CN116925207A - 重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明提供了脯氨酰‑4‑羟化酶和重组人源化胶原蛋白共表达的方法，利用本发明提供的方法构建的重组菌株能够成功表达具有三螺旋结构的重组人源化胶原蛋白，克服了大分子合成的困难，保留了胶原蛋白的生物活性，为胶原蛋白功能区的开发奠定基础。

Description

重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用
本申请要求于2023年05月31日提交中国专利局、申请号为202310638280.8、发明名称为“重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是人体中含量最多的蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，胶原蛋白维持细胞结构的完整性和各种生理功能。胶原蛋白是所有结缔组织的主要结构成分，也存在于几乎所有实质器官的间质组织中。在过去的十年里，人们对胶原蛋白的认识不断增加，胶原家族成员也迅速增多。经研究发现，在人体中，已经发现出20多种不同类型的胶原蛋白，大致可以分为以下几类：纤维形成胶原、基底膜胶原、微纤维胶原、锚原纤维、跨膜区胶原、未完全定性胶原。III型胶原蛋白为纤维胶原，广泛存在新生儿皮肤、血管中，能强化微血管强度和弹性，可提供细胞充足的养分，维持皮肤饱满，滑润，光泽，又被称为婴儿蛋白。但有研究发现它还有其他的功能，在组织中，III型胶原蛋白纤维的直径小于I型胶原，I型和III型胶原同时出现在一种胶原纤维时，III型胶原蛋白负责调节原纤维直径。III型胶原蛋白也存在于成人软骨中，有研究认为，在组织愈合过程中，III型胶原蛋白充当II型胶原蛋白和其他小胶原蛋白组成的纤维网络的修饰剂。此外，III型胶原蛋白还是大血管、子宫、肠道等中空器官的主要结构成分，作为细胞外基质蛋白，维持皮肤和组织器官的形态和结构，III型胶原蛋白还在凝血级联反应中与血小板相互作用，同时也是伤口愈合的重要信号分子。
目前国际研究只是针对III型胶原蛋白的Gly-Xaa-Yaa重组区域，或是III型胶原蛋白的一段氨基酸序列，或是III型胶原蛋白的a1合成方法，没有针对III型胶原蛋白特定功能区的序列进行开发。III型胶原蛋白中a 1链的411-518序列是COL3A1中活性的三重螺旋活性位点，在细胞粘附和配体重组中发挥重要作用。此序列中还含Glu-Lys-Gly和Glu-Arg-Gly三联体，增强该区域的细胞粘附性，而且含有三螺旋片段多个串联重复的重组蛋白使其具有更稳定的螺旋构象或更有利的配体结合构型，使三重螺旋区域具有高度的灵活性，有利于配体结合，细胞膜的附着和粘附或其他生物活性。通过构建人源的脯氨酸羟化酶，并与III型胶原蛋白特定功能区共表达，成功合成人源化胶原蛋白，并形成正确的三螺旋结构，能够填补国际中肽段不能形成正确螺旋结构的空白。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明利用真核表达体系共表达脯氨酸羟化酶和III型胶原蛋白特定区域，获得了重组人源化胶原蛋白。
本发明提供了重组人源化胶原蛋白，其结构为XnY；
其中，X为III型胶原蛋白a1链第411位～639位的片段，Y为III型胶原蛋白a1链第1158位～1199位的片段；1≤n≤30。
本发明所述人源化胶原蛋白氨基酸序列包括如下I～III中的任意一种：
(I)、如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、在如(I)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(Ⅲ)、与如(I)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
本发明提供了所述重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒；
S2、构建脯氨酰-4-羟化酶α亚基和/或β亚基的表达载体；
S3、将含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒和脯氨酰-4-羟化酶的表达载体共转化至宿主细胞中，得到共表达菌株；
S4、发酵培养工表达菌株，得到所述重组人源化胶原蛋白。
具体的，所述S1步骤中含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒依次包括骨架载体和启动子、编码权利要求1或2所述重组人源化胶原蛋白的核酸和终止子；
所述启动子选自T7启动子、sCMV启动子、Lac启动子、tac启动子、IPL启动子、araB启动子、AOX1启动子、trc启动子或trp启动子中的任一种；
所述终止子选自T7终止子、rrnB T1终止子、AOX1终止子、不依赖于ρ的终止子或依赖ρ的终止子中的任一种。
在一些具体的实施例中，所述含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒依次包括PcDNA3.1载体或pPICZα系列载体、AOX1启动子、编码权利要求1或2所述重组人源化胶原蛋白的核酸和AOX1终止子。
具体的，所述S2步骤中脯氨酰-4-羟化酶α亚基和/或β亚基的表达载体包括编码脯氨酰-4-羟化酶的核酸和PcDNA3.1载体。
具体的，所述S3步骤中的宿主细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、哺乳动物细胞中的任意一种或多种。在一些具体的实施例中，所述宿主细胞为毕赤酵母和/或CHO细胞。
本发明提供了表达单元，其包括启动子、本发明所述编码胶原蛋白的核酸和终止子。
进一步的，所述的表达单元包括本发明所述的核酸以单个或多个串联形式与所述启动子、终止子组成的表达单元，本发明对此不做限定。
本发明中还提供了含有所述的核酸或所述的表达模块的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。本发明中所述启动子选自T7启动子、sCMV启动子、Lac启动子、tac启动子、IPL启动子、araB启动子、trc启动子或trp启动子中的任一种；所述终止子选自T7终止子、rrnB T1终止子、不依赖于ρ的终止子或依赖ρ的终止子中的任一种。
具体的，在一些实施例中，本发明所述的表达单元还可以包括增强子、内含子、辅助因子、转录元件或其他特异性元件。例如本发明所述的表达单元可以包括启动子、增强子、转录元件、本发明所述的编码胶原蛋白的核酸中的任一种和终止子。本发明对此不作限定，任何包含有本发明所述编码胶原蛋白的核酸的表达单元都在本发明的保护范围之内。
在另一些实施例中，本发明所述的表达单元依次包括AOX1启动子、编码胶原蛋白的核酸和AOX1终止子。与其他启动子和终止子相比，本发明所利用的AOX1启动子和AOX1终止子具有高度的特异性，能够增加基因的转录速率，准确控制DNA的转录终止。
本发明提供了表达载体，其包括骨架载体和本发明所述的编码胶原蛋白的核酸；或包括骨架载体和本发明所述的表达单元。所述骨架载体包括pUC系列载体、pCAMBIA系列载体、pPICZα系列载体、pSC系列载体、pET系列载体。其可以是穿梭载体、噬菌体或病毒载体，本发明对此不做限定。通过对骨架载体的筛选，发现将本发明所述的核酸或表达单元构建到pPICZα系列载体上，其表达量更高。因此在本发明的实施例中，骨架载体优选为pPICZαB。
本发明所述的表达载体，是指核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对细菌中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。本发明中所述的表达载体包括质粒载体，其可为线形，也可为环形，其可以为单链的也可为双链的，本发明对此不做限定。本发明所述的表达载体，包含有如前所述的胶原蛋白编码核酸的表达单元。进一步的，本发明所述的表达载体，还包括脯氨酰-4-羟化酶编码核酸的表达单元。
所述脯氨酰-4-羟化酶编码核酸和本发明提供的表达单元不在同一个表达载体中，则本发明还提供了质粒组合，其包括本发明所述的编码胶原蛋白核酸的质粒载体，和含有脯氨酰-4-羟化酶编码核酸的重组质粒。所述含有脯氨酰-4-羟化酶编码核酸的重组质粒包括PcDNA3.1载体、pPICZα系列载体和SEQ ID NO：2～6任一项所示的核苷酸序列。
所述脯氨酰-4-羟化酶的编码核酸包括P4Hα的核酸和/或P4Hβ的核酸，两个核酸可以在同一个表达单元也可以在两个表达单元。当在同一个表达单元中时，编码P4Hα的核酸和编码P4Hβ的核酸共用同一个启动子和终止子。
所述编码脯氨酰-4-羟化酶的核酸为优化后的具有毕赤酵母偏好性的核酸序列，其密码子适应指数升高，GC含量均在41％～43％之间，能够在宿主体内稳定表达。相对于脯氨酰-4-羟化酶的其他编码核酸，本发明提供的所述核酸在真核表达体系中的表达量更高，表达产物活性更高。
本发明提供了宿主，其包括如下I)或II)所示中的至少一种：
I)、基因组整合本发明所述的编码胶原蛋白的核酸或所述的表达单元；
II)、转染或转化本发明所述的表达载体或质粒组合。
本发明中，表达载体或质粒组合转染或转化进入宿主；所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。在本发明的实施例中，质粒组合通过电转染或化学转染的方式进入宿主。
进一步的，本发明所述的宿主包括细菌、真菌、病毒或动物。所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于大肠杆菌。所述真菌包括霉菌、酵母、蕈菌；所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、毕赤酵母和假丝酵母等。所述病毒包括但不限于包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、朊病毒。所述动物包括人、鼠、兔、猪、斑马鱼等。
具体的，在一些实施例中，本发明所述的宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、哺乳动物细胞中的任意一种或多种。优选为毕赤酵母和CHO细胞。
本发明提供了所述的表达单元、表达载体、质粒组合或宿主在制备III型胶原蛋白中的应用。
本发明提供了重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括发酵培养本发明所述的宿主细胞。具体的，将构建成功的重组菌株接种到YPD培养基中，培养总体积为3L，使溶解氧保持在40％左右，培养18-96h时间，取细胞上清液裂解获得重组人源化胶原蛋白。
本发明提供了重组人源化胶原蛋白，其由上述制备方法制备获得。
本发明还提供了所述重组人源化胶原蛋白在具有修复功能填充支撑的产品、药物缓控释制剂、疫苗保护剂和稳定剂或药品中的应用。所述产品包括食品、化妆品、药品或保健品等；所述化妆品原料包括用于美白，抗衰，修复，抗皱，紧致皮肤等的原料；所述药品包括用于治疗痔疮、硬化症等疾病的药品。
本发明提供的重组人源化胶原蛋白还可用于制备可用作组织工程材料、医疗美容材料，包括填充组织凹陷，例如额头纹、鱼尾纹、法令纹、颈纹、及全身皮肤皱纹，修复破损皮肤，淡化细纹，美白，抗衰，紧致皮肤；用于制备生物支架材料、药物的缓控释材料、治疗皮肤问题的产品、疫苗保护剂或稳定剂、止血材料。用此原料做创口敷料，修护受损皮肤，促进细胞黏附，增值，迁移，从而避免疤痕产生。用此原料做水光针，可以促进胶原再生，美白，滋润。此原料与人工骨复合，能提高生物相容性，促进骨细胞生长和爬行。
本发明找到人III型胶原a1链的特定功能的序列411-639，并将特定功能区重复拼接n次，1≤n≤30，再加上III型胶原蛋白a1链的功能序列1158-1199，利用脯氨酸羟化酶与目的蛋白共表达，获得了稳定的具有三螺旋结构目的蛋白，此蛋白有利于配体结合，细胞膜的附着和粘附，具有很好力学性能，促进细胞增值和再生或其他生物活性。本发明提供的III型胶原蛋白特定功能区的合成方法，克服了真核表达系统的缺点和重组人源化III型胶原蛋白合成困难的问题。使脯氨酸羟基化程度更高，解决不能使脯氨酸羟基化，或羟基化程度低的问题。利用本发明合成的胶原蛋白能够与细胞表面受体整合素的相互作用在细胞粘附、迁移、增殖和分化中发挥作用，能够广泛应用于医疗领域。
附图说明
图1示P4Hα1的核酸序列优化结果；
图2示P4Hβ的核酸序列优化结果；
图3示rhP4H粗酶液SDS-PAGE鉴定图；
图4示重组人源化III型胶原蛋白鉴定图；
图5示电转染之后细胞状态染色图；
图6示三螺旋结构检测图；
图7示生物活性检测图；
图8示工艺流程图；
图9示羟脯氨酸含量测定直线回归方程。
具体实施方式
本发明提供了重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1毕赤酵母表达体系
将P4Hα1和P4Hβ其中任何一种或两种进行双酶切融合连接到真核表达体系的载体上,构建重组质粒，用于毕赤酵母重组菌种的转化；其中P4Hα，P4Hβ包括所有的亚系。
1.1、构建脯氨酰-4-羟化酶的α亚基(C-P4Hα)和β亚基(P4Hβ)的重组表达质粒
NCBI上分别选取人源P4Hα基因序列和P4Hb基因序列如下：
羟化酶P4Hα1的氨基酸序列(SEQ.ID NO.5)：
MIWYILIIGILLPQSLAHPGFFTSIGQMTDLIHTEKDLVTSLKDYIKAEEDKLEQIKKWAEKLDRLTSTATKDPEGFVGHPVNAFKLMKRLNTEWSELENLVLKDMSDGFISNLTIQRQYFPNDEDQVGAAKALLRLQDTYNLDTDTISKGNLPGVKHKSFLTAEDCFELGKVAYTEADYYHTELWMEQALRQLDEGEISTIDKVSVLDYLSYAVYQQGDLDKALLLTKKLLELDPEHQRANGNLKYFEYIMAKEKDVNKSASDDQSDQKTTPKKKGVAVDYLPERQKYEMLCRGEGIKMTPRRQKKLFCRYHDGNRNPKFILAPAKQEDEWDKPRIIRFHDIISDAEIEIVKDLAKPRLRRATISNPITGDLETVHYRISKSAWLSGYENPVVSRINMRIQDLTGLDVSTAEELQVANYGVGGQYEPHFDFARKDEPDAFKELGTGNRIATWLFYMSDVSAGGATVFPEVGASVWPKKGTAVFWYNLFASGEGDYSTRHAACPVLVGNKWVSNKWLHERGQEFRRPCTLSELE
羟化酶P4Hα2的氨基酸序列(SEQ.ID NO.6)：
mklwvsallmawfgvlscvqaefftsighmtdliyaekelvqslkeyilveeaklskikswankmealtsksaadaegylahpvnayklvkrlntdwpaledlvlqdsaagfianlsvqrqffptdedeigaakalmrlqdtyrldpgtisrgelpgtkyqamlsvddcfgmgrsaynegdyyhtvlwmeqvlkqldageeatttksqvldylsyavfqlgdlhralelt rrllsldpsheraggnlryfeqlleeerektltnqteaelatpegiyerpvdylperdvyeslcrgegvkltprrqkrlfcryhhgnrapqlliapfkeedewdsphivryydvmsdeeierikeiakpklaratvrdpktgvltvasyrvsksswleedddpvvarvnrrmqhitgltvktaellqvanygvggqyephfdfsrrpfdsglktegnrlatflnymsdveaggatvfpdlgaaiwpkkgtavfwynllrsgegdyrtrhaacpvlvgckwvsnkwfhergqeflrpcgstevd
羟化酶P4Hα3的氨基酸序列(SEQ.ID NO.7)：
mgpgarlaallavlalgtgdperaaargdtfsaltsvaralaperrllgllrrylrgeearlrdltrfydkvlslhedsttpvanpllaftlikrlqsdwrnvvhsleaseniralkdgyekveqdlpafedlegaaralmrlqdvymlnvkglargvfqrvtgsaitdlyspkrlfsltgddcfqvgkvaydmgdyyhaipwleeavslfrgsygewktedeasledaldhlafayfragnvscalslsrefllyspdnkrmarnvlkyerllaespnhvvaeaviqrpniphlqtrdtyeglcqtlgsqptlyqipslycsyetnsnaylllqpirkevihlepyialyhdfvsdseaqkirelaepwlqrsvvasgekqlqveyrisksawlkdtvdpklvtlnhriaaltgldvrppyaeylqvvnygigghyephfdhatspssplyrmksgnrvatfmiylssveaggatafiyanlsvpvvrnaalfwwnlhrsgegdsdtlhagcpvlvgdkwvankwiheygqefrrpcsssped
羟化酶P4Hα4的氨基酸序列(SEQ.ID NO.8)：
mgpgarlaallavlalgtgdperaaargdtfsaltsvaralaperrllgllrrylrgeearlrdltrfydkvlslhedsttpvanpllaftlikrlqsdwrnvvhsleaseniralkdgyekveqdlpafedlegaaralmrlqdvymlnvkglargvfqrvtgsaitdlyspkrlfsltgddcfqvgkvaydmgdyyhaipwleeavslfrgsygewktedeasledaldhlafayfragnvscalslsrefllyspdnkrmarnvlkyerllaespnhvvaeaviqrpniphlqtrdtyeglcqtlgsqptlyqipslycsyetnsnaylllqpirkevihlepyialyhdfvsdseaqkirelaepwlqrsvvasgekqlqveyrisksawlkdtvdpklvtlnhriaaltgldvrppyaeylqvvnygigghyephfdhatspssplyrmksgnrvatfmiylssveaggatafiyanlsvpvvrhcfggtctgvvkgtvthfmlavlswweisgwptsgymsmdrnsadpaapalktellaerswwspvafqrsqepkagvgeekaeqppgrrpcqlclclanqrqgrgcyqgtlrmyi
羟化酶P4Hβ的氨基酸序列(SEQ.ID NO.9)：
MLRRALLCLAVAALVRADAPEEEDHVLVLRKSNFAEALAAHKYLLVEFYAPWCGHCKALAPEYAKAAGKLKAEGSEIRLAKVDATEESDLAQQYGVRGYPTIKFFRNGDTASPKEYTAGREADDIVNWLKKRTGPAATTLPDGAAAESLVESSEVAVIGFFKDVESDSAKQFLQAAEAIDDIPFGITSNSDVFSKYQLDKDGVVLFKKFDEGRNNFEGEVTKENLLDFIKHNQLPLVIEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQELPEDWDKQPVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVFVEFYAPWCGHCKQLAPIWDKLGETYKDHENIVIAKMDSTANEVEAVKVHSFPTLKFFPASADRTVIDYNGERTLDGFKKFLESGGQDGAGDDDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAVKDEL
按照密码子偏好性原则，将羟化酶P4Hα1和羟化酶P4Hβ的核酸序列进行5'区域优化(翻译起始效率)、DNA重复序列、mRNA二级结构、GC含量、SD序列、以及排除指定的限制性内切酶位点等，优化成具有毕赤酵母偏好性的DNA序列，根据P4Hα1和P4Hβ序列信息选取限制性内切酶进行全序列合成。
羟化酶P4Hα1的核酸序列(SEQ.ID NO.3)：
CTGTGAACGCCTTCAAGCTGATGAAACGGCTGAACACCGAGTGGTCCGAGCTGGAGAATCTCGTGCTGAAGGACATGAGCGACGGCTTCATCTCTAATCTGACCATCCAGCGGCAGTACTTTCCTAACGACGAGGACCAGGTGGGCGCTGCCAAGGCTCTGCTGCGGCTGCAGGACACCTACAACCTGGACACAGATACCATCTCTAAGGGCAACCTGCCCGGCGTGAAGCACAAGAGCTTCCTGACCGCCGAGGACTGCTTCGAGCTGGGCAAGGTGGCCTACACCGAGGCCGACTACTACCACACCGAGCTGTGGATGGAACAGGCGCTGCGGCAGCTGGACGAAGGCGAAATCTCTACCATCGACAAAGTGAGCGTCCTGGACTACCTGTCCTACGCCGTGTACCAGCAGGGCGACCTGGACAAGGCCCTGCTGCTGACCAAGAAGCTGCTGGAGCTGGACCCTGAGCACCAGAGAGCCAACGGCAACCTGAAGTACTTCGAGTACATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACAGAAGTATGAGATGCTGTGCAGAGGCGAGGGCATTAAGATGACCCCTAGAAGACAGAAGAAGCTGTTCTGCAGATACCATGACGGCAACAGAAATCCAAAGTTCATCCTGCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTGCTGTGGACTACCTGCCTGAAAGACCATCATGGCCAAAGAGAAGGACGTCAACAAATCTGCCTCTGATGATCAGTCCGACCAGAAGACCACACCCAAGAAGAAGGGCGTTG
羟化酶P4Hβ的核酸序列(SEQ.ID NO.4)：
CAAGCTGAAGGCTGAAGGCTCTGAGATCAGACTGGCCAAAGTGGACGCCACAGAGGAGTCCGACCTGGCTCAGCAGTACGGCGTCAGAGGCTACCCTACCATCAAGTTCTTCCGGAATGGCGACACCGCTTCTCCTAAAGAGTACACCGCTGGCAGAGAGGCCGACGACATCGTGAACTGGCTGAAGAAACGGACCGGACCTGCTGCCACCACCCTGCCAGACGGCGCCGCTGCCGAGTCTCTGGTGGAGAGCTCCGAGGTGGCTGTGATCGGCTTCTTCAAGGACGTGGAATCTGACTCCGCCAAGCAGTTCCTGCAGGCCGCCGAGGCCATCGATGATATCCCCTTCGGCATCACCTCCAACTCCGACGTGTTCTCCAAGTACCAGCTGGACAAGGACGGCGTGGTGCTGTTCAAGAAGTTCGATGAGGGCCGGAACAACTTCGAGGGCGAAGTGACCAAAGAGAACCTGCTGGACTTCATCAAGCACAACCAGCTGCCTCTGGTTATCGAGTTTACAGAACAGACCGCCCCTAAGATCTTTGGAGGCGAGATCAAGACCCACATCCTGCTGTTTCTGCCTAAGTCCGTGTCTGATTACGACGGAAAACTGTCCAATTTCAAAACCGCCGCCGAGTCCTTCAAGGGAAAGATCCTGTTTATCTTCATCGACTCTGACCACACCGACAACCAGAGAATCCTGGAGTTCTTCGGCCTGAAAAAAGAAGAGTGTCCTGCCGTGCGGCTGATCACTCTTGAGGAAGAGATGACCAAGTATAAGCCCGAATCTGAAGAACTGACCGCTGAGCGGATCACCGAGTTCTGCCATAGATTCCTGGAAGGCAAGATCAAGCCTCACCTGATGTCCCAAGAGCTGCCCGAGGACTGGGACAAGCAGCCTGTGAAGGTGCTGGTCGGAAAGAACTTCGAGGACGTGGCCTTCGACGAGAAGAAGAACGTGTTCGTGGAGTTCTACGCTCCTTGGTGTGGCCACTGCAAGCAACTAGCTCCTATCTGGGATAAGCTGGGCGAGACATACAAGGATCACGAGAACATTGTGATCGCCAAGATGGACTCCACCGCCAACGAGGTGGAAGCCGTCAAGGTGCACAGCTTCCCTACACTGAAGTTTTTCCCAGCTAGCGCAGACAGAACCGTGATCGACTACAACGGCGAGAGGACCCTGGATGGCTTCAAGAAATTTCTCGAGTCCGGCGGCCAGGACGGCGCTGGCGACGATGACGATCTGGAAGACCTGGAAGAAGCTGAGGAGCCTGACATGGAAGAAGATGATGACCAGAAGGCCGTGAAGGACGAGCTGTACCCCTACGATGTGCCCGACTACGCTTGATGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTG
如图1～2所示，P4Hα1的核酸序列优化后，CAI从0.77升高至0.84，GC含量从41.62％变为42.07％。P4Hβ的核酸序列优化后，CAI从0.69升高至0.83，GC含量从56.25％变为41.93％。
随后分别将优化后的DNA序列进行双酶切连接到真核表达体系的质粒上构建重组质粒。
1.2、rh C-P4H重组毕赤酵母工程菌的获取
(1)重组质粒扩增
取上述质粒2-5μL，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α30-60μL(冰上放置)，混匀后冰浴静止30min，混合后悬液置于干式恒温仪中，温度设置为42℃放置90s，取出后再冰浴3min，加入500μL无抗生素的LB培养基，恒温摇床160-200rpm，37℃，培养2-3h。取20-40μL菌液均匀涂在5-20μg/mL Zecion抗生素的LB平板上，恒温培养箱37℃培养16-18h，挑取平板上单克隆，接种于10mL含10μg/mL Zecion抗生素的LB培养基中，于160-200rpm，37℃，培养13-16h。
(2)重组质粒提取、鉴定及线性化
使用质粒提取试剂盒从上述培养液中提取质粒，分别得到重组质粒，并测定浓度。根据基因序列设计上下游引物，正反向进行3次测序比对。
鉴定成功则使用酶对质粒进行双酶切。酶切反应体系如下：
10X CutSmart@Buffer 5μL
重组人源化胶原蛋白和脯氨酸羟化酶共表达的重组质粒 4μL
ddH2O 39μL
BamH I 1μL
Not I 1μL
将配置好的反应液置于PCR仪上，37℃酶切1-3h。再调温度至60-80℃，10min失活。酶切及线性化后的质粒使用Wizard SV Geland PCR Clean-Up System清洁试剂盒按操作说明进行纯化，留样少许进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余置于-20℃存储备用。
(3)成型酵母感受态细胞制备
取X33表达菌或GS115表达菌株或其他酵母菌株100-200μL接种至200mLYPD培养基中，200-250rpm、25℃-30℃，过夜培养。至OD600nm＝1.2～1.5。将细胞培养物于4℃，1500rpm离心5min，用20mL无菌水重悬。菌体，重复2次后将重悬液置于4℃，1500rpm离心5min，用5mL无菌水重悬菌体，并加入50-70μLDTT混匀室温放置20min。随后将重悬液置于4℃，1500rpm离心5min，用500μL的1M山梨醇重悬菌体，重复两次。
(4)重组质粒电转化，制备感受态细胞方法如下：
a)将电转杯浸泡于75％酒精20min以上，紫外灯照射20min，吹干代用；
b)电转杯中加入20-100μLX感受态细胞，及不低于4μg的线性化重组质粒，冰浴中静止10min后电击，电击条件设置为电压：1.5KV；电容25μF；电阻200-400W，电击10msec；
c)加入2mL4℃预冷的1M山梨醇溶液将菌体用枪头轻轻混匀，转至2.5mL的EP管中；
d)将菌体重悬液涂布于含有Zecion抗生素的YPD平板上，置于恒温培养48h，至出现单个菌落。
1.3、III型胶原蛋白特定氨基酸序列在共表达重组人源胶原蛋白和脯氨酰羟化酶的毕赤酵母菌株中分别表达及鉴定
III型胶原蛋白中a1链第411位～639位和第1158位～1199位片段氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)：
(gargppgpagangapglrggagepgkngakgepgprgergeagipgvpgakgedgkdgspgepganglpgaagergapgfrgpagpngipgekgpagergapgpagprgaagepgrdgvpggpgmrgmpgspggpgsdgkpgppgsqgesgrpgppgpsgprgqpgvmgfpgpkgndgapgkngerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgpggdkgdtgppgpqg)n+gpigppgprgnrgergsegspghpgqpgppgppgapgpccgg(1≤n≤30)(在本实施例中以n＝2为例进行构建)
III型胶原蛋白中a 1链第411位～639位和第1158位～1199位片段的核苷酸序列(SEQ.ID NO.2)：
(GGAGCCCGGGGTCCTCCAGGACCAGCCGGTGCTAATGGTGCTCCTGGACTGCGAGGTGGTGCAGGTGAGCCTGGTAAGAATGGTGCCAAAGGAGAGCCCGGACCACGTGGTGAACGCGGTGAGGCTGGTATTCCAGGTGTTCCAGGAGCTAAAGGCGAAGATGGCAAGGATGGATCACCTGGAGAACCTGGTGCAAATGGGCTTCCAGGAGCTGCAGGAGAAAGGGGTGCCCCTGGGTTCCGAGGACCTGCTGGACCAAATGGCATCCCAGGAGAAAAGGGTCCTGCTGGAGAGCGTGGTGCTCCAGGCCCTGCAGGGCCCAGAGGAGCTGCTGGAGAACCTGGCAGAGATGGCGTCCCTGGAGGTCCAGGAATGAGGGGCATGCCCGGAAGTCCAGGAGGACCAGGAAGTGATGGGAAACCAGGGCCTCCCGGAAGTCAAGGAGAAAGTGGTCGACCAGGTCCTCCTGGGCCATCTGGTCCCCGAGGTCAGCCTGGTGTCATGGGCTTCCCCGGTCCTAAAGGAAATGATGGTGCTCCTGGTAAGAATGGAGAACGAGGTGGCCCTGGAGGACCTGGCCCTCAGGGTCCTCCTGGAAAGAATGGTGAAACTGGACCTCAGGGACCCCCAGGGCCTACTGGGCCTGGTGGTGACAAAGGAGACACAGGACCCCCTGGTCCACAAGGA)n+GGTCCCATTGGACCACCAGGGCCTCGAGGTAACAGAGGTGAAAGAGGATCTGAGGGCTCCCCAGGCCACCCAGGGCAACCAGGCCCTCCTGGACCTCCTGGTGCCCCTGGTCCTTGCTGTGGTGGT(1≤n≤30)(在本实施例中以n＝2为例进行构建)
将此段氨基酸序列的DNA序列进行双酶切连接到含脯氨酰羟化酶的毕赤酵母菌株中，构建重组人源化胶原蛋白和脯氨酸羟化酶共表达的菌株。
1.4、重组人源化胶原蛋白和脯氨酸羟化酶共表达的菌株的获取
(1)重组质粒扩增
取上述质粒2-5μL，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α30-60μL(冰上放置)，混匀后冰浴静止30min，混合后悬液置于干式恒温仪中，温度设置为42℃放置90s，取出后再冰浴3min，加入500μL无抗生素的LB培养基，恒温摇床160-200rpm，37℃，培养2-3h。取20-40μL菌液均匀涂在5-20μg/mL Zecion抗生素的LB平板上，恒温培养箱37℃培养16-18h，挑取平板上单克隆，接种于10mL含10μg/mLZecion抗生素的LB培养基中，于160-200rpm，37℃，培养13-16h。
(2)重组质粒提取、鉴定及线性化
使用质粒提取试剂盒从上述培养液中提取质粒，分别得到重组质粒，并测定浓度。根据基因序列设计上下游引物，正反向进行3次测序比对。
鉴定成功则使用酶对质粒进行双酶切，酶切反应体系如下：
10X CutSmart@Buffer 5μL
重组人源化胶原蛋白和脯氨酸羟化酶共表达的重组质粒 4μL
ddH2O 39μL
BamH I 1μL
Not I 1μL
将配置好的反应液置于PCR仪上置于PCR以上，37℃酶切1-3h。再调温度至60-80℃，10min失活。酶切及线性化后的质粒使用Wizard SV Geland PCR Clean-Up System清洁试剂盒按操作说明进行纯化，留样少许进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余置于-20℃存储备用。
(3)成型酵母感受态细胞制备
取X33表达菌或GS115表达菌株或其他酵母菌株100-200μL接种至200mL YPD培养基中，200-250rpm、25℃-30℃，过夜培养。至OD600nm＝1.2～1.5。将细胞培养物于4℃，1500rpm离心5min，用20mL无菌水重悬。菌体，重复2次后将重悬液置于4℃，1500rpm离心5min，用5mL无菌水重悬菌体，并加入50-70μL DTT混匀室温放置20min。随后将重悬液置于4℃，1500rpm离心5min，用500μL的1M山梨醇重悬菌体，重复两次。
(4)重组质粒电转化，制备感受态细胞方法如下：
a)将电转杯浸泡于75％酒精20min以上，紫外灯照射20min，吹干代用；
b)电转杯中加入20-100μLX感受态细胞，及不低于4μg的线性化重组质粒，冰浴中静止10min后电击，电击条件设置为电压：1.5KV；电容25μF；电阻200-400W，电击10sec；
c)加入2mL4℃预冷的1M山梨醇溶液将菌体用枪头轻轻混匀，转至2.5mL的EP管中；
d)将菌体重悬液涂布于含有Zecion抗生素的YPD平板上，置于25℃-30℃恒温培养48h，至出现单个菌落。
将含有重组质粒在工程菌中进行培养，具体实施方案如下:
(1)分别挑取活化后含有重组质粒的工程菌接种于20mL的YPD培养基中，200-260rpm、25℃-30℃，培养18-24h。按2％接种量吸取培养液于25mL的YPG培养基中，200-260rpm、25℃-30℃，培养18-20h至OD600＝2.1。
(2)将上述培养液2000-4000rpm离心10min收集菌体，用20-50mL的YPM重悬菌体并置于250mL的三角瓶中，200-260rpm、、25℃-30℃，培养36-72h。将获得的发酵液，10000-15000rpm离心5min，取上清即得rhP4H粗酶液。通过SDS-PAGE进行鉴定，鉴定结果如图3所示。
实施例2CHO表达体系
2.1、构建质粒
将优化后的羟化酶P4Hα1、羟化酶P4Hβ的核酸序列和III型胶原蛋白中特定氨基酸的核酸序列分别构建到哺乳动物细胞的载体上。步骤如下：
将P4Hα，P4Hβ进行双酶切连接到哺乳动物的载体上，在用双酶切的方式将III型胶原蛋白中特定氨基酸的核酸序列SEQ.ID NO.1构建到哺乳动物细胞的载体上。
2.2、将两种质粒以1：5到1：20的比例，转化到CHO细胞表达体系中。步骤如下：
(1)将电转杯浸泡于75％酒精20min以上，紫外灯照射20min，吹干代用；
(2)细胞密度为1x10^6-5x10^8cells/ml，质粒用量为2-20μg，电转液体积为50-100μl，电压为50V-150V，电容为600μF-950μF。
(3)电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
(4)将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
(5)正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的培养基，以去除上层的死细胞。
2.3、CHO细胞复苏、传代、转化、培养、蛋白鉴定
2.3.1、细胞复苏
(1)从液氮中取出细胞冻存管，快速将其置入37℃水浴中解冻直至冻存管中无结晶，75％的酒精擦拭冻存管外壁；
(2)将冻存管中的细胞移至含6mL完全培养基的15mL离心管中，1000--2000rpm离心5-10min；
(3)弃上清，沉淀用6mL完全培养基重悬，接种25cm2培养瓶，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
2.3.2、传代
贴壁细胞：
(1)细胞生长至覆盖培养瓶的80％-90％面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
(2)添加0.25％胰蛋白酶消化液约1mL-3mL至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5mL完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，
将悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5min；
(3)弃上清，沉淀细胞用1-2mL完全培养基重悬，按1:2比例进行分瓶传代，
补加培养基后放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
悬浮细胞:
待细胞达到1x10^6/ml～1x10^9/ml左右，可按照以下方法换液培养或传代。
方法①：收集细胞，1000rpm-1500rpm离心5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到含培养基的新瓶中。
方法②：竖立放置培养瓶，细胞沉淀后弃去上半量培养基，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到含培养基的新瓶中。
2.3.3、转化
(1)CHO细胞培养于含10％-20％小牛血清DMEM培养基，在电击前48h-96h以1∶3到1：10的比例传代，电击前24h换新鲜培养基，电击前镜检细胞，选择80％～90％视野贴壁的对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，1000r/min，10min离心，沉淀用无血清DMEM培养基洗涤并离心，同时细胞计数，调整每个实验组细胞数达到2×106～2×109。
(2)CHO细胞电敏感性实验以低离子强度Tris-Cl缓冲液的pH的范围是6～8，电场强度为500～800V/cm，电流25～100uF,将细胞混悬于电穿孔缓冲液中(方案的优化参数如表1所示)，冰浴10～20min，脉冲次数2～5次，间隔冰浴1～3min，电击后冰浴10min，取细胞悬液用10％小牛血清DMEM培养基稀释10倍，37℃，5％ CO2培养6h，台盼蓝染色法计数活细胞(台盼蓝染色结果如图4所示)。结果用SPSS13.软件进行嵌套设计的方差分析。每3d换液，至抗性克隆出现后换DMEM维持培养基，并每日观察计数抗性克隆数目(结果如表2所示)。
表1
表2
2.3.4、细胞培养
悬浮细胞
(1)摇瓶培养2-3天后，细胞密度增加，营养物质耗尽，根据细胞密度计算扩培体积，在超净台内将摇瓶细胞接种到摇瓶内，用无菌焊接机将接种摇瓶管路与反应器管路无菌焊接，用泵先将罐内PBS排出，此过程注意保持无菌。待PBS排出后，泵入一定量的培养基，调整本批细胞培养的参数，待pH、Temperature、dO2、Stirrer、示数稳定后，将一定量的细胞接种至生物反应器内，最后补加培养基，补至本次试验设计的培养体积。接种细胞后打开生物反应器监测系统Bio Xpert，对此次培养状态进行实时监控，直至本次细胞培养结束。
细胞以每毫升50万的细胞量进行生物反应器培养，培养总体积为3L。白天为自动控制溶氧dO2保持在40％左右，当反应器过夜时，采取培养液表面通空气的方法，防止细胞缺氧。在整个培养过程中，每间隔12h进行细胞计数，取细胞上清液1mL进行检测，对重组人源化III型胶原蛋白进行鉴定。
贴壁细胞：
培养2-3天后，细胞密度增加，营养物质耗尽，根据细胞密度计算扩培体积，在超净台内将摇瓶细胞接种到培养瓶内，用无菌焊接机将接种摇瓶管路与反应器管路无菌焊接，用泵先将罐内PBS排出，此过程注意保持无菌。待PBS排出后，泵入一定量的培养基，调整本批细胞培养的参数，待pH、Temperature、dO2、Stirrer、示数稳定后，将一定量的细胞接种至培养瓶内，最后补加培养基，补至本次试验设计的培养体积。在整个培养过程中，每间隔一段时间进行细胞计数，通过细胞上清和细胞裂解液，对重组人源化III型胶原蛋白进行鉴定。鉴定结果如图5所示，目的蛋白被成功表达。
实施例3目的蛋白检测
3.1、氢脯氨酸含量检测
羟脯氨酸是胶原蛋白中含有的特异性氨基酸,且含量比较稳定。将试样在105C和c(HCI)＝6mol/L盐酸作用下,水解成羟脯氨酸,羟脯氨酸经氯胺T氧化后,与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长560nm处进行比色测定。
具体的操作步骤如下：
试剂(除特别注明者外,所有试剂均为分析纯)
A、L-羟脯氨酸对照品:国家对照品。
B、盐酸溶液,c(HCl)＝6mol/L:将优级纯盐酸与水等体积混合。
C、pH＝6.0缓冲液:称取57g三水合乙酸钠,37.5g柠檬酸三钠,5.5g一水合柠檬酸,385mL异丙醇,加水500mL,用一水合柠檬酸调节pH至6.0,加水稀释至1000mL。
D、氯胺T溶液:称取3.5g氯胺T,加水稀释至50mL,现用现配。
E、氧化剂溶液:将加氯胺T溶液和pH＝6.0缓冲液按1:4的比例混合。
F、60％高氯酸溶液:量取高氯酸43mL,加水稀释至50mL。
G、对二甲氨基苯甲醛溶液:称取10g对二甲氨基苯甲醛溶液,加15mL60％高氯酸溶液溶解。
H、显色剂:量取15mL对二甲氨基苯甲醛溶液,溶于65mL异丙醇中。
I、氢氧化钠溶液,c(NaOH)＝6mol/L:称取24g氢氧化钠,加水稀释至100mL。
精密量取0.5mL空白(水)、羟脯氨酸对照品系列溶液及供试液,分别加人1mL异丙醇K.氧化剂溶液,混合后在室温下放置4min；再分别加入6.5mL显色剂,混合后,将各管放置在60℃水浴中加热15min，冷却。用空白作对照,于560nm测定吸光度值,以羟脯氨酸对照品溶液系列浓度对其吸光度做直线回归,求得直线回归方程(图9),计算出供试品溶液中羟脯氨酸含量(表3)。经过计算，此方法合成的目的蛋白含量在5％-15％之间。
表3
浓度μg/mL 0.50 1.00 1.5 2.0 2.5
吸光度A560 0.134 0.284 0.412 0.547 0.683
3.2、三螺旋结构检测
将合成的目的蛋白用圆二色谱检测，步骤如下：
将目的蛋白用磷酸盐溶解，之后放在比色皿中，在圆二色谱仪中检测。
结果表明(图6)，本发明合成的人源化胶原蛋白符合三螺旋结构的特征。
3.3、生物活性检测
将合成的目的蛋白在纤维母细胞培养14-20天后，Calcein-AM染色，步骤如下：
3.3.1(成纤维细胞)培养、扩增和冻存:
培养体系:RMPI1640加入5％-10％FBS，37℃,5％CO2，pH6.5。培养瓶中培养，每2-4天更新培养基，至细胞融合后进行传代，细胞传至P2冻存用以后续检测。
3.3.2活细胞染色测试
3.3.3测试时间点:铺板后14天。
测试方法:每个时间单组设6个实验孔进行测试。在预设测试时间点，轻柔移除孔中培养基，PBS清洗2次，加入1x缓冲液配制的0.1％-0.3％浓度的Calcein-AM溶液,4℃下避光孵育30分钟,PBS清洗2次后，在490nm激发光下观察绿色荧光染色的活细胞。
结果表明(图7)本发明合成目的蛋白能刺激成纤维母细胞增值。
此外，还采用与本发明相同的方法表达SEQ.ID NO.1中n＝1和n＝30的氨基酸序列，因所选表达体系、试验方法和试验步骤与实施例中n＝2相同，故不再赘述。试验表明，n为1～30的范围内，特别是n为1、n为30的目的蛋白，生理活性与n为2的目的蛋白相似。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.人源化胶原蛋白，其特征在于，其结构为XnY；
其中，X为III型胶原蛋白a1链第411位～639位的片段，Y为III型胶原蛋白a1链第1158位～1199位的片段；1≤n≤30。
2.根据权利要求1所述的人源化胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列包括如下I～III中的任意一种：
(Ⅰ)、如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、在如(Ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(Ⅲ)、与如(Ⅰ)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
3.权利要求1或2所述人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒；
S2、构建脯氨酰-4-羟化酶α亚基和/或β亚基的表达载体；
S3、将含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒和脯氨酰-4-羟化酶的表达载体共转化至宿主细胞中，得到共表达菌株；
S4、发酵培养共表达菌株，得到所述人源化胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒依次包括骨架载体和启动子、编码权利要求1或2所述人源化胶原蛋白的核酸和终止子；
所述启动子选自T7启动子、sCMV启动子、Lac启动子、tac启动子、IPL启动子、araB启动子、AOX1启动子、trc启动子或trp启动子中的任一种；
所述终止子选自T7终止子、rrnB T1终止子、AOX1终止子、不依赖于ρ的终止子或依赖ρ的终止子中的任一种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含有III型胶原蛋白a1链第411位～639位片段和第1158位～1199位片段的编码核酸的质粒依次包括PcDNA3.1载体或pPICZα系列载体、AOX1启动子、编码权利要求1或2所述人源化胶原蛋白的核酸和AOX1终止子。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中脯氨酰-4-羟化酶α亚基和/或β亚基的表达载体包括编码脯氨酰-4-羟化酶的核酸和PcDNA3.1载体。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S3步骤中的宿主细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、哺乳动物细胞中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母和/或CHO细胞。
9.权利要求1或2所述的人源化胶原蛋白或权利要求3～8任一项所述制备方法获得的人源化胶原蛋白在制备具有修复功能填充支撑的产品、药物缓控释制剂、疫苗保护剂和稳定剂或药品中的应用。
10.具有修复功能填充支撑的产品、可用作组织工程材料、医疗美容产品、药物缓控释制剂、疫苗保护剂和稳定剂或药品，其特征在于，包括权利要求1或2所述的人源化胶原蛋白或权利要求3～8任一项所述制备方法获得的人源化胶原蛋白。
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