CN117510618A - 一种合成i型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成I型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明的合成人源化I型胶原蛋白为人I型胶原α1链蛋白的氨基酸674‑736肽段的9次重复体，含有9个GFPGER结构，该结构域能与细胞整合素受体结合；通过串联表达来增加单个蛋白分子所含该结构域的数量可以提升胶原蛋白与细胞的亲和力，促进细胞粘附。本发明所合成的胶原蛋白的氨基酸序列含有如SEQNO.1所示的567个氨基酸，基因序列经毕赤酵母偏好的密码子优化，引入重组质粒pPIC9K转化得到毕赤酵母工程菌；经发酵培养，实现合成人源化I型胶原蛋白的诱导表达，再进一步分离与纯化，得到精纯合成人源化I型胶原。所得到的合成人源化I型胶原蛋白可用于制备敷料、修复原液等医疗产品。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种合成I型人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是一种三螺旋结构，可以启动和维持细胞与基质之间的相互作用。迄今为止，已经鉴定出29种不同类型胶原蛋白。最常见的是I型胶原蛋白(Col I，Collagen typeI)，因其在人体组织中的高生物相容性而独特。Col I的来源多种多样，并且能模拟天然细胞外基质(ECM)环境，通常在血管、皮肤、骨骼、器官包膜、肌腱、角膜和筋膜和其他组织中占较大的蛋白质成分(90％)。天然Col I可塑理化性质进一步增强了其在制药、美妆、再生医学和临床等各个领域的应用。Col I也被称为原纤维形成胶原蛋白，由于其丰富度，作为生物材料在组织工程中应用最为广泛。
胶原蛋白的3D结构，孔隙大小影响组织和器官的机械强度。天然的Col I蛋白由两条链组成COL1A1和COL1A2，也称为α1和α2链。Col I蛋白可以表现为同型三聚体或异型三聚体，异源三聚体是显性异构体；同源三聚体的性质，它们对胶原酶具有高度抗性，导致切割过程受阻，同型三聚体在伤口愈合中起重要作用。一般来说，Col I被认为对蛋白水解降解具有高度的抗性。Col I蛋白大约有1000多种氨基酸组成，其长度可达300nm，宽度为1-5nm。包括三个结构域：N端肽、C端肽和一个中心结构域，中心结构域表征了95％分子结构。
胶原原纤维表面的结构直接影响并可能协助胶原受体相互作用，从而发挥胶原蛋白的促进细胞粘附、迁移、增殖和基质重塑等功能。胶原蛋白重要的受体包括酪氨酸激酶的盘状蛋白受体结构域受体家族(DDR1和DDR2)、整合素及GPVI。目前已被证明β1整合素是主要的胶原蛋白受体之一，晶体学研究也表明整合素与胶原蛋白三螺旋中心结构中特定氨基酸序列(例如GFOGER，O一般为脯氨酸或羟脯氨酸)发生相互作用。
目前，使用较为广泛的是牛或猪来源的胶原，而这些天然胶原蛋白的水溶性差，存在动物病毒隐患，并且性质比较复杂，并且分子量不均一，加工难度大等问题都限制了其应用于医疗器械等领域。所以，通过合成生物学技术，以基因工程为手段建立微生物表达系统来制备重组全长人源胶原蛋白或者理性设计的合成人源胶原蛋白，可以解决以上动物源性胶原蛋白应用的问题。
然而，重组人源胶原蛋白存在功能活性差、规模化生产难、制备周期长以及异源的胶原蛋白用于人体易引发免疫反应等系列问题。
毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。与其它真核表达系统也更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。并且毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
发明内容
本发明选择I型胶原蛋白中心结构中特定氨基酸序列(例如GFPGER)作为核心功能结构，设计GFPGER多倍体的合成人源化I型胶原多肽序列，以毕赤酵母作为生物合成宿主进行制备。该蛋白序列与细胞受体β1整合素有更好的结合能力，促进细胞粘附、迁移、增殖和基质重塑等功能的效果更佳。
本发明首先提供了一种合成I型人源化胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该序列为I型胶原α1链蛋白的氨基酸674-736的9次GFPGER重复体，总氨基酸为567个。本发明合成I型人源化胶原蛋白的序列含有9个GFPGER结构，使其与细胞整合素受体的结合能力提升。本发明合成I型人源化胶原蛋白表达产物的理论等电点(PI)为10.47，与天然人I型胶原PI更为接近，亲水性更好，具备较高的人体细胞相容性。
本发明又提供了编码所述合成I型人源化胶原蛋白的基因。优选的，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该序列由对编码上述合成I型人源化胶原蛋白的基因序列进行密码子优化所得，密码子优化根据毕赤酵母密码子偏好性优化。
本发明又提供了一种重组表达载体，包含所述基因。优选的，将合成的基因序列通过EcoR I/Not I 2个酶切后连接构建至质粒pPIC9K获得重组表达载体。pPIC9K质粒具有α因子分泌表达信号序列(α-factor secretion signal)，能够使用酵母做分泌表达。
本发明又提供了一种重组表达细胞，包括宿主细胞和导入宿主细胞中的所述重组表达载体。优选的，宿主细胞为毕赤酵母。
将重组表达质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并利用组氨酸缺陷型培养基筛选转化菌株、再利用G418抗性筛选出多拷贝转化菌株，获得能表达合成人源化I型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌。
优选的，所述重组表达细胞分类命名为Komagataella pastoris，株号PC1a1T201，保藏号为GDMCC No：63820。
将毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基获得足量菌体，转接至BMMY培养基进行甲醇诱导表达，每24小时补加甲醇至0.5％。
本发明又提供了一种合成I型人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：将所述重组表达细胞进行发酵培养，然后分离纯化获得所述合成I型人源化胶原蛋白。
如果使用质粒pPIC9K获得重组表达载体，则可以进行分泌表达，目标产物蛋白分泌表达在发酵液上清中。收集发酵液上清后，采用硫酸铵盐析沉淀上清蛋白组分，并通过超滤进行脱盐及去除小分子杂质。采用CM阳离子柱进行精纯，高浓度的盐离子洗脱下获得合成人源化I型胶原蛋白高纯度样品。
本发明又提供了所述合成I型人源化胶原蛋白在制备化妆品、保健品、食品添加剂、医疗器械或者药物中的应用。
本发明又提供了一种包含所述合成I型人源化胶原蛋白的产品，所述产品为以下一种：
(1)合成I型人源化胶原蛋白复配型凝胶敷料：分为A、B两部分，其中A部分为无菌冻干所述合成I型人源化胶原蛋白，含量为2-8mg；
B部分按质量百分比计成分为：透明质酸钠0.05％-0.5％、卡波姆0.1％-2％、丙二醇0.5％-5％、甘油0.5％-5％、羟苯甲酯0.03％-0.1％、羟苯丙酯0.02％-0.05％，余量为纯化水，
使用时将A、B两部分混匀并使用；
(2)合成I型人源化胶原蛋白贴敷料：包含合成I型人源化胶原蛋白、增稠剂、保湿剂及基材，合成I型人源化胶原蛋白0.5-5mg/ml，其余成分按质量百分比计包括：增稠剂及保湿剂为甘油1％-10％，HEC100 0.1％-5％，聚乙二醇400 1％-8％，甜菜碱0.1％-2％，PEG-40氢化蓖麻油0.1％-2％，羟苯甲酯0.03％-0.1％、羟苯丙酯0.02％-0.05％，余量为纯化水；基材为无纺布或经交联处理过的动物胶原基质膜；
(3)合成I型人源化胶原蛋白液体敷料：包含合成I型人源化胶原蛋白0.5-5mg/ml，其余成分按质量百分比计包括：小分子透明质酸钠0.05％-0.5％，甘油1％-10％，卡波姆0.1％-2％，余量为纯化水。
本发明为一种合成人源化I型胶原蛋白的方法及其运用。本发明的合成人源化I型胶原蛋白为人I型胶原α1链蛋白的氨基酸674-736肽段的9次重复体，含有9个GFPGER结构，该结构域能与细胞整合素受体结合；通过串联表达来增加单个蛋白分子所含该结构域的数量可以提升胶原蛋白与细胞的亲和力，促进细胞粘附。本发明所合成的胶原蛋白的氨基酸序列含有如SEQNO.1所示的567个氨基酸，基因序列经毕赤酵母偏好的密码子优化，引入重组质粒pPIC9K转化得到毕赤酵母工程菌；经发酵培养，实现合成人源化I型胶原蛋白的诱导表达，再进一步分离与纯化，得到精纯合成人源化I型胶原。所得到的合成人源化I型胶原蛋白可用于制备敷料、修复原液等医疗产品。
附图说明
图1是合成人源I型胶原蛋白C1a1T2表达的质粒图谱。
图2是电转毕赤酵母转化子在MD平板生长的菌落图。
图3是重组毕赤酵母菌落基因组PCR。
图4是C1a1T2蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图谱。
图5是C1a1T2蛋白细胞增殖、细胞粘附实验结果。
具体实施方式
实施例1：合成人源I型胶原蛋白C1a1T2的制备
1、C1a1T2表达质粒构建
本实施例中设计人源I型胶原蛋白C1a1T2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长513aa。核苷酸序列的密码子优化及化学合成委托南京金斯瑞完成，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；并委托南京金斯瑞完成重组质粒构建：将合成后的基因片段通过EcoR I(Takara公司货号：1611)和Not I(Takara公司货号：1623)的酶切位点插入pPIC9K载体的EcoR I/Not I位点之间，得到重组质粒pPIC9K-C1a1T2，质粒图谱如图1所示。
将重组质粒pPIC9K-C1a1T2转化大肠杆菌感受态细胞(北京天根生化科技)涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，培养24小时；通过菌落PCR筛选并验证含有重组质粒pPIC9K-C1a1T2的阳性菌落。PCR引物如下：
R1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCCTCT-3’，
F1：5’-CGACTGGTTCCAATTGACAAGCT-3’。
实验所有引物合成及测序均委托上海生工完成。目的条带大小为2187bp。阳性菌落的PCR产物测序结果经比对与理论序列完全一致。
将含有重组质粒pPIC9K-C1a1T2的大肠杆菌进行培养，提取质粒10μg并使用SaII酶切线性化，酶切反应条件为37℃消化3h，冻干浓缩待用。
2、毕赤酵母GS115电转化
电击杯经无水乙醇灭菌热处理，进行冰浴。将10μg上述步骤所得线性化质粒与80μL GS115毕赤酵母感受态混合，混合液转移至直径0.2cm的电击杯中，冰浴5min后进行电击：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～6msec(毫秒)。电击结束后，取900μL预冷的1M山梨醇溶液进行混合，轻轻吹匀后转移至2mL EP管中，30℃静置培养2h。700g低俗离心收集菌体，全部涂布于MD平板上，30℃恒温培养3-4天，收集并验证平板生长的转化子菌落(图2)。
3、重组毕赤酵母菌株鉴定
挑取MD平板上的单菌落接种到装有0.5mL YPD液体培养基的24孔板中，30℃，220rpm培养过夜。提取酵母基因组DNA，通过引物F1和R1进行PCR验证，预期条带大小为2180bp；阳性克隆的PCR产物电泳结果如图3所示，测序结果经比对与理论序列完全一致，获得鉴定正确的阳性菌株，命名为PC1a1T201。
将阳性菌-巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris PC1a1T201保藏于广东省微生物菌种保藏中心，重组表达细胞分类命名为Komagataella pastoris，株号PC1a1T201，时间2023年9月19日(保藏中心地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮政编码：510070，保藏编号为GDMCC No：63820)。
4、蛋白表达
将鉴定阳性的菌株PC1a1T201接种到25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养过夜；取对数生长期(约16小时，OD600＝4-6)菌液进行离心，室温4000rpm收集菌体；去上清后，用BMMY培养基重悬细胞至OD＝1并进行诱导表达(培养基总体积100mL)，每24h补加甲醇至终浓度0.5％(体积比)继续诱导，收集72小时表达上清。
5、表达产物收集与纯化
将发酵液在室温3000g进行离心，收集上清液；经0.45μm滤膜过滤后加入硫酸铵至60％饱和度，搅拌15min，4℃离心15min收集沉淀。使用纯化水复溶至沉淀前体积。使用10kDa滤膜进行截留浓缩，并使用10mM的PBS pH 7.4进行换液，至最终溶液电导<5ms/cm。
阳离子交换填料(博格隆，Diamond SP Mustang，货号AI0192)层析进行分离纯化：
(1)平衡：10mM PBS，pH 7.4±0.1；使用3倍柱体积清洗并排出废液；
(2)上样：离心后收集发酵液上清加入层析柱中，依靠重力流经柱体树脂；
(3)洗涤：10mM PBS，pH 7.4±0.1；使用5倍柱体积进行洗涤；
(4)洗脱：1M NaCl，pH 7.4±0.1；使用3倍柱体积进行洗脱；
(5)冲洗：10mM PBS，1.5M NaCl，pH 7.4±0.2；使用5倍柱体积冲洗；
(6)CIP清洗：500mM NaOH；使用5倍柱体积冲洗。
6、蛋白鉴定分析
收集含有合成人源I型胶原蛋白C1a1T2的洗脱液，并进行SDS-PAGE。结果如图4所示：纯化得到的合成人源I型胶原蛋白为单体，表观分子量为56kDa接近其理论分子量。纯化回收率达到90％，纯度达到89％。
实施例2：合成人源I型胶原蛋白C1a1T201的生物活性分析
本实施例胶原蛋白的生物活性分析方法参考文献(陈晖娟,刘玲蓉,王静洁,等.胶原模拟多肽对L929细胞粘附的影响[J].功能材料,2012,43(10):1352-1356.)。
细胞增殖实验的具体实施方法如下：
制备胶原浓度为1.0mg/ml和0.5mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml，pH为2-3的4组溶液作为试验组，对照组中加PBS溶液，分别加入96孔板中，每孔加入100μL溶液，每个样品包被制备3个孔，在5％ CO2培养箱中37℃孵育2h，取出后吸走多余包被液，置于2-8℃冷藏过夜。
L929细胞消化，计数后用生长培养基稀释为细胞悬浮液，按照2000细胞/孔的密度种于96孔板(每孔100μL)，此时记为0h，在5％ CO2培养箱中37℃孵育培养11h。培养结束后，每孔加入10μL CCK-8溶液，再放入培养箱孵育1h后，于450nm处测定吸光度。比较试验组和对照组之间的吸光度OD值是否有显著性差异。结果如表1所示。
表1
细胞粘附实验的具体实施方法如下：
包被：制备胶原浓度为2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml和0.1mg/ml，pH为2-3的4组溶液作为试验组，对照组中加PBS溶液，分别加入96孔板中，每孔加入100μl溶液，每个样品包被制备3个孔，在5％ CO2培养箱中37℃孵育2h。
清洗：除去孔中多余的包被溶液，加入PBS溶液清洗2次。
计数：细胞于培养基中重悬计数，至终浓度为2×105个/ml。
检测：吸取上述细胞悬液，添加至3.1.1中的每个孔中，每孔100μl，于5％ CO2培养箱中37℃孵育4h后弃去培养基，用PBS轻轻漂洗3次吸弃洗去未粘附的细胞，后加入新鲜培养基，培养2h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，再放入培养箱孵育1h后，于450nm处测定吸光度。
细胞粘附数量及形态观察：(1)L929刚接种至三种样品的孔板中培养时，在光镜下放大100倍进行观察；(2)孵育4h后，在光镜下放大100倍观察，观察和比较不同时期细胞形态变化以及粘附细胞的数量。
改变包被条件：
制备胶原浓度为0.025mg/ml和0.1mg/ml，pH为2-3的2组溶液作为试验组，对照组中加PBS溶液，分别加入96孔板中，96孔板的孔面积是0.32cm2，按照表面积比为5μg/cm2，因此最低包被量为1.6μg/孔，每个孔加入64μl，每个浓度制备3个孔，每个浓度对应的胶原蛋白包被量分别是6.4μg/孔和1.6μg/孔，PBS做对照组，在5％ CO2培养箱中37℃孵育2h。
细胞染色镜检结果如图5所示，其中，图5(a)显示PBS包被下细胞粘附数量较少，形态圆润，细胞伪足数量很少。图5(b)显示商业化I型胶原蛋白包被下，部分贴壁细胞出现，细胞伸出伪足，出现“拉网”现象，邻近细胞相互接触，细胞形态伸展。图5(c)显示0.5mg/mL胶原蛋白C1a1T201包被下，贴壁细胞数量更多，细胞形态伸展、伸出伪足，“拉网”现象及邻近细胞相互接触程度比商业化I型胶原蛋白更好，说明胶原蛋白C1a1T201可以有效地促进细胞粘附。
细胞粘附率计算结果如表2所示。
表2
结果标明相较于9倍体合成I型胶原蛋白对细胞粘附的促进作用(粘附率55.80％)好于单倍GFPGER结构域的全长I型胶原蛋白(粘附率44.10％)。
实施例3：制备合成I型人源化胶原蛋白复配型凝胶敷料
将本发明重组表达制备的胶原蛋白C1a1T201制备合成I型人源化胶原蛋白复配型凝胶敷料，组成分为A、B两部分：
A瓶组分：2-8mg冻干合成I型人源化胶原蛋白微纤维(胶原蛋白PC1a1T201)；
B瓶组分(质量比)：透明质酸钠0.05％-0.5％、卡波姆0.1％-2％、丙二醇0.5％-5％、甘油0.5％-5％、羟苯甲酯0.03％-0.1％、羟苯丙酯0.02％-0.05％。
制备方法如下：
(1)精确称取卡波姆、透明质酸钠、甘油、丙二醇、羟苯甲酯和羟苯丙酯，搅拌1h，加入纯化水，充分溶解。
(2)精确称取冻干合成I型人源化胶原蛋白微纤维。
(3)无菌条件下灌装，密封包装，辐照灭菌后即为合成I型人源化胶原蛋白复配型凝胶敷料产品。
使用方式：A、B瓶可以无菌快接混匀，并使用。
实施例4：制备合成I型人源化胶原蛋白贴敷料
将本发明重组表达制备的胶原蛋白C1a1T201制备合成I型人源化胶原蛋白贴敷料，配方如表3所示，方法如下：
(1)将增稠剂(羟乙基纤维素，HEC100)预先分散入水中，再加入A相中其余物质，75℃加热搅拌使其完全溶解。
(2)降温至40℃左右加入B相，搅拌至均匀透明状，即得精华液。
表3
选用胶原基质膜，厚度1mm，折叠后放入铝塑袋，每袋加入20-25ml精华液，密封处理，辐照灭菌后即为合成I型人源化胶原蛋白贴敷料产品。
使用方式：洁面后轻轻敷于脸上，用指腹轻轻压掉空气，并配合按摩手法让面膜的精华液充分吸收15-20min。
实施例5：制备合成I型人源化胶原蛋白液体敷料
将本发明重组表达制备的胶原蛋白C1a1T201制备合成I型人源化胶原蛋白液体敷料，其中液体敷料含有合成I型人源化胶原蛋白0.5-5mg/ml(按所含精华液计算)，其余成分按质量百分比计：小分子透明质酸钠0.05％-0.5％，甘油1％-10％，卡波姆0.1％-2％，其余为纯化水。
制备方法如下：
(1)精确称取卡波姆、透明质酸钠、甘油，搅拌1h，充分溶解。
(2)精确称取冻干合成I型人源化胶原蛋白微纤维，加入纯化水，充分溶解。
(3)混匀后在无菌条件下灌装，密封包装，辐照灭菌后即为合成I型人源化胶原蛋白液体敷料产品。
使用方式：洁面后均匀涂抹在脸部，可轻轻揉搓或拍打至完全吸收。
Claims (10)
1.一种合成I型人源化胶原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.编码权利要求1所述合成I型人源化胶原蛋白的基因。
3.权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2或3所述基因。
5.一种重组表达细胞，其特征在于，包括宿主细胞和导入宿主细胞中的权利要求4所述重组表达载体。
6.根据权利要求5所述重组表达细胞，其特征在于，宿主细胞为毕赤酵母。
7.根据权利要求6所述重组表达细胞，其特征在于，所述重组表达细胞分类命名为Komagataella pastoris，株号PC1a1T201，保藏号为GDMCC No：63820。
8.一种合成I型人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4～6中任一所述重组表达细胞进行发酵培养，然后分离纯化获得所述合成I型人源化胶原蛋白。
9.权利要求1所述合成I型人源化胶原蛋白在制备化妆品、保健品、食品添加剂、医疗器械或者药物中的应用。
10.一种包含权利要求1所述合成I型人源化胶原蛋白的产品，其特征在于，所述产品为以下一种：
(1)合成I型人源化胶原蛋白复配型凝胶敷料：分为A、B两部分，其中A部分为无菌冻干所述合成I型人源化胶原蛋白，含量为2-8mg；
B部分按质量百分比计成分为：透明质酸钠0.05％-0.5％、卡波姆0.1％-2％、丙二醇0.5％-5％、甘油0.5％-5％、羟苯甲酯0.03％-0.1％、羟苯丙酯0.02％-0.05％，余量为纯化水，
使用时将A、B两部分混匀并使用；
(2)合成I型人源化胶原蛋白贴敷料：包含合成I型人源化胶原蛋白、增稠剂、保湿剂及基材，合成I型人源化胶原蛋白0.5-5mg/ml，其余成分按质量百分比计包括：增稠剂及保湿剂为甘油1％-10％，HEC100 0.1％-5％，聚乙二醇400 1％-8％，甜菜碱0.1％-2％，PEG-40氢化蓖麻油0.1％-2％，羟苯甲酯0.03％-0.1％、羟苯丙酯0.02％-0.05％，余量为纯化水；基材为无纺布或经交联处理过的动物胶原基质膜；
(3)合成I型人源化胶原蛋白液体敷料：包含合成I型人源化胶原蛋白0.5-5mg/ml，其余成分按质量百分比计包括：小分子透明质酸钠0.05％-0.5％，甘油1％-10％，卡波姆0.1％-2％，余量为纯化水。
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