CN114316017A - 鼠源肠道α-防御素及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠源肠道α‑防御素及其应用，属于生物技术领域。该鼠源肠道α‑防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明构建了小鼠α‑防御素亚型Defa20的重组表达载体，并转入HEK293细胞中进行真核细胞表达，优化了真核表达及后续纯化的方法，提高了表达效率和蛋白纯度，纯化后的蛋白具备明显的体外抑菌效果。

Description

鼠源肠道α-防御素及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鼠源肠道α-防御素及其应用。

背景技术

抗菌肽（Antimicrobial peptide）是一类天然存在于几乎所有生命体的小分子多肽，不仅具有广谱的抗菌活性，对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞均有强有力的杀伤作用，同时也是机体天然免疫的重要组成部分。α-防御素是抗菌肽家族重要组成成员，在肠道中由潘氏细胞表达并分泌，不仅参与宿主的免疫防御，而且能够调节肠内菌群的组成，对于维持肠道平衡，保持肠道健康非常重要。α-防御素的两亲性结构利于其嵌入细胞膜，其二聚体或者多聚体形成跨膜离子通道，造成细胞膜像孔一样的缺陷，膜的通透性发生改变，使必要的离子和营养物质等内容物外渗，细菌裂解死亡。与传统抗生素不同的是，防御素是机体自身产生的生物活性分子，不易引起细菌病原体产生耐药性，同时对机体共生菌具有兼容调节作用。防御素在抑制病原微生物方面的特性使其有望成为传统杀菌剂和抗生素的替代物，在医疗工业和食品添加剂行业具有很好的应用前景。

虽然防御素具有广阔的应用前景和巨大的开发潜力，但是其产业化进程和机制理化研究比较缓慢。防御素的生产方式主要有三种：天然提取法，化学合成法以及基因工程法。天然防御素在动物体内含量低，从动物体内提取防御素存在产量低、费事长、工艺复杂、效价低、价格昂贵等不足。化学合成防御素多肽存在成本高，难度大，且不能控制多肽的二硫键和空间折叠构象，影响其活性。因此，开发和制备能够克服上述缺点的新一代防御素具有重要意义。目前通过微生物发酵、细胞表达纯化等基因工程方法，可规模化大量表达有活性的防御素，是目前生产防御素多肽的最佳途径。基因工程可分为原核细菌表达和真核细胞表达，原核细胞表达可以大量产生多肽，缺点是多肽可能缺乏翻译后修饰，影响多肽功能。而真核细胞表达产生的多肽则避免了这一问题，得到类似于机体天然产生的活性防御素。

发明内容

本发明的目的是提供鼠源肠道α-防御素蛋白及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

鼠源肠道α-防御素蛋白，其氨基酸序列为：

SRDLICYCRKGGCNRGEQVYGTCSGRLLFCCRRRHRH（SEQ ID No.1）。

编码SEQ ID No .1所示蛋白的核酸，其核苷酸序列为：

GAAGAGCAGCCGGGACCTGATCTGCTACTGCAGAAAGGGCGGATGTAATAGAGGCGAGCAAGTGTACGGCACCTGTAGCGGCAGACTGCTCTTCTGCTGCCGGAGACGGCACAGACACCACCACCACCATCACCACTGA（SEQID No.2）。

一种重组载体，它包含SEQ ID No.2所示的核酸。优选地，所述重组载体为pCDNA3.4。

SEQ ID No.1所示的蛋白或编码SEQ ID No.1所示蛋白的核酸或上述的重组载体在制备抗菌产品中的应用。优选地，所述抗菌产品可抑制革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的生长。

SEQ ID No.1所示的蛋白通过以下步骤制备得到：

步骤1，优化表达该防御素的基因序列；

步骤2，构建上述防御素的表达载体；

步骤3，将上述表达载体转化入原核表达宿主中；

步骤4，扩增质粒，转染至HEK293细胞中表达该防御素；

步骤5，纯化上述表达的防御素重组蛋白。

本发明的鼠源肠道α-防御素蛋白是小鼠肠道内重要的α-防御素亚型，是由37个氨基酸构成阳离子肽，且经真核表达后获得的重组防御素在纯化后即具有明显的体外抑菌效果。

足够量的防御素单体是进一步对防御素进行结构分析、理化特性分析和作用机理深入研究的前提，本发明通过真核表达可以获得足量的Defa20，可支持后续研究。

附图说明

图1为优化基因序列与原始序列的对比图。

图2为重组质粒的结构示意图。

图3为重组质粒的PCR凝胶电泳结果，其中：M为KB Ladder；1为Defa20质粒；2为由Xbal和EcoRV酶解的Defa20质粒。

图4为重组Defa20的SDS-PAGE电泳结果。

图5为不同真核细胞表达Defa20的SDS-PAGE电泳结果。

图6为不同浓度咪唑洗脱Defa20的SDS-PAGE电泳结果。

图7为重组蛋白抑菌实验图。

具体实施方式

小鼠α-防御素亦称为隐窝素，有多种亚型，Defa20亚型基因位于小鼠8号染色体，属于分泌蛋白，由小肠潘氏细胞组织特异性分泌。它全长93个氨基酸，成熟肽37个氨基酸，全长分子量是10.6kDa。Defa20在小鼠防御素中表达丰度较高，代表Defa20在体内有重要作用。

本发明的鼠源α-防御素多肽（现将该基因命名为Defa20基因）的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列SEQ ID NO.2所示。本发明优化表达该防御素的基因序列，构建了上述防御素的表达载体，将构建好的表达载体转入原核宿主中，进行载体质粒的扩增，提取质粒后转染至HEK293细胞中进行真核表达，用NI柱亲和层析法纯化上述表达的重组蛋白，将上述获得的重组蛋白用于抗菌活性的检测。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

下列实施例所采用的载体及宿主细胞：载体pCDNA3.4购自南京金斯瑞公司，Caco2、293T、HEK293均购自上海中国科学院细胞所。

下列实施例所采用的试剂：无内毒素质粒中提试剂盒购自康为世纪，细胞培养相关试剂购自Invitrogen公司，Ni NTA Beads（cat.No.SA004010）购自天地人和公司。其他都为国产试剂，均可以从普通生化试剂公司购买得到。

下列实施例所采用的培养基：LB（1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0）。

实施例1

1、鼠源α-防御素Defa20的编码基因克隆及载体构建

首先根据真核表达载体密码子优化获得Defa20目的基因的优化序列，通过化学合成方法合成Defa20的基因核苷酸片段（委托金斯瑞公司完成，如图1所示），并在核苷酸片段前依次加入XbaⅠ酶切位点、Kozak序列（GCCACC）、核苷酸片段后加入6×His序列、终止密码子以及EcoRV酶切位点序列。之后获得的核酸片段插入pCDNA3.4真核表达载体中的多克隆位点的XbaⅠ和EcoRV中，DNA连接酶连接后，PCR和基因测序验证获得插入完整的质粒（如图2和图3所示）。质粒转化到Top10感受态细菌中。通过氨苄抗生素筛选得到转化阳性的转化菌，加入甘油保存。

2、肠道α-防御素Defa20的质粒扩增及真核表达

挑取阳性转化子接种于LB培养基， 37℃、200rpm振摇培养过夜， 取300μL菌液接种于30mL液体LB培养基中， 37℃、230rpm振摇培养10-12小时。

将上述菌液5000g离心10min，尽可能多的除去上清，用康为世纪无内毒素质粒中提试剂盒提取Defa20的质粒，将其分别转入Caco2、293T、HEK293中进行真核表达，转染时间为24小时，结果发现在HEK293细胞中表达效率最高，后续实验采用HEK293细胞进行。HEK293细胞铺六个100mm大皿至汇合度70-80%，用lipo3000、P3000试剂进行转染，每皿质粒质量为12μg，转染时间为24小时，每皿使用2mL裂解缓冲液裂解，超声10min，4℃，12000rpm，离心20min，上清转移至新离心管中，重复离心一次，上清转移至新EP管中，弃沉淀。

3、肠道α-防御素Defa20重组蛋白的纯化

取上述上清液，采用Ni柱亲和层析法纯化目的蛋白，具体步骤如下：(1)每皿用2mL裂解液（20mM Tris-HCL、150mM NaCL、20mM 咪唑，pH=8.0）充分裂解细胞，裂解液插入冰中超声，时间为10min，强度为50%，将超声过的裂解液4℃条件下12000rpm离心20min，取上清，重复离心一次，以充分除去沉淀避免堵塞柱子；（2）使用5mL裂解液(20mM Tris-HCL、150mMNaCL、20mM 咪唑，pH=8.0)润洗Ni柱；(3)加入上述重组蛋白上清，颠倒混匀，使得蛋白与Ni柱充分结合；(4)将Ni柱竖直放置，待填料沉降在底部后，流净柱子内的液体，收集过柱后的液体；(5)向柱子内加入5mL漂洗液(20mM Tris-HCL、150mM NaCL、50mM咪唑，pH=8)，颠倒混匀，静置，待填料沉降后，再流净柱内液体，使得杂蛋白被充分洗脱；(6)按照从低到高的咪唑浓度向柱子内加入1mL洗脱液（咪唑浓度分别20mM、50 mM、100 mM、300 mM），上下颠倒混匀，静置，待填料沉降后，充分收集柱内液体，按照咪唑浓度由低到进行洗脱，且每个浓度洗脱两次，分别收集洗脱液，获得目的蛋白。

SDS-PAGE凝胶电泳

纯化的目的蛋白经BCA试剂盒进行蛋白定量后，在SDS-PAGE凝胶（15%分离胶，5%浓缩胶）上进行电泳，拍照记录结果。

如图4-图6所示，HEK293表达效率最高，因此后续采用HEK293表达该防御素，咪唑洗脱纯化蛋白的最佳浓度是100mM。

实施例2

重组蛋白的抗菌活性检测

使用显微分光光度法测定抗菌活性，确定IC50（达到50%的抑制作用的肽浓度）。分别将沙门氏菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌培养至对数生长期（OD600为0.5），调整菌液浓度为1*10^6CFU/ML，取50μL调整浓度后的菌液，加入96孔板中，加入不同浓度纯化Defa20重组蛋白，加入LB液体培养基补充总体积为100μL，使各孔的最终Defa20重组蛋白浓度为10、50、100、200、300μg/mL；对照孔不加Defa20，加入50μL LB液体培养基补充总体积为100μL。上述各浓度肽及对照组均重复三个复孔。各96孔板于37℃培养12H后，用酶标分析仪于600nm处测量各孔OD值。Defa20的抗菌活性以生长抑制率表示。

如图7所示，Defa20对沙门氏菌和地衣芽孢杆菌有较为明显的抑菌作用，在100μg/mL时抑菌率达到50%；对大肠杆菌的抑制作用较弱，在100μg/mL时，抑菌率仅达到10%左右。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 鼠源肠道α-防御素及其应用

<130> 20220105

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Arg Asp Leu Ile Cys Tyr Cys Arg Lys Gly Gly Cys Asn Arg Gly

1 5 10 15

Glu Gln Val Tyr Gly Thr Cys Ser Gly Arg Leu Leu Phe Cys Cys Arg

20 25 30

Arg Arg His Arg His

35

<210> 2

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagagcagc cgggacctga tctgctactg cagaaagggc ggatgtaata gaggcgagca 60

agtgtacggc acctgtagcg gcagactgct cttctgctgc cggagacggc acagacacca 120

ccaccaccat caccactga 139

Claims (6)

1.鼠源肠道α-防御素蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID No.2所示的核酸。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pCDNA3.4。

5.权利要求1所述的蛋白或权利要求1所述的核酸或权利要求3所述的重组载体在制备抗菌产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗菌产品可抑制革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的生长。

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