CN116640206A - 一种重组人源化ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一种重组人源化Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明经筛选活性高、稳定性高、水溶性好的序列拼接成一段全新的人源化Ⅲ型胶原蛋白序列，其核苷酸序列经毕赤酵母密码子偏好性优化，并通过多位点整合质粒介导的重组菌构建方法，构建了一株高产重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的工程酵母菌株，该菌株较优化前发酵上清液目标蛋白的浓度提高了2倍。上述技术方案制备得到的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白与市售的胶原蛋白产品相比，其抗氧化及促细胞迁移等生物活性效果更好，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一种重组人源化Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白，占体内蛋白质含量的25%～35%，是人体细胞骨架和细胞质基质的主要组成部分。Ⅲ型胶原蛋白是一种成纤维胶原蛋白，它由3条α1(Ⅲ)肽链组成。III型胶原蛋白是血管、子宫和肠等中空器官的主要结构蛋白，它还经常与Ⅰ型胶原蛋白共生，广泛存在于皮肤、筋膜、肌腱等组织中。III型胶原蛋白为许多器官提供抗张强度和结构完整性，并参与调控细胞的黏附、增殖、迁移、分化等基本活动。III型胶原蛋白在伤口愈合、组织修复等过程中发挥关键作用，它被作为一种主要功能成分，被广泛应用于皮肤修复敷料中。
III型胶原蛋白因为与其他类型胶原蛋白共生，含量较低，因此，从动物组织提取III胶原蛋白存在难度大、纯度低、成本高等严峻问题。生物合成法利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。动物、植物等表达体系成本高、周期长，难以满足产业化需求，相比之下，微生物发酵生产重组胶原蛋白成本低、周期短、培养较容易，更易于商业化生产。但是细菌表达系统容易造成热原残余，致使表达产物不纯，难以应用于临床，而且目的蛋白通常以包涵体形式表达，产物纯化过程复杂，另外原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点影响产品的品质。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组人源化Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用。经试验证明，本发明生产的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白其具有更佳的抗氧化及促细胞迁移等生物活性，且非常适合进行工业化大规模生产。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种重组人源化Ⅲ型胶原蛋白，所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白：
a1）如SEQ ID NO.1所示；或，
a2）与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性。
本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子能够编码上述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
本发明的第三个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四个方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的重组表达载体或染色体整合有本发明第二方面所述的核酸分子或者能够表达本发明第一方面所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
本发明的第五个方面，提供一种制备本发明第一方面所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的方法，包括：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白；和分离纯化所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
本发明的第六个方面，提供上述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白在制备食品、药品或日化用品中的应用。
本发明的第七个方面，提供一种化妆品，所述化妆品至少包含上述第一方面所述的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案经筛选活性高、稳定性高、水溶性好的序列拼接成一段全新的人源化Ⅲ型胶原蛋白序列，其核苷酸序列经毕赤酵母密码子偏好性优化，并通过多位点整合质粒介导的重组菌构建方法，构建了一株高产重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的工程酵母菌株，该菌株较优化前发酵上清液目标蛋白的浓度提高了2倍。上述技术方案制备得到的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白与市售的胶原蛋白产品相比，其抗氧化及促细胞迁移等生物活性效果更好，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例2中筛选含高拷贝重组人源Ⅲ型胶原蛋白基因的工程酵母平板；其中，A为重组转化子P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt经遗传霉素G418筛选图，B为重组转化子P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt经博来霉素Zeocin筛选图。
图2为本发明实施例3中重组人源Ⅲ型胶原蛋白发酵上清液SDS-PAGE蛋白电泳及Western Blot结果图；其中，A为SDS-PAGE蛋白电泳图，图中泳道M代表分子量为180 kDa的标准蛋白；泳道1代表对照菌P .pastorisGS115/pPIC9K发酵上清液；泳道2代表重组菌P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt发酵上清液；B为Western Blot结果图。
图3为本发明实施例5中摇瓶发酵培养上清液中重组人源Ⅲ型胶原蛋白表达水平的电泳验证图。其中，泳道M代表分子量为180 kDa的标准蛋白；泳道1代表重组菌P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt发酵上清液；泳道2代表组合菌株P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt以甲醇为碳源发酵上清液；泳道3代表组合菌株P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt以甘油为碳源发酵上清液。
图4为本发明实施例6中样品DPPH自由基清除率的数据图。
图5为本发明实施例7中重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的促细胞迁移活性结果图；其中，A为不含重组胶原蛋白细胞培养液的空白对照组给药前细胞迁移图；B为不含重组胶原蛋白细胞培养液的空白对照组给药后细胞迁移图；C为含有1 mg/mL样品col细胞培养液的样品组给药前细胞迁移图；D为含有1 mg/mL样品col细胞培养液的样品组给药后细胞迁移图；E为含有1 mg/mL市售重组胶原蛋白的细胞培养液处理组给药前细胞迁移图；F为含有1mg/mL市售重组胶原蛋白的细胞培养液处理组给药后细胞迁移图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种重组人源化Ⅲ型胶原蛋白，所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白：
a1）如SEQ ID NO.1所示；或，
a2）与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种核酸分子，所述核酸分子能够编码上述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
具体的，所述核酸分子：
b1）如SEQ ID NO.2所示；或，
b2）与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％以上的序列同源性。
需要说明的是，术语“同源”主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个蛋白质或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。蛋白质和DNA的同源性常常通过它们序列的相似性来判定，相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述核酸分子。
根据本发明，所述重组表达载体通过上述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体。本发明的又一具体实施方式中，所述表达载体为质粒，具体可以为pPIC系列中的任意质粒载体或pGAPZα系列中的任意质粒载体，更具体的，所述表达载体为pPIC9K或pGAPZαA质粒。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述重组表达载体或染色体整合有所述核酸分子或者能够表达所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。
本发明的又一具体实施方式中，所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞；
其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任一种；
本发明的又一具体实施方式中，所述细菌细胞为大肠杆菌（如大肠杆菌BL21）、根癌农杆菌（如GV3101）、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌。
所述真菌细胞包括酵母菌。
进一步的，所述酵母菌为巴斯德毕赤酵母（如毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168）。本发明通过优选采用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，其兼具原核生物和真核生物的部分特性，表达调控机制清晰，培养成本低，菌体密度高，蛋白表达潜力高，能够稳定遗传，不会产生内毒素，分泌性型表达，利于下游纯化，具有翻译后修饰功能，能够更好的支撑胶原蛋白的生理活性；其生产的重组III型胶原蛋白的氨基酸组成与天然胶原蛋白α1链一致，应用于人体不会产生免疫排斥，且非常有利于工业化大规模生产。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种制备所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的方法，包括：培养所述宿主细胞，从而表达出所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白；和分离纯化所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
其中，培养所述宿主细胞时可采用BMGYP培养基，同时，本发明经试验证明，宿主细胞既可以以甲醇为碳源，也可以以甘油为碳源生产重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白在制备食品、药品或日化用品中的应用。
需要说明的是，在本发明中，所使用的术语“食品”应做广义的理解，其可以理解为可以使任何可以被食用的形式，因此所述食品包括普通食品和特殊食品，所述特殊食品包括保健食品和特殊医学用途配方食品；而普通食品时相对于特殊食品而言的，是适合所有人的食品。
所述食品包括但不限于固体食品、液体食品；所述固体食品包括但不限于烘焙食品、糖果、固体饮料等；所述液体食品包括但不限于液体饮料等。
所述药品可以单位剂量形式给药，液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型等。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、乳剂、颗粒剂等。
本发明的药品中还可以含有常用的载体，这里的可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质等。载体在药品中的含量可以是1％重量-98％重量，通常大约是占到80％重量。
在本发明中，所述药品还可以是药械组合产品，所述药械组合产品系指由药品与医疗器械共同组成，并作为一个单一实体生产的产品。所述药械组合产品的一个具体实施方式可以为含有上述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的外用敷料。
所述日化用品可以为个人卫生清洁剂和化妆品等，具体如牙膏、漱口水、消毒剂、洗发水、发乳、发胶、沐浴露、肥皂、洗面奶、面膜、面霜、防晒霜等。经试验证明，上述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白具有优异的抗氧化及促细胞迁移功效，因此特别适合作为化妆品（尤其是护肤品）成分进行使用。
因此，本发明的第七个方面，提供一种化妆品，所述化妆品至少包含上述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
进一步的，所述化妆品具体为护肤品。
当然，所述化妆品还可以包含任意化妆品领域允许添加的其他原料成分，包括但不限于乳化剂、润肤剂、保湿剂和增稠剂等。本领域技术人员可根据实际情况进行选择添加，在此不做具体限定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1 重组III型胶原蛋白的序列选择
利用NCBI网站获取天然人III型胶原蛋白α1链蛋白氨基酸序列（序列号NP_000081），依据天然胶原蛋白为不溶性性纤维蛋白且氨基酸序列高度重复的特点，经软件分析，筛选出6段活性高、稳定性高、水溶性好的氨基酸序列，拼接成为一段447个氨基酸的全新胶原蛋白序列col，其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示，该序列与人Ⅲ型胶原蛋白序列100%同源，免疫原性低。
实施例2 含人源化Ⅲ型胶原蛋白基因（colopt）表达系统的构建
根据毕赤酵母密码子偏好性对人源化Ⅲ型胶原蛋白进行序列优化，优化后的人源化Ⅲ型胶原蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括EcoR I酶切位点、Not I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。密码子优化的人源化Ⅲ型胶原蛋白核苷酸序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组表达载体pPIC9K-colopt。经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pPIC9K-colopt经SalI快切酶线性化后电转入P .pastorisGS115表达宿主细胞中，重组转化子经遗传霉素G418筛选（图1A）获得高拷贝重组毕赤酵母P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt。
实施例3 重组人源化Ⅲ型胶原蛋白工程酵母菌株摇瓶发酵
对获得的重组工程菌P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt进行摇瓶发酵培养。
发酵步骤如下：挑取单克隆接种于40 mL的YPD培养基(酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200 rpm培养24 h。按10％的接种量转接于40 mL的初始表达培养基BMGY(酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸铵10 g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10 g/L)中，30℃，200 rpm培养24 h。离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体后更换至40 mL诱导表达培养基BMMY（酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸铵10 g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇10 mL/L），30℃、200 rpm培养，每隔24 h向培养基中添加纯甲醇至终浓度为1.0％(v/v)，诱导表达96 h。
重组工程菌发酵上清液与对照菌发酵上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，电泳分析结果如图2A所示。在理论蛋白分子量51 kDa附近，重组工程菌P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt发酵上清液(泳道2)多出一条蛋白条带，进一步通过Western Blot检测，检测结果如图2B所示，确定了该位置条带为重组工程菌表达的人源化Ⅲ型胶原蛋白。
实施例4 高产重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的工程酵母菌株的构建
采用多位点整合质粒介导的方式提高重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的产量，构建双启动子表达的组合菌株。
对重组载体pPIC9K-colopt进行EcoRI和NotI双酶切，克隆至经相同酶切处理的线性表达载体pGAPZαA上，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框不移码的前提下获得重组表达质粒pGAPZαA-colopt，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒pGAPZαA-colopt经限制性内切酶AvrII线性化后电转入P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt细胞中，重组转化子经博来霉素Zeocin筛选（图1B）得到高拷贝人源化Ⅲ型胶原蛋白基因的组合菌株P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt。
实施例5 高产重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的工程酵母菌株的摇瓶发酵
对获得的组合菌株P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt按照实施例3的方法进行摇瓶发酵培养。组合菌株发酵上清液（泳道2）与对照菌P .pastorisGS115/pPIC9K-colopt发酵上清液（泳道1）进行SDS-PAGE蛋白电泳（图3）分析，泳道2的条带大小明显要大于泳道1，经BioAnaly生物分析软件得，组合菌株的蛋白表达量相比单启动子的重组菌株提高了2倍。
纯甘油培养发酵步骤如下：挑取单克隆接种于40 mL的YPD培养基，30℃、200 rpm培养24 h。按10％的接种量转接于40 mL的表达培养基BMGYP(酵母提取物10 g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸铵10 g/L，生物素4×10-4g/L，甘油40g/L)中，30℃，200 rpm培养96 h。
纯甘油培养组合菌株发酵上清液SDS-PAGE结果如图3泳道3所示，在理论分子量51kDa左右有一条明显的蛋白条带，说明了该组合菌株既可以以甲醇为碳源，也可以以甘油为碳源生产重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
实施例6 重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的抗氧化实验
取适量重组人源Ⅲ型胶原蛋白置于试管中，加入2.5 mL溶于95%乙醇的DPPH自由基溶液（0.1 mmoL/L），将混合物激烈振荡10 s，然后置于室温下反应30 min，反应结束后，于517 nm下测量反应混合物吸光度，以蒸馏水代替样品液做空白对照，以等量市售重组胶原蛋白做对比实验。样品液对DPPH自由基清除活性=（空白对照吸光度-样品吸光度）/空白对照吸光度。
结果如图4所示，样品col与空白对照相比具有明显的DPPH自由基清除能力且其自由基清除率明显高于市售胶原蛋白，故本发明制备的重组人源Ⅲ型胶原蛋白具备较市售胶原蛋白更高的抗氧化功效。
实施例7 重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的促细胞迁移活性实验
试验前使用marker笔在6孔板底部画一条横线，做好标记。收集生长状态良好的HaCaT人永生化角质形成细胞并用细胞培养基制备细胞悬液，调整细胞浓度为1x106个/孔，于6孔细胞培养板中加入2 mL/孔细胞悬液。实验设置空白对照组、样品col组、市售重组胶原蛋白组，每组设3个平行。置于细胞培养箱(5% CO2，37℃)中孵育24 h，细胞融合率达到100%。在显微镜下检查每个板孔，确保各板孔细胞增长相对相等，吸出原培养基，分别加入1mL PBS洗去未贴壁的细胞。用一根200 μL枪头竖着划过细胞形成一条笔直的划痕，划痕与标记相交。吸出PBS，再使用PBS清洗1次，至显微镜下视野清晰。吸出PBS，空白对照组只加2mL细胞培养液，样品组加入含有1 mg/mL样品col的2 mL细胞培养液，市售重组胶原蛋白组加入含有1 mg/mL市售重组胶原蛋白的2 mL细胞培养液。置于细胞培养箱(5% CO2，37℃)中培养24 h后，弃掉培养液，1 mL PBS洗一次，至显微镜下视野清晰。加入1 mL PBS，显微镜拍照。细胞迁移率（%）=（A给药后-A给药前）/A给药前×100，其中A给药后为实验结束时细胞划痕的面积；A给药前为划痕初始面积。
表1 重组胶原蛋白细胞迁移率数据统计表
结果如图5所示，24 h拍摄的细胞迁移实际对比图及表1所示的计算出的细胞相对迁移率比较可知，样品col和市售重组胶原蛋白的细胞迁移率均显著高于对照组，并且样品col的细胞迁移率明显高于市售重组胶原蛋白。细胞迁移活性是有效表征胶原蛋白生物学活性的指标，迁移率越高，速度越快，说明胶原蛋白的生物学活性越佳，故本发明制备的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的生物活性高于市售重组胶原蛋白。
本发明未尽事宜为公知技术。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组人源化Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列：
a1）如SEQ ID NO.1所示；或，
a2）与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
3.如权利要求2所述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列：
b1）如SEQ ID NO.2所示；或，
b2）与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％以上的序列同源性。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2或3所述核酸分子；
所述重组表达载体通过权利要求2或3所述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述重组表达载体或染色体整合有权利要求2或3所述核酸分子或者表达权利要求1所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
6.如权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞；
所述真菌细胞包括酵母菌，所述酵母菌为巴斯德毕赤酵母。
7.一种制备权利要求1所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括：培养权利要求5或6所述宿主细胞，从而表达出所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白；和分离纯化所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。
8.权利要求1所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白在制备食品、药品或日化用品中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述日化用品为个人卫生清洁剂和化妆品。
10.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品至少包含权利要求1所述重组人源化Ⅲ型胶原蛋白；所述化妆品为护肤品。
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