CN104262471B

CN104262471B - 一种重组菌丝霉素及其表达纯化的方法和应用

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Publication number: CN104262471B
Application number: CN201410487066.8A
Authority: CN
Inventors: 陈新; 李凌; 史家玮; 温耀安; 石羽; 余楠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2014-09-22
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-09-22
Also published as: CN104262471A

Abstract

本发明公开了一种重组菌丝霉素及其表达纯化的方法和应用，该重组菌丝霉素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将含有编码该氨基酸基因的重组菌增殖培养，诱导表达培养，离心，取菌体裂解，离心，得裂解上清液，纯化，即得重组菌丝霉素。将获得的重组菌丝霉素经酶SUMOpro酶切，透析，即可获得菌丝霉素。本发明通过对重组菌丝霉素的表达纯化方法的优化，可大量获得高纯度、高活性的菌丝霉素，其抑菌效果佳，抗菌范围广泛，抗菌谱大。

Description

一种重组菌丝霉素及其表达纯化的方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组菌丝霉素及其表达纯化方法和应用。

背景技术

随着抗生素在临床上的广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，增加了疾病治愈的难度并且给患者和社会带来了严重的经济负担。特别是近年来“超级细菌”逐渐增多，使得在合理用药的同时研发新一代安全高效的抗菌制剂显得尤为迫切。

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，多具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点。迄今为止，研究者已经从细菌、真菌、两栖类、昆虫、植物、哺乳动物乃至人体中发现并分离获得了具有抗菌活性的多肽。由于这些多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides, ABP”。并随着研究工作的深入，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有杀伤作用。

Plectasin也称为菌丝霉素，是在腐生子囊菌Pseudoplectania nigrella中发现的新型抗菌肽。体外抑菌试验表明，Plectasin对于多种G+细菌具有很高的杀菌活性。进一步体内抑菌试验表明，在肺炎链球菌感染小鼠引起的腹膜炎和肺炎模型中，Plectasin的疗效分别与万古霉素和青霉素相当。Shintaro Harat等人实验证明Plectasin对人类支气管上皮细胞、齿槽上皮细胞和肺纤维原细胞没有毒性，不会影响他们的增殖，而且不会诱导炎症因子IL-8的转录和表达。此外，Plectasin具有选择性杀灭作用，安全性高。Plectasin与细菌细胞壁形成的前体物质Lipid Ⅱ具有很强的亲和性，可以通过与Lipid Ⅱ结合阻止病菌细胞壁的形成，从而阻止病菌繁殖。Plectasin独特的作用机制不易诱导产生耐药性菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组菌丝霉素。

本发明的另一目的在于提供一种重组菌丝霉素的表达纯化方法。

本发明的再一目的在于提供上述重组菌丝霉素的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种菌丝霉素，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

一种重组菌丝霉素，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，其为含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的pE-SUMO重组载体。

一种重组菌，其含有上述所述的重组载体。

一种重组菌丝霉素的表达和纯化的方法，包括以下步骤：

1）取上述所述的重组菌，增殖培养，诱导表达培养，离心，得菌体；

2）取步骤1）所得菌体，裂解，离心，得裂解上清液；

3）将上述上清液进行使用Ni-NTA亲和层析纯化，即得重组菌丝霉素。

进一步的，上述步骤1）中，所述重组菌为重组大肠杆菌BL21(DE3)，培养基为LB 培养基，增殖培养的条件是37℃、180 r/min 振荡培养至OD600为0.5。

进一步的，上述步骤1）中所述诱导表达培养的条件是30℃、180 r/min 振荡培养6h，使用的诱导剂是浓度为0.05mM的IPTG。

进一步的，上述步骤2）中所述裂解为冰浴超声破碎，破碎条件为工作时间5s，间歇时间5s，功率400W，工作时间20min。

进一步的，上述步骤3）中所述纯化的具体步骤为：每5mL Ni-NTA树脂用50mlNTA20平衡后，与上清液混合，4 ℃摇动结合1 h后；再将Ni-NTA树脂装入层析柱，流速为2mL/min；使用pH 7.4磷酸盐缓冲液以流速2 mL/min洗涤；用咪唑浓度为500mmol/L的含0.1%Tween20的 pH7.4磷酸钠洗脱液洗脱，FPLC自动收集洗脱液。

一种菌丝霉素的表达和纯化的方法，将上述获得的重组菌丝霉素经酶SUMOpro酶切，透析，即可，所述透析用截留分子量为3kDa的透析袋进行透析。

本发明的有益效果是：

本发明的制备了一种新的重组菌丝霉素，小泛素相关修饰物（SUMO）有利于蛋白质中巯基的形成，有利于菌丝霉素发挥其抑菌杀菌的生物学功能。而且SUMO化的蛋白质不像泛素化的蛋白质那样容易被蛋白酶体水解，反而更加稳定。

本发明通过对重组菌丝霉素的表达纯化方法的优化，可大量获得高纯度、高活性的菌丝霉素，其抑菌效果佳，抗菌范围广泛，抗菌谱大。

附图说明

图1为 PCR鉴定pE-SUMO-Plectasin结果；M：DNA分子量标准；1：重组质粒pE-SUMO-Plectasin PCR鉴定结果；

图2 为15%SDS-PAGE检测诱导表达产物；M：蛋白分子量标准；1：非诱导菌体总蛋白；2：诱导后菌体总蛋白；3：诱导后菌体超声破碎上清；4：诱导后菌体超声破碎沉淀；

图3 为15% SDS-PAGE检测表达产物的纯化；1：诱导后菌体超神破碎上清；M：蛋白分子量标准；2：洗涤流出液；3： 50mmol/L咪唑洗脱液；4： 100mmol/L咪唑洗脱液；5：500mmol/L咪唑洗脱液；6：500mmol/L咪唑洗脱液（非还原性）；

图4为15%SDS-PAGE检测纯化后融合蛋白的酶切产物；1：纯化产物；2：40IU/mgSUMOpro酶切后产物；3： 20IU/mg SUMOpro酶切后产物； 4：10IU/mg SUMOpro酶切后产物；5： 5IU/mg SUMOpro酶切后产物；M: 蛋白分子量标准；

图5为菌丝霉素的Tricine-SDS-PAGE图，M为marker；1透析纯化后的菌丝霉素；2：化学合成的菌丝霉素作阳性对照；

图6为纸片法测试菌丝霉素抑菌效果；A：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471114；B：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471118；C：耐青霉素肺炎链球菌PRSP31355；D：耐万古霉素屎肠球菌；1：30μg菌丝霉素；2:10μg头孢氨苄；3：阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实验试剂和材料

质粒pE-SUMO，大肠杆菌Escherichia coli Origami(DE3)，大肠杆菌E. coli DH5α，内切酶Xba I，Bsa I均购自NEB公司，SUMOpro购自Lifesensors公司，Tricine-SDS-PAGE试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

临床分离的耐药菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471114、MRSA15471118、耐青霉素肺炎链球菌PRSP31355、耐万古霉素屎肠球菌均由广东南方医科大学附属南方医院提供。

LB培养基：10 g/L 蛋白胨, 5 g/L 酵母提取物, 5 g/L NaCl，蒸馏水，pH 7.0。

破碎缓冲液SUMO1：50mM 磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，pH 7.4，1mM 蛋白酶抑制剂PMSF酶切缓冲液SUMO2：20mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，pH 7.4。

实施例1 重组菌丝霉素原核重组表达菌的构建

（1）设计菌丝霉素Plectasin核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

（2）重组菌丝霉素原核表达载体的构建

1）设计、合成菌丝霉素核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2）酶切连接

将合成片段（如SEQ ID NO.3所示）与表达载体pE-SUMO经Bsa I和Xba I双酶切后克隆至经相同双酶切。酶切体系如下：

37℃酶切3h，1%琼脂糖凝胶电泳并使用胶回收试剂盒回收。回收后，目的基因与表达载体按照3:1比例，以T4 DNA连接酶16℃连接过夜，构建重组表达载体pE-SUMO-Plectasin。反应体系如下：

3）转化、筛选和验证

将上述重组表达载体pE-SUMO-Plectasin转化至感受态DH5α以扩增质粒，筛选出阳性单克隆菌落。并进行菌落PCR验证，蘸取少量菌体混匀于10μl ddH2O进行PCR鉴定，PCR上下游引物序列如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示，反应体系如下。

PCR反应条件：97℃预变性5min；94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 20s进行30个循环；72℃延伸20 s；25℃保存。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图1所示，从中可以看出能够扩增出约140bp的目的条带，同时进行测序验证，将验证正确的pE-SUMO-Plectasin重组载体用于后续研究。

（3）重组表达菌E. coli BL21(DE3)的构建

将上述验证正确的pE-SUMO-Plectasin重组载体转化表达宿主E. coli BL21(DE3)，挑取菌落提取质粒，进行PCR鉴定筛选出正确的阳性重组菌BL21(DE3)。

实施例2 菌丝霉素融合蛋白（重组菌丝霉素）的诱导表达

挑取上述验证正确的阳性重组表达菌株BL21(DE3)接种于500ml LB培养基中，37℃摇床培养至OD600=0.5，以不同浓度IPTG、不同诱导温度、不同诱导时间做正交实验优化。诱导条件为30℃，转速为180rpm，诱导表达使用的诱导剂为终浓度为0.05mM的IPTG，诱导时间为6h获得较高的融合蛋白，即重组菌丝霉素。

实施例3 菌丝霉素融合蛋白（重组菌丝霉素）的纯化

离心收集菌体，以50ml 破碎缓冲液SUMO1重悬菌体，冰浴超声破碎菌体，破碎条件为工作时间5s，间歇时间5s，功率400W，工作时间20min。4℃ 14000 rpm离心15 min，收集上清，并使用0.22 μm滤器过滤。使用15% SDS-PAGE检测超声上清及沉淀中的蛋白分布情况，蛋白检测结果如图2所示，图中M为蛋白质分子量标准；1为非诱导菌体总蛋白；2为诱导后菌体总蛋白；3为诱导后菌体超声破碎上清；4为诱导后菌体超声破碎沉淀。从中可以看出，融合蛋白主要存在上清上，分子量约为16.7kDa。以Bradford法测定超声上清中总蛋白含量，用Quantity One扫描凝胶并分析蛋白表达情况。超声上清中总蛋白表达量为580mg/L,可溶性融合蛋白占超声上清总蛋白的含量为23.44%，可溶性融合蛋白表达量为136.0mg/L，菌丝霉素融合蛋白表达量为35.7mg/L。

使用Ni-NTA亲和层析纯化菌丝霉素融合蛋白：将5mL Ni-NTA树脂用50ml NTA20平衡，与超声上清混合，4 ℃摇动结合1 h后；再将Ni-NTA树脂装入层析柱，流速2mL/min，收集流穿液，用于 SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况；使用pH7.4磷酸盐缓冲液流速2 mL/min洗涤；分用咪唑浓度为50mmol/L，100mmol/L，500mmol/L的0.1%Tween20 pH7.4磷酸钠洗脱液洗脱，FPLC自动收集洗脱液，根据电脑软件记录的出峰时间和峰值收集对应洗脱液。使用15% SDS-PAGE检测表达产物的纯化情况，如图3所示，图中1为诱导后菌体超声破碎上清；M为蛋白分子量标准；2为洗涤流出液；3为50mmol/L咪唑洗脱液；4为100mmol/L咪唑洗脱液；5为500mmol/L咪唑洗脱液；6为500mmol/L咪唑洗脱液（非还原），从中可以获知，用500mmol/L咪唑洗脱液可获得大量纯度较高的菌丝霉素融合蛋白，即重组菌丝霉素。

实施例4 菌丝霉素的获得

将上获得的菌丝霉素融合蛋白使用酶切缓冲液SUMO2及酶SUMOpro进行酶切，酶切条件为40 IU/mg，20IU/mg，10 IU/mg，5 IU/mg SUMOpro，在30℃下酶切1h，以截留分子量为3kDa的透析袋透析获得的菌丝霉素。用15%SDS-PAGE检测酶切情况，如图4所示，图中1为纯化后菌丝霉素融合蛋白；2为40IU/mg SUMOpro酶切后产物；3为20IU/mg SUMOpro酶切后产物； 4为10IU/mg SUMOpro酶切后产物；5为5IU/mg SUMOpro酶切后产物；M为蛋白分子量标准。从中可以看出，经不同浓度的SUMOpro酶切后均可获得高浓度高纯度的SUMO多肽。

将上述SUMOpro酶切后的蛋白经截留分子量为3kDa的透析袋透析纯化后的菌丝霉素进行Tricine-SDS-PAGE检测，检测结果如图5所示，从中可以明显看出一条大小约4.4kDa的蛋白条带，即菌丝霉素。以Moclecular Imaging System 分析该目标条带纯度达98.3%。

实施例5 菌丝霉素的抑菌杀菌实验

（1）纸片法测试菌丝霉素抑菌效果

测试菌临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471114、MRSA15471118、耐万古霉素屎肠球菌以M-H培养基培养，耐青霉素肺炎链球菌PRSP31355以5%绵羊血M-H培养基培养，37℃下培养至OD600=0.5，取100µl菌液均匀涂布在琼脂平板上。在琼脂平板表面均匀放置高压灭菌过的纸片，在纸片上分别滴加30µl 1mg/ml菌丝霉素和10µl 1mg/ml头孢氨苄。以滴加30µl ddH₂O的纸片作为阴性对照，如图6所示，图中A为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471114平板；B为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471118平板；C为耐青霉素肺炎链球菌PRSP31355平板；D为耐万古霉素屎肠球菌平板；1为30μg菌丝霉素；2为10μg头孢氨苄；3为阴性对照，结果表明，菌丝霉素对四种临床耐药菌均有抑菌效果。

（2）最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）实验鉴定菌丝霉素的抑菌杀菌活性

测试菌临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471114、MRSA15471118、耐万古霉素屎肠球菌以M-H培养基培养，耐青霉素肺炎链球菌PRSP31355以5%绵羊血M-H培养基培养。在96孔板中加入菌液及倍比稀释后的菌丝霉素，在37℃下培养18-24小时判断最小抑菌浓度结果。在产生抑菌效果的孔中取10µl菌液接种在琼脂培养基上，37℃培养12小时用以判断最小杀菌浓度结果。实验均以氨苄西林对照，并设三组平行。结果表明：菌丝霉素对临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA15471114（MIC 14µM，MBC 14µM）、MRSA15471118（MIC 14µM，MBC 14µM）、耐青霉素肺炎链球菌PRSP31355（MIC 7.3µM，MBC 7.3µM）、耐万古霉素屎肠球菌（MIC 14µM，MBC 14µM）均有较好的抑菌及杀菌效果，均优于同摩尔浓度下的氨苄西林并有显著性差异（如表1所示）。本发明的菌丝霉素在治疗革兰阳性菌，尤其是各种临床耐药性菌株方面有良好的前景。

表1 菌丝霉素对耐药菌株的最小抑菌浓度MIC、最小杀菌浓度MBC的测定

<110> 陈, 新

<120> 一种重组菌丝霉素及其表达纯化的方法和应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工合成基因序列

<400> 1

ggtttcggtt gcaacggtcc gtgggacgaa gacgacatgc agtgccacaa ccactgcaaa 60

tctatcaaag gttacaaagg tggttactgc gctaaaggtg gtttcgtttg caaatgctac 120

<210> 2

<211> 148

<212> PRT

<213> 重组菌丝霉素氨基酸序列

<400> 2

Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val

1 5 10 15

Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr

20 25 30

His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys

35 40 45

Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys

50 55 60

Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Asp Gly Ile

65 70 75 80

Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn

85 90 95

Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Phe Gly Cys

100 105 110

Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His Cys Lys

115 120 125

Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Val

130 135 140

Cys Lys Cys Tyr

145

<210> 3

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工合成基因序列

<400> 3

ggtctcaagg tggtttcggt tgcaacggtc cgtgggacga agacgacatg cagtgccaca 60

accactgcaa atctatcaaa ggttacaaag gtggttactg cgctaaaggt ggtttcgttt 120

gcaaatgcta ctaatctaga 140

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 4

ggtctcaagg tggtttcggt tgcaa 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成引物

<400> 5

ggactagtgc atctcccgtg atgcag 26

Claims

1.一种菌丝霉素，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种重组菌丝霉素，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于：其为含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的pE-SUMO重组载体。

4.一种重组菌，其特征在于：其含有权利要求3所述的重组载体。

5.一种重组菌丝霉素的表达和纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）取权利要求4 所述的重组菌，增殖培养，诱导表达培养，离心，得菌体；

2）取步骤1）所得菌体，裂解，离心，得裂解上清液；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述重组菌为重组大肠杆菌BL21(DE3)，培养基为LB 培养基，增殖培养的条件是37℃、180 r/min 振荡培养至OD₆₀₀为0.5。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述诱导表达培养的条件是30℃、180 r/min 振荡培养6h，使用的诱导剂是浓度为0.05mM的IPTG。

8.根据权利要求5 所述的方法，其特征在于：步骤2）中所述裂解为冰浴超声破碎，破碎条件为工作时间5s，间歇时间5s，功率400W，工作时间20min。

9.根据权利要求5 所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述纯化的具体步骤为：每5mLNi-NTA树脂用50ml NTA20平衡后，与上清液混合，4 ℃摇动结合1 h后；再将Ni-NTA树脂装入层析柱，流速为2mL/min；使用pH 7.4磷酸盐缓冲液以流速2 mL/min洗涤；用咪唑浓度为500mmol/L的含0.1%Tween20的 pH7.4磷酸钠洗脱液洗脱，FPLC自动收集洗脱液。

10.一种菌丝霉素的表达和纯化的方法，其特征在于：将权利要求5～9任一获得的重组菌丝霉素经酶SUMOpro酶切，透析，即可，所述透析用截留分子量为3kDa的透析袋进行透析。