CN111620953B - 类胶原融合蛋白组合物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及类胶原融合蛋白组合物，类胶原融合蛋白包括依次连接的结构单元，基础结构和活性单元，符合结构通式nR1‑Cg1‑mR2，其中，R1为结构单元，R2为活性单元，Cg1为为基础结构，m和n均为0‑5的自然数；其中，R1和R2均为弹性蛋白E和功能蛋白的组合物；这种类胶原融合蛋白能够用于医学美容材料，软骨重建材料，辐射防护材料或皮肤创面修复材料。本发明的有益效果是：类胶原融合蛋白序列中的弹性蛋白结构除了在生物学功能上可以发生网状交联形成稳定的力学结构以外，在融合蛋白的结构中可以起到柔性链接的作用，便于各个基本结构表现出独立的生物活性；增加类胶原融合蛋白的稳定性，也能够提高蛋白活性。

Description

类胶原融合蛋白组合物及制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学及转化医学领域，尤其是涉及类胶原融合蛋白组合物。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白种类较多，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子，根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。其中以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白应用较为广泛。胶原蛋白在机体内的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能、修复肌体损伤等方面。胶原蛋白无论是作为修复的生物支架材料、还是保护剂方面相对于其它高分子材料，具有较强的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业。
目前规模化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，其主要来源为动物结缔组织，但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险。伴随基因工程技术的大规模应用，基因工程重组表达胶原利用模式化表达宿主以外源蛋白表达的形式成功的解决了胶原蛋白大规模制备的瓶颈。如专利201210482543.2公布了一种II、III型胶原蛋白的融合性重组蛋白；西安巨子生物基因技术股份有限公司公布了重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，对重组胶原蛋白进一步进行结构修饰，便于进一步提高产品的使用场景。江苏悦智生物医药有限公司公布的专利201910088754.X，涉及重组人源III型胶原蛋白a1链及其应用。纵观这些专利所涉及的胶原蛋白，均为单体式设计，未能考虑分析医学美容整形、软骨修复、辐射防护及慢性创面等方面，对不同类型胶原蛋白的需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供类胶原融合蛋白组合物。
本发明采用的技术方案是：类胶原融合蛋白组合物，类胶原融合蛋白包括依次连接的结构单元，基础结构和活性单元，符合式1结构通式；
nR1-Cg1-mR2      式1；
其中，R1为结构单元，R2为活性单元，Cg1为为基础结构，Cg1为I型胶原蛋白的截短型蛋白序列，序列如SEQ No：1所示，m和n均为0-5的自然数。
优选地，R1和R2均为弹性蛋白E和功能蛋白的组合物；
E序列如SEQ No：4所示。
优选地，R1为Cg2-E或Cg3-E；
Cg2和Cg3分别为II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的截短型蛋白序列，Cg2序列如SEQNo：2所示，Cg3序列如SEQ No：3所示。
优选地，R2为E-Cg2、E-Cg3、E-SOD和E-EGF中的一种；
Cg2和Cg3分别为II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的截短型蛋白序列，Cg2序列如SEQNo：2所示，Cg3序列如SEQ No：3所示；
SOD为超氧化物歧化酶截短型蛋白序列，序列如SEQ No：5所示；
EGF为表皮细胞因子截短型蛋白序列，序列如SEQ No：6所示。
类胶原融合蛋白组合物的制备方法，通过序列拼接技术生成类胶原融合蛋白序列，定向插入到原核表达载体中，经表达纯化后得到类胶原融合蛋白。
类胶原融合蛋白组合物在医学修补材料中的应用。
一种类胶原融合蛋白组合物在医学美容材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式2所示，
m(Cg3-E)-Cg1-n(E-Cg3)     式2；
其中m：n为2：1；
优选地，m为2，n为1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：7所示。
一种类胶原融合蛋白组合物在软骨重建材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式3所示，
m(Cg2-E)-Cg1-n(E-Cg2)    式3；
其中，m：n为1：1；
优选地，m为3，n为3，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：8所示。
一种类胶原融合蛋白组合物在辐射防护材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式4所示，
m(Cg3-E)-Cg1-n(E-SOD)     式4；
其中，m：n为3：1；
优选地，m为3，n为:1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：9所示。
一种类胶原融合蛋白组合物在皮肤创面修复材料中的应用，类胶原融合蛋白结构通式如式5所示，
m(Cg3-E)-Cg1-n(E-EGF)     式5；
其中，m：n为3：1；
优选地，m为3，n为:1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：10所示。
本发明具有的优点和积极效果是：类胶原融合蛋白序列中的弹性蛋白结构除了在生物学功能上可以发生网状交联形成稳定的力学结构以外，在融合蛋白的结构中可以起到柔性链接的作用，便于各个基本结构表现出独立的生物活性；增加类胶原融合蛋白的稳定性，也能够提高蛋白活性。
附图说明
图1重组人源类胶原融合蛋白A型质粒；
图2重组人源类胶原融合蛋白B型质粒；
图3重组人源类胶原融合蛋白C型质粒；
图4重组人源类胶原融合蛋白D型质粒。
具体实施方式
本发明根据胶原蛋白在各个领域的需求，模拟人体组织结构中各类胶原的组成方式，重新分析设计一组人源类胶原融合蛋白组合物。类胶原融合蛋白包括依次连接的结构单元，基础结构和活性单元，符合式1结构通式；
nR1-Cg1-mR2      式1；
其中，R1为结构单元，R2为活性单元，Cg1为为基础结构，m和n均为0-5的自然数；
其中，R1和R2均为弹性蛋白E和功能蛋白的组合物；E为弹性蛋白(Elastin，以下简称E)的活性结构单元；弹性蛋白结构除了在生物学功能上可以发生网状交联形成稳定的力学结构以外，在融合蛋白的结构中可以起到柔性链接的作用，便于各个基本结构表现出独立的生物活性；
其中，R1为Cg2-E或Cg3-E；R2为E-Cg2、E-Cg3、E-SOD和E-EGF中的一种；Cg1、Cg2和Cg3分别为I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的截短型蛋白序列，序列如SEQ No：1、SEQ No：2和SEQ No：3所示；SOD为超氧化物歧化酶截短型蛋白序列，EGF为表皮细胞因子截短型蛋白序列，序列分别如SEQ No：5和SEQ No：6所示；弹性蛋白E序列如SEQ No：4所示。R1也可以为弹性蛋白E与具有其他功能的蛋白的组合物，例如E-FGF，FGF为成纤维细胞生长因子截短型蛋白序列。本发明所涉及的结构组成单元均为根据GeneBank中的人源蛋白序列以及Swiss-Prot进行蛋白结构及功能分析获得。
SEQ No.1:pro-SEQ Cg1
GEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKP
SEQ No.2:pro-SEQ Cg2
GPPGPACGGG
SEQ No.3:pro-SEQ Cg3
GERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAP
SEQ No.4:pro-SEQ E
VPGVG
SEQ No.5:pro-SEQ SOD
KHSLPDLPYDYGALEPHINAQIMQLHHSKHHAAYVNNLNVTEEKYQEALAKGDVTAQTALQPALKFNGGGHINHSIFWTNLSPNGGGEPKGELLEAIKRDFGSFDKFKEKLTAASVGVQGSGWGWLGFNKERGHLQIAACPNQDPLQGTTGLIPLLGIDVWEHAYYLQYKNVRPDYLKAIWNVINWENVTER
SEQ No.6:pro-SEQ EGF
NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
本发明某些实施例中，类胶原融合蛋白根据预期用途可以分为用于医学美容材料A型、软骨重建材料B型、辐射防护材料C型和皮肤创面修复材料D型。
本发明某些实施例中，根据医学美容及愈伤组织中的各类型胶原蛋白的分布及功能需求设计A型胶原融合蛋白，具体由I型胶原蛋白(collagen I，简称Cg1)、III型胶原蛋白(collagen III，简称Cg3)、弹性蛋白(Elastin，以下简称E)功能单元组成，A型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg3-E)-Cg1-n(E-CG3)，其中m、n为自然数0-5，根据皮肤结构中I、III型的蛋白比例，令m：n为2：1，进一步的，m为2，n为1，具体蛋白序列如SEQ No.7所示。
SEQ No.7：pro-A
GERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAPVPGVGGERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAPVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGGERGAPGFRGPAGPNGLPGEKGPAGERGAP
本发明某些实施例中，根据据软骨重建过程中需要软骨细胞的诱导及传导的需求，生物支架应满足软骨细胞分化及基础力学作用，设计软骨重建类B型胶原融合蛋白由I型胶原蛋白和II型胶原蛋白(collagen II，简称Cg2)的功能单元组成，B型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg2-E)-Cg1-n(E-CG2)，其中m、n为自然数0-5，根据软骨重建过程中结构中I、II型胶原蛋白的需求，令m：n为1：1，进一步的，m为3，n为3，具体蛋白序列如SEQ No8所示。
SEQ No8：pro-B
GPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGG
本发明某些实施例中，根据放射线对皮肤及黏膜的损伤的发生机制及组织修复方式，设计能够用于辐射防护材料的C型胶原融合蛋白，具体由III型胶原蛋白、I型胶原蛋白、弹性蛋白E以及超氧化物歧化酶(SOD)功能单元组成，C型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg3-E)-Cg1-n(E-SOD)，其中m、n为自然数0-5，根据辐射防护及放射性创面的愈合机制，令m：n为3：1，进一步的，m为3，n为1，具体蛋白序列如SEQ No.9所示。
SEQ No.9：pro-C
GPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGKHSLPDLPYDYGALEPHINAQIMQLHHSKHHAAYVNNLNVTEEKYQEALAKGDVTAQTALQPALKFNGGGHINHSIFWTNLSPNGGGEPKGELLEAIKRDFGSFDKFKEKLTAASVGVQGSGWGWLGFNKERGHLQIAACPNQDPLQGTTGLIPLLGIDVWEHAYYLQYKNVRPDYLKAIWNVINWENVTER
本发明某些实施例中，根据难愈合创面发生机制及组织修复方式，设计能够用于皮肤创面修复材料的D型胶原融合蛋白，具体为由III型胶原蛋白、I型胶原蛋白、弹性蛋白E以及表皮细胞因子(EGF)功能单元组成，D型类胶原融合型蛋白的结构为m(Cg3-E)-Cg1-n(E-EGF)，其中m、n为自然数0-5，令m：n为3：1，进一步的，m为3，n为1，具体蛋白序列如SEQ No.10所示。
SEQ No.10：pro-D
GPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGPPGPCCGGGVPGVGGEPGNPGKPGSPGPAGSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNGPQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGNEGPKGQPGQNGKPVPGVGNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
上述类胶原融合蛋白组合物的制备方法，经过原核表达细胞密码子优化后，通过序列拼接技术生成类胶原融合蛋白序列，定向插入到原核表达载体pET28a中，转入大肠杆菌中经表达纯化后，得到类胶原融合蛋白。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：类胶原融合蛋白编码基因的合成
A型类胶原融合蛋白结构为序列为2(Cg3-E)-Cg1-(E-3Cg3)，蛋白序列为SEQ No.8；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ NO.11所示；
SEQ No.11：DNA-A
ATGGGTGAACGTGGTGCCCCTGGTTTTCGTGGTCCTGCTGGTCCGAATGGTCTGCCGGGTGAAAAAGGCCCGGCTGGTGAACGTGGTGCTCCAGTTCCAGGTGTTGGTGGCGAACGTGGTGCTCCTGGCTTTCGTGGTCCAGCAGGTCCTAACGGCCTGCCAGGTGAAAAAGGCCCAGCAGGTGAACGTGGTGCACCAGTACCTGGCGTAGGCGGTGAGCCAGGTAACCCAGGTAAACCGGGTTCTCCAGGTCCAGCTGGTTCCAACGGTGAACCAGGTCCGGCTGGTTCCCCTGGTGAGAAGGGTTCTCAGGGTTCTAACGGTAACCCGGGTCCTGCCGGTAATCAGGGTCAACCAGGCAACAAAGGTTCCCCTGGTAACCCGGGTAAACCGGGTGAACCTGGCTCTAATGGTCCGCAGGGTGAACCGGGTAGCCAAGGTAACCCAGGTAAAAACGGTCAACCTGGTTCTCCAGGCAGCCAGGGTTCTCCAGGTAACCAGGGTCAGCCGGGTAAACCTGGTCAGCCGGGTGAACAAGGTTCCCCAGGCAATCAAGGCCCTGCCGGTAACGAAGGTCCTAAGGGTCAACCGGGTCAGAACGGTAAACCGGTTCCGGGTGTTGGTGGTGAACGTGGCGCACCAGGTTTTCGTGGTCCTGCTGGTCCGAATGGTCTGCCTGGTGAAAAAGGTCCAGCGGGCGAACGTGGCGCTCCTTAA
B型类胶原融合蛋白结构为3(Cg2-E)-Cg1-3(E-3Cg2)，蛋白序列为SEQ No.9；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ No.12；
SEQ No.12：DNA-B
ATGGGTCCACCAGGTCCGTGTTGCGGTGGTGGTGTTCCAGGTGTAGGTGGTCCTCCAGGTCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTTCCAGGTGTTGGCGGTCCTCCAGGCCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTACCGGGTGTCGGTGGTGAACCAGGTAACCCGGGTAAACCGGGTTCTCCAGGTCCGGCAGGTTCTAATGGTGAACCTGGTCCAGCAGGTTCTCCGGGTGAAAAAGGCAGCCAGGGTTCCAACGGCAATCCTGGCCCGGCTGGTAACCAAGGTCAGCCTGGTAATAAAGGTTCTCCAGGTAACCCGGGTAAGCCGGGTGAACCGGGTTCTAACGGTCCGCAAGGTGAACCGGGTTCTCAGGGTAATCCAGGCAAAAACGGCCAACCTGGTTCTCCAGGTTCCCAGGGTTCTCCGGGTAACCAGGGCCAACCTGGTAAACCAGGCCAGCCAGGTGAACAAGGTTCTCCTGGCAATCAAGGTCCAGCCGGTAACGAAGGTCCTAAAGGCCAGCCGGGTCAGAACGGTAAACCGGTTCCAGGTGTAGGCGGTCCTCCAGGTCCATGTTGCGGTGGTGGTGTACCGGGTGTGGGTGGTCCACCAGGTCCATGTTGTGGTGGTGGTGTACCAGGTGTAGGTGGTCCGCCTGGTCCATGCTGTGGTGGTGGTTAA
C型胶原融合蛋白结构为3(Cg3-E)-Cg1-(E-SOD)，蛋白结构为SEQ No.10；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ NO.13；
SEQ No.13：DNA-C
ATGGGTCCACCAGGTCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTACCTGGTGTAGGTGGTCCGCCAGGTCCATGTTGTGGTGGCGGTGTACCAGGTGTTGGTGGCCCTCCAGGTCCATGTTGTGGCGGTGGTGTCCCGGGTGTAGGTGGTGAACCAGGTAACCCAGGTAAACCGGGTTCTCCGGGCCCAGCAGGTTCTAACGGTGAACCGGGTCCAGCAGGTTCTCCGGGTGAAAAAGGTTCTCAGGGTAGCAATGGTAACCCGGGTCCGGCTGGTAATCAAGGTCAGCCTGGTAACAAAGGCAGCCCAGGCAACCCTGGTAAACCGGGTGAACCGGGTTCTAACGGTCCGCAGGGTGAACCGGGTTCTCAGGGTAACCCGGGCAAAAACGGTCAGCCGGGCTCTCCTGGTTCTCAAGGCTCCCCTGGCAACCAGGGTCAACCTGGTAAACCGGGTCAGCCTGGTGAACAAGGTAGCCCAGGTAACCAGGGTCCGGCTGGTAACGAAGGTCCGAAAGGCCAGCCTGGCCAGAACGGTAAACCGGTACCGGGTGTAGGTAAACATAGCCTGCCTGACCTGCCATACGATTACGGCGCTCTGGAACCGCACATTAACGCACAGATTATGCAGCTGCACCACTCTAAACATCACGCTGCTTACGTTAATAACCTGAACGTCACTGAAGAGAAATATCAGGAAGCTCTGGCTAAAGGTGACGTTACTGCGCAGACTGCACTGCAGCCAGCCCTGAAATTCAATGGTGGTGGTCACATTAATCACAGCATCTTCTGGACCAACCTGAGCCCAAACGGTGGTGGCGAACCGAAAGGCGAACTGCTGGAGGCTATCAAACGTGACTTCGGCAGCTTTGACAAATTTAAAGAAAAACTGACTGCAGCGTCCGTAGGTGTTCAAGGTTCTGGCTGGGGTTGGCTGGGTTTCAACAAAGAACGTGGTCACCTGCAGATCGCTGCATGCCCGAACCAGGACCCTCTGCAGGGTACCACCGGTCTGATCCCGCTGCTGGGTATTGATGTTTGGGAACACGCCTACTACCTGCAATATAAAAACGTTCGCCCGGACTACCTGAAAGCAATTTGGAACGTTATCAACTGGGAAAATGTCACTGAGCGTTAA
D型胶原融合蛋白结构为3(Cg3-E)-Cg1-(E-EGF)，蛋白结构为SEQ No.11；其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ NO.14。
SEQ No.14：DNA-D
ATGGGTCCACCTGGTCCTTGTTGCGGTGGTGGTGTACCTGGTGTAGGTGGTCCACCGGGCCCTTGTTGTGGTGGTGGTGTACCAGGCGTTGGTGGTCCGCCAGGTCCATGTTGTGGTGGTGGTGTGCCGGGTGTTGGCGGTGAACCAGGTAACCCTGGTAAACCAGGCTCTCCAGGTCCTGCGGGTTCTAACGGTGAACCAGGTCCGGCAGGTTCTCCGGGTGAGAAAGGTAGCCAGGGCTCCAATGGTAACCCTGGCCCGGCAGGTAATCAAGGTCAGCCTGGTAATAAAGGTTCTCCGGGTAATCCAGGTAAACCTGGTGAACCGGGCTCTAATGGTCCTCAAGGTGAACCTGGTTCCCAAGGCAACCCGGGTAAAAACGGCCAGCCAGGTTCCCCGGGTTCTCAAGGTTCTCCGGGTAACCAGGGCCAACCGGGTAAACCAGGCCAACCAGGTGAACAGGGTAGCCCGGGTAACCAGGGTCCAGCTGGTAACGAAGGTCCGAAAGGCCAGCCGGGTCAAAACGGTAAACCGGTTCCGGGTGTGGGCAACTCCGACTCTGAGTGTCCGCTGTCTCACGACGGCTACTGCCTGCACGATGGCGTGTGCATGTACATCGAAGCACTGGACAAATACGCGTGCAACTGTGTGGTTGGTTACATCGGCGAACGCTGTCAGTACCGTGACCTGAAGTGGTGGGAGCTGCGC
依据上述基因序列信息，分别合成A、B、C、D型类胶原融合蛋白基因片段。
实施例2：类胶原融合蛋白表达纯化
将上述A、B、C、D型类胶原融合蛋白基因片段插入pET28a载体，分别形成pET28a-A、pET28a-B、pET28a-C、pET28a-D表达质粒，质粒图谱如图1-4所示，转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中。经PCR验证后，选取成功转化的菌株作为基因工程菌保藏并标记。
分别挑取转化后的基因工程菌，接种至10mL含有20-100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，30-37℃培养至OD600达到0.4-0.7。按1％-5％接种量接种至100-300mL含有20-100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，30-37℃培养至OD600达到0.4-0.7后，加入IPTG使其终浓度为0.1-0.8mM，调整培养温度为15-28℃，继续培养8-12h。
培养完成后，在4℃，12,000rpm条件下，离心30min收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤1-2次。用破菌缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0)按1:5-1:10的比例重悬菌体，并在800-1,200bar压力下通过细胞破碎机破菌1-3次，在4℃，10,000rpm条件下分别离心收集上清，此时上清中含有大量的重组蛋白。
因纯化的蛋白含有His标签，纯化柱采用镍离子亲和柱(Ni-NTA，His-Bind Resin)柱材，用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)柱材，然后将柱材和重组蛋白上清液的溶液混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用PBS缓冲液平衡，再用含有15-20mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白；在柱上加入适量具有His标签的凝血酶，于室温或冰上轻摇2h，再用PBS缓冲液洗脱即可获得A、B、C、D型类胶原融合蛋白，经冻干后冷冻保存。
实施例3：A型类胶原融合蛋白的应用
修复液体：由重组人源A型类胶原融合蛋白(0.3％)、海藻糖3％、甘油5％、透明质酸钠(0.1％)、50mM柠檬酸缓冲液(pH 5.8)组成，经过滤后，无菌分装。
修复软膏：由重组人源A型类胶原融合蛋白(0.3％)及软膏基质组成。其中软膏基质由硬脂酸(3％)、硬脂酸甘油酯(1％)、液体石蜡(5.5％)、小分子硅酮(1.5％)、角鲨烷(2.5％)、三乙醇胺(0.45)、尿囊素(0.1％)、纯化水组成。软膏基质经乳化混匀后，降温至45℃。添加重组人源A型类胶原融合蛋白(0.3％)继续搅拌至完全均一。
本实施例所涉及产品，能够用于快速修复临床过程中因手术、烧伤、激光整形等原因形成的创面的材料。同时对于修复液体部分配方在一定调整下可以形成修复喷雾及修复面膜等产品。
同时将本实施例中的重组人源A型类胶原融合蛋白更换为重组人源C型类胶原融合蛋白或重组人源D型类胶原融合蛋白，即可对应辐射产生的皮肤及粘膜损伤具有较好的修复效果。
实施例4：B型类胶原融合蛋白的应用
将冻干后的重组人源B型类胶原融合蛋白，用预冷0.05M醋酸溶液重悬，调整浓度为6mg/ml标准溶液；
配置细胞培养液：取75ml的2×DMEM培养基加入20ml血清混合均一后，加入预先配置的25uM的Hepes缓冲液(pH7.6)5ml，充分混匀，过滤除菌。
加入软骨细胞至细胞浓度为2×105/mL，使用移液器轻柔混匀。加入等量的重组人源类胶原融合蛋白B型标准溶液，充分混匀后，转移至特定的模具内，37℃进行凝胶相变为固态凝胶。转移至细胞培养箱中培养一周，即可根据软骨缺损进行修剪后，在生物胶的作用下，粘结到缺损区。
将培养一周后的胶原块，无菌切除1×1cm大小，抽提RNA，分别利用I型胶原蛋白、II型胶原蛋白核酸探针进行RT-PCR检测各个细胞因子的表达丰度，证实在本发明的生物支架中预培养的软骨细胞具备初代细胞的分化能力及细胞代谢功能。
以上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Figure BDA0002554947710000121
Figure BDA0002554947710000131
Figure BDA0002554947710000141
Figure BDA0002554947710000151
Figure BDA0002554947710000161
Figure BDA0002554947710000171
Figure BDA0002554947710000181
Figure BDA0002554947710000191
Figure BDA0002554947710000201
Figure BDA0002554947710000211
Figure BDA0002554947710000221
Figure BDA0002554947710000231
Figure BDA0002554947710000241
SEQUENCE LISTING
<110> 亘元（天津）生物医药科技有限公司
<120> 类胶原融合蛋白组合物及制备方法
<130> 2020
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列Artificial sequence
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Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly
1               5                   10                  15
Ser Asn Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu Lys Gly Ser
            20                  25                  30
Gln Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Ala Gly Asn Gln Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly
    50                  55                  60
Ser Asn Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln
                85                  90                  95
Gly Gln Pro Gly Lys Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Ser Pro Gly
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Asn Gly Lys Pro
    130
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<212> PRT
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 3
Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro
            20                  25                  30
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<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 5
Lys His Ser Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Leu Glu Pro
1               5                   10                  15
His Ile Asn Ala Gln Ile Met Gln Leu His His Ser Lys His His Ala
            20                  25                  30
Ala Tyr Val Asn Asn Leu Asn Val Thr Glu Glu Lys Tyr Gln Glu Ala
        35                  40                  45
Leu Ala Lys Gly Asp Val Thr Ala Gln Thr Ala Leu Gln Pro Ala Leu
    50                  55                  60
Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Ile Phe Trp Thr Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Lys Gly Glu Leu Leu Glu Ala
                85                  90                  95
Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Lys Glu Lys Leu Thr
            100                 105                 110
Ala Ala Ser Val Gly Val Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Phe
        115                 120                 125
Asn Lys Glu Arg Gly His Leu Gln Ile Ala Ala Cys Pro Asn Gln Asp
    130                 135                 140
Pro Leu Gln Gly Thr Thr Gly Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile Asp Val
145                 150                 155                 160
Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Arg Pro Asp Tyr
                165                 170                 175
Leu Lys Ala Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp Glu Asn Val Thr Glu Arg
            180                 185                 190
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<212> PRT
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 6
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1               5                   10                  15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
            20                  25                  30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
        35                  40                  45
Trp Trp Glu Leu Arg
    50
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<212> PRT
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 7
Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Val Pro
            20                  25                  30
Gly Val Gly Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly
        35                  40                  45
Pro Asn Gly Leu Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala
    50                  55                  60
Pro Val Pro Gly Val Gly Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly
65                  70                  75                  80
Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ser Asn Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser
                85                  90                  95
Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Ala
            100                 105                 110
Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly
        115                 120                 125
Lys Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Ser
    130                 135                 140
Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln
145                 150                 155                 160
Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Lys Pro Gly Gln Pro Gly
                165                 170                 175
Glu Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Asn Glu Gly Pro
            180                 185                 190
Lys Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Lys Pro Val Pro Gly Val Gly Gly
        195                 200                 205
Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Leu
    210                 215                 220
Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro
225                 230                 235
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 8
Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
1               5                   10                  15
Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Pro
            20                  25                  30
Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Glu Pro
        35                  40                  45
Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ser Asn Gly
    50                  55                  60
Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Ser
65                  70                  75                  80
Asn Gly Asn Pro Gly Pro Ala Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys
                85                  90                  95
Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly
            100                 105                 110
Pro Gln Gly Glu Pro Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln
        115                 120                 125
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro
    130                 135                 140
Gly Lys Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ala Gly Asn Glu Gly Pro Lys Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Lys
                165                 170                 175
Pro Val Pro Gly Val Gly Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly
            180                 185                 190
Val Pro Gly Val Gly Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val
        195                 200                 205
Pro Gly Val Gly Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly
    210                 215                 220
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<212> PRT
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 9
Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
1               5                   10                  15
Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Pro
            20                  25                  30
Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Glu Pro
        35                  40                  45
Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ser Asn Gly
    50                  55                  60
Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Ser
65                  70                  75                  80
Asn Gly Asn Pro Gly Pro Ala Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys
                85                  90                  95
Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly
            100                 105                 110
Pro Gln Gly Glu Pro Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln
        115                 120                 125
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro
    130                 135                 140
Gly Lys Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ala Gly Asn Glu Gly Pro Lys Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Lys
                165                 170                 175
Pro Val Pro Gly Val Gly Lys His Ser Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp
            180                 185                 190
Tyr Gly Ala Leu Glu Pro His Ile Asn Ala Gln Ile Met Gln Leu His
        195                 200                 205
His Ser Lys His His Ala Ala Tyr Val Asn Asn Leu Asn Val Thr Glu
    210                 215                 220
Glu Lys Tyr Gln Glu Ala Leu Ala Lys Gly Asp Val Thr Ala Gln Thr
225                 230                 235                 240
Ala Leu Gln Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His
                245                 250                 255
Ser Ile Phe Trp Thr Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Lys
            260                 265                 270
Gly Glu Leu Leu Glu Ala Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe Asp Lys
        275                 280                 285
Phe Lys Glu Lys Leu Thr Ala Ala Ser Val Gly Val Gln Gly Ser Gly
    290                 295                 300
Trp Gly Trp Leu Gly Phe Asn Lys Glu Arg Gly His Leu Gln Ile Ala
305                 310                 315                 320
Ala Cys Pro Asn Gln Asp Pro Leu Gln Gly Thr Thr Gly Leu Ile Pro
                325                 330                 335
Leu Leu Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Lys
            340                 345                 350
Asn Val Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Ala Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp
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Glu Asn Val Thr Glu Arg
    370
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<212> PRT
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<400> 10
Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly
1               5                   10                  15
Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Pro
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Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Glu Pro
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Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ser Asn Gly
    50                  55                  60
Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Ser
65                  70                  75                  80
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            100                 105                 110
Pro Gln Gly Glu Pro Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln
        115                 120                 125
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro
    130                 135                 140
Gly Lys Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ala Gly Asn Glu Gly Pro Lys Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Lys
                165                 170                 175
Pro Val Pro Gly Val Gly Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His
            180                 185                 190
Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu
        195                 200                 205
Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys
    210                 215                 220
Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
225                 230                 235
<210> 11
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 11
atgggtgaac gtggtgcccc tggttttcgt ggtcctgctg gtccgaatgg tctgccgggt 60
gaaaaaggcc cggctggtga acgtggtgct ccagttccag gtgttggtgg cgaacgtggt 120
gctcctggct ttcgtggtcc agcaggtcct aacggcctgc caggtgaaaa aggcccagca 180
ggtgaacgtg gtgcaccagt acctggcgta ggcggtgagc caggtaaccc aggtaaaccg 240
ggttctccag gtccagctgg ttccaacggt gaaccaggtc cggctggttc ccctggtgag 300
aagggttctc agggttctaa cggtaacccg ggtcctgccg gtaatcaggg tcaaccaggc 360
aacaaaggtt cccctggtaa cccgggtaaa ccgggtgaac ctggctctaa tggtccgcag 420
ggtgaaccgg gtagccaagg taacccaggt aaaaacggtc aacctggttc tccaggcagc 480
cagggttctc caggtaacca gggtcagccg ggtaaacctg gtcagccggg tgaacaaggt 540
tccccaggca atcaaggccc tgccggtaac gaaggtccta agggtcaacc gggtcagaac 600
ggtaaaccgg ttccgggtgt tggtggtgaa cgtggcgcac caggttttcg tggtcctgct 660
ggtccgaatg gtctgcctgg tgaaaaaggt ccagcgggcg aacgtggcgc tccttaa 717
<210> 12
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 12
atgggtccac caggtccgtg ttgcggtggt ggtgttccag gtgtaggtgg tcctccaggt 60
ccttgttgtg gtggtggtgt tccaggtgtt ggcggtcctc caggcccttg ttgtggtggt 120
ggtgtaccgg gtgtcggtgg tgaaccaggt aacccgggta aaccgggttc tccaggtccg 180
gcaggttcta atggtgaacc tggtccagca ggttctccgg gtgaaaaagg cagccagggt 240
tccaacggca atcctggccc ggctggtaac caaggtcagc ctggtaataa aggttctcca 300
ggtaacccgg gtaagccggg tgaaccgggt tctaacggtc cgcaaggtga accgggttct 360
cagggtaatc caggcaaaaa cggccaacct ggttctccag gttcccaggg ttctccgggt 420
aaccagggcc aacctggtaa accaggccag ccaggtgaac aaggttctcc tggcaatcaa 480
ggtccagccg gtaacgaagg tcctaaaggc cagccgggtc agaacggtaa accggttcca 540
ggtgtaggcg gtcctccagg tccatgttgc ggtggtggtg taccgggtgt gggtggtcca 600
ccaggtccat gttgtggtgg tggtgtacca ggtgtaggtg gtccgcctgg tccatgctgt 660
ggtggtggtt aa 672
<210> 13
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 13
atgggtccac caggtccttg ttgtggtggt ggtgtacctg gtgtaggtgg tccgccaggt 60
ccatgttgtg gtggcggtgt accaggtgtt ggtggccctc caggtccatg ttgtggcggt 120
ggtgtcccgg gtgtaggtgg tgaaccaggt aacccaggta aaccgggttc tccgggccca 180
gcaggttcta acggtgaacc gggtccagca ggttctccgg gtgaaaaagg ttctcagggt 240
agcaatggta acccgggtcc ggctggtaat caaggtcagc ctggtaacaa aggcagccca 300
ggcaaccctg gtaaaccggg tgaaccgggt tctaacggtc cgcagggtga accgggttct 360
cagggtaacc cgggcaaaaa cggtcagccg ggctctcctg gttctcaagg ctcccctggc 420
aaccagggtc aacctggtaa accgggtcag cctggtgaac aaggtagccc aggtaaccag 480
ggtccggctg gtaacgaagg tccgaaaggc cagcctggcc agaacggtaa accggtaccg 540
ggtgtaggta aacatagcct gcctgacctg ccatacgatt acggcgctct ggaaccgcac 600
attaacgcac agattatgca gctgcaccac tctaaacatc acgctgctta cgttaataac 660
ctgaacgtca ctgaagagaa atatcaggaa gctctggcta aaggtgacgt tactgcgcag 720
actgcactgc agccagccct gaaattcaat ggtggtggtc acattaatca cagcatcttc 780
tggaccaacc tgagcccaaa cggtggtggc gaaccgaaag gcgaactgct ggaggctatc 840
aaacgtgact tcggcagctt tgacaaattt aaagaaaaac tgactgcagc gtccgtaggt 900
gttcaaggtt ctggctgggg ttggctgggt ttcaacaaag aacgtggtca cctgcagatc 960
gctgcatgcc cgaaccagga ccctctgcag ggtaccaccg gtctgatccc gctgctgggt 1020
attgatgttt gggaacacgc ctactacctg caatataaaa acgttcgccc ggactacctg 1080
aaagcaattt ggaacgttat caactgggaa aatgtcactg agcgttaa 1128
<210> 14
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial sequence
<400> 14
atgggtccac ctggtccttg ttgcggtggt ggtgtacctg gtgtaggtgg tccaccgggc 60
ccttgttgtg gtggtggtgt accaggcgtt ggtggtccgc caggtccatg ttgtggtggt 120
ggtgtgccgg gtgttggcgg tgaaccaggt aaccctggta aaccaggctc tccaggtcct 180
gcgggttcta acggtgaacc aggtccggca ggttctccgg gtgagaaagg tagccagggc 240
tccaatggta accctggccc ggcaggtaat caaggtcagc ctggtaataa aggttctccg 300
ggtaatccag gtaaacctgg tgaaccgggc tctaatggtc ctcaaggtga acctggttcc 360
caaggcaacc cgggtaaaaa cggccagcca ggttccccgg gttctcaagg ttctccgggt 420
aaccagggcc aaccgggtaa accaggccaa ccaggtgaac agggtagccc gggtaaccag 480
ggtccagctg gtaacgaagg tccgaaaggc cagccgggtc aaaacggtaa accggttccg 540
ggtgtgggca actccgactc tgagtgtccg ctgtctcacg acggctactg cctgcacgat 600
ggcgtgtgca tgtacatcga agcactggac aaatacgcgt gcaactgtgt ggttggttac 660
atcggcgaac gctgtcagta ccgtgacctg aagtggtggg agctgcgc 708

Claims (8)

1.类胶原融合蛋白组合物，其特征在于：类胶原融合蛋白包括依次连接的结构单元，基础结构和活性单元，符合式1结构通式；
nR1-Cg1-mR2           式1；
其中，R1为结构单元，R2为活性单元，Cg1为基础结构，Cg1为I型胶原蛋白的截短型蛋白序列，序列如SEQ No：1所示，m和n均为1-5的自然数；
R1为Cg2-E或Cg3-E，R2为E-Cg2、E-Cg3、E-SOD和E-EGF中的一种；E序列如SEQ No：4所示；Cg2和Cg3分别为II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的截短型蛋白序列，Cg2序列如SEQ No：2所示，Cg3序列如SEQ No：3所示；
SOD为超氧化物歧化酶截短型蛋白序列，序列如SEQ No：5所示；
EGF为表皮细胞因子截短型蛋白序列，序列如SEQ No：6所示。
2.根据权利要求1所述的类胶原融合蛋白组合物，其特征在于：序列如SEQ No：7、SEQNo：8、SEQ No：9或SEQ No：10所示。
3.权利要求1或2所述的类胶原融合蛋白组合物的制备方法，其特征在于：通过序列拼接技术生成类胶原融合蛋白序列，定向插入到原核表达载体中，经表达纯化后得到类胶原融合蛋白。
4.权利要求1或2所述的类胶原融合蛋白组合物在制备医学修补材料中的应用。
5.一种类胶原融合蛋白组合物在制备医学美容材料中的应用，其特征在于：类胶原融合蛋白结构通式如式2所示，
m（Cg3-E）-Cg1-n（E-Cg3）     式 2；
其中，m为2，n为1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：7所示。
6.一种类胶原融合蛋白组合物在制备软骨重建材料中的应用，其特征在于：类胶原融合蛋白结构通式如式3所示，
m（Cg2-E）-Cg1-n（E-Cg2）    式3；
其中， m为3，n为3，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：8所示。
7.一种类胶原融合蛋白组合物在制备辐射防护材料中的应用，其特征在于：类胶原融合蛋白结构通式如式4所示，
m（Cg3-E）-Cg1-n（E-SOD）    式4；
其中， m为3，n为1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：9所示。
8.一种类胶原融合蛋白组合物在制备皮肤创面修复材料中的应用，其特征在于：类胶原融合蛋白结构通式如式5所示，
m（Cg3-E）-Cg1-n（E-EGF）    式5；
其中，m为3，n为1，类胶原融合蛋白序列如SEQ No：10所示。
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