盐水的体积比为1:100。
21-28日龄SPF鸡购自法国梅里亚公司。
H9亚型标准抗原购自哈尔滨维科生物技术开发公司，产品目录号为080018077。
实施例1、利用反向遗传操作技术进行重组病毒的拯救及纯化
一、提取A/Chicken/Hebei/YT/2010和A/Puerto Rico/8/34病毒的RNA。
二、分别以两种病毒的RNA为模板进行反转录。
反转录体系如下：
在反应管中依次加入上述各成分，混匀，瞬时离心。
其中vRNA指步骤一得到的病毒的RNA。
反转录条件：42℃1h，94℃5min。
将反转录后的cDNA产物作为PCR反应的模板。
三、PCR扩增
PCR反应体系如下：
其中cDNA为步骤二得到的A/Chicken/Hebei/YT/2010或A/Puerto Rico/8/34病毒的cDNA。
依次加入以上各成分，瞬时离心混匀，进行PCR反应，扩增A/Chicken/Hebei/YT/2010或A/Puerto Rico/8/34病毒中的以下各基因，基因的名称以及对应的引物如下：
1、PB2基因
上游引物：
YT-PB2-F：5’-TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGATGGG-3’
PR8-PB2-F：5’-TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGATGGA-3’
下游引物：
YT-PB2-R：5’-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGATTGA-3’
PR8-PB2-R：5’-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGCTAAT-3’
2、PB1基因
上游引物：
YT-PB1-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGATGGA-3’
PR8-PB1-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGATGGA-3’
下游引物：
YT-PB1-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTTTTT-3’
PR8-PB1-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTTTTT-3’
3、PA基因
上游引物：
YT-PA-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCATGGA-3’
PR8-PA-F:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCATGGA-3’
下游引物：
YT-PA-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAATCTCA-3’
PR8-PA-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACTAAC-3’
4、HA基因
上游引物：
YT-HA-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGGCAGT-3’
下游引物：
YT-HA-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTATAC-3’
5、NP基因
上游引物：
YT-NP-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGatggc-3’
PR8-NP-F:5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGatggc-3’
下游引物：
YT-NP-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGGTCATAC-3’
PR8-NP-R:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTTAATTG-3’
6、NA基因
上游引物：
YT-NA-F：5’-TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGatgca-3’
PR8-NA-F：5’-TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGatgaa-3’
下游引物：
YT-NA-R：5’-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTATAGG-3’
PR8-NA-R：5’-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGCTACTT-3’
7、M基因
上游引物：
YT-M-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGatgag-3’
PR8-M-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGatgag-3’
下游引物：
YT-M-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTACT-3’
PR8-M-R:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTACT-3’
8、NS基因
上游引物：
YT-NS-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTGatgga-3’
PR8-NS-F：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTGatgga-3’
下游引物：
YT-NS-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTAAA-3’
PR8-NS-R：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGCTAAA-3’
上述引物中，YT标示的引物为扩增A/Chicken/Hebei/YT/2010各基因的引物，PR8标示的引物为扩增A/Puerto Rico/8/34各基因的引物。
PCR反应条件如下：
四、鉴定PCR扩增产物，并进行目的片段的回收，得到如下基因。
1、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的HA基因，以下简称YT-HA，该基因的序列如SEQ ID No.1所示。
2、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的NA基因，以下简称YT-NA，该基因的序列如SEQ ID No.2所示。
3、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的PB2基因，以下简称YT-PB2，该基因的序列如SEQ ID No.3所示。
4、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的PB1基因，以下简称YT-PB1，该基因的序列如SEQ ID No.4所示。
5、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的PA基因，以下简称YT-PA，该基因的序列如SEQ ID No.5所示。
6、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的NP基因，以下简称YT-NP，该基因的序列如SEQ ID No.6所示。
7、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的M基因，以下简称YT-M，该基因的序列如SEQ ID No.7所示。
8、A/Chicken/Hebei/YT/2010中扩增得到的NS基因，以下简称YT-NS，该基因的序列如SEQ ID No.8所示。
9、A/Puerto Rico/8/34中扩增得到的PB2基因，以下简称PR8-PB2，该基因的序列如SEQ ID No.9所示。
10、A/Puerto Rico/8/34中扩增得到的M基因，以下简称PR8-M，该基因的序列如SEQ ID No.10所示。
11、A/Puerto Rico/8/34中扩增得到的NA基因，以下简称PR8-NA，该基因的序列如SEQ ID No.11所示。
12、A/Puerto Rico/8/34中扩增得到的NP基因，以下简称PR8-NP，该基因的序列如SEQ ID No.12所示。
13、A/Puerto Rico/8/34中扩增得到的NS基因，以下简称PR8-NS，该基因的序列如SEQ ID No.13所示。
14、A/Puerto Rico/8/34中扩增得到的PA基因，以下简称PR8-PA，该基因的序列如SEQ ID No.14所示。
15、A/Puerto Rico/8/34中扩增得到的PB1基因，以下简称PR8-PB1，该基因的序列如SEQ ID No.15所示。
YT-HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
YT-NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
YT-PB2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。
YT-PB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。
YT-PA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。
YT-NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示。
SEQ ID No.7中自5’末端起第1位至第759位核苷酸编码的蛋白YT-M1的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示。
SEQ ID No.7中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸编码的蛋白YT-M2的氨基酸序列如SEQ ID No.23所示。
SEQ ID No.8中自5’末端起第1位至第654位核苷酸编码的蛋白YT-NS1的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。
SEQ ID No.8中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸编码的蛋白YT-NS2的氨基酸序列如SEQ ID No.25所示。
PR8-PB2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.26所示。
SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第759位核苷酸编码的蛋白PR8-M1的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示。
SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸编码的蛋白PR8-M2的氨基酸序列如SEQ ID No.28所示。
PR8-NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.29所示。
PR8-NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.30所示。
SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第693位核苷酸编码的蛋白PR8-NS1的氨基酸序列如SEQ ID No.31所示。
SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸编码的蛋白PR8-NS2的氨基酸序列如SEQ ID No.32所示。
PR8-PA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.33所示。
PR8-PB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.34所示。
五、将YT-PB2、YT-PB1、YT-PA、PR8-PB2、PR8-PB1和PR8-PA分别与载体pLLB-G连接，得到重组质粒YT-PB2-LLB、YT-PB1-LLB、YT-PA-LLB、PR8-PB2-LLB，PR8-PB1-LLB和PR8-PA-LLB，将重组质粒测序，结果正确。
将YT-HA、YT-NP、YT-NA、YT-M、YT-NS、PR8-NP、PR8-NA、PR8-M、PR8-NS分别与载体pLLB-A连接，得到重组质粒YT-HA-LLB、YT-NP-LLB、YT-NA-LLB、YT-M-LLB、YT-NS-LLB、PR8-NP-LLB、PR8-NA-LLB、PR8-M-LLB和PR8-NS-LLB，将重组质粒测序，结果正确。
六、提取步骤五得到15种重组质粒。
七、病毒的拯救
（一）细胞的准备
将293T细胞和MDCK细胞按照5:1的数量比例铺于6孔细胞板。铺板后18-24小时进行转染，此时细胞85%左右融合。进行转染前用PBS缓冲液轻轻洗两次细胞。
（二）混合质粒
将两种流感病毒15种重组质粒各500ng加入1.5mL离心管中，混匀。
（三）转染
1、将200μL Opti-MEM培养基（无血清、无抗生素）加入已加入质粒的1.5mL离心管中，再加入10μL Mirus转染试剂TranslT-LT1Transfection Reagent，瞬时离心以混匀。室温放置45min，加入200μL Opti-MEM培养基（无血清、无抗生素）于离心管中。
2、吸净6孔板中的细胞培养液，用PBS缓冲液洗细胞两次后，吸净残余的PBS。
3、将每个1.5mL离心管中的液体移入每个孔中，共转染40块6孔板，共240个孔，37℃培养6小时。
4、加入含有2μg/mL TPCK-胰酶的Opti-MEM培养基于6孔板中，1mL/孔，37℃培养48-72小时后，收集各孔中转染的细胞和上清液的混合液，置于-80℃保存备用。
八、拯救病毒的增殖与鉴定
（一）增殖
将转染后冻存的细胞液从-80℃冰箱取出，待其融化后吹打混匀细胞液，接种于MDCK细胞，于37℃CO2培养箱中培养48-72h，收获细胞上清液，测定其凝集红细胞的活性（血凝活性）。若无血凝活性，则再接种MDCK细胞一次，放弃仍无血凝活性的样本。
（二）鉴定
提取具有血凝活性的样本中含有的拯救的病毒的RNA，反转录成cDNA。对病毒进行全基因组序列测定，通过与两亲本病毒A/Chicken/Hebei/YT/2010和A/PuertoRico/8/34的基因组比较来判定拯救的病毒的序列的正确性。最终确定拯救成功了18株不同的重组病毒。
实施例2、重组病毒的传代、纯化与鉴定
一、将实施例1得到的18株重组病毒在MDCK细胞上进行连续传代，具体方法如下：将含病毒的细胞和上清的混合液分别以10-2、10-3、10-4稀释度感染MDCK细胞（用含1%双抗的DMEM），挑选出各病毒在各稀释度下HA效价（即病毒能够凝集红细胞的最高稀释倍数）最高的病毒，再将选出的病毒以相同的方式感染MDCK细胞，连续挑选出各病毒在各稀释度下HA效价（即病毒能够凝集红细胞的最高稀释倍数）最高的病毒。以此方法将18株重组病毒连续传至第10代。
二、传代病毒的噬斑纯化
（一）待6孔板单层MDCK细胞95%-100%融合时，吸弃细胞培养液，用PBS清洗细胞两次。将传代后的18株病毒液分别进行100倍、1000倍、10000倍、100000、1000000倍倍比稀释，取适当稀释度的重组病毒液接种MDCK细胞，每孔300μL病毒液，37℃吸附1h。
（二）待4%低熔点琼脂在70℃水浴锅中融化后，将含1%双抗的DMEM培养基与融化的4%低熔点琼脂按照体积比3:1进行混合，并加入TPCK-胰酶，TPCK-胰酶终浓度为2μg/mL，配制成覆盖液。
（三）吸弃6孔板中的病毒液，每孔加入2mL覆盖液，4℃放置15-20min，待覆盖液凝固后，将6孔板放入CO2培养箱，37℃培养2-3天。
（四）当出现肉眼可见的噬斑后，挑取单个噬斑，溶解于1mL含1%双抗的DMEM培养基中，得到病毒液。
（五）从中取300μL病毒液重复步骤(一)到步骤（四），再次纯化病毒，通常纯化2-3次。
（六）通过RT-PCR方法扩增步骤五纯化后的重组病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因，进行测序验证，结果正确。
PB2基因的测序引物为实施例1中的PB2基因上游引物和下游引物。
PB1基因的测序引物为实施例1中的PB1基因上游引物和下游引物。
PA基因的测序引物为实施例1中的PA基因上游引物和下游引物。
HA基因的测序引物为实施例1中的HA基因上游引物和下游引物。
NP基因的测序引物为实施例1中的NP基因上游引物和下游引物。
NA基因的测序引物为实施例1中的NA基因上游引物和下游引物。
M基因的测序引物为实施例1中的M基因上游引物和下游引物。
NS基因的测序引物为实施例1中的NS基因上游引物和下游引物。
实施例3、传代毒TCID50/mL及血凝效价的测定
一、MDCK单层细胞的准备
实验前24h将MDCK细胞传至96孔细胞培养板中，待细胞长至70%-90%，以10mL移液管移去孔中的培养液，用PBS洗涤细胞，弃去洗液，重复洗涤3次。
二、病毒液倍比稀释
（一）实验前30min在-80℃冰箱中将实施例2得到的18株纯化后的病毒液拿出，置4℃冰箱中，自然融化。
（二）将每个病毒依次用含1%双抗的DMEM按照10倍倍比稀释至10-8，作好标记。
（三）将倍比稀释后的病毒液置冰上保存。
三、接种病毒
（一）将MDCK细胞接种在96孔板上，每个稀释度的病毒液接种3个细胞孔，每孔100μL，37℃孵育1h（一般病毒液效价介于101TCID50/0.1mL-108TCID50/0.1mL之间，建议检测10-1至10-8稀释度）。
(二)移去孔内病毒液，加入100μL无血清DMEM培养基（同时加入TPCK-胰酶，终浓度为2μg/mL）继续于37℃5％CO2培养箱中培养。每隔12h观察一次细胞病变情况，待细胞出现较严重病变时（36h-48h）对每孔细胞培养液进行免疫荧光（IFA）检测以及血凝效价测定。
四、IFA检测
（一）清洗：移去孔内细胞培养液，用PBS（0.1M，pH7.3）洗涤细胞，弃去洗液，重复洗涤3次（轻轻晃动，避免强烈清洗）。
(二)固定：每孔加入1mL固定液室温放置10min。
（三）清洗：移去孔内固定液，用PBS（0.1M，pH7.3）洗涤细胞，弃去洗液，重复洗涤3次（轻轻晃动，无需吹打）。
（四）一抗孵育反应：将抗流感病毒NP蛋白单抗用PBS（0.1M，pH7.3）做1500倍稀释，每孔加入0.1mL，37℃温箱孵育反应1h（或4℃过夜）。
（五）清洗：移去孔内一抗，用PBS（0.1M，pH7.3）洗涤细胞，弃去洗液，重复洗涤3次（加完洗液PBS静置5min再弃去）。
（六）二抗孵育反应：FITC标记的羊抗鼠IgG用PBS（0.1M，pH7.3）做20倍稀释，每孔加入0.1mL，37℃温箱避光孵育反应1h。
（七）清洗：移去孔内二抗，用PBS-T（1000mLPBS加入0.5mL吐温-20）洗涤细胞，弃去洗液，重复洗涤3次用（加完洗液PBS静置5min再弃去）。
（八）观察结果：荧光显微镜紫外光观察细胞，发绿色荧光判定为阳性
（九）计算出18株传代病毒的TCID50/mL，挑选出TCID50较高的重组病毒作为疫苗候选株。
结果如表1所示。
五、传代病毒血凝效价的测定
（一）用微量移液器向反应板（血凝板）的每孔加生理盐水25μL。
(二)用微量移液器分别吸取待测抗原（即纯化后的18株重组病毒液）25μL于第1孔中并吹吸6次混合，后吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，最后弃去25μL。
(三)微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL。
（四）将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。
(五)结果判定：将反应板倾斜成450，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原的红细胞凝集效价（即HA滴度）。
结果如表1所示。
表1在MDCK细胞中具有较高繁殖力疫苗候选株以及YT原毒的HA滴度及TCID50/mL
“r”代表“重组”；
数字代表PR8的基因片段：1:PB22:PB13:PA5:NP6:NA7:M8:NS；
来源于A/Puerto Rico/8/34的基因片段用灰色表示；
来源于A/Chicken/Hebei/YT/2010的基因片段用黑色表示；
“a”代表在MDCK细胞中繁殖力高的毒株基因组成；
“b”代表传统疫苗株的基因组成；
其中YT原毒指A/Chicken/Hebei/YT/2010。
表1中所列的病毒株中HA基因（未列出）均为H9N2亚型禽流感病毒（A/Chicken/Hebei/YT/2010）的HA基因。
将在MDCK细胞中繁殖力较高的编号为18和38的重组病毒作为候选疫苗株。
其中编号为18的重组病毒的PB2基因序列如SEQ ID No.9所示、PB1基因如SEQ IDNo.15所示、PA基因如SEQ ID No.14所示、HA基因如SEQ ID No.1所示、NP基因如SEQ ID No.6所示、NA基因如SEQ ID No.11所示、M基因如SEQ ID No.10所示、NS基因如SEQ ID No.13所示。
将PR8-PB2-LLB、PR8-PB1-LLB、PR8-PA-LLB、YT-HA-LLB、YT-NP-LLB、PR8-NA-LLB、PR8-M-LLB、PR8-NS-LLB质粒按照实施例1步骤七的方法可以得到编号为18的重组病毒。
其中编号为38的重组病毒的PB2基因序列如SEQ ID No.9所示、PB1基因如SEQ IDNo.4所示、PA基因如SEQ ID No.14所示、HA基因如SEQ ID No.1所示、NP基因如SEQ ID No.6所示、NA基因如SEQ ID No.2所示、M基因如SEQ ID No.10所示、NS基因如SEQ ID No.13所示。
将PR8-PB2-LLB、YT-PB1-LLB、PR8-PA-LLB、YT-HA-LLB、YT-NP-LLB、YT-NA-LLB、PR8-M-LLB、PR8-NS-LLB质粒按照实施例1步骤七的方法可以得到编号为38的重组病毒。
实施例4、重组病毒灭活疫苗的免疫原性及保护性检测
一、重组病毒灭活疫苗的免疫原性检测
（一）MDCK细胞中繁殖力较高的编号为18和38的重组病毒的灭活疫苗分别对10只SPF鸡进行免疫，剩余10只鸡注射等量的PBS缓冲液作为对照。
灭活疫苗制备步骤如下：
1、向编号为18和38的重组病毒液中加入终浓度为0.4%（体积百分含量）甲醛溶液，置于37℃摇床48h灭活。
2、取灭活病毒液96ml，逐滴加入4ml吐温-80作为乳化剂，颠倒混匀。
3、油相制备：取白油200ml于研磨钵中,向其中加入2%的硬脂酸铝粉末，用电炉加热，并不断搅拌，直到硬脂酸铝完全溶解，溶液清亮透明。再向上述溶液里加入6%的司班-80，混合均匀即为油相。
4、油相高压灭菌：将油相放入小的注射用玻璃瓶中，瓶口用纱布塞紧，再外包报纸，橡皮筋固定，高压灭菌。
5、待油相灭菌冷却后，再把病毒液和吐温-80混合物逐渐加入其中，充分乳化0.5h，两注射器来回推注乳化，待推力感明显增大时，即乳化基本可以。
6、待病毒液和白油充分包容即为编号为18和38的重组病毒的油乳剂灭活疫苗。
7、疫苗接种
（二）将30只21-28日龄的SPF鸡分为3个大组（A、B、C），每大组10只鸡。
A、B大组为实验组，免疫编号为18和38的重组病毒的灭活疫苗，分别经颈背侧皮下注射步骤（一）制备的编号为18号和38的重组病毒的灭活疫苗0.3ml/只。
C大组不免疫（注射等量的PBS缓冲液），作为空白对照组。
（三）免疫后21天通过翅根采血，分离各组鸡的血清，用于测定血清的血凝抑制效价。
（四）单位抗原的配制、抗原值校正以及血清血凝抑制（HI）效价的测定
1、用生理盐水配制血凝效价为22单位的H9亚型标准抗原。
2、用微量移液器向反应板的第2孔至第6孔加生理盐水25μL，第1孔不加。
3、用微量移液器吸取血凝效价为22单位的H9亚型标准抗原25μL分别加入第1孔、第2孔中，从第2孔开始吹吸6次混合，后吸出25μL至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，最后弃去25μL。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25μL。
5、将反应板置微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。
6、结果观察：第1、2、3孔为红细胞完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔完全沉淀，第6孔（对照组）红细胞完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配血凝效价为22单位的H9亚型标准抗原准确，校正成立。如不成立，需重新配制血凝效价为22单位的H9亚型标准抗原，并进行上述操作。
7、血清血凝抑制（HI）效价的测定
①用微量移液器加25μL生理盐水于反应板的各孔中。
②用微量移液器吸取步骤（三）得到的各待检血清25μL置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25μL。最后1孔（即第12孔，生理盐水组）作为对照。
③用微量移液器吸取配制好的血凝效价为22单位的H9亚型标准抗原，每孔加25μL。
④将反应板置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置20min。
⑤用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25μL。
⑥置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置40min后观察结果。
⑦结果观察：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制实验滴度（即HI抗体水平），以2的指数表示，结果如表2所示。
表2候选疫苗株免疫鸡只产生的HI抗体水平（log2）
表2表明，用所获得的编号为18和38的重组病毒的灭活疫苗免疫SPF鸡后，血清中的HI抗体水平都达到28以上。
二、重组病毒的灭活疫苗的保护性检测
（一）重组病毒的灭活疫苗的制备、实验分组、免疫剂量及方式与步骤一相同。免疫14天后，每隔3天采集已免疫鸡只的血液，分离出血清，用相应血清进行HI效价测定；效价高于26后，进行攻毒。免疫后21-28天，每只鸡通过点眼和滴鼻分别接种100ul（106TCID50）H9N2亚型禽流感病毒（A/chicken/Shandong/16/05）。
（二）攻毒后第5天采取每只鸡的泄殖腔拭子，经含双抗（青霉素和链霉素）PBS处理后，每只鸡的泄殖腔拭子接种3个鸡胚得到病毒的尿囊液，测定尿囊液血凝效价，如果血凝效价高于24则判定所测泄殖腔拭子病毒来源的鸡为阳性鸡（即被病毒感染的鸡），具体步骤如实施例3中的血凝效价的测定。
（三）计算免疫保护率
免疫保护率计算方法：泄殖腔拭子病毒来源的阴性鸡只数/总鸡只数。
结果如表3所示。
表3候选疫苗株保护率
| 疫苗编号 | 18 | 38 | 对照 |
| 保护率 | 100% | 100% | 0% |
表3表明，编号为18和38的重组病毒的灭活疫苗的免疫保护率均为100%。说明，编号为18和38的两株重组病毒的灭活疫苗可以用于保护鸡免受H9N2亚型禽流感病毒（A/chicken/Shandong/16/05）的感染。
Claims (10)
1.一种病毒，该病毒的PB2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.26所示，PB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.34所示，PA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.33所示，NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.29所示，M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示，M2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.28所示，NS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.31所示，NS2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.32所示，HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
2.一种病毒，该病毒的PB2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.26所示，PB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，PA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.33所示，NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，NA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示，M2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.28所示，NS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.31所示，NS2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.32所示，HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
3.根据权利要求1所述的病毒，其特征在于：所述PB2蛋白的编码基因如SEQ IDNo.9所示，所述PB1蛋白的编码基因如SEQ ID No.15所示，所述NA蛋白的编码基因如SEQ ID No.11所示，所述PA蛋白的编码基因如SEQ ID No.14所示，所述HA蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示，所述NP蛋白的编码基因如SEQ ID No.6所示，所述M1蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第759位核苷酸所示，所述M2蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸所示，所述NS1蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第693位核苷酸所示，所述NS2蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸所示。
4.根据权利要求2所述的病毒，其特征在于：所述PB2蛋白的编码基因如SEQ IDNo.9所示，所述PB1蛋白的编码基因如SEQ ID No.4所示，所述NA蛋白的编码基因如SEQ ID No.2所示，所述PA蛋白的编码基因如SEQ ID No.14所示，所述HA蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示，所述NP蛋白的编码基因如SEQ ID No.6所示，所述M1蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第759位核苷酸所示，所述M2蛋白的编码基因如SEQ ID No.10中自5’末端起第1位至第26位、第715位至第982位核苷酸所示，所述NS1蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第693位核苷酸所示，所述NS2蛋白的编码基因如SEQ ID No.13中自5’末端起第1位至第30位、第503位至第838位核苷酸所示。
5.一种疫苗，由权利要求1或3所述的病毒经灭活制成。
6.一种疫苗，由权利要求2或4所述的病毒经灭活制成。
7.权利要求5或6所述的疫苗在制备提高动物血清中血凝抑制抗体水平的产品中的应用；
所述血凝具体是由流感病毒血凝素蛋白凝集红细胞引起的。
8.权利要求5或6所述的疫苗在制备预防和/或治疗流感病毒引起的动物疾病的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述病毒为禽流感病毒；
所述禽流感病毒具体为H9N2亚型禽流感病毒。
10.根据权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于：所述动物为禽或除禽以外的其他动物。
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