CN101870986A

CN101870986A - 一种抗菌肽plectasin的高效生产方法及应用

Info

Publication number: CN101870986A
Application number: CN 201010181259
Authority: CN
Inventors: 黄毓茂; 刘德辉; 何俊
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2010-10-27

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽plectasin的高效生产方法及应用，通过构建pGAPZαA-plectasin真核表达载体转化宿主细胞毕赤酵母，构建表达工程菌，发酵培养表达工程菌后将表达培养基离心处理得到上清液即为纯化得到抗菌肽plectasin。所述抗菌肽plectasin可应用于制备抗菌药物或饲料添加剂或防腐剂，对金黄色葡萄球菌或猪源链球菌具有良好的抗性作用。本发明操作简单，成本较低。

Description

一种抗菌肽plectasin的高效生产方法及应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽的表达技术，尤其是涉及一种真菌防御素抗菌肽plectasin的高效生产方法及应用。

背景技术

目前，几乎所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着动物和人类的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，是一种由微生物、植物、无脊椎动物和各种动物的细胞和组织产生的一种抗菌活性多肽，也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分。现有技术研究发现抗菌肽广泛分布于细菌、昆虫、植物、两栖动物和哺乳动物中，它具有广谱抗菌、抗病毒、杀肿瘤细胞、热稳定、强碱性、易溶于水和带正电荷等特点，相对分子质量低及对真核细胞几乎没有毒不良反应。并且抗菌肽的抗菌所需浓度小，抗菌浓度单位一般在μmol/L水平，可作为传统抗生素的替代品，具有巨大发展潜力。

Plectasin是2005年Mygind等研究小组从腐生子囊菌(thesaprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella)中分离得到首例真菌防御素，其研究结果公布在《自然》杂志上，(Nature，2005，437：975-980)。Plectasin具有有效的抗革兰氏阳性菌且无溶血性等功能，是一种具有治疗潜能的肽抗生素。

Plectasin基因开放阅读框编码一个95个残基长的肽，由一个信号肽序列(残基1-23)，一个前片断(残基23-55)和一个40个残基的C端区域(残基56-95)，与几种无脊椎动物防御素存在50～55％序列相似性，其分子量约为4.4KD。

直接从腐生子囊菌菌丝体中提取天然Plectasin时，分离提纯存在一定的困难，而且产量有限。化学合成和基因工程法是获得抗菌肽Plectasin的主要手段，但化学合成Plectasin成本高，而通过基因工程在微生物中表达抗菌肽基因是获得Plectasin的有效途径。Mygind等2005年从P.nigrella菌丝体中克隆到Plectasin的cDNA，将其转化将到Aspergillus oryzae表达系统中，分泌出Plectasin，并进行了其结构和活性研究。

大肠杆菌表达系统基于大肠杆菌的原核表达系统是迄今在基因工程领域中应用最多、也最完善的系统，但运用该系统表达抗菌肽则遇到很多困难，主要表现在2个方面：一是抗菌肽的宿主细胞毒性，宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性地抑制宿主细胞的增殖，从而影响抗菌肽的进一步表达；二是容易被降解。由于抗菌肽本身带有大量正电荷，因而对蛋白酶非常敏感，在表达胞中容易被降解，难以实现大量表达。而且大肠杆菌表达产物均以包涵体的形式存在，需将细胞超声破碎后透析纯化，给后续处理带来困难。

抗菌肽Plectasin的现有表达技术同样存在上述问题，表达量较低，纯化操作繁琐。

酵母表达系统具有与大肠杆菌同样的繁殖快、易于培养、遗传操作简单、可工业化生产等特点，酵母表达系统同时还具有使蛋白折叠、磷酸化、糖基化、酰胺化等修饰能力，避免了蛋白以包涵体形式表达、活性降低等问题。

但目前抗菌肽的酵母表达系统基本上是基于甲醇诱导，存在着较多技术问题，如某些蛋白的表达量相对较低甚至不能表达；分泌表达产物不均一，存在聚合体、信号肽加工不完全、表达产物降解等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术抗菌肽Plectasin生产技术的不足，筛选得到更适合抗菌肽plectasin的表达系统，并寻找到获得高效表达结果的技术方案，提供一种抗菌肽plectasin的高效生产方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种抗菌肽(真菌防御素)plectasin的高效生产方法，包括以下步骤：

(1)将编码plectasin的DNA序列克隆到载体pGAPZαA上，构建pGAPZαA-plectasin重组表达载体；

(2)将重组表达载体pGAPZαA-plectasin转化宿主细胞毕赤酵母SMD1168，构建重组酵母基因工程菌；

具体操作方法是：将感受态P.pastoris SMD 1168与Avr II线性化的pGAPZαA-plectasin相混合，将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板上，培养至单菌落出现。采用煮—冻—煮法制备PCR模板分析P.pastoris转化子，设计引物扩增出391bp的克隆子定为阳性转化子，添加不同浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母表达子；

(3)发酵培养重组酵母菌，进行表达；

具体操作是：用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于5mL的YPD液体培养基中进行一级培养，30℃，200r/min振荡过夜，至OD₆₀₀＝2～6，此时细胞处于对数生长期。取一级培养液，重悬于YPD液体培养基中中，继续振荡培养，包扎好后培养约72～120小时。

(4)表达产物纯化得到抗菌肽plectasin。纯化的方法是将表达培养基离心处理，取上清液即为纯化的抗菌肽plectasin。

本发明同时提供了上述方法制备得到的抗菌肽plectasin的应用，可应用于制备抗菌药物，尤其是抗金黄色葡萄球菌或猪源链球菌等药物。本发明plectasin的表达产物还可以应用制备饲料添加剂或防腐剂。

本发明的有益效果是：

本发明选择毕赤酵母菌作为外源基因真核表达系统，并选择其蛋白酶缺陷型菌株SMD1168，以及载体pGAPZαA，使plectasin获得高效表达，避免了产物被蛋白酶降解。

本发明不需采用甲醇诱导，所表达异源蛋白直接分泌到培养基中，培养基中的外源基因表达产物的纯化操作简单，并可获得较高的表达量。

本发明选择的培养基价格低廉，更利于实现工业化生产。

本发明应用基因工程技术在真核宿主细胞中高效表达了抗菌肽plectasin，经实验验证该抗菌肽对多种革兰氏阳性菌有杀菌作用。可应用于制备抗菌药物，或应用制备饲料添加剂和防腐剂。

本发明方法表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，具有广阔的应用推广前景。

附图说明

图1是抗菌肽plectasin对金黄色葡萄球菌的抑菌作用实验结果

图2是抗菌肽plectasin对猪源链球菌的抑菌作用实验结果

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例1：抗菌肽(真菌防御素)plectasin的制备

pGAPZαA、Puc18、毕赤酵母SMD1168均购自Invitrogen公司。

(1)构建表达载体：根据毕赤酵母基因的偏嗜性和抗菌肽plectasin氨基酸序列，pGAPZαA质粒载体图谱上的多克隆位点设计并全基因合成plectasin核酸在质粒Puc18载体上。本实施例基因由上海英俊公司合成在Puc18载体上。

设计四条引物序列如下：

引物P1：Plectasin-P1：5’CCCTCGAGAAAAGAGGTTTTGGTTGTAAC3’

引物P2：Plectasin-P2：5’GCTCTAGATCAGTAACACTTACAAACAAAACC3’

引物P3：Plectasin-P3：5’GTCCCTATTTCAATCAAT3’

引物P4：Plectasin-P4：5’ACCCTTAGCACAGTAACC3’

酶切位点为Xho Ⅰ和Xba Ⅰ，表达载体为pGAPZαA；

(2)构建基因工程菌：用上述表达载体转化宿主菌，宿主菌为毕赤酵母SMD1168；

将感受态P.pastoris SMD1168与Avr II线性化的pGAPZαA-plectasin相混合，在1.5kV、200Ω条件下电击5ms。

AvrII线性化pGAPZαA-plectasin的酶切体系为：

10×KBuffer 10μL

pGAPZαA-plectasin 40μL

AvrII 3μL

ddH2O 47u L

总体积 100μL

将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板(YPDS平板含100μg/ml Zeocin)上，将平板倒置，于30℃恒温箱中培养至单菌落出现。采用煮—冻—煮法制备PCR模板分析P.pastoris转化子，以P3、P4为引物扩增出391bp的克隆确定为阳性转化子；添加不同浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母表达子，将抗性增加到500μg/ml Zeocin筛选到符合要求的表达子。

上述采用煮-冻-煮法制备PCR模板分析P.pastoris转化子是取单菌落中少量菌放Eppendorf管中，加100ul的灭菌水，100℃煮10分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，100℃煮10分钟，10000r/min离心取上清液。

(3)发酵培养重组酵母菌，进行表达：用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于5mL的常规YPD液体培养基中进行一级培养，30℃，200r/min振荡过夜，至OD₆₀₀＝2～6，此时细胞处于对数生长期。取1mL一级培养液，重悬于30mL的YPD中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72～120小时。

(4)纯化：表达上清于3000～5000r/min离心5min即可，操作简便易行。

实施例2：

通过琼脂糖扩散抗菌鉴定(Agarose diffusion antimicrobial assay)(美国专利6,337,314，2002年1月8日)。

按照实施例1的方法得到基因工程表达的抗菌肽plectasin，以具有代表性的标准金黄色葡萄球菌S.aureus和本实验室临床分离的猪链球菌(也可以采用现有技术领域一般实验室常规使用的猪链球菌)进行抗菌鉴定，针对其他菌的实验本领域技术人员可以参照此实施例，不一一在此赘述。将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌和猪链球菌悬浮液(OD₆₀₀≈0.5)各15μL，与55℃的LB固体培养基30mL混匀后铺平板，等其凝固后，用灭菌的打孔器(直径3mm)打孔，滴加50μL待测plectasin样品，37℃培养过夜，以同体积的pGAPZαA空载体转化酵母表达蛋白为阴性对照，Amp为阳性对照，37℃培养24小时。

本发明抗菌肽plectasin对金黄色葡萄球菌和猪源链球菌的抑菌作用实验结果分别见附图1和附图2。附图1中1、2分别为抑菌圈，3为Amp阳性对照，4为空载体表达上清液阴性对照；附图2中1为空载体表达上清液阴性对照，2为Amp阳性对照，3、4分别为抑菌圈。表明上述菌株对抗菌肽plectasin敏感，可应用于制备抗金黄色葡萄球菌或猪源链球菌药物方面以及应用于制备饲料添加剂或防腐剂。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>一种抗菌肽plectasin的高效生产方法及应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>引物P1人工序列

<400>1

ccctcgagaa aagaggtttt ggttgtaac 29

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>引物P2人工序列

<400>2

gctctagatc agtaacactt acaaacaaaa cc 32

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>引物P3人工序列

<400>3

gtccctattt caatcaat 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>引物P4人工序列

<400>4

acccttagca cagtaacc 18

Claims

1.一种抗菌肽plectasin的高效生产方法，其特征在于通过构建pGAPZαA-plectasin真核表达载体转化宿主细胞毕赤酵母，构建表达工程菌，发酵培养表达工程菌后将表达培养基离心处理得到的上清液即纯化得到抗菌肽plectasin。

2.根据权利要求1所述抗菌肽plectasin的高效生产方法，其特征在于包括以下步骤：

(3)发酵培养重组酵母菌，进行表达；

(4)将表达培养基离心处理，取上清液即得纯化的抗菌肽plectasin。

3.根据权利要求2所述抗菌肽plectasin的高效生产方法，其特征在于步骤(3)是将筛选的具有Zeocin抗性的单菌落于的YPD液体培养基中进行一级培养，至OD₆₀₀＝2～6，此时细胞处于对数生长期；取一级培养液，重悬于YPD中，继续振荡培养72～120小时。

4.根据权利要求2所述抗菌肽plectasin的高效生产方法，其特征在于步骤(4)是将表达培养基于3000～5000r/min下离心，取上清液即为纯化得到的抗菌肽plectasin。

5.一种权利要求1所述方法制备得到的抗菌肽plectasin的应用，其特征在于应用于制备抗金黄色葡萄球菌或猪源链球菌药物方面。

6.一种权利要求1所述方法制备得到的抗菌肽plectasin的应用，其特征在于应用于制备饲料添加剂或防腐剂。