CN102526703B - 一种鼻咽癌相关易感基因yh1蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种YH1蛋白在与病原微生物结合和凝集中的应用，还提供了YH1蛋白在制备由细菌感染引起的炎症相关疾病中的药物的应用，以及公开所述YH1蛋白制备方法，包括构建表达载体构建、表达工程菌的构建及诱导表达、纯化和酶切。本发明获得的重组YH1蛋白具有生物活性。该重组YH1蛋白能结合和凝集病原微生物，具有杀灭革蓝氏阴性细菌的作用，可用于防治由细菌感染引起的炎症。

Description

一种鼻咽癌相关易感基因YH1蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种鼻咽癌相关易感基因YH1的蛋白制备方法及该蛋白在微生物识别和抑菌方面的应用，可用于细菌引起的炎性相关的疾病。

背景技术

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma, NPC) 是多因素 (EB病毒感染、环境因素和遗传易感性等) 参与的多基因遗传性疾病,在已知的癌基因中，ras、c-myc和bcl-2等分子在大多数鼻咽癌中表达水平增高，但没有发现基因结构的重排、突变或基因扩增，这说明其蛋白产物可能参与鼻咽癌发生发展的某个阶段，它们在鼻咽癌的发生发展中可能不起主要作用。在已知的抑瘤基因中，p53在鼻咽癌中的作用尚不确定，p53基因在鼻咽癌中突变率极，但p53蛋白有高水平的表达，推测其与EB病毒的瘤蛋白和（或）细胞瘤蛋白有关。p16基因在鼻咽癌中没有点突变，但是存在表达下调，认为可能与p16基因的异常甲基化有关。这些结果提示鼻咽癌的遗传不稳定性很可能与鼻咽癌基因组中尚未发现的易感/抑瘤基因有关。YH1基因（GenBank收录号为AF158745，该基因全长为1084bp,编码256个氨基酸，蛋白分子量26.7kDa,该基因与现在公认的SPLUNC1基因仅有一个碱基的差别），是我们研究所何志巍教授最早发现的在正常鼻咽上皮组织中高表达而在鼻咽癌组织中低或无表达的鼻咽癌易感基因。他们首次应用cDNA表达微阵列技术筛选了成人正常鼻咽和鼻咽癌组织5184个基因或表达序列标签（ESTs）的表达差异，筛选到来源于脊椎动物嗅上皮且在小鼠鼻腔侧部表达的基因PLUNC同源的ESTN27741，RT-PCR及Northern blot杂交检测发现，该EST确实在鼻咽癌组织中很低表达而在正常鼻咽组织中高表达。根据该EST进而克隆到全长为1084bp的cDNA序列，在GenBank，EMBL等数据库中比较表明，该cDNA序列所代表的是一个新基因，含有完整的阅读框架，编码256个氨基酸，名YH1基因。 YH1基因的表达下调有助于鼻咽癌的发生，为一个新的鼻咽癌相关基因候选者。虽然在鼻咽癌组织中存在多个已知及未知功能的新基因，而对于一个鼻咽相对特异基因YH1在鼻咽癌发生发展过程中功能的深入研究，无疑具有明显的针对性和必要性。我们最近的免疫组织化学实验结果也证实了YH1分子在慢性鼻咽炎等组织中表达明显高于在鼻咽癌组织中的表达量。

腭、肺及鼻咽上皮克隆(PLUNC)家族蛋白是一个组织特异性的分泌性蛋白，该家族蛋白在N端有一保守的信号肽。PLUNC可以划分为短的PLUNC (SPLUNC)和长的PLUNC (LPLUNC) 蛋白，按照结构上来划分，YH1属于SPLUNC1家族成员。它可能参与人类的抗微生物、上呼吸道抗炎等宿主免疫防御反应和肿瘤的发生、发展及转移等多个过程。 PLUNC家族的三维结构与杀菌/渗透性增强蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein, BPI）和脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein, LBP）家族，胆脂转移蛋白（cholesterol ester transfer protein, CETP）及磷脂转移蛋白（phospholipid transfer protein, PLTP）家族具有相似性。研究表明SPLUNC1蛋白在阻止呼吸道细菌、病毒、支原体、真菌等病原微生物入侵，抵抗理化因素刺激，参与机体炎症反应中发挥重要作用。近年来的研究也显示，鼻咽癌、非小细胞性肺癌、唾液腺癌及胃癌可能与PLUNC蛋白有关，但具体的作用机制尚不清楚。为了观察PLUNC蛋白对EB病毒作用，周后德等用PLUNC蛋白处理三株转化有EB病毒的B型淋巴细胞，发现PLUNC蛋白能够促进转化有EB病毒的B型淋巴细胞的破裂及凋亡，使EB病毒潜在膜蛋白1的表达减少，却使EB病毒包装膜蛋白GP350/220表达增加。说明PLUNC蛋白 能抑制EB病毒对呼吸道上皮的潜在致瘤性。Hong Wei Chu 等研究肺炎支原体和白介素－13（IL-13）对PLUNC基因的表达调节作用。结果发现：PLUNC蛋白能够减少肺炎支原体的水平，抑制肺炎支原体衍生脂蛋白诱导的上皮细胞分泌白介素－8。虽然肺炎支原体感染促使PLUNC蛋白表达增加，但白介素－13显著减弱PLUNC蛋白的表达和清除肺炎支原体的能力。Sung等发现摘除嗅球后，小鼠鼻黏膜上皮和腺上皮高表达PLUNC蛋白，这可能是鼻黏膜受到损伤后出现防御性机制。所有这些表明，PLUNC蛋白能阻止呼吸道细菌，病毒，支原体、真菌等病原微生物入侵，抵抗理化因素刺激，参与机体炎症发应，是呼吸道一道宿主防御的天然屏障。

PLUNC蛋白家族成员与鼻咽癌的关系研究正在成为新的热点，国内外已有文献报道了PLUNC基因家族成员与鼻咽癌的关系。何等通过筛选PLUNC基因的SNPs确定它们为中国鼻咽癌的敏感性标记物,提示PLUNC可能影响鼻咽癌的易感性并探讨了PLUNC基因编码区多态位点G14595T在鼻咽癌患者中的作用。周等探讨了SPLUNC1参与主体上呼吸道防御系统的机制，揭示了LPUNC1基因对鼻咽癌细胞系HNE1的影响；最近又运用抑制性消减杂交技术以确定差异表达的人鼻咽癌基因和选择分子标记物，提示PLUNC 和CDC37L1基因可能为鼻咽癌的分子标记物，表明CDC37L1 和 NPC两者关系密切； 同时李等论述SPLUNC1基因的表达下调是鼻咽癌早期预警的分子诊断标志物，从而证实了以SPLUNC1作为抗鼻咽癌药物开发新靶标的可行性。

研究表明,环境因素和遗传易感性可能在鼻咽癌的发生发展中起重要作用。 鼻咽癌发生发展中的致癌微生物除了 EB 病毒以外，还有一类不可忽视的生物致癌因素—细菌。由于细菌感染导致上皮细胞由炎性增生转化成癌性增生的模式已有多家报道。最近有报道发现，一种与鼻咽癌发生密切相关的致癌微生物—纳米细菌是鼻咽癌病因发病机制的因素之一。研究发现它们的编码蛋白是一种分泌性的具有抗微生物作用的固有免疫分子，它能与鼻咽癌组织中纳米细菌结合，从而将纳米细菌阻止于鼻咽上皮细胞之外，以便机体免疫系统监视和清除，从而保护鼻咽上皮免遭恶性攻击。以往的研究侧重于寻找癌基因（如LMP1）的分子机制研究，但是忽视了机体本身的天然免疫防御系统所起的作用。特别是当这些天然免疫防线出现严重“漏洞”时，由各种因素引发的炎症必然对鼻咽上皮造成损伤，很可能诱导鼻咽上皮恶性转化。YH1发挥天然免疫分子的作用，可能介导肿瘤微环境中炎症细胞与肿瘤细胞之间的对话，调节组织的抗炎反应,因此YH1在鼻咽上皮的表达下调或缺失，使得鼻咽上皮失去了这一重要的天然免疫分子所介导的抗炎功能，很可能是鼻咽癌的重要易感因素。

但是关于YH1蛋白与外源病原微生物的关系还没有系统的研究。由于该蛋白分泌在细胞外，它对于外源微生物的结合，或者杀菌作用也未见系统报道。因此，对于GST-YH1融合蛋白和YH1非融合蛋白的制备及与病原微生物关系的探索研究，对于推动我国鼻咽癌科学的发展，促进以YH1为靶点的药物开发，防治炎性疾病都具有不容忽视的理论价值和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鼻咽癌相关蛋白YH1的新应用。

实现上述目的的具体技术方案如下：

鼻咽癌相关蛋白YH1在与病原微生物结合和凝集中的应用。

鼻咽癌相关蛋白YH1在制备由细菌感染引起的炎症相关疾病中的药物的应用。

本发明的另一目的是提供鼻咽癌相关蛋白YH1的制备方法：

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种鼻咽癌相关蛋白YH1的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建表达载体构建：提取总RNA，反转录出cDNA；用带有BglII/Xho1双酶切位点

的YH1特异性引物进行PCR扩增获得YH1基因，回收产物进行BglII/Xho1酶切；同时pGEX-4T-1载体用BglII/Xho1进行双酶切；纯化、回收；回收的YH1基因的双酶切产物连接到pGEX-4T-1载体；连接液转化DH5a大肠杆菌，阳性克隆筛选，得到pGEX-4T-1-YH1表达质粒；

（ 2 ）表达工程菌的构建及诱导表达：将pGEX-4T-1-YH1表达质粒加到冰预冷的E.coli

BL21 ( DE3 )感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上孵育25－35 min，40－45℃热激85－95S，立即置冰上2.5－3.5min，加入在37℃预热的500ul 无抗LB液体培养基，37℃，200 rpm摇45－55min；取100-200μl菌液涂布在含有Amp抗性LB平板上，放入37℃培养过夜；取单个菌落接种于Amp抗性 LB液体培养基中，37℃震摇培养3h至对数生长期，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度为1mM后，37℃震摇培养3h，收集培养菌液，离心取上清即得所述YH1融合蛋白。

（3）将离心后的上清重悬于超声缓冲液中 (PBS, 1%Triton X-100,1mM EDTA, pH7.4) ，在冰上以400W的功率超声180－220次，每超声3秒，间隔5秒，然后离心取上清；于Glutathione FF层析柱进行亲和层析，以1%Triton X-100,1mM EDTA ,pH7.4 PBS 缓冲液洗脱，纯化得到GST-YH1融合蛋白。

（4）将GST-YH1融合蛋白脱盐至pH7.4，PBS 缓冲液中，按照4.5－5.5 unit酶量消化1mgGST-YH1融合蛋白的比例加入Thrombin凝血酶，室温消化2小时；Q Sepharose FF阴离子交换柱进行亲和层析， 10mM GSH（谷胱甘肽（glutathione））,pH8.0 PBS缓冲液GST洗脱下来，再用pH8.0，20mM Tris缓冲液将YH1蛋白洗脱下来,得到非融合YH1蛋白。

本发明提供一种新的YH1蛋白融合蛋白和非融合蛋白的表达。用RT-PCR的方法从慢性鼻咽炎患者的鼻咽组织总RNA中分离得到的YH1基因，该蛋白在N端有一信号肽，是一分泌性蛋白。本发明通过设计一对引物，将编码YH1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上，并转化大肠杆菌BL21构建成工程菌株pGEX-4T-1-YH1。 此表达载体有凝血酶切割位点，通过对培养时间，诱导时间，诱导浓度等条件的摸索和优化，重组蛋白的表达量可达到1mg/L。

本发明摸索和优化了融合GST-YH1的纯化条件，上清经GST亲和柱纯化，可得到纯度在>85%以上的成熟重组融合YH1蛋白。本发明还摸索和优化了非融合YH1蛋白的纯化条件，融合蛋白经过凝血酶酶切后经过阴离子交换，疏水层析可得到纯度在85%以上的成熟重组非融合YH1蛋白。

本发明还提供该蛋白在病原微生物结合，凝集，及抑菌方面的应用。本发明获得的重组YH1蛋白具有生物活性。该重组YH1蛋白能结合和凝集病原微生物，具有杀灭革蓝氏阴性细菌的作用，可用于防治由细菌感染引起的炎症。

附图说明

图1是目的基因YH1的PCR扩增。

图2是含目的基因YH1的阳性克隆鉴定。

图3是目的基因YH1的测序序列比对分析。

图4是含YH1基因的表达质粒pGEX-4T-1-YH1构建图。

图5是含基因YH1的诱导表达SDS-PAGE电泳图。 其中，MW, 蛋白分子marker；A，没有诱导的菌体；B，IPTG诱导的菌体。

图6 是融合蛋白GST-YH1的纯化。其中，1: 含GST-YH1蛋白的沉淀； 2: 含 GST-YH1蛋白的上清； 3: 流出产物； 4-6: 含GST-YH1蛋白的洗脱产物(15ml, 10ml and 5ml)。

图7 是融合蛋白GST-YH1的酶切。其中，A:没有切割的样品； B:切割1小时的样品(还原)； C:切割1小时的样品(非还原)； D:切割2h的样品(还原)； E: 切割2h的样品(非还原)。

图8是非融合YH1的分离纯化图。其中，1: 没切割的样品； 2: 用10U/mg 的凝血酶室温消化2小时； 3-4: 非融合蛋白YH1/SPLUNC1的洗脱； 5:伴体 GST 的洗脱。

图9 是融合蛋白GST-YH1与不同病原微生物的结合的western blot图，其中，1, 副溶血弧菌(G-)；2，副溶血弧菌对照；3, 气单胞菌(G-)； 4，气单胞菌对照；5，腐生葡萄球菌(G+)； 6，腐生葡萄球菌对照；7，不动杆菌(G-)； 8，不动杆菌对照。

图10 是融合蛋白GST-YH1与其他不同病原微生物的结合的western blot图。其中，1, 粪肠球菌(G+)；2，粪肠球菌对照；3, 大肠杆菌(G-)； 4，大肠杆菌对照；5，金黄色葡萄球菌(G+)； 6，金黄色葡萄球菌对照；7，枯草杆菌(G+)； 8，枯草杆菌对照。

图11 是YH1蛋白与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌凝集图。

图12 是YH1能直接杀死革蓝氏阴性菌大肠杆菌和溶血不动杆菌的示意图。其中，A,大肠杆菌，GST为阴性对照，AMP为阳性对照； B, 溶血不动杆菌，GST为阴性对照，AMP为阳性对照。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例 1 ：目的基因 YH1 的获得，阳性克隆鉴定及表达载体构建

YH1蛋白的序列如下所示，其中斜体加粗的1-19氨基酸为信号肽，根据我们的表达纯化经验，在构建表达载体时去掉信号肽。提取慢性鼻咽炎患者的鼻咽组织总RNA，以随机引物反转录出cDNA，用带有BglII/Xho1双酶切位点的YH1特异性引物进行PCR扩增获得YH1基因（图1），引物序列如下(斜体为酶切位点，加粗为保护碱基)：NPCRP-BGL2-F: 5’－CCG AGATCT ATGCAGTTTGGAGGCCTGCCCGTG－3’（SEQ ID NO.1）；NPCRP-XHO-R: 5’－CCG CTCGAG TTAGACCTTGATGACAAACTGTAG－3’（SEQ ID NO.2）。回收产物进行BglII/Xho1酶切。同时pGEX-4T-1载体用相同的酶进行双酶切，切胶纯化试剂盒回收。回收的双酶切产物连接到pGEX-4T-1载体。连接液转化DH5a大肠杆菌，挑取10个克隆进行PCR鉴定（图2）。阳性克隆送测序。测序比对结果见图3，10号测序正确（图3），其pGEX-4T-1-YH1表达质粒构建流程如图4所示。

1 MFQTGGLIVF YGLLAQTMA Q FGGLPVPLDQ TLPLNVNPAL PLSPTGLAGS LTNALSNGLL

61 SGGLLGILEN LPLLDILKPG GGTSGGLLGG LLGKVTSVIP GLNNIIDIKV TDPQLLELGL

121 VQSPDGHRLY VTIPLGIKLQ VNTPLVGASL LRLAVKLDIT AEILAVRDKQ ERIHLVLGDC

181 THSPGSLQIS LLDGLGPLPI QGLLDSLTGI LNKVLPELVQ GNVCPLVNEV LRGLDITLVH

241 DIVNMLIHGL QFVIKV（SEQ ID NO.3）。

实施例 2 ：表达工程菌的构建及诱导表达

抽提测序正确的质粒，溶于适量的TE溶液中备用。将质粒转入BL21(DE3)表达菌株中。具体方法：取出在-80℃冻存的E.coli BL21 ( DE3 )感受态细胞，立即放置于冰上，待解冻后转化；取1ul质粒加到100uL感受态细胞中, 轻轻混匀，在冰上孵育30 min，42℃热激90S，立即置冰上3min；加入在37℃预热的500ul LB液体无抗培养基，37℃，200 rpm摇50min；取100-200μl菌液涂布在含有Amp(50 μg/ml)的LB平板上，放入37℃培养箱培养过夜。

取单个菌落接种于2ml LB液体培养基(含50 μg/ml Amp)中，37℃ 200r/min震摇培养3h至对数生长期，取200ul培养菌液作对照（未诱导），剩余的培养基中加入IPTG至终浓度为1mM后，37℃震摇培养3h，收集培养菌液于离心管，各取200 µl菌液于离心管中，离心取上清，分别取40 µL H₂O重悬（诱后全菌），诱导前全菌样同样处理，加入10 µL 5 X loading Buffer（还原），混匀，煮沸5分钟，12000g 离心5 min，取10 µL上清进行SDS-PAGE电泳（图5）。

重组蛋白的表达量达到1mg/L。

实施例 3 ：融合蛋白 GST-YH1 的纯化

培养上清以5000g在4 ℃离心收集，然后重悬于超声缓冲液中 (PBS, 1%Triton X-100,1mM EDTA, pH7.4) ，裂解物在冰上以400W的功率超声200次（每超声3秒，间隔5秒），然后15000g离心30分钟后取上清。

亲和层析: Glutathione FF层析柱用buffer （PBS,1%Triton X-100,1mM EDTA ,pH7.4）平衡10个柱体积后将破菌上清加载到层析柱，然后用buffer（ PBS,1mM EDTA ,pH7.4）冲洗20个柱体积，接着用buffer （PBS,10mM GSH,1mM EDTA ,pH8.0）将GST-YH1洗脱下来。分别取诱导后上清，沉淀及洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析（图6）。纯化获得的GST-YH1融合蛋白保存于−80 ℃。

实施例 4 ：融合蛋白 GST-YH1 的酶切及非融合蛋白 YH1 的获得

将亲和层析洗脱样品脱盐至buffer （PBS, pH7.4），按照5unit酶量消化1mg样品的比例加入凝血酶（Thrombin），室温消化2小时（图7）。 用buffer （PBS, pH7.4）平衡10个阴离子交换柱体积后将Thrombin酶切后样品加载到层析柱，然后用buffer （PBS, pH7.4）冲洗5个柱体积，接着用buffer （PBS,10mM GSH ,pH8.0）将GST洗脱下来。流穿样品透析到buffer（ PBS, pH7.4）中。Phenyl HP层析柱用buffer （20mM Tris,0.2M (NH₄)₂SO₄,pH8.0）平衡10个柱体积后将亲和层析洗脱样品补加(NH₄)₂SO₄至200mM后加载到层析柱，然后用buffer （20mM Tris,0.2M (NH₄)₂SO₄,pH8.0）冲洗10个柱体积，接着用buffer（20mM Tris,pH8.0）将YH1洗脱下来。分别取不同阶段的产物进行SDS-PAGE电泳分析（图8），由图可见，泳道5所跑出来的是目的蛋白，与预期的分子量相一致，蛋白产物保存于−80 ℃。

以下实验中的YH1蛋白可以上述方法制备得到，也可以由购买得到。

实施例 5 ： YH1 蛋白与不同病原微生物结合分析 ++

粪肠球菌（Enterococcus faecium；G+），腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus； G+）。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus； G-），气单胞菌（Aeromonas sobria； G-），枯草杆菌（Bacillus subtilis；G+），金黄色葡萄秋菌（Staphylococcus aureus；G+), 溶血不动杆菌（A.haemolytius；G-）和大肠杆菌（E. coli DH5α；G-）都是临床菌株，由中山大学生物防治重点实验室惠赠。 副溶血弧菌在TCBS中26°C培养，其他的菌株都是在LB培养基370°C培养。所有的微生物菌株均以3500g 离心10 min并以恰当的浓度重悬，大约5×10⁷个微生物与5μg目的蛋白GST-YH1在PBS溶液反应，于4°C摇床中振荡过夜。次日反应复合物用PBS洗5次，然后用还原buffer重悬并迅速于100°C变性10分钟。蛋白质用BCA试剂盒进行定量分析，然后用Western blot进行微生物结合分析，具体步骤如下：以每个泳道50μg的量进行蛋白质电泳（12%SDS-PAGE），电泳后的蛋白质转移到硝酸nitrocellulose膜上(Pall Corporation)。膜用5%的脱脂奶粉室温封闭2小时然后用PBST洗3次。用抗GST单克隆抗体4°C振荡杂交过夜，次日用PBST洗膜3次后用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗室温杂交2小时。用ODYSSEY^® Infrared Imaging Systems (LI-COR^®)扫描分析YH1蛋白与微生物的结合情况（图9图10），可见YH1与我们所检测的病原微生物都能结合，相应的GST作为阴性对照。

实施例 6 ： YH1 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的凝集实验方法

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养如实施例5，6,000 rpm收集这两种细菌用TBS（pH7.5）清洗2次。加入50 μl FITC溶液(溶于DMSO, 终浓度为10 mg/ml)后，用TBS（pH7.5）补平至总体积1 ml，避光摇晃1 h。用TBS（pH7.5）清洗7-8遍至溶液无色，最后悬浮在1 ml TBS（pH7.5）溶液中备用。在96 孔平板上进行， 每孔加入10 μl的各种微生物悬浮液 （终浓度大约1 ×107 CFU/ml的细菌，10 μg 的融合蛋白或非融合蛋白，用TBS（pH7.5）补平至 100 μl，混匀后避光静置1~2 h后在荧光显微镜下检测凝集活性（图11）。我们发现融合蛋白和非融合蛋白YH1均能使金葡菌和大肠杆菌发生凝集，且相对于金葡菌，YH1蛋白对大肠杆菌具有更强的凝集效果，TBS作为阴性对照。

实施例 7 ：打孔法研究抗菌活性

将不同菌株种子菌于平板画线， 培养过夜， 得到单克隆； 次日挑单克隆于5 ml对应的培养液，培养过夜；5,000 rpm、4℃离心，去上清后用50 mM Tris, 150 mM NaCl重悬。测细菌OD值。同时准备配LB 培养基，加入1％的琼脂糖。高压灭菌20 min，待温度降至45℃ 左右时，按1：1000的体积比加入培养至OD600=0.3 的菌液，摇匀倒板。用灭菌后的打孔器在活性筛选板上打孔（直径4-5 mm）。空白对照孔加100μl GST；测试孔加100μl含有非融合蛋白100μg的TBS（pH7.5）；阳性对照加100 μl终含量为 100μg 的氨苄青霉素（Amp）。各溶液0.22 μm细菌过滤器过滤除菌。培养过夜。次日观察有无抑菌圈形成（图12）。由图可见，与GST阴性对照和Amp阳性对照相比较，加入YH1蛋白的孔周围出现了明显的抑菌斑，证明其具有抑制革蓝氏阴性细菌的作用。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

序列表

<110> 广东医学院司法鉴定中心

<120> 一种鼻咽癌相关易感基因YH1蛋白的制备方法及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgagatcta tgcagtttgg aggcctgccc gtg 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagt tagaccttga tgacaaactg tag 33

<210> 3

<211> 256

<212> PRT

<213> YH1蛋白

<400> 3

Met Phe Gln Thr Gly Gly Leu Ile Val Phe Tyr Gly Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gln Thr Met Ala Gln Phe Gly Gly Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln

20 25 30

Thr Leu Pro Leu Asn Val Asn Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Thr

35 40 45

Gly Leu Ala Gly Ser Leu Thr Asn Ala Leu Ser Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Ser Gly Gly Leu Leu Gly Ile Leu Glu Asn Leu Pro Leu Leu Asp

65 70 75

Ile Leu Lys Pro Gly Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Leu Gly Gly

80 85 90

Leu Leu Gly Lys Val Thr Ser Val Ile Pro Gly Leu Asn Asn Ile

95 100 105

Ile Asp Ile Lys Val Thr Asp Pro Gln Leu Leu Glu Leu Gly Leu

110 115 120

Val Gln Ser Pro Asp Gly His Arg Leu Tyr Val Thr Ile Pro Leu

125 130 135

Gly Ile Lys Leu Gln Val Asn Thr Pro Leu Val Gly Ala Ser Leu

140 145 150

Leu Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Ile Thr Ala Glu Ile Leu Ala

155 160 165

Val Arg Asp Lys Gln Glu Arg Ile His Leu Val Leu Gly Asp Cys

170 175 180

Thr His Ser Pro Gly Ser Leu Gln Ile Ser Leu Leu Asp Gly Leu

185 190 195

Gly Pro Leu Pro Ile Gln Gly Leu Leu Asp Ser Leu Thr Gly Ile

200 205 210

Leu Asn Lys Val Leu Pro Glu Leu Val Gln Gly Asn Val Cys Pro

215 220 225

Leu Val Asn Glu Val Leu Arg Gly Leu Asp Ile Thr Leu Val His

230 235 240

Asp Ile Val Asn Met Leu Ile His Gly Leu Gln Phe Val Ile Lys

245 250 255

Val

256

Claims (2)

1.一种鼻咽癌相关蛋白YH1制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）、构建表达载体构建：提取鼻咽组织总RNA，反转录出cDNA；用带有BglII/Xho1双酶切位点的YH1特异性引物进行PCR扩增获得YH1基因，回收产物进行BglII/Xho1酶切；同时pGEX-4T-1载体用BglII/Xho1酶进行双酶切、纯化、回收；回收的YH1基因的双酶切产物连接到pGEX-4T-1载体；连接液转化DH5a大肠杆菌，阳性克隆筛选，得到pGEX-4T-1-YH1表达质粒；所述带有BglII/Xho1双酶切位点的YH1特异性引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

（2）、表达工程菌的构建及诱导表达：将pGEX-4T-1-YH1表达质粒加到冰预冷的E.coli BL21 ( DE3 )感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上孵育25－35 min，40－45℃热激85－95S，立即置冰上2.5－3.5min，加入在37℃预热的500ul无抗LB液体培养基，37℃，震摇45－55min；取菌液涂布在含有Amp抗性LB平板上，放入37℃培养过夜；取单个菌落接种于Amp抗性 LB液体培养基中，37℃震摇培养2.5－3.5h至对数生长期，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为1mM后，37℃震摇培养2－4h，收集培养菌液，离心取上清液，即得所述鼻咽癌相关蛋白YH1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，还包括纯化和酶切：

（3）、将离心后的上清液重悬于PBS缓冲液中，在冰上以400W的功率超声180－220次，每超声3秒，间隔5秒，然后离心取上清；于Glutathione FF层析柱上进行亲和层析，以1%Triton X-100,1mM EDTA ,pH7.4 PBS 缓冲液洗脱，纯化得到GST-YH1融合蛋白；

（4）、将GST-YH1融合蛋白脱盐至pH7.4，PBS 缓冲液中，按照4.5－5.5 unit酶量消化1mgGST-YH1融合蛋白的比例加入Thrombin凝血酶，室温消化1.5－2.5小时；Q Sepharose FF阴离子交换柱进行亲和层析， 10mM GSH,pH8.0 PBS缓冲液GST洗脱下来，再用pH8.0，20mM Tris缓冲液将YH1蛋白洗脱下来,得到非融合YH1蛋白。

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