CN101314762A

CN101314762A - 一种表达重组虹鳟鱼抗菌肽OncorhyncinⅡ的酵母工程菌及制备方法

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Publication number: CN101314762A
Application number: CNA2008101382046A
Authority: CN
Inventors: 王凤山; 李娜; 生举正; 张建; 曹吉超; 孟硕
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2008-07-03
Filing date: 2008-07-03
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2028-07-03
Also published as: CN101314762B

Abstract

本发明公开了一种表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌及其制备方法，是将虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽的编码基因导入酿酒酵母中，得到能够分泌表达虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的菌株；所述酿酒酵母工程菌株已于2008年6月19日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.2554。本发明的酿酒酵母工程菌株能稳定表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II，所述抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性，可用于制作饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品。

Description

一种表达重组虹鳟鱼抗菌肽OncorhyncinⅡ的酵母工程菌及制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域中的一种酵母工程菌及其构建方法，尤其涉及一种表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌及制备方法。

背景技术

与哺乳动物不同，硬骨鱼缺乏专门的淋巴样器官，如淋巴结等。因此，与哺乳动物相比，硬骨鱼的次级获得性免疫反应比较微弱，换言之鱼类更依赖于天然免疫系统，特别是在个体发育期或在不能产生抗体的环境中。现已知参与鱼类非特异性免疫反应的因子主要包括巨噬细胞和粒细胞等一些具有吞噬作用的细胞以及介导一系列免疫或应激反应的蛋白质分子，如补体、细胞因子、趋化因子及溶菌酶和抗菌肽等。硬骨鱼的黏液腺细胞分泌物作为一道物理及生物化学屏障保护着其不受微生物侵害，是宿主防御系统的第一道防线。虽然硬骨鱼的种类多达24,000余种，但目前已知来源于硬骨鱼的抗菌肽却寥寥无几(Fernandes JM，Smith VJ.A novel antimicrobial function for a ribosomal peptidefrom rainbow trout skin[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，296(1)：167-171.)。

抗菌肽是一类可以抵抗多种病原菌感染的非特异性免疫因子。抗菌肽具有分子量小、热稳定性强、水溶性好、杀菌能力强、抗菌谱广、不易诱导产物耐药菌等特点。过去几年，抗菌肽在植物和小鼠上研究较多，并得到成功应用。研究表明，转抗菌肽基因的植物(John L.Norelli.Use of Antimicrobial Proteins and Peptides in Transgenic Plants.)和小鼠的抗病能力(Reed WA，Elzer PH，Enright FM，et al.Interleukin 2 promoter/enhancercontrolled expression of a synthetic cecropin-class lytic peptide in transgenic mice andsubsequent resistance to Brucella abortus[J].Transgenic Res，1997，6(5)：337-347.)明显提高；相类似，抗菌肽在鱼、虾抵抗病原感染过程中也起着重要作用。英国和法国科学家在虹鳟鱼和对虾抗菌肽分离纯化上做了许多工作(Fernandes JM，Smith VJ.A novelantimicrobial function for a ribosomal peptide from rainbow trout skin[J].Biochem BiophysRes Commun，2002，296(1)：167-171.)(Destoumieux D，Bulet P，Loew D，et al.Penaeidins，a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei(Decapoda)[J].J Biol Chem，1997，272(45)：28398-28406.)。

鱼类的皮肤、皮肤分泌物、肝脏、腮等有大量的抗菌肽物质存在。目前已分离到的鱼类组蛋白抗菌肽类似物主要有来自虹鳟鱼(rainbow trout)的Oncorhyncin II、III(Fernandes JM，Molle G，Kemp GD，et al.Isolation and characterisation of oncorhyncin II，a histone H1-derived antimicrobial peptide from skin secretions of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss[J].Dev Comp Immunol，2004，28(2)：127-138；Fernandes JM，SaintN，Kemp GD，et al.Oncorhyncin III：a potent antimicrobial peptide derived from thenon-histone chromosomal protein H6 of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss[J].Biochem J，2003，373(2)：621-628.)，来自Trout-Testis Histone H1(Macleod AR，Wong NC，Dixon GH.The amino-acid sequence of trout-testis histone H1[J].Eur J Biochem，1977，78(1)：281-291.)，来自银鲑(coho salmon)的HDSF(Patrzykat A，Zhang L，Mendoza V，et al.Synergy of histone-derived peptides of coho salmon with lysozyme and flounderpleurocidin[J].Antimicrob Agents Chemother，2001，45(5)：1337-1342.)，来自大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)的H1(Richards RC，O′Neil DB，Thibault P，et al.Histone H1：anantimicrobial protein of Atlantic salmon(Salmo salar)[J].Biochem Biophys Res Commun，2001，284(3)：549-555.)等。

虹鳟鱼肉质鲜美、营养价值高，在世界水产业养殖业中占有重要地位。本发明所述抗菌肽Oncorhyncin II是2004年由英国Fernandes等从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)表皮分泌物中分离得到的一种高效广谱的抗菌肽(Fernandes JM，Molle G，Kemp GD，et al.Isolation and characterisation of oncorhyncin II，a histone H1-derived antimicrobial peptidefrom skin secretions of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss.Dev Comp Immunol.2004，28(2)：127-138.)。该抗菌肽相对分子质量(M_r)为7195.3Da，是组蛋白H1 C-末端衍生的一段69个氨基酸残基片断，抗菌活性强且抗菌谱广，对藤黄微球菌(MicrococcusLuteus)、柠檬色动性球菌(Planococcus citreus)等革兰阳性菌和大肠杆菌(Escherichiacoli)、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)等革兰阴性菌的MIC均在微摩尔级，是天蚕抗菌肽P1的1/10；在发挥抗菌作用的浓度下无溶血性，对宿主细胞无损伤。机制研究初步表明，该多肽能够显著降低平面脂双层的稳定性，但不形成稳定的离子通道，推测可能采用毯式模型进入细胞，然后对胞内靶点发挥抗菌作用。此外，该抗菌肽具有较强的热稳定性，80℃孵育5min活性仍保持不变。进一步研究结果揭示，该抗菌肽可能在虹鳟鱼黏膜防御系统中扮演重要角色。

酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又具有真核生物能够对蛋白质进行翻译后修饰的优点，能够表达糖蛋白等结构复杂蛋白质。酿酒酵母表达系统作为研究高等真核生物基因功能的理想模式生物具有许多优点，如遗传背景清楚，易进行操作；安全，不产生毒素，其表达产物无需大量宿主安全性实验；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；工艺简单，成本低等。虽然已有大量的蛋白质类药物在酵母表达系统中成功表达，但至今还未见利用酵母表达系统成功表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的报道，或者涉及表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II酵母工程菌及其所述菌构建的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能够分泌表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌及制备方法。

本发明所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌，是将虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽的编码基因导入酿酒酵母中，得到能够分泌表达虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的菌株；其特征在于：所述虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽的编码基因是自GenBank号为X02624的5′-端第956-1165位碱基的核苷酸序列；所述酿酒酵母是酿酒酵母H158；所述虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的氨基酸残基序列是自GenBank号为P06350的N-端第139-207位氨基酸残基序列；所述酿酒酵母工程菌株已于2008年6月19日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.2554。

本发明所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158(paOnII)，菌的细胞形态为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度为30℃，其发酵培养基和培养条件与酿酒酵母H158相同。

上述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌的构建方法步骤是：

(1)以质粒pGAPZαA中信号肽α-factor基因序列为模板，利用PCR的方法获得α-factor片段，两条引物分别为：

F2：5′CGCCGAATTCATGAGATTTCCTTCAA TTTTTACTGCT3′

R2：5′TTCTTTGCGGCCACGGCCTTTCTTTTTTCGAGAGATA3′

其中F2的5′-端加入限制性内切酶位点EcoR I。

(2)以重组载体Oncorhyncin II/

-T Easy为模板扩增目的基因Oncorhyncin II序列，两条引物分别为：

F3：5′TATCTCTCGAAAAAAGAAAGGCCGTGGCCGCAAAGAA3′

R3：5′GCGGCTCGAGTTACTTCTTCTTGGGGGCTGC3′

其中R3的5′端加入限制性内切酶位点Xho I。

(3)以α-factor和Oncorhyncin II的PCR产物为模板进行overlap extension PCR扩增，得α-factor-Oncorhyncin II的PCR产物，两条引物为F2和R3。

(4)利用EcoR I和Xho I分别双酶切融合片段α-factor-Oncorhyncin II和质粒pAJ401，然后用T4DNA连接酶连接。

(5)连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒paOn II，最终获得重组表达质粒paOn II。

(6)将测序正确的重组质粒paOn II用限制性内切酶EcoRV酶切线性化，以空质粒pAJ401为阴性对照，利用电击转化法将线性化的重组质粒paOn II和空质粒pAJ401转化酿酒酵母H158感受态细胞，在CSM-Ura平板上培养2～3天筛选转化子，挑取阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得Ura⁺含paOn II转化子H158。

(7)酵母重组工程菌株发酵及产物鉴定。

上述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌的构建方法中：

步骤(6)所述电击转化法的条件优选是：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms。

步骤(7)中所述酵母重组菌株发酵的条件优选是：30℃，200～250r/min培养3～4天。

步骤(7)中所述产物鉴定的方法包括SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE。

上述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌的构建方法中涉及的培养基配方是：CSM-Ura培养基：以g/L计无氨基酸酵母氮源(YNB)6.5g，D-葡萄糖20g，灭菌后分别加入过滤除菌的氨基酸储液即L-Leu 3mg/ml、L-His 2mg/ml、L-Trp2mg/ml各30ml；YPD培养基：以g/L计酵母抽提物10g，蛋白胨20g，D-葡萄糖20g。

本发明述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌在制备饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品中的应用。

本发明提供的表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌能够稳定分泌表达虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II。所述酿酒酵母工程菌与宿主菌相比，其生理、生化特性无明显差异。本发明的酿酒酵母工程菌分泌表达的重组抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑菌活性，在制备饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品中的具有广泛应用，能够进一步地开发制作饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品。

附图说明

本发明提供的表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌已于2008年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCCNo.2554。

图1为重组质粒paOn II的构建过程示意图

图2为目的基因Oncorhyncin II PCR产物

其中：泳道M为DNA Marker I(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为Oncorhyncin II的PCR产物

图3为信号肽α-factor基因的PCR产物的电泳图

其中：泳道M为DNA Marker I(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为α-factor的PCR产物。

图4为Oncorhyncin II基因的PCR产物的电泳图

其中：泳道M为DNA Marker I(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为Oncorhyncin II的PCR产物。

图5为α-factor-Oncorhyncin II的PCR产物的电泳图

其中：泳道M为100bp DNA Ladder(1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为α-factor-Oncorhyncin II的PCR产物。

图6为重组质粒转化子的PCR验证的电泳图

其中：泳道M为100bp DNA Ladder(1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1～4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物。

图7为目的基因整合到酿酒酵母染色体上的PCR验证的电泳图

其中：泳道M为DNA Marker I(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1～6为阳性转化子的PCR产物，泳道7～8为空质粒转化子的PCR产物，泳道9为阳性对照。

图8为工程菌发酵液上清对大肠杆菌的抑菌活性检测图

其中：1-4为阳性转化子，5为阴性转化子，6为阳性对照氨苄青霉素。

图9为工程菌发酵液上清对金黄色葡萄球菌的抑菌活性检测图

其中：1-6为阳性转化子，7为阴性转化子。

具体实施方式

下面以具体实施例方式对本发明作进一步描述，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、构建表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158(paOn II)，CGMCC No.2554。

一、虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽基因的获得

采用TRIzol法从虹鳟鱼表皮中提取总RNA，用M-MuLV逆转录合成cDNA；根据虹鳟鱼抗菌肽基因序列，设计一对引物F1和F2，进行常规聚合酶链式反应，扩增虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽基因序列，得到210bp的DNA片段(见图2)，产物扩增纯化后克隆到

-T Easy载体上，构建成重组载体Oncorhyncin II/

-T Easy，序列测定结果表明，获得的虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽基因序列与GenBank号为X02624的5′-端第956-1165位碱基的核苷酸序列完全一致。两条引物分别为：

F1：5′GCGGAAGGCCGTGGCCGCAAAG3′

R1：5′GCGGTTACTTCTTCTTGGGGGCTG3′

二、含有虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽的编码基因的表达载体paOn II的构建

含有虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽的编码基因的表达载体paOn II的构建过程参见图1描述。

1、信号肽α-factor序列的获得

以质粒pGAPZαA中信号肽α-factor的基因序列(pGAPZA，B，and C.pGAPZαA，B，and C.Pichia expression vectors for constitutive expression and purification of recombinantproteins.Invitrogen.)为模板扩增信号肽α-factor基因序列，两条引物分别为：

F2：5′CGCCGAATTCATGAGATTTCCTTCAA TTTTTACTGCT3′

R2：5′TTCTTTGCGGCCACGGCCTTTCTTTTTTCGAGAGATA3′

其中F2的5′-端加入限制性内切酶位点EcoR I。

将得到的PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，得到一条约285bp的特异条带，其大小与预期相当。图3中，泳道M为DNA Marker I(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为α-factor的PCR产物。

信号肽α-factor的扩增产物经回收纯化后于-20℃保存备用。

2、目的基因Oncorhyncin II序列的获得

以重组载体Oncorhyncin II/

F3：5′TATCTCTCGAAAAAAGAAAGGCCGTGGCCGCAAAGAA3′

R3：5′GCGGCTCGAGTTACTTCTTCTTGGGGGCTGC3′

其中R3的5′-端加入限制性内切酶位点Xho I。

将得到的PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，得到一条约237bp的特异条带，其大小与预期相当。图4中，泳道M为DNA Marker I(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为Oncorhyncin II的PCR产物。

虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的扩增产物经回收纯化后于-20℃保存备用。

3、信号肽α-factor与目的基因Oncorhyncin II序列的拼接

以α-factor和Oncorhyncin II的PCR产物为模板进行overlap extension PCR扩增，两条引物为F2和R3。

将得到的PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图5所示，得到一条约485bp的特异条带，其大小与预期相当。图5中，泳道M为100bp DNA Ladder(1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1为α-factor-Oncorhyncin II的PCR产物。

4、目的基因片段克隆入载体

拼接产物经纯化回收后进行EcoR I和Xho I的双酶切，酚/氯仿抽提，-20℃保存备用。pAJ401质粒同样进行EcoR I、Xho I双酶切，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，-20℃保存备用。将酶切后的α-factor-Oncorhyncin II融合片段与pAJ401质粒用T4 DNA连接酶连接，4℃反应过夜。

感受态细胞的制备：挑取单个大肠杆菌JM109菌落，接种于LB培养基3ml中，37℃培养过夜，次日按1∶100二次接种于LB培养基50ml中，37℃培养3h，待菌液OD₆₀₀＝0.6时，4℃、5000r/min离心8min，弃上清，沉淀用0.1mol/L CaCl₂悬浮，再以5000r/min离心8min，弃上清，沉淀以适量0.1mol/L CaCl₂悬浮，分装后于-80℃备用。

连接产物的转化：取上述连接产物加入大肠杆菌JM109感受态细胞50μl冰浴30min，42℃热击60s，再置冰浴2min，加入LB培养基950μl，37℃培养1.5h，取菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的固体LB平板上培养，筛选得到具有氨苄青霉素抗性的转化子，提取转化子质粒后以F2和R3为引物进行PCR验证。

结果如图6所示，泳道M为100bp DNA Ladder(1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1～4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物。经PCR扩增鉴定，挑取的阳性转化子可扩增获得一条约485bp的单一条带，与α-factor-Oncorhyncin II基因的大小一致，而空载体转化子经PCR后没有这一特异条带。这表明表达质粒pAJ401中已经插入了α-factor-Oncorhyncin II片段。

将筛选得到的阳性克隆小量扩增后进行测序分析，验证重组质粒中α-factor-Oncorhyncin II融合片段序列的正确性，最终获得了重组质粒paOn II。

三、表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158(paOn II)(CGMCC No.2554)的构建

1、工程菌H158(paOn II)的构建

将测序正确的重组质粒paOn II用限制性内切酶EcoRV酶切线性化，酶切产物经酚/氯仿抽提纯化，沉淀用无菌超纯水10μl溶解，-20℃备用。与此同时，以空载体pAJ401为阴性对照。此重组质粒含有虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽的编码基因，即自GenBank号为X02624的5′-端第956-1165位碱基的核苷酸序列。

将该线性化质粒电转化酿酒酵母H158感受态细胞，在CSM-Ura平板上筛选转化子，获得Ura⁺转化子H158(paOn II)。该线性化重组质粒与H158基因组上的URA3发生同源重组，结果虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽基因被整合到染色体上。这样，在重组酵母菌株中即含有了虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II成熟肽的编码基因。

具体方法是：

酿酒酵母H158感受态细胞的制备：挑酿酒酵母H158单菌落于YPD培养基2ml中，30℃振荡培养过夜；取过夜培养物1ml于YPD 10ml中，30℃振荡培养至OD₆₀₀＝1.0～1.3；显微镜观察无污染后，4℃、5000r/min离心5min收集细胞；用等体积冰冷无菌超纯水洗涤，重悬细胞，离心(4℃，5000r/min，5min)；弃上清，用1/2体积冰冷无菌超纯水洗涤，重悬细胞，离心(4℃，5000r/min，5min)；弃上清，用1/25体积冰冷1mol/L无菌D-山梨醇溶液洗涤，重悬细胞离心(4℃，5000r/min，5min)；弃上清，用1/200体积的冰冷1mol/L无菌D-山梨醇溶液重悬细胞。此感受态细胞制备后尽快用于电转。

将电转杯置于冰上预冷，取新鲜制备的酿酒酵母H158感受态细胞80μl与线性化载体DNA溶液10μl混合，在电转杯中用微量加样器轻轻混匀，冰浴5min后用电穿孔仪进行电转化，条件为：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms。

电击后立即加入冰冷的1mol/L山梨醇1ml，混匀后转入无菌Ep管中，30℃静置2h。然后以1000×g离心6min，从上清中取出200μl，剩余倒掉，用该上清200μl将细胞轻轻悬浮，并涂布于CSM-Ura固体选择培养基平板上，30℃培养2～3天。

挑取数个Ura⁺转化子进行菌落PCR验证，引物为F2和R3，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测其大小是否正确。结果如图7所示，泳道M为DNA Marker I(700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1～6为阳性转化子的PCR产物，泳道7～8为空质粒转化子的PCR产物，泳道9为阳性对照。在空质粒转化子组中没有任何片段生成，而在挑选的工程菌H158(paOn II)中扩增得到了与阳性对照大小相当的485bp特异片段，说明这些转化子的染色体中已经整合了α-factor-Oncorhyncin II片段。

取酵母重组工程菌株在YPD平板上划线，30℃培养两天后挑取单菌落分别接种于YPD液体培养基5ml中，30℃、220r/min培养24h。然后将菌液按1∶100转接至YPD中进行扩大培养，30℃、220r/min培养3～4天。其中涉及的培养基配方是：YPD培养基(以g/L计)：酵母抽提物10g，蛋白胨20g，D-葡萄糖20g。

以6000r/min离心收集发酵液，取500μl加入2倍冰冷无水乙醇中，于-20℃放置30min或更久，4℃、12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用适量样品缓冲液溶解，沸水浴10min，放冷后进行Tricine-SDS-PAGE分析，检测重组蛋白的分泌表达情况。电泳条件：恒压30V，约1h后进入分离胶，调整电压至150V继续电泳，约3h，待前沿迁移至胶板下沿1cm时结束电泳。

上述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程——菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158(paOn II)已于2008年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.2554。

2、表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158(paOn II)的抗菌活性测定

重组酿酒酵母工程菌株发酵液经6000r/min离心10min，收集上清；经真空冻干后，用无菌水溶解，约浓缩20倍，以备活性检测。活性测定采用标准琼脂孔穴扩散法：将处于对数生长期的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌悬液(OD₆₀₀＝0.3)200μl与固体LB(含1％琼脂)50ml在55℃左右混合均匀，铺板，待其凝固后在培养基上用打孔器打直径为5mm的小孔，加入待测样品液20μl，37℃培养过夜。

结果如图7(受试菌为大肠杆菌，其中1-4为阳性转化子，5为阴性转化子，6为氨苄青霉素)、图8(受试菌为金黄色葡萄球菌，其中1-6为阳性转化子，7为阴性转化子)所示，工程菌株发酵液上清对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示了一定的抗菌活性，而对照组未见抑菌圈。这表明，工程菌发酵液上清对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑菌活性。

Claims

1.一种表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌，是将虹鳟鱼抗菌肽OncorhyncinII成熟肽的编码基因导入酿酒酵母中，得到能够分泌表达虹鳟鱼抗菌肽OncorhyncinII的菌株；其特征在于：所述虹鳟鱼抗菌肽OncorhyncinII成熟肽的编码基因是GenBank号为X02624的5′-端第956-1165位碱基的核苷酸序列；所述酿酒酵母是酿酒酵母H158；所述虹鳟鱼抗菌肽OncorhyncinII的氨基酸序列是自GenBank号为P06350的N-端第139-207位氨基酸残基序列；所述酿酒酵母工程菌株已于2008年6月19日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.2554。

2.权利要求1所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌的构建方法，步骤是：

F2：5′CGCCGAATTCATGAGATTTCCTTCAA TTTTTACTGCT3′

R2：5′TTCTTTGCGGCCACGGCCTTTCTTTTTTCGAGAGATA3′

其中F2的5′-端加入限制性内切酶位点EcoR I；

(2)以重组载体Oncorhyncin II/pGEM

F3：5′TATCTCTCGAAAAAAGAAAGGCCGTGGCCGCAAAGAA3′

R3：5′GCGGCTCGAGTTACTTCTTCTTGGGGGCTGC3′

其中R3的5′-端加入限制性内切酶位点Xho I；

(3)以α-factor和Oncorhyncin II的PCR产物为模板进行overlap extension PCR扩增，得α-factor-Oncorhyncin II的PCR产物，两条引物为F2和R3；

(4)利用EcoR I和Xho I分别双酶切融合片段α-factor-OncorhyncinII和质粒pAJ401，然后用T4DNA连接酶连接；

(5)连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒paOn II，最终获得重组表达质粒paOn II；

(6)将测序正确的重组质粒paOnII用限制性内切酶EcoRV酶切线性化，以空质粒pAJ401为阴性对照，利用电击转化法将线性化的重组质粒paOn II和空质粒pAJ401转化酿酒酵母H158感受态细胞，在不含Ura的MD平板上培养2～3天筛选转化子，挑取阳性转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得Ura⁺含paOnII转化子H158；

(7)酵母重组工程菌株发酵及产物鉴定。

3.如权利要求2所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(6)所述电击转化法的条件是：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms。

4.如权利要求2所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(7)中所述酵母重组工程菌株发酵的条件是：30℃，200～250r/min培养3～4天。

5.如权利要求2所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(7)中所述产物鉴定的方法包括SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE。

6.如权利要求2所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽OncorhyncinII的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：方法中涉及的培养基配方是：CSM-Ura培养基：以g/L计无氨基酸酵母氮源6.5g，D-葡萄糖20g，灭菌后分别加入过滤除菌的氨基酸储液即L-Leu3mg/ml、L-His 2mg/ml、L-Trp 2mg/ml各30ml；YPD培养基：以g/L计酵母抽提物10g，蛋白胨20g，D-葡萄糖20g。

7.权利要求1所述表达重组虹鳟鱼抗菌肽Oncorhyncin II的酿酒酵母工程菌在制备饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品中的应用。