CN117285616B - 一种重组人源化i+iii型胶原蛋白及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组人源化I+III型胶原蛋白，由人源I型胶原蛋白截短体和人源III型胶原蛋白截短体拼接而成，所述人源I型胶原蛋白截短体的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.7中的至少一种，所述人源III型胶原蛋白截短体的氨基酸序列选自SEQ ID No.8～SEQ ID No.32中的至少一种。本发明选用位于人I型和III型胶原蛋白的序列，均为天然人源氨基酸序列，保证了整个序列的稳定性，不会产生免疫排斥反应。而且本发明的重组人源化I+III型胶原蛋白具有促细胞增殖功能，水溶性好，质量稳定，可广泛应用于护肤品、皮肤修复敷料、医学美容、保健食品等领域。

Description

一种重组人源化I+III型胶原蛋白及应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别是一种重组人源化I+III型胶原蛋白及应用。
背景技术
胶原蛋白是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用。人体胶原蛋白占比最多研究最透彻的为I型、II型和III型胶原蛋白。Ⅰ型胶原蛋白是构成正常成人皮肤的主体，主要存在于成人皮肤、肌腱、骨组织，因其良好的支撑性，所以在医疗器械中应用广泛。II型胶原蛋白主要存在于软骨、玻璃体、椎间盘等部位，促进骨愈合，缓解关节疼痛，增强免疫力等。III型胶原蛋白是婴儿皮肤的主要胶原蛋白，用于保持皮肤柔嫩度，使皮肤细腻和富有弹性，创伤后III型胶原蛋白可以更好地让伤口恢复，不容易留疤痕。
胶原蛋白主要由成纤维细胞合成，但成人自身真皮的成纤维细胞只能合成I型胶原，在人成长过程中，Ⅲ型胶原占比下降而Ⅰ型胶原占比不断提升，而随着年龄的增长，I型胶原蛋白自身合成能力逐渐减弱，只能通过直接灌溉在真皮层补充丢失的胶原蛋白。在成人皮肤中Ⅲ型胶原占比不断下降、I型胶原蛋白自身合成能力逐渐减弱的情况下，III型胶原蛋白分布在Ⅰ型胶原蛋白周围，具有促进细胞增生、增加细胞活性、帮助机体修复老化受损皮肤等作用。因此，Ⅰ型胶原蛋白和III型胶原蛋白联合使用具有重要的意义。
目前工业上制备胶原蛋白的方法主要为传统提取法，即利用动物组织如猪皮、牛皮、驴皮等进行酸、碱、盐、酶处理来获取胶原蛋白，虽然该种方法操作简单、回收率高，但得到的胶原蛋白为水不溶性胶原蛋白，可加工性弱，提取过程中会造成胶原蛋白的部分活性丧失，且提取的产品还存在携带动物源病毒的风险隐患，应用于人体会产生免疫排斥反应，这极大地限制了其在生物医学领域的应用范围。
基因工程手段生产重组胶原蛋白是一种安全可控、质量稳定、低排异反应的生产方法。人源胶原蛋白全长超1400个氨基酸，表达全长的胶原蛋白的会存在一定困难。并且现有发明中大量的案例均是单一的重组人源化I型胶原蛋白或者重组人源化III型胶原蛋白，重组人源化I+III型胶原蛋白的研究比较少见。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种重组人源化I+III型胶原蛋白及应用。
本发明所采取的技术方案是：
第一个方面，本发明提供一种重组人源化I+III型胶原蛋白，由人源I型胶原蛋白截短体和人源III型胶原蛋白截短体拼接而成，所述人源I型胶原蛋白截短体的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.7中的至少一种，所述人源III型胶原蛋白截短体的氨基酸序列选自SEQ ID No.8～SEQ ID No.32中的至少一种。
在一些实例中，所述重组人源化I+III型胶原蛋白的结构构型选自I+III类型、III+I类型、III+I+III类型、I+III+I类型中的任意一种。
在一些实例中，所述人源III型胶原蛋白截短体的氨基酸序列选自SEQ ID No.15～SEQ ID No.32中的至少一种。
在一些实例中，所述重组人源化I+III型胶原蛋白的结构为III+I+III类型。
第二个方面，本发明提供一种基因，其编码第一个方面所述的重组人源化I+III型胶原蛋白。
第三个方面，本发明提供一种载体，其含有第二个方面所述的基因。
在一些实例中，所述载体选自pIC9k、pICZα、pESC系列酵母表达载体中的任意一种。
第四个方面，本发明提供一种宿主细胞，可表达第一个方面所述的重组人源化I+III型胶原蛋白。
第五个方面，一种修复肌肤的护肤品，包含第一个方面所述的重组人源化I+III型胶原蛋白。
在一些实例中，所述护肤品中重组人源化I+III型胶原蛋白的浓度为0.1～0.8g/L。
本发明的有益效果是：
本发明选用位于人I型和III型胶原蛋白的序列，均为天然人源氨基酸序列，保证了整个序列的稳定性，不会产生免疫排斥反应。而且本发明的重组人源化I+III型胶原蛋白具有促细胞增殖功能，水溶性好，质量稳定，可广泛应用于护肤品、皮肤修复敷料、医学美容、保健食品等领域。
附图说明
图1为pX1载体谱图。
图2为pX2载体谱图。
图3为pX3载体谱图。
图4为ZTX1(a图)、ZTX2(b图)发酵液上清SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
以下实施例中试剂均为分析纯试剂，分子克隆相关酶试剂购于New EnglandBiolabs公司，大肠杆菌菌株为本实验室保存，基因合成、引物合成和基因测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例中未详细描述的分子克隆实验步骤均参考《分子克隆实验指南(第四版)》(M.R.格林、J.萨姆布鲁克主编，贺福初主译，北京：科学出版社，2017)。
本发明实施例中提供一种重组人源化I+III型胶原蛋白，由人源I型胶原蛋白截短体和人源III型胶原蛋白截短体拼接而成，所述人源I型胶原蛋白截短体的氨基酸序列选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.7中的至少一种，所述人源III型胶原蛋白截短体的氨基酸序列选自SEQ ID No.8～SEQ ID No.32中的至少一种。截断体的具体序列如下表1所示。
表1
I型胶原蛋白和III型胶原蛋白外显子编码区多为编码15、18、33、36个氨基酸的序列。I型胶原蛋白通常以15/18和33/36个氨基酸数目交替出现(SEQ ID No.1～SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4～SEQ ID No.7)；III型胶原蛋白有以编码18个氨基酸数目的外显子连续排(SEQ ID No.8～SEQ ID No.14)，也有以15/18和33/36个氨基酸数目交替出现，在本发明中更偏向截选33/36个氨基酸数目的外显子(SEQ ID No.15～SEQ ID No.32)，这样编码的有益处是更能完整的保留胶原蛋白的功能区域。
实施例1
在本实施例中，选取III型胶原蛋白中的SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14，I型胶原蛋白中的SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7，III型胶原蛋白中的SEQ ID No.25、SEQID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31这些序列，按照先后顺序拼接形成新型III+I+III型胶原蛋白序列，在序列的C端插入6*HIS标签以便后续纯化，得到的新型III+I+III型胶原蛋白序列的氨基酸编码序列为SEQ ID No.33。
根据毕赤酵母密码子偏好性优化编码基因序列，其编码基因见SEQ ID No.34，由苏州金唯智生物科技有限公司负责进行合成。在编码基因两端分别插入EcoRI/NotI限制酶识别位点。
实施例2
在本实施例中，选取III型胶原蛋白中的SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14，I型胶原蛋白中的SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3，III型胶原蛋白中的SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25这些序列，按照先后顺序拼接形成新型III+I+III型胶原蛋白序列，在序列的C端插入6*HIS标签以便后续纯化，得到的新型III+I+III型胶原蛋白序列的氨基酸编码序列为SEQ ID No.35。
根据毕赤酵母密码子偏好性优化编码基因序列，其编码基因见SEQ ID No.36，由苏州金唯智生物科技有限公司负责进行合成。在编码基因两端分别插入EcoRI/NotI限制酶识别位点。
实施例3
在本实施例中，选取I型胶原蛋白中的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3，III型胶原蛋白中的SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14，I型胶原蛋白中的SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7这些序列，按照先后顺序拼接形成新型I+III+I型胶原蛋白序列，在序列的C端插入6*HIS标签以便后续纯化，得到的新型I+III+I型胶原蛋白序列的氨基酸编码序列为SEQ ID No.37。
根据毕赤酵母密码子偏好性优化编码基因序列，其编码基因见SEQ ID No.38，由苏州金唯智生物科技有限公司负责进行合成。在编码基因两端分别插入EcoRI/NotI限制酶识别位点。
重组人源化I+III型胶原蛋白毕赤酵母表达载体构建
将表达载体pIC9k用NotI/EcoRI双酶切，酶切反应体系为30μg质粒(85μL)、3μLNotI、3μLEcoRI、10μL 10*cutsmart，在37度酶切1.5h后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中载体的约9kb条带从凝胶中切出，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
将实施例的合成基因载体用NotI/EcoRI双酶切，酶切反应体系为30μg质粒(80μL)、3μLNotI、3μLEcoRI、10μL 10*cutsmart，在37度酶切1.5h后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中载体的约1.6kb条带从凝胶中切出，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
按照NotI/EcoRI双酶切后的载体pIC9k 50ng、NotI/EcoRI双酶切后的外源片段150ng、2*无缝克隆试剂盒5μL的体系将载体与外源片段连接，得到重组表达载体并命名为pX1(对应实施例1)、pX2(对应实施例2)、pX3(对应实施例3)，重组表达载体图谱见图1和图2和图3。
挑取5个载体用通用引物5’AOX和3’AOX做pcr验证，并将验证正确的载体用引物5’AOX和3’AOX进行测序分析以确保外源序列无突变。
将测序正确的表达载体pX1、pX2、pX3线性化，酶切体系为30μg质粒(83μL)、3μLSalI、9.5μL 10*cutsmart，在37度酶切1.5h后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，约11kb条带从凝胶中切出，使用凝胶提取试剂盒进行回收，获得线性片段pX1-SalI、pX2-SalI、pX3-SalI。
重组人源化I+III型胶原蛋白毕赤酵母表达菌株的构建和筛选
所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115电转感受态，转化方法为：将感受态从-80℃冰箱中取出放在冰上，感受态融化后加入约1～2μg获取的线性表达载体pX1-SalI、pX2-SalI、pX3-SalI，枪头缓慢搅匀冰浴5分钟后电击，电击后加入1mL预冷的YPD液体培养基，30℃220rpm复苏1～2h，涂布在含有500mg/mLG418固体YPD平板上，30℃培养2～3天，挑取转化子验证正确后，用4g/mLG418筛选多拷贝重组表达转化体，命名为ZTX1、ZTX2、ZTX3，扩培后用20％终浓度甘油保存于-80℃
重组人源化I+III型胶原蛋白摇瓶发酵诱导表达
从重组表达转化体甘油管中取5μL甘油菌接种于5mLYPD液体培养基中，30℃、220rpm培养。培养至OD60010～15时，按菌液：培养基＝1：100(v:v)接种于100mLBMGY液体培养基中，30℃和220rpm的条件下培养至OD600约为10-15时，收集菌体，用100mL BMMY培养基重悬，在30℃和220rpm的条件下继续培养，之后每24h加入1％甲醇诱导，诱导96h后收集发酵液上清。
图4a和4b分别为ZTX1和ZTX2的SDS-PAGE检测结果，均有大量表达，其中ZTX2表达量更高。
重组人源化I+III型胶原蛋白高密度发酵诱导表达
从重组表达转化体甘油管中取5μL甘油菌接种于30mLYPD液体培养基中，30℃、220rpm培养，培养至OD60010～15时，按菌液：基础盐培养基＝0.4：100(v:v)接种于280mL二级培养基中，培养至OD60010～15时作为种子液，接入2.5L的发酵培养基(BSM基础盐培养基，同时补加PTM1微量盐溶液)中进行高密度发酵。初始温度30℃，搅拌速度200rpm，通气量1vvm，pH为5.0，通过搅拌，通气量控制DO大于30％。培养16h左右，培养基中的碳源消耗完全，按照DO进行反馈流加补甘油500mL，待甘油补完后，饥饿1h，降温至28℃，流加甲醇诱导，DO保持20％以上，培养至120h左右放罐，离心收取发酵液上清。
重组人源化I+III型胶原蛋白纯化
将重组人源化I+III型胶原蛋白摇瓶发酵诱导表达和重组人源化I+III型胶原蛋白高密度发酵诱导表达获得的发酵液上清用镍柱亲和层析以及CM离子交换层析，将洗脱液进行超滤浓缩脱盐，用SDS-PAGE蛋白胶检测重组人源化I+III型胶原蛋白。
细胞毒性检测及促细胞增殖测试
采用MTT法检测不同浓度重组化I+III型胶原蛋白ZTX2、ZTX3的细胞毒性及促增殖作用，实验所用的细胞为L929细胞，小鼠成纤维细胞。
用含10％胎牛血清的DMEM+双抗PS的培养液培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105～5.0×106个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。取96孔培养板，将培养的成纤维细胞L929稀释配成5×103/mL的细胞悬液，每孔接种100μL的细胞悬浮液，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24h。弃去原培养液，每孔加入100μL实验组(0.5mg/L，1g/L，5g/L)配制溶液，同时设置阴性对照组(单纯细胞培养液)和阳性对照组(4％DMSO)，各设置3个复孔；分别于48h、96h进行检测，每孔加入MTT(噻唑蓝)50μL，在37℃条件下培养2h，吸弃原培养液，立即加入二甲基亚砜，每孔150μL，室温放置并轻轻振荡10–15min；选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，并计算细胞相对增殖率RGR(％)＝(实验组吸收值/阴性对照组吸收值)×100％。
根据细胞毒性评价表(表2)对样品细胞毒性进行评价。ZTX2、ZTX3样品组48h和96h，0.5–5g/L浓度细胞毒性反应均为0级。
从ZTX2的48h和96h细胞增殖率测定的表3中可以看出，实施例2中III+I+III型胶原蛋白样品在0.5g/L～5g/L的浓度下具有促细胞增值的作用，其中0.5g/L效果最好；5g/L可能由于浓度偏高致渗透压偏高，促细胞增殖作用不明显。
从ZTX3的48h和96h细胞增殖率测定的表4中可以看出，实施例3中I+III+I胶原蛋白样品在0.5g/L～5g/L的浓度下具有促细胞增值的作用，其中0.5g/L效果最好，但促细胞增殖效果不及实施例2中III+I+III型样品。
因此，重组人源I+III型胶原蛋白具有促细胞增殖功能且无明显的细胞毒性，具有良好的细胞相容性，满足作为生物材料的要求。
表2细胞相对增殖率与细胞毒性分级
分级 0 1 2 3 4 5
RGR(％) ≥100 75–99 50–74 25–49 1–24 0
表3实施例2胶原蛋白48h和96h细胞增殖率测定
表4实施例3胶原蛋白48h和96h细胞增殖率测定
实施例4
本实施例提供一种保湿舒缓紧致功效的重组人源化I+III型胶原蛋白冻干粉产品。旨在通过外部补充流失的胶原蛋白，调理角质层水分和纤维结构的完整性。
该胶原蛋白冻干粉产品包括冻干粉及辅料溶媒液，冻干粉以及辅料溶媒液的配比可以根据需要进行调整，其各自的具体配方见表5。
冻干粉制备步骤为：称量各相物料，依次将A相加入至C相，然后再加入B相搅拌均匀，除菌过滤，灌装，冻干，轧盖。
溶媒液制备步骤为：称量各相物料，依次将A相加入至C相，搅拌均匀，然后再加入B相搅拌均匀，除菌过滤，灌装，冻干，轧盖。
表5重组人源化I+III型胶原蛋白冻干粉及溶媒液配方
胶原蛋白冻干粉产品保湿紧致功效测试
征集33名受试者，其中3名男性，20名女性，年龄35-58岁，平均年龄45.5岁，使用实施例4制备的冻干粉产品每日一次，洁肤后将产品均匀涂抹于面部肌肤，轻轻拍打至吸收，产品持续使用4周。皮肤水分测试仪Corneometer CM825测试皮肤角质层水分含量，皮肤弹性测试仪Cutometer dual MPA580测试皮肤紧致度F4。
其中W0、W2、W4分别为受试区使用产品前、2周、4周的皮肤参数数值，N表示受试者人数。检测结果见表6。
表6皮肤角质层水分含量和紧致度F4检测结果
*表中数据值为均值+标准误差
受试者产品使用区域的皮肤角质层水分含量，在使用产品2周与基础值相比有显著性上升(p<0.001)，上升率为50.8％，在使用产品4周与基础值相比有显著性上升(p<0.001)，上升率为68.3％。测量值皮肤角质层水分含量测量值越高，皮肤越水润。
受试者产品使用区域的皮肤紧致度F4，在使用产品2周与基础值相比有显著性下降(p<0.001)，下降率为14.2％，在使用产品4周与基础值相比有显著性下降(p<0.001)，下降率为21.1％。测量值，皮肤紧致度F4数值越低，皮肤越紧致。
胶原蛋白冻干粉产品舒缓功效测试
舒缓功效主要通过评估试验样品对透明质酸酶的抑制率来表征。透明质酸在皮肤和其他组织中广泛存在，透明质酸与皮肤的关系非常紧密。高分子透明质酸能够抑制炎症反应，从而对皮肤炎症所引起的不适能起到缓解作用。高分子透明质酸会在透明质酸酶的作用下降解，产生降解产物N-乙酰氨基葡糖。测定反应体系中的N-乙酰氨基葡糖含量可以间接反应透明质酸酶的活性。
本试验采用体外法，相关文献资料显示体内法的趋势与体外法有一定的相关性。设置两组反应，一组为透明质酸酶+底物反应，另一组为透明质酸酶+底物+实施例4冻干粉测试样品反应，每组3个平行，37℃水浴后加入pH调节剂，沸水中水浴3分钟，冷却至室温，测定OD值。
计算实施例4冻干粉测试样品透明质酸酶活性抑制率为27.3％，统计差异P<0.05，有显著性差异，本产品具有舒缓功效。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重组人源化I+III型胶原蛋白，其特征在于，由人源I型胶原蛋白截短体和人源III型胶原蛋白截短体拼接而成，所述重组人源化I+III型胶原蛋白的氨基酸序列选自SEQID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37中的任意一种。
2.一种基因，其编码权利要求1任一项所述的重组人源化I+III型胶原蛋白。
3.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的基因。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体选自pIC9k、pICZα、pESC系列酵母表达载体中的任意一种。
5.一种宿主细胞，其特征在于，表达权利要求1所述的重组人源化I+III型胶原蛋白。
6.一种修复肌肤的护肤品，其特征在于，包含权利要求1所述的重组人源化I+III型胶原蛋白。
7.根据权利要求6所述的护肤品，其特征在于，所述护肤品中重组人源化I+III型胶原蛋白的浓度为0.1～0.8g/L。
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