CN112941132A - 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法 - Google Patents
一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112941132A CN112941132A CN202110531695.6A CN202110531695A CN112941132A CN 112941132 A CN112941132 A CN 112941132A CN 202110531695 A CN202110531695 A CN 202110531695A CN 112941132 A CN112941132 A CN 112941132A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oligopeptide
- precipitate
- escherichia coli
- seq
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 27
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 9
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 6
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- PFAQXUDMZVMADG-AVGNSLFASA-N Cys-Gln-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O PFAQXUDMZVMADG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N Cys-Met-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N Cys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N Gly-Tyr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N Ile-Glu-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GYXVUTAOICLGKJ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GYXVUTAOICLGKJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- IYHRKILQAQWODS-VJBMBRPKSA-N Trp-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N IYHRKILQAQWODS-VJBMBRPKSA-N 0.000 description 1
- QJBWZNTWJSZUOY-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N QJBWZNTWJSZUOY-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079202 tyrosyl-alanyl-cysteine Proteins 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种利用大肠杆菌表达寡肽‑1的方法，所述寡肽‑1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，所述大肠杆菌中转染的质粒包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本发明的SEQ ID NO.1的核苷酸序列相比于常规的寡肽‑1的核苷酸序列以及针对大肠杆菌进行密码子优化的核苷酸序列能够更有效的提高发酵液中产物的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法。
背景技术
寡肽-1(又名表皮细胞生长因子)是人体内的一种活性物质，是由53个氨基组成的活性多肽。广泛存在于许多组织器官和体液中，可促进上皮细胞生长增殖，能够对皮肤起到保护作用。利用其促进皮肤组织细胞的增殖与生长，使年轻新生的细胞替代衰老的细胞，从而起到抗衰老和护肤保健等功能，添加于护肤品中有抗衰老、增加弹性等功能，对受损伤的皮肤能自动地进行护理、调养和修复。
寡肽-1是美国生化学家Stanley Cohen博士于1962年最先在小鼠下颌腺的提取液中发现，并提出该因子有直接促进皮肤粘膜的修复和表皮细胞的生长，并能使衰老的细胞逆分化为年轻细胞，有促进胶原蛋白和弹力蛋白的合成，能促进肉芽组织再生，延缓细胞衰老、滋养女性生殖器官、淡化皱纹与色斑的作用，它是人类医学与美学史上最伟大的发现之一。Stanley Cohen博士发现的EGF生长因子于1986年获国际诺贝尔生理医学奖。寡肽-1藉由刺激寡肽-1受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，对创伤、溃疡等受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效，对腔道粘膜有保湿、紧致、自净的作用。其最大特点是能够促进细胞的增殖逆分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。最初的寡肽-1主要被用于医学领域，以促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤、溃疡、促进伤口愈合、修复肠胃道、肝脏和眼角膜的损伤等，功效十分显著。现代临床早已将寡肽-1扩大应用于医疗耗材、人体保健及抗衰老的化妆品领域。因而，寡肽-1的制备合成面临全球市场需求量大，产品资源十分稀缺的问题。
虽然寡肽-1广泛存在于人体体液中，但含量极低，以提取的方式获得远远不能满足市场需求。尽管目前已有一些寡肽-1的基因工程生产方法，但均存在发酵液中产物浓度低，提取工艺复杂，操作成本高及收率低等缺点，至今尚未有成熟的基因工程下游生产技术生产寡肽-1。
中国专利申请CN105463006A公开了工程菌株RoEGF-1和用其制备EGF的方法，其包括根据大肠杆菌偏爱密码子合成hEGF基因；构建表达质粒pET27-S-EGF，能表达hEGF与标签S的融合蛋白；用表达质粒pET27-S-EGF转化宿主菌并筛选得到工程菌株RoEGF-1；将工程菌RoEGF-1在培养基中诱导表达rhEGF。
中国专利申请CN106279439A公开了一种含穿膜肽的寡肽-1融合新蛋白在大肠杆菌中的基因工程工业化生产方法，采用大肠杆菌通过种子培养，扩大发酵、菌体采集、破碎、裂解、分离纯化等工艺方法收集含穿膜肽的寡肽-1融合蛋白，发酵液中产物浓度大于100mg/L。
在本申请的在先申请CN106319002A中，公开了一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的制备方法，它是采用工程菌发酵从保存的菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中加入氨苄青霉素，摇床培养；扩张床吸附，用冷冻离心机将发酵液离心，弃沉淀保留发酵液，入扩张床，洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，洗脱液保存备用；凝胶分离，用层析系统将洗脱液加到凝胶层析柱中，缓冲洗脱液，保留吸收峰；经冷冻干燥获得。利用上述方法制得的寡肽-1，具有产量大的优点，通常大于400mg/L。
然而，如何进一步提高发酵液中产物浓度，提高发酵效率和降低生产成本，本领域仍然存在强烈需求。本申请技术人员在实施CN106319002A技术方案过程中发现部分批次中发酵液产物浓度较其它批次更高，经过深入比较和分析，发现主要原因为大肠杆菌中寡肽-1的核苷酸序列出现突变。
发明内容
基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法，以提高发酵液中产物的浓度。本发明采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法，所述寡肽-1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，所述大肠杆菌中转染的质粒包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本发明的SEQ ID NO.1的核苷酸序列相比于常规的寡肽-1的核苷酸序列以及针对大肠杆菌进行密码子优化的核苷酸序列能够更有效的提高发酵液中产物的浓度。
所述方法包括如下步骤：
(1) 大肠杆菌发酵；
(2)分离纯化宿主细胞的表达产物；
(3)冷冻干燥。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述步骤如下：
⑴大肠杆菌发酵：
将所述大肠杆菌接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基经摇床培养，按比例的接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其继续在摇床培养，之后，再按比例的接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中培养，然后温度诱导，继续培养一定时间；
⑵分离纯化宿主细胞的表达产物：
用冷冻离心机将发酵液离心，弃上清液保留沉淀保存备用；取适量沉淀，用数倍量的缓冲液溶解，经高压均质机处理，再用冷冻离心机将缓冲液离心，弃上清液，取沉淀用裂解液溶解，再离心，收集上清液，用层析系统将该上清液加入扩张床中，用缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用缓冲液以一定比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将复性液加入扩张床中，用精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用氯化钠和精氨酸缓冲液以一定比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，洗脱液在一定温度条件下保存备用；用层析系统将洗脱液加入到凝胶层析柱中，然后将精氨酸缓冲液洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集原液。
⑶冷冻干燥：
将收集液冷冻干燥，得白色干粉状寡肽-1。
本发明还涉及一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有可表达的SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
本发明还涉及上述大肠杆菌在制备寡肽-1中的应用，所述寡肽-1具有SEQ IDNO.4所述的氨基酸序列。
本发明还涉及一种质粒，其具有可表达的SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
本发明还涉及上述质粒在制备寡肽-1中的应用，所述寡肽-1具有SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列，所述质粒用于转染大肠杆菌。
有益效果
本发明的SEQ ID NO.1的核苷酸序列相比于常规的寡肽-1的核苷酸序列以及针对大肠杆菌进行密码子优化的核苷酸序列能够更有效的提高发酵液中产物的浓度。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1
⑴工程菌发酵：
从-80℃保存的菌种管中挑取单菌落（经测序，其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列）接入2-10ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到10-200ug/ml，28-32℃，50-250rpm摇床培养8-12小时，按1-8％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在10-200ug/ml，28-32℃，50-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，28-32℃，100-200rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时。寡肽-1表达于菌种中。
⑵分离纯化宿主细胞的表达产物：
用冷冻离心机将发酵液于2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于4℃条件下保存备用。取适量沉淀，用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-20℃条件下以6000-12000rpm的速度离心5-30min，弃上清液，取沉淀用10-40倍裂解液溶解，6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液。用层析系统将该上清液以1.5-40ml/min速度加入source 30Q离子交换扩张床中，用10mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠10mMTris缓冲液以3％比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰。再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将2000-4000ml的复性液以1-40ml/min的速度加入source 30Q离子交换扩张床中，用5mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.15M氯化钠5mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，洗脱液于2-18℃条件下保存备用。
用层析系统将上述洗脱液以1-10ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将5mM精氨酸缓冲液以1-10ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰。
⑶冷冻干燥：
将收集液于-35℃至-42℃下冷冻干燥，得白色干粉状寡肽-1。
利用上述方法重复三次，制得的寡肽-1的产量为680±78mg/。采用上述方法制备寡肽-1，提取工艺简单(只需要3步层析操作)，具有操作成本低及纯度高(98％以上)等特点，可进行成熟化工业生产，经济效益十分显著。
比较例1：
参照CN105463006A的实施例，将常规具有寡肽-1核苷酸序列的SEQ ID.2的质粒转染到大肠杆菌中，按照本发明实施例1的方法生产白色干粉状寡肽-1。同样重复三次，制得的寡肽-1的产量为380±59mg/。
比较例2：
参照CN105463006A的实施例，将进行密码子优化之后的具有寡肽-1核苷酸序列的SEQ ID.3的质粒转染到大肠杆菌中，按照本发明实施例1的方法生产白色干粉状寡肽-1。同样重复三次，制得的寡肽-1的产量为480±76mg/。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 烟台市华昕生物医药科技有限公司
<120> 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
aactctgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctgcacga cggtgtctgt 60
atgtacatcg aagctctgga caaatacgct tgcaactgcg ttgttggtta catcggcgag 120
cgttgccagt accgtgacct gaagtggtgg gaactgcgt 159
<210> 2
<211> 159
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
aattcagatt ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gccttcacga tggtgtttgc 60
atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg tgcaactgtg ttgttggtta catcggtgaa 120
cgttgccagt accgtgatct gaaatggtgg gaactgcgt 159
<210> 3
<211> 159
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
aactctgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctgcacga cggtgtttgc 60
atgtacatcg aagctctgga caaatacgct tgcaactgcg ttgttggtta catcggtgaa 120
cgttgccagt accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgt 159
<210> 4
<211> 53
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
Claims (7)
1. 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法，所述寡肽-1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，其特征在于所述大肠杆菌中转染的质粒包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 大肠杆菌发酵；
(2) 分离纯化宿主细胞的表达产物；
(3) 冷冻干燥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤如下：
(1)大肠杆菌发酵：
将所述大肠杆菌接入种子培养基，同时加入氨苄青霉素，经摇床培养，按比例的接种量将前述培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，继续摇床培养，再按比例的接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中培养，然后温度诱导，继续培养一定时间；
(2)分离纯化宿主细胞的表达产物：
用冷冻离心机将发酵液离心，弃上清液保留沉淀保存备用；取适量沉淀，用数倍量的缓冲液溶解，经高压均质机处理，再用冷冻离心机将缓冲液离心，弃上清液，取沉淀用裂解液溶解，再离心，收集上清液，用层析系统将该上清液加入扩张床中，用缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用缓冲液以一定比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将复性液加入扩张床中，用精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用氯化钠和精氨酸缓冲液以一定比例洗脱，收集含寡肽-1的洗脱峰，洗脱液在一定温度条件下保存备用；用层析系统将洗脱液加入到凝胶层析柱中，然后将精氨酸缓冲液洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集原液；
(3)冷冻干燥：
将收集液冷冻干燥，得白色干粉状寡肽-1。
4.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有可表达的SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的大肠杆菌在制备寡肽-1中的应用，所述寡肽-1具有SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列。
6.一种质粒，其具有可表达的SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
7.权利要求6所述的质粒在制备寡肽-1中的应用，所述寡肽-1具有SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列，所述质粒用于转染大肠杆菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110531695.6A CN112941132B (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110531695.6A CN112941132B (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112941132A true CN112941132A (zh) | 2021-06-11 |
| CN112941132B CN112941132B (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76233859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110531695.6A Active CN112941132B (zh) | 2021-05-17 | 2021-05-17 | 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112941132B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113801190A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-12-17 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 寡肽-1盐酸盐的制备方法 |
| CN113943766A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-01-18 | 守正创新生物科技(天津)有限公司 | 一种抗糖化寡肽-5（AdP）的制备及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840840A (en) * | 1990-04-17 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Selective RNase cytotoxic reagents |
| EP1364966A2 (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-26 | Alberta Research Council of Canada | Production of recombinant human epidermal growth factor in plants |
| WO2005012527A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-02-10 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof |
| CN105463006A (zh) * | 2014-09-12 | 2016-04-06 | 尹成凯 | 重组人表皮生长因子的新型制备方法 |
| CN107254472A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-10-17 | 江苏迈健生物科技发展股份有限公司 | 人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用 |
| CN111471636A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 旖肽(上海)生物科技有限公司 | 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 |
-
2021
- 2021-05-17 CN CN202110531695.6A patent/CN112941132B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5840840A (en) * | 1990-04-17 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Selective RNase cytotoxic reagents |
| EP1364966A2 (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-26 | Alberta Research Council of Canada | Production of recombinant human epidermal growth factor in plants |
| WO2005012527A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-02-10 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof |
| CN105463006A (zh) * | 2014-09-12 | 2016-04-06 | 尹成凯 | 重组人表皮生长因子的新型制备方法 |
| CN107254472A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-10-17 | 江苏迈健生物科技发展股份有限公司 | 人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用 |
| CN111471636A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-31 | 旖肽(上海)生物科技有限公司 | 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨云彭等: "密码子优化策略在异源蛋白表达中的应用", 《生物工程学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113801190A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-12-17 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 寡肽-1盐酸盐的制备方法 |
| CN113801190B (zh) * | 2020-06-12 | 2023-07-07 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 寡肽-1盐酸盐的制备方法 |
| CN113943766A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-01-18 | 守正创新生物科技(天津)有限公司 | 一种抗糖化寡肽-5（AdP）的制备及其应用 |
| CN113943766B (zh) * | 2021-11-26 | 2024-01-26 | 守正创新生物科技(天津)有限公司 | 一种抗糖化寡肽-5（AdP）的制备及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112941132B (zh) | 2021-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113621052B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 | |
| CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| CN112941132B (zh) | 一种利用大肠杆菌表达寡肽-1的方法 | |
| CN111944057B (zh) | 一种重组人胶原蛋白肽及其应用 | |
| CN113121705B (zh) | 用于制备短肽混合物的融合蛋白、目的多肽、短肽混合物的制备方法及应用 | |
| CN113683679B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l6t及其制备方法和用途 | |
| CN115521373B (zh) | 一种三螺旋重组人源化i型胶原蛋白、制备方法及其应用 | |
| CN113637068B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l5t及其制备方法和用途 | |
| CN113735966B (zh) | 一种抗肿瘤重组胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| JPS62174026A (ja) | 白血球減少症治療剤 | |
| CN113683680A (zh) | 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途 | |
| CN107459580A (zh) | 一种利用酵母菌表达含有穿膜肽的寡肽‑1（egf）创新制备工艺 | |
| CN112745385A (zh) | 重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用 | |
| CN109021071B (zh) | 肽及其制备方法和用途 | |
| CN108948151B (zh) | 肽及其制备方法和用途 | |
| CN116554309A (zh) | 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN113683681B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途 | |
| CN117285616B (zh) | 一种重组人源化i+iii型胶原蛋白及应用 | |
| CN117466992B (zh) | 一种纤连蛋白突变体及其制备和应用 | |
| CN114292315B (zh) | ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用 | |
| CN114292834B (zh) | 一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取i型胶原蛋白中的应用以及该i型胶原蛋白的用途 | |
| CN114410614B (zh) | Yh66_05415蛋白或其突变体在制备l-精氨酸中的应用 | |
| CN113788891B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l4t及其制备方法和用途 | |
| CN117551185A (zh) | 一种类人源弹性蛋白多肽及其制备方法和应用 | |
| CN115850525A (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 264000 No. 1, No. 17, Tianjin North Road, Yantai Economic and Technological Development Zone, Shandong Province Patentee after: Huaxin Biopharmaceutical (Shandong) Group Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 264001 No.1, No.17 Tianjin North Road, Yantai Economic and Technological Development Zone, Shandong Province Patentee before: YANTAI HUAXIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Country or region before: China |