CN114292834B

CN114292834B - 一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取i型胶原蛋白中的应用以及该i型胶原蛋白的用途

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Publication number: CN114292834B
Application number: CN202210221349.2A
Authority: CN
Inventors: 李慧; 许洋
Original assignee: Tianjin Fuyuan Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Fuyuan Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2042-03-09
Also published as: CN114292834A

Abstract

本发明创造提供了一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途，所述融合蛋白酶包括蛋白酶7片段mmp7C和/或蛋白酶9片段mmp9C；所述蛋白酶7片段mmp7C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白酶9片段mmp9C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的融合蛋白酶在提取动物皮和肌腱组织的I型胶原蛋白的过程中，I型胶原蛋白空间结构不会被破坏，且能够去除终产品中的杂蛋白，提高了I型胶原蛋白的提取率。

Description

一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途

技术领域

本发明创造属于生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途。

背景技术

胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，结构高度复杂，从分子结构、超分子结构，再到组织分布和功能等，具有显著的多样性。它们存在于生物的各种组织中，如，皮肤、骨、肌腱、基底膜等等。I型胶原蛋白较多地存在于骨骼和肌腱中。其分子长度约300nm，直径约1.5nm，呈棒状。显微结构上I型胶原蛋白由三条肽链组成，包括两条α(I)链和一条 α(II)链。由于I型胶原蛋白具有可降解性、生物相容性和止血性等许多生物优点，因此被作为天然生物材料被广泛应用在生物医药和化妆品中。

目前市场上出售的I型胶原蛋白主要是从动物的皮和肌腱组织中提取制备而成，由于现有的提取方法制备出的I型胶原蛋白受工艺条件的影响，提取产率较低，而且提取的胶原蛋白中含有的杂蛋白较多，严重影响胶原蛋白的质量。酸法：酸溶液无法溶解交联程度较大的胶原蛋白，而这种胶原蛋白所占的比例又较高，提取率不高，且杂蛋白无法去除。碱法：碱法提取使得胶原蛋白会被降解成多肽，提取周期较长，由于易引起蛋白质变性，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏，天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸，还会产生 D、L-型氨基酸消旋混合物，有些D型氨基酸有毒，甚至有致癌、致畸和致突变的作用。酶法：市场上常用水解鼠尾肌腱的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、凤梨蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶，这些蛋白酶在降解杂蛋白的同时，也将I型胶原蛋白降解，使I型胶原蛋白失去空间结构。酸酶法：常用的酸为弱酸，常用的酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、无花果蛋白酶、凤梨蛋白酶。虽然酸酶法比酸法、碱法、酶法的提取效率都要高，但是酸酶法中的酶在降解杂蛋白的同时，也会降解I型胶原蛋白，破坏I型胶原蛋白的空间结构。

因此开发一种只对杂蛋白进行水解，而对I型胶原蛋白无影响的蛋白酶，来提取I型胶原蛋白的方法，以保护I型胶原蛋白空间结构不被破坏，且去除终产品中的杂蛋白，来满足I型胶原蛋白在生物医学和化妆品行业等领域的应用显得十分重要。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种融合蛋白酶，以解决现有技术中的蛋白酶在提取制备I型胶原蛋白的过程中，在降解杂蛋白的同时，也将I型胶原蛋白降解，使I型胶原蛋白失去空间结构的技术问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种融合蛋白酶，所述融合蛋白酶包括蛋白酶7片段mmp7C和/或蛋白酶9片段mmp9C；

所述蛋白酶7片段mmp7C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述蛋白酶9片段mmp9C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述融合蛋白酶从N端至C端的连接顺序为蛋白酶7片段mmp7C、连接肽linker、蛋白酶9片段mmp9C；所述连接肽linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明在提供上述融合蛋白酶的同时，还提供了编码上述融合蛋白酶的核苷酸序列。

优选的，编码本发明融合蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了含有上述编码本发明融合蛋白酶的核苷酸序列的克隆载体。

优选地，所述克隆载体包括pET21a。

本发明还提供了含有上述编码本发明融合蛋白酶的核苷酸序列或克隆载体的工程菌。

优选地，所述工程菌为含有pET21a的大肠杆菌BL21。

本发明还提供了上述融合蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：

（1）将融合蛋白酶的核苷酸序列克隆至大肠杆菌表达载体pET21a的NdeI和HindIII酶切位点之间，构建重组大肠杆菌表达载体；

（2）将步骤（1）构建的重组大肠杆菌表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞BL21中，IPTG诱导表达后，离心收集菌体，细胞裂解液破碎细胞，离心收集上清；

（3）将步骤（2）收集的上清通过Ni-柱纯化，即得到融合蛋白酶。

本发明还提供了上述融合蛋白酶在提取I型胶原蛋白中的应用。

优选的，上述融合蛋白酶在提取鼠尾肌腱中的I型胶原蛋白中的应用。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

（1）应用本发明所述的融合蛋白酶在提取动物皮和肌腱组织的I型胶原蛋白的过程中，I型胶原蛋白空间结构不会被破坏，且能够去除终产品中的杂蛋白，提高了I型胶原蛋白的提取率。

（2）使用本发明的融合蛋白酶提取的I型胶原蛋白具有优良的生物相容性和生物活性，能够适应生物医学的应用，同时能够活化上皮细胞，促进上皮细胞增生和胶原酶生成，使皮肤紧致有弹力，具有保湿、防皱、亮肤等特性，在化妆品领域具有重要的应用价值。

（3）使用本发明的融合蛋白酶提取的I型胶原蛋白具有修复的特性，可以在软骨损失的治疗中使用；具有止血的特性，可以作为止血剂中原料的添加；具有护理的特性，可以作为烧伤和创伤修复材料中原料的添加。

附图说明

图1为重组质粒pET21a-mmp7c的图谱；

图2为重组质粒pET21a-mmp9c的图谱；

图3为重组质粒pET21a-mmp7c- linker-mmp9c的图谱；

图4为重组质粒pET21a-mmp7c的PCR鉴定结果；

图5为重组质粒pET21a -mmp9c的PCR鉴定结果；

图6为重组质粒pET21a-mmp7c- linker-mmp9c的PCR鉴定结果；

图7为羟脯氨酸的标准曲线；

图8为吸湿度检测对比图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例中使用的实验材料如下：

1、菌株和质粒：BL21/pET21a

2、试剂：质粒小量提取试剂盒、T4 DNA连接酶、NdeI、EcoRI、HindIII、DNA LadderMarker、IPTG、LB培养基。

3、主要溶液：

3.1、基因克隆

a) 核酸电泳缓冲液 (50×TAE)

b) EB储备液(10 mg/mL)：100mg EB，10mL蒸馏水，充分搅拌溶解，4℃避光保存。

3.2、蛋白电泳

1) 蛋白电泳缓冲液（1 L）：取Tris碱 3 g，SDS 1 g，甘氨酸 14.4 g，加蒸馏水溶解，定容至1 L，调节pH 8.3。

2) 考马斯亮蓝染色液：取0.25 g考马斯亮蓝(Coomassie blue) R250溶解于90mL的甲醇：水(1：1)和10 mL冰醋酸混合液中，过滤除去颗粒杂质。

3.3、培养基和抗生素

(1) LB 培养基(g/L)：酵母浸出粉5.0，NaCl5.0，胰蛋白胨10.0，pH 7.0。

(2) 氨苄青霉素(Ampicillin，简称Amp)，母液(50 mg/mL)：50 mg Amp，1 mLddH₂O，充分搅拌溶解，过滤除菌，-20℃保存备用。

(3) IPTG诱导剂（g/L）：取IPTG粉末10 mg，用80 ml无菌水溶解，定容至100 ml，过滤除菌，-20℃保存备用。

实施例1蛋白酶的制备

1、优化蛋白酶7和蛋白酶9的催化域

在REACTOME网站上，查找出小鼠的鼠尾肌腱中蛋白酶7和蛋白酶9，在BRENDA、MEROPS、UNIPROT数据库中，对蛋白酶7、蛋白酶9进行结构分析。在UNIPROT数据库中找到催化域的序列，根据大肠杆菌对氨基酸的偏好性，对催化域序列进行优化，优化后的蛋白酶7（mmp7c）的序列如序列表SEQ ID NO.4所示，优化后的蛋白酶9（mmp9c）的序列如序列表SEQID NO.5所示。

2、构建重组质粒和重组菌种

将合成后的序列和质粒pET21a进行酶切，使mmp7c、mmp9c、mmp7C-linker-mmp9C的序列分别构建到质粒pET21a上，得到pET21a-mmp7c、pET21a-mmp9c和pET21a-mmp7c-linker-mmp9c，如图1-3所示。

将重组质粒pET21a-mmp7c、pET21a-mmp9c和pET21a-mmp7c-linker-mmp9c分别转化到大肠杆菌BL21中，形成重组大肠杆菌BL21。从重组大肠杆菌BL21中分别提取质粒利用PCR技术来验证重组质粒，如图4-6所示。具体步骤如下：

2.1、提取质粒：

（1）将菌种接种于LB固体培养基上，37℃培养过夜。

（2）收集菌液于1.5 ml的EP管中，离心，收集菌体。

（3）加入250 μl溶液I，重悬菌体。

（4）待菌体重悬均匀后，加入250 μl溶液Ⅱ，轻轻颠倒4-5次，使菌体充分裂解。

（5）待裂解完，立即向EP管中，加入350 μl溶液Ⅲ，轻轻地颠倒5-6次。

（6）12000 r/min离心15 min，收集上清。

（7）将上清加入DNA纯化柱中，静置2 min。

（8）12000 r/min离心2 min，弃滤液，重复3次。

（9）加入500 μl HB buffer，12000 r/min离心2 min，弃滤液。

（10）加入500 μl Wash DNA buffer，12000 r/min离心2 min，弃滤液。

（11）将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加提前预热的30 μl无菌水。

（12）12000 r/min离心2 min，重复两次。

2.2、琼脂糖凝胶电泳

(1)根据所需要的琼脂糖浓度（0.8%）称取0.8g的琼脂糖，加入100 mL 1×TAE缓冲液，在沸水浴中使琼脂糖充分溶解。

(2)溶液冷至60℃时，若需要，则加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5 μg/mL。

(3)将制胶模具摆放整齐，插入梳子，将提前加热且预冷的琼脂糖倒入模具中。

(4)待琼脂糖溶液凝固后，取下梳子，收取凝胶。使用凝胶时，将凝胶放置于电泳槽中。

(5)向电泳槽中，加入电泳缓冲液。

(6)将样品缓慢加入到凝胶的样品孔中。

(7)打开电泳仪的电源，进行电泳。

(8)待电泳结束后，取出凝胶，在EB缓冲液中浸泡约3min。

(9)利用全自动凝胶成像仪上检测电泳结果。

2.3、质粒和片段的酶切

酶切反应体系为20 μL，限制性内切酶的酶切温度，通常为37℃，酶切时间2h，酶切体系见表1。

表1 酶切体系

成分	体积或质量
		目的基因、T载体或表达质粒	0.2 μg-1 μg
FastDigest Endonuclease（up）	1 μL
		FastDigest Endonucleas（down）	1 μL
10×FastDigest 绿色缓冲液	2 μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至20 uL

2.4、载体和片段的连接

连接反应体系为10 μL，16℃水浴过夜连接，连接反应体系见表2。

表2 连接反应体系

成分	体积或质量
		目的基因	50 ng-150 ng
表达质粒	1 μL（100 ng）
		T4 连接酶（2 U/μL）	0.5 μL
10×Buffer	1 μL
		ddH2O	补足至10 uL

2.5、大肠杆菌感受态的制备及其化学转化

（1）大肠杆菌感受态细胞的制备

a)挑取单菌落转接于5mL液体培养基中，37℃、220r/min过夜培养，将菌液转接到100 mL LB的摇瓶中，控制初始菌浓OD₆₀₀=0.1，在37℃、220 r/min条件下继续培养；

b)定时检测摇瓶中菌株的OD₆₀₀值(每30 min测定一次)；

c)当菌体的OD₆₀₀达到0.4-0.5时，取出摇瓶冰浴20min，将菌液倒入提前预冷的无菌离心管中，冰浴20 min，4℃、5000 r/min离心10min，弃上清；

d)取10 mL 0.1 mol/L CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴30 min；

e)4℃、5000 r/min离心10 min，弃上清；

f)取1mL 0.1 mol/L CaCl₂悬浮菌体；

g)每EP管装50 μL重悬菌体液，于-80℃超低温冰箱中保存。

（2）感受态细胞的转化

a)从-80℃超低温冰箱中取出感受态细胞，插入冰中使其融化；

b)向其中加入已经连接好的质粒Pet21α混合液，轻轻吹打均匀，冰浴20 min；

c)42℃水浴中热击90 s，迅速插入冰中，冰浴10 min；

d)在超净工作台中向EP管中加入300 μL LB复苏液轻轻摇匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡培养1h。

e) 12000r/min离心2min，弃上清，取50μL LB培养基重悬菌体，涂布在含有氨苄抗生素的平板上，30℃静止培养72 h，长出的菌落即为可能的阳性转化子。

从重组大肠杆菌中，根据2.1方法提取质粒，利用PCR技术来扩增出目的条带，依此初步验证重组质粒构建成功。并将扩增出来的目的条带进行测序，与理论序列进行比对，得到比对结果为100%。

6、重组菌株的诱导和表达

挑取重组大肠杆菌单菌落接种到5 mL LB液体培养基中，37℃、220 r/min培养过夜，将菌液接种到50 mL LB发酵培养基中，控制起始菌浓OD600=0.1，待菌株的OD600=0.6时，加入适量的诱导剂IPTG，使其诱导剂的终浓度为0.5 mmoL/L，18℃、180 r/min 诱导24h后。收集菌体，破碎细胞，离心得上清，将上清通过Ni-柱纯化，得到较纯的蛋白酶。

实施例2 蛋白酶对鼠尾肌腱降解的检测分析

将实验分为10组，分别编号A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2，分别取新鲜大白鼠尾肌腱1g，置于1：1000新洁尔灭液内浸泡10-15min，取出后以生理盐水冲洗5次以上，倒掉生理盐水，用剪刀修成1mm³左右的组织块，放入锥形瓶内，加入含有1M Nacl的0.05M Tris-Hcl（PH7.5）溶液100ml，放置1天。1天后，弃掉上清液。在A1和A2中加入适量的生理盐水，在B1和B2中加入等量的乙酸溶液和胰蛋白酶溶液，在C1和C2中加入等量的蛋白酶7溶液，在D1和D2中加入等量的蛋白酶9溶液，在E1和E2中加入等量的融合蛋白酶，均在37℃下提取8h，并定时震摇和观察。然后高速低温离心30 min，将上清液和沉淀分为两部分。5组中分别加入20 % Nacl溶液，胶原以白色絮状沉淀析出。以生理盐水清洗沉淀物数遍后，将胶原沉淀再次用融合蛋白酶溶液浸泡6h。离心，得到精制胶原液，以上均为无菌操作。将获得的精制胶原液进行冻干，得到胶原冻干粉。第一批样品：称取适量的冻干粉，用PBS缓冲液溶解。第二批样品：称取适量的冻干粉，在110℃条件下，用6M的盐酸进行降解，获得降解后的氨基酸溶液。

利用羟脯氨酸试剂盒法检测三种蛋白酶是否对I型胶原蛋白降解。羟脯氨酸是I型胶原的特征氨基酸，具有连接多肽以及稳定胶原的三螺旋结构的作用，且羟脯氨酸含量越低，其螺旋结构被破坏的温度就会越低。在450nm/558nm的波长下测定光密度值（OD值）并记录，并且绘制羟脯氨酸标准曲线，根据标准曲线的计算公式代入 OD值即可计算出胶原样品的羟脯氨酸含量，依此判断蛋白酶7和蛋白酶9，以及融合蛋白酶是否对I型胶原蛋白产生降解。根据羟脯氨酸的标准曲线（如图7所示）可以得到酸酶法、蛋白酶7、蛋白酶9、融合蛋白酶提取液中羟脯氨酸的含量，检测结果为：酸酶法（0.35 mg/mL）；mmp7（0 mg/mL）；mmp9（0 mg/mL）；mmp7c- linker-mmp9c融合蛋白酶（0 mg/mL）。由于羟脯氨酸是I型胶原蛋白特有的氨基酸，在蛋白酶7和蛋白酶9的降解产物中没有羟脯氨酸，这表明：蛋白酶7、蛋白酶9对I型胶原蛋白不会产生降解。

利用氨基酸自动分析仪分别来检测第二批样品，根据第二批样品中羟脯氨酸的含量来计算I型胶原蛋白的提取纯度（胶原蛋白的量=羟脯氨酸的量*9.75）。检测结果见表3。

表3 提取后胶原蛋白氨基酸组成及含量

由表上的数据分析可知，酸酶法对鼠尾肌腱的蛋白提取率为81.63%，对I型胶原蛋白的提取效率为66.25%，蛋白酶7的蛋白提取率为82.12%，对I型胶原蛋白的提取效率为76.34%，蛋白酶9的蛋白提取率为84.46%，对I型胶原蛋白的提取效率为71.40%，融合蛋白酶的蛋白提取率为87.48%，对I型胶原蛋白的提取效率为80.37%。

实施例3 利用融合蛋白酶从鼠尾肌腱中提取I型胶原蛋白的特性检测

1、保湿性检测：将样品冷冻干燥后，用烘箱法测定它们的初始水分质量分数。以甘油为参照物，将冻干样品，在相对湿度RH=81%的干燥器中放置80H左右，测定它们稀释率与时间的关系。稀释率=[（W₁-W₀）/W₀]*100% W₀, W₁分别为样品放置前和放置一定时间后的质量。吸湿结束后，将样品转移至氯化钙干燥器中，测定样品水分残存率与时间的关系。水分残存率=[（W₂-W₀）/W₀]*100% W₀同吸湿实验；W₂为放置一定时间后的样品质量。由图8可知：甘油分子小，亲水基团（羟基）含量大，吸湿效果最为明显。胶原虽然亲水基团的含量不大，但是其具有特有的三股螺旋结构，因此吸湿效果仅次于甘油，对于三股螺旋被破坏的明胶和水解胶原蛋白，亲水基团含量大，吸湿性强。

2、胶原蛋白对小鼠耳表创面的止血性能研究：小鼠，20只，随机分为2组，每组10只。1组小鼠左耳用止血贴，右耳用无菌药棉进行常规治疗，另1组小鼠左耳使用胶原蛋白海绵进行治疗。无菌条件下于小鼠左右耳缘末1/3处，用消毒后的剪刀横剪约1cm长的伤口，伤口从耳缘横切小鼠耳朵，左右受到同样的剪伤。于5s后将相应受试物敷于伤口，用手按压，每隔20s观察损伤部位的止血情况，并用药棉吸附所出血液，以不再渗血、出血为止血时间，并计算失血量。失血量=止血后药棉和受试物的重量-操作前精确称量的药棉和受试物重量。由表4可知：在耳表创面的止血时间方面，胶原蛋白贴组、止血贴的止血时间与对照组比较，具有显著性差异。胶原蛋白贴组的智学时间与止血贴组比较，具有显著性差异。胶原蛋白贴组、止血贴组的失血量与对照组比较，具有显著性差异。胶原蛋白组的失血量与止血贴组比较，无明显差异。

表4 胶原蛋白海绵对小鼠耳表创面止血效果的影响

组别	N	止血时间（S）	失血量（G）
				对照组	10	440.2	1.01
止血贴组	10	266.9	0.30
				胶原蛋白贴组	10	229.8	0.32

3、护理特性的检测：在小鼠的皮肤上用热水烫15s，制成10%深II度烧伤创面。烧伤后的小鼠随机分为A、B、C、D四组，每组20只，A组为自然愈合（空白）组，B组为基质凝胶组，C组为胶原蛋白组，D组为烧伤软膏组。A组：创面不用药，自然愈合；B组：创面外用基质凝胶；C组：创面外用胶原蛋白；D组：创面外用烧伤软膏。于烧伤后第7、14、21d用透明塑料薄膜记录创面边缘，以烧伤后第一天的创面面积为原始面积，以后的面积均和原始面积相比。创面愈合面积百分比=[（烧伤面积-各时间点创面面积）/烧伤面积]*100%。由表5可知：烧伤创面随着伤后时间的延长，愈合速度逐渐加快，在伤后7、14、21d，B组愈合率高于A组，但差异无显著性；D组愈合率明显高于A组；C组创面愈合率显著高于B组和D组。

表5 烧伤后不同时间创面愈合率的比较

4、软骨损失的治愈修复实验检测：15只小鼠随机分为三组，每组10膝。A组为软骨缺损空白对照组；B组为支架修复组；C组为胶原蛋白加支架修复组。在A组小鼠的软骨部位制造微骨折，不做任何处理；在B组小鼠的软骨部位制造微骨折，在骨折部位，覆盖支架；在C组小鼠的软骨部位制造微骨折，在骨折部位，注射胶原蛋白，后覆盖支架。术后实验小鼠常规饲料喂养，前3-5天活动量减少，术后1周基本恢复正常活动量。术后观察期内，13只小鼠术后第一天可开始站立行走，2只于术后第2天开始站立行走，30例切口均1期愈合，无皮肤及关节内感染、相关并发症发生；无动物死亡及四肢畸形出现。术后6周大体观察可见：A组各缺损处大量滑膜增生、包裹，清理后缺损处未见明显填充，呈深灰色；C组可见缺损处基本完全填充，颜色与周围正常关节软骨颜色较为一致。术后24周大体观察可见：A组缺损处白色多层纤维状物覆盖，颜色不均一，缺损处表面明显凹陷，可见缺损周围正常软骨组织退变，软骨表面毛糙，与周围组织整合差；B组缺损表面白色纤维状物覆盖，缺损处稍凹陷，缺损与正常软骨交界处部分修复组织呈淡粉色；C组缺损处透明状滑膜样组织，缺损基本与正常软骨组织高度持平。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 天津辅元生物医药科技有限公司

<120> 一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取I型胶原蛋白中的应用以及该I型胶原蛋白的用途

<141> 2022-01-21

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 170

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Tyr Ser Leu Met Pro Asn Ser Pro Lys Trp His Ser Arg Ile Val Thr

1 5 10 15

Tyr Arg Ile Val Ser Tyr Thr Ser Asp Leu Pro Arg Ile Val Val Asp

20 25 30

Gln Ile Val Lys Lys Ala Leu Arg Met Trp Ser Met Gln Ile Pro Leu

35 40 45

Asn Phe Lys Arg Val Ser Trp Gly Thr Ala Asp Ile Ile Ile Gly Phe

50 55 60

Ala Arg Arg Asp His Gly Asp Ser Phe Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn

65 70 75 80

Thr Leu Gly His Ala Phe Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Gly Asp Ala

85 90 95

His Phe Asp Lys Asp Glu Tyr Trp Thr Asp Gly Glu Asp Ala Gly Val

100 105 110

Asn Phe Leu Phe Ala Ala Thr His Glu Phe Gly His Ser Leu Gly Leu

115 120 125

Ser His Ser Ser Val Pro Gly Thr Val Met Tyr Pro Thr Tyr Gln Arg

130 135 140

Asp Tyr Ser Glu Asp Phe Ser Leu Thr Lys Asp Asp Ile Ala Gly Ile

145 150 155 160

Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Asn Thr Leu

165 170

<210> 2

<211> 428

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Phe Gln Thr Phe Lys Gly Leu Lys Trp Asp His His Asn Ile Thr Tyr

1 5 10 15

Trp Ile Gln Asn Tyr Ser Glu Asp Leu Pro Arg Asp Met Ile Asp Asp

20 25 30

Ala Phe Ala Arg Ala Phe Ala Val Trp Gly Glu Val Ala Pro Leu Thr

35 40 45

Phe Thr Arg Val Tyr Gly Pro Glu Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly

50 55 60

Val Ala Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu

65 70 75 80

Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly Ala Gly Val Gln Gly Asp Ala His

85 90 95

Phe Asp Asp Asp Glu Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Ile Pro

100 105 110

Thr Tyr Tyr Gly Asn Ser Asn Gly Ala Pro Cys His Phe Pro Phe Thr

115 120 125

Phe Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Asn Asp

130 135 140

Gly Thr Pro Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asp Tyr Asp Lys Asp Gly Lys

145 150 155 160

Phe Gly Phe Cys Pro Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Glu His Gly Asn Gly

165 170 175

Glu Gly Lys Pro Cys Val Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser Tyr

180 185 190

Ser Ala Cys Thr Thr Lys Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala

195 200 205

Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Gln Asp Lys Leu Tyr Gly Phe Cys Pro Thr

210 215 220

Arg Val Asp Ala Thr Val Val Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys

225 230 235 240

Val Phe Pro Phe Val Phe Leu Gly Lys Gln Tyr Ser Ser Cys Thr Ser

245 250 255

Asp Gly Arg Arg Asp Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe

260 265 270

Asp Thr Asp Lys Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu

275 280 285

Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His

290 295 300

Ser Ser Val Pro Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr Ser Tyr Leu Glu

305 310 315 320

Gly Phe Pro Leu Asn Lys Asp Asp Ile Asp Gly Ile Gln Tyr Leu Tyr

325 330 335

Gly Arg Gly Ser Lys Pro Asp Pro Arg Pro Pro Ala Thr Thr Thr Thr

340 345 350

Glu Pro Gln Pro Thr Ala Pro Pro Thr Met Cys Pro Thr Ile Pro Pro

355 360 365

Thr Ala Tyr Pro Thr Val Gly Pro Thr Val Gly Pro Thr Gly Ala Pro

370 375 380

Ser Pro Gly Pro Thr Ser Ser Pro Ser Pro Gly Pro Thr Gly Ala Pro

385 390 395 400

Ser Pro Gly Pro Thr Ala Pro Pro Thr Ala Gly Ser Ser Glu Ala Ser

405 410 415

Thr Glu Ser Leu Ser Pro Ala Asp Asn Pro Cys Asn

420 425

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 558

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

catatgtact ctctgatgcc gaactctccg aaatggcact cccgtatcgt tacctaccgc 60

attgtgtctt atacttctga cctgccgcgt atcgtggttg atcagatcgt caaaaaggct 120

ctgcgcatgt ggagcatgca gatcccgctg aactttaaac gtgtaagctg gggtactgct 180

gacatcatca tcggtttcgc gcgtcgcgac cacggtgata gctttccgtt cgatggccct 240

ggtaatactc tgggtcacgc tttcgcacca ggtcctggcc tgggtggtga tgctcatttc 300

gataaggatg aatactggac cgatggtgaa gacgcaggtg taaacttcct gtttgcggcc 360

acccacgaat ttggtcattc tctgggtctg tcccacagct ctgttccggg caccgtaatg 420

tatccgacct atcagcgtga ctactctgaa gactttagcc tgaccaaaga cgatatcgcc 480

ggtatccaga aactgtacgg taaacgtaac accctgggtg gtggtggctc tggtggcggt 540

ggttctggtg gtgaattc 558

<210> 5

<211> 1296

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gaattcttcc agaccttcaa gggcctgaaa tgggaccatc acaacatcac ctactggatc 60

cagaactact ctgaggacct gccacgcgat atgatcgacg acgcattcgc gcgtgcattt 120

gctgtttggg gtgaagttgc ccctctgacc tttactcgtg tctatggtcc ggaagctgac 180

attgtaatcc agttcggtgt ggcggagcac ggtgatggtt acccattcga cggtaaagac 240

ggtctgctgg cccacgcgtt ccctccgggc gcaggtgtac agggcgatgc ccacttcgac 300

gacgatgagc tgtggtctct gggcaagggc gttgtgattc cgacgtatta tggcaacagc 360

aacggtgccc cgtgccactt cccgtttact tttgagggtc gttcttactc tgcttgcact 420

accgacggcc gtaacgatgg caccccgtgg tgcagcacta ccgctgatta cgacaaagat 480

ggtaaatttg gtttctgccc atctgaacgt ctgtataccg aacacggtaa cggtgagggc 540

aaaccatgtg ttttcccatt cattttcgaa ggccgtagct attctgcttg caccaccaaa 600

ggtcgttccg atggttaccg ttggtgcgcg actaccgcaa actacgatca ggacaaactg 660

tacggcttct gtccgacccg tgtggacgcg actgttgttg gtggtaacag cgcaggtgaa 720

ctgtgtgtgt tcccgttcgt ttttctgggc aaacaataca gctcctgcac ttctgatggt 780

cgtcgtgatg gtcgtctgtg gtgcgccacg actagcaact tcgatactga caaaaaatgg 840

ggtttctgtc cggatcaggg ctactctctg ttcctggttg cggcgcacga gttcggccat 900

gcactgggtc tggatcacag ctctgtaccg gaagcactga tgtacccgct gtacagctac 960

ctggagggtt ttccgctgaa taaggacgat atcgacggta ttcagtacct gtacggccgt 1020

ggctccaaac cggacccgcg cccaccggct actaccacca ctgaaccgca gccgactgcg 1080

cctcctacta tgtgtccgac catccctcct actgcttatc cgaccgtggg tccgacggtg 1140

ggtccgaccg gtgcgccaag cccgggcccg acttcctctc cgagcccagg cccaaccggt 1200

gcaccgtctc cgggtccgac cgctccgccg accgcgggtt cttctgaagc cagcactgaa 1260

tctctgtctc cggcggataa cccgtgtaac aagctt 1296

<210> 6

<211> 1890

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atgtactctc tgatgccgaa ctctccgaaa tggcactctc gtatcgttac ctaccgtatc 60

gtttcttaca cctctgacct gccgcgtatc gttgttgacc agatcgttaa aaaagctctg 120

cgtatgtggt ctatgcagat cccgctgaac ttcaaacgtg tttcttgggg taccgctgac 180

atcatcatcg gtttcgctcg tcgtgaccac ggtgactctt tcccgttcga cggtccgggt 240

aacaccctgg gtcacgcttt cgctccgggt ccgggtctgg gtggtgacgc tcacttcgac 300

aaagacgaat actggaccga cggtgaagac gctggtgtta acttcctgtt cgctgctacc 360

cacgaattcg gtcactctct gggtctgtct cactcttctg ttccgggtac cgttatgtac 420

ccgacctacc agcgtgacta ctctgaagac ttctctctga ccaaagacga catcgctggt 480

atccagaaac tgtacggtaa acgtaacacc ctgggtggtg gtggttctgg tggtggtggt 540

tctggtggtg agctcatgtt ccagaccttc aaaggtctga aatgggacca ccacaacatc 600

acctactgga tccagaacta ctctgaagac ctgccgcgtg acatgatcga cgacgctttc 660

gctcgtgctt tcgctgtttg gggtgaagtt gctccgctga ccttcacccg tgtttacggt 720

ccggaagctg acatcgttat ccagttcggt gttgctgaac acggtgacgg ttacccgttc 780

gacggtaaag acggtctgct ggctcacgct ttcccgccgg gtgctggtgt tcagggtgac 840

gctcacttcg acgacgacga actgtggtct ctgggtaaag gtgttgttat cccgacctac 900

tacggtaact ctaacggtgc tccgtgccac ttcccgttca ccttcgaagg tcgttcttac 960

tctgcttgca ccaccgacgg tcgtaacgac ggtaccccgt ggtgctctac caccgctgac 1020

tacgacaaag acggtaaatt cggtttctgc ccgtctgaac gtctgtacac cgaacacggt 1080

aacggtgaag gtaaaccgtg cgttttcccg ttcatcttcg aaggtcgttc ttactctgct 1140

tgcaccacca aaggtcgttc tgacggttac cgttggtgcg ctaccaccgc taactacgac 1200

caggacaaac tgtacggttt ctgcccgacc cgtgttgacg ctaccgttgt tggtggtaac 1260

tctgctggtg aactgtgcgt tttcccgttc gttttcctgg gtaaacagta ctcttcttgc 1320

acctctgacg gtcgtcgtga cggtcgtctg tggtgcgcta ccacctctaa cttcgacacc 1380

gacaaaaaat ggggtttctg cccggaccag ggttactctc tgttcctggt tgctgctcac 1440

gaattcggtc acgctctggg tctggaccac tcttctgttc cggaagctct gatgtacccg 1500

ctgtactctt acctggaagg tttcccgctg aacaaagacg acatcgacgg tatccagtac 1560

ctgtacggtc gtggttctaa accggacccg cgtccgccgg ctaccaccac caccgaaccg 1620

cagccgaccg ctccgccgac catgtgcccg accatcccgc cgaccgctta cccgaccgtt 1680

ggtccgaccg ttggtccgac cggtgctccg tctccgggtc cgacctcttc tccgtctccg 1740

ggtccgaccg gtgctccgtc tccgggtccg accgctccgc cgaccgctgg ttcttctgaa 1800

gcttctaccg aatctctgtc tccggctgac aacccgtgca acgtcgacaa gcttgcggcc 1860

gcactcgagc accaccacca ccaccactga 1890

Claims

1.一种融合蛋白酶，其特征在于：编码所述融合蛋白酶的核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

2.编码权利要求1所述的融合蛋白酶的核酸，其特征在于：所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.含有权利要求2所述的核酸的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包括pET21a。

5.含有如权利要求2所述的核酸或权利要求4所述的重组表达载体的重组工程菌。

6.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于：所述重组工程菌为含有pET21a的大肠杆菌BL21。

7.权利要求1所述的融合蛋白酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将融合蛋白酶的核苷酸序列克隆至表达载体pET21a的NdeI和HindIII酶切位点之间，构建重组表达载体；

（2）将步骤（1）构建的重组表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞BL21中，IPTG诱导表达后，离心收集菌体，细胞裂解液破碎细胞，离心收集上清；

8.权利要求1所述的融合蛋白酶在提取鼠尾肌腱中的I型胶原蛋白中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其特征在于：提取的I型胶原蛋白在制备化妆品原料、治疗软骨损伤药物、止血剂或治疗烧创伤药物中的用途。