CN101974546A - nisin-rbLF-N融合基因以及表达该融合基因的毕赤酵母工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Nisin-rbLF-N融合基因、含有该基因序列的表达载体，以及能够高效表达Nisin-rbLF-N融合基因的重组毕赤酵母菌；另外，本发明还提供了所述重组毕赤酵母菌的诱导培养方法。本发明通过PCR方法，将融合基因Nisin-rbLF-N克隆到真核表达载体pPIC9K中，转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达，能够表达出可观的融合蛋白。去糖基化后的融合蛋白经过复合蛋白酶酶解，具有抑干酪乳杆菌(G+菌)和大肠杆菌(G-菌)的作用。

Description

nisin-rbLF-N融合基因以及表达该融合基因的毕赤酵母工程菌

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种高效表达重组nisin-rbLF-N融合基因的毕赤酵母工程菌、其构建方法及诱导培养方法。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin)是一种高效、无毒的天然防腐剂，也是唯一一种可作为防腐剂应用于食品的细菌素。Nisin又称乳酸链球菌肽，是由乳酸链球菌产生的一种多肽物质，它能有效抑杀嗜热脂肪芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭菌、乳酸菌等各种革兰氏阳性菌的营养细胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的灭菌温度、缩短食品灭菌时间，使食品保持原有营养成份、风味、色泽，同时还可节约大量能源。可广泛应用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐装食品、果汁饮料及经热处理密闭包装食品的防腐保鲜，同时也可应用于化妆品和医疗保健品等领域。

乳铁蛋白肽(LFcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一段多肽，广泛存在于动物的乳汁、体液、泪液、唾液、血浆、中性粒细胞及多种组织中。具有抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、调节机体免疫、促进骨细胞生长等多种生物功能，在众多的功能中，抗菌功能是最引人注目的，而对真核细胞几乎没有毒性。且牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)的抗菌活性较其它的乳铁蛋白肽活性高具有很好的应用前景。

Nisin应用前景广阔，但也存在局限性，如不能够抑制G-菌、酵母菌以及霉菌，在中性及碱性环境中溶解度低、不稳定而且抗菌效果大大降低等，因此扩大nisin抗菌谱的研究不仅具有理论价值，而且具有十分重要的应用价值。

本发明针对乳链菌肽(nisin)抑菌谱窄的缺点，选择抗菌谱较广且具有较强抗性的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料，构建融合基因nisin-rbLF-N，并在毕赤酵母GS115宿主中进行表达，获得具有较广抗菌谱的融合蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种能在毕赤酵母中高效表达的重组nisin-rbLF-N融合基因。

本发明的另一目的是提供一种含有所述重组nisin-rbLF-N融合基因的表达载体。

本发明的再一目的是提供能够高效表达重组nisin-rbLF-N融合基因的毕赤酵母工程菌及其构建方法。

本发明的进一步目的是提供所述毕赤酵母工程菌的诱导培养方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种融合基因，其含有编码乳酸链球菌素的nisin基因和编码牛乳铁蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。

前述的融合基因为Nisin-rbLF-N，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供含有上述融合基因的载体。优选地，其出发载体为pPIC9K。

本发明还提供含有上述载体的工程菌。优选地，所述工程菌为毕赤酵母。更优选地，其为毕赤酵母GS115。

本发明另外提供构建上述毕赤酵母GS115工程菌的方法。

根据密码子的简并性，设计并合成适于在BL21中表达的nisin基因，并在5’端和3’端设计EcoR I和BamH I酶切位点，将优化后的nisin基因克隆于pMD19-T载体。根据目的序列分别设计引物。在上游引物设计酶切位点BamH I(下划线标记)和保护碱基。

上游引物F1：5’-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’；

下游引物R1：5’-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’。

根据牛乳铁蛋白cDNA序列，设计引物。在上游引物设计与nisin互补配对的序列(下划线标记)，下游引物设计酶切位点EcoR I(下划线标记)、终止密码子和保护碱基。

上游引物F2：5’-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3；

下游引物R2：5’-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’。

以合成的pMD19-T/nisin质粒为模板，用引物F1、R1进行PCR扩增nisin基因为179bp，纯化回收PCR产物；以牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增rbLF-N基因为181bp，纯化回收PCR产物；以纯化回收后的nisin基因和rbLF-N基因为模板，用引物F1、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因约为340bp。

将上述合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到载体pPIC9K中，将该载体转入毕赤酵母GS115中，然后进行重组克隆的筛选，获得重组毕赤酵母GS115工程菌，冷冻保存。

为了获得Nisin-rbLF-N重组蛋白的高效表达，所述赤酵母GS115工程菌在如下条件下诱导培养：

1)将重组酵母冻存菌种接于YPD平板上活化，28℃培养2d，至长出单菌落；

2)挑取一活化的单菌落于200mL BMGY液体培养基中，于30℃，250rpm培养，直至培养基的OD₆₀₀达到2.0～6.0；

3)6000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗涤菌体1～2次；

4)将菌体转移至200mL BMMY诱导培养基中，于28～30℃，200rpm诱导培养1～2d。优选地，诱导培养温度为28℃，诱导培养时间间为2d。

本发明选用的pPIC9K质粒是表达融合蛋白的毕赤酵母GS115高效表达载体，选择该载体的主要原因是：①pPIC9K含有乙醇氧化酶AOX1的调控序列，当其转化入受体菌株中，能与受体染色体上相应的序列AOX1发生同源重组，从而使整个载体连同外源基因被插入到受体染色体上，外源基因可在AOX1启动子控制下稳定地表达②质粒pPIC9K携带有野生型HIS4基因，于是通过基因的互补作用，野生型HIS4基因就可作为His⁺重组子的筛选标记。所以重组菌株可以在不含组氨酸的MD培养基中生长。

本发明将上述pPIC9K/nisin-rbLF-N原核表达载体转入毕赤酵母，然后进行重组克隆的筛选，从而获得重组毕赤酵母工程菌，其出发菌株优选为GS115。

本发明针对Nisin抑菌谱窄的缺点，选择对抗菌谱较广且具有较强抗性的rbLF-N为材料，构建nisin-rbLF-N融合基因，并在真核表达系统中表达，获得具有G+菌和G-菌抗性的融合蛋白。其优点在于：

(1)本发明针对乳链菌肽(Nisin)抑菌谱窄的缺点，选择对抗菌谱较广且具有较强抗性的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料，通过特异引物的设计用PCR技术成功获得融合蛋白基因nisin-rbLF-N，并能够由毕赤酵母GS115高效表达。

(2)使用pPIC9K作为表达载体，pPIC9K含有乙醇氧化酶AOX1的调控序列，当其转化入受体菌株中，能与受体染色体上相应的序列AOX1发生同源重组，从而使整个载体连同外源基因被插入到受体染色体上，外源基因可在AOX1启动子控制下稳定地表达。同时质粒pPIC9K携带有野生型HIS4基因，于是通过基因的互补作用，野生型HIS4基因就可作为His⁺重组子的筛选标记。所以重组菌株可以在不含组氨酸的MD培养基中生长。

(3)本发明将融合基因nisin-rbLF-N克隆到原核表达载体pPIC9K中，转化毕赤酵母GS115进行诱导表达，重组菌经诱导后可表达出可观的融合蛋白，融合蛋白的大小为10kDa左右。在信号肽的作用下，融合蛋白nisin-rbLF-N可顺利地分泌到培养基的上清中。去糖基化后的融合蛋白经过复合蛋白酶酶解后具有抑干酪乳杆菌(G+菌)和大肠杆菌(G-菌)的作用。

附图说明

图1为本发明以合成的pMD19-T/nisin质粒为模板，用引物F1、R1进行PCR扩增的nisin基因片段和以牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增的rbLF-N基因片段；其中1为扩增目的片段nisin；2为阴性对照；3为扩增目的片段rbLF-N；4为阴性对照；5为DL2000Marker。

图2为本发明以纯化回收后的nisin基因片段和rbLF-N基因片段为模板，用引物F1、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因片段；其中1为nisin-rbLF-N的PCR产物；2为DL2000Marker。

图3为本发明重组质粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的酶切鉴定电泳图，其中，1为DL2000Marker；2为目的基因nisin-rbLF-N PCR产物对照；3为重组质粒双酶切产物；4为重组表达质粒pPIC9K/nisin-rbLF-N。

图4为本发明用特异引物F1和R2从pGEM-T easy/nisin-rbLF-N质粒中扩增到长度约为340bp的融合基因；其中，1为DL2000Marker；2为pGEM-T easy/nisin-rbLF-N质粒的PCR产物。

图5为本发明重组质粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N和载体pPIC9K纯化回收后的目的基因，经EcoR I和Not I双酶切鉴定电泳图，其中，1为DL2000Marker；2为目的基因nisin-rbLF-N的PCR产物对照；3为重组质粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N；4为重组质粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N双酶切产物；5为重组表达质粒pPIC9K/nisin-rbLF-N；6为重组质粒pPIC9K/nisin-rbLF-N双酶切产物；7为DL2000Marker。

图6为本发明酵母转化子PCR检测结果电泳图；其中，1为DL2000Marker；2为阳性对照；3～13为重组酵母菌株PCR产物；14为阴性对照。

图7为本发明不同天数诱导的重组酵母菌株上清中蛋白表达SDS-PAGE电泳图，其中，1为小分子量蛋白Marker；2～6分别代表菌株诱导1、2、3、4、5天的蛋白表达量。

图8为本发明nisin-rbLF-N融合蛋白对干酪乳杆菌(G+菌)的抑菌活性图，其中：1为处理后的表达上清液：去糖基化并酶切后的上清液100μL；2为阳性对照：乳酸链球菌素10μL；3为阴性对照：未处理的表达上清液100μL；4为阴性对照：处理后的空载体的酵母发酵液100μL。

图9为本发明nisin-rbLF-N融合蛋白对大肠杆菌(G-菌)的抑菌活性图，其中：1和2为处理后的表达上清液：去糖基化并酶切后的上清液100μL；3为阴性对照：未处理的表达上清液100μL；4为阴性对照：处理后的空载体的酵母发酵液100μL。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  nisin基因及牛乳铁蛋白基因引物的设计与合成

根据nisin基因序列及蛋白序列，使目的基因获得稳定表达，用适于在BL21中表达的密码子代替那些不适合于在其中表达的密码子优化nisin基因，并在5’端和3’端设计EcoR I和BamH I酶切位点。优化后的nisin基因序列合成并克隆于pMD19-T载体。根据目的序列分别设计引物。在上游引物设计酶切位点BamH I(下划线标记)和保护碱基。

上游引物F1：5’-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’；

下游引物R1：5’-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’。

根据牛乳铁蛋白cDNA序列，设计引物。在上游引物设计与nisin互补配对的序列(下划线标记)，下游引物设计酶切位点EcoR I(下划线标记)、终止密码子和保护碱基。

上游引物F2：

5’-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’；

下游引物R2：

5’-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’。

实施例2  重组质粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的构建与鉴定

以合成的pMD19-T/nisin质粒为模板，用引物F1、R1进行PCR扩增nisin基因为179bp，纯化回收PCR产物(图1)；以牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增rbLF-N基因为181bp，纯化回收PCR产物(图1)；以纯化回收后的nisin基因和rbLF-N基因为模板，用引物F1、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因约为340bp，纯化回收PCR产物(图2)后与pGEM-T easy载体连接，并转化E.cili DH5α，用PCR及EcoR I和BamH I双酶切鉴定阳性克隆。

实施例3  nisin-rbLF-N基因克隆载体的构建

根据表达载体基因序列和目的基因序列分别设计引物，在上游引物设计酶切位点EcoR I(下划线标记)和保护碱基，下游引物设计酶切位点Not I(下划线标记)、终止密码子和保护碱基。

F3：5’-CGGAATTCATGAGCACCAAAGAT-3’

R3：5’-TTGCGGCCGCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’

以重组的pGEM-T easy/nisin-rbLF-N质粒为模板，F3和R3为引物进行PCR反应，PCR采用25μL反应体系。

将nisin-rbLF-N基因的PCR回收产物通过连接酶连接到pGEM-Teasy克隆载体上。连接反应采用10μL体系，连接后，将连接产物通过热激反应立即转化大肠杆菌DH5α。

挑取平板上的白色菌落(转化子)，接种于加Amp^r的LB液体培养基中培养，37℃，150rpm振荡培养12h。取1μL菌液进行PCR扩增验证。挑取阳性菌落小量提取质粒。(图3和图4)

实施例4  nisin-rbLF-N基因表达载体的构建

上述克隆载体构建好后，同时用EcoR I和Not I对重组质粒pGEM-T/nisin-rbLF-N和酵母分泌型表达质粒pPIC9K进行双酶切，酶切采用20μL体系。之后将回收的pPIC9K载体片段与nisin-rbLF-N基因片段进行体外连接，连接反应采用20μL体系。(图5)

实施例5  毕赤酵母菌株GS115的转化

1、活化巴斯德毕赤酵母菌株GS115

取200μL于-80℃冻存的GS115菌株接入2mL新鲜的YPD培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养后，于新鲜的YPD平板上划线，28℃培养2天至出现单菌落。

2、制备GS115感受态细胞

a)挑取一个单菌落接种于5mLYPD培养基中，28℃摇床180rpm过夜培养，取出2mL接种于200mL YPD培养基中扩大培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5，其余可用20％的甘油进行菌种保藏。

b)于4℃，1500×g离心5min收集菌体细胞，并用200mL冰预冷无菌水重悬菌体细胞。

c)于4℃，1500×g离心5min收集菌体细胞，再用100mL冰预冷无菌水重悬菌体细胞。

d)于4℃，1500×g离心5min收集菌体细胞，再用8mL冰预冷的无菌的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞。

e)于4℃，1500×g离心5min收集菌体细胞，再用2mL冰预冷的无菌的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞。置于冰上备用。也可将此感受态细胞分装80μL于1.5mL微离心管中冻存备用，但其转化效率将明显下降。

3、重组表达载体的线性化

通过对nisin-rbLF-N基因和pPIC9K载体的酶切位点分析，采用SacI酶切线性化重组质粒pPIC9K/nisin-rbLF-N(37℃，5h)。凝胶回收纯化。

4、毕赤酵母感受态细胞的电转化

在Bio-Rad Gene Pulse电转仪上进行电转化反应。电转化条件为：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，转化时间随DNA样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在3.5-4.0s范围内。(图6)

实施例6  nisin-rbLF-N基因在毕赤酵母GS115中的诱导表达

1、将重组酵母冻存菌种接于YPD平板上活化，28℃培养2d，至长出单菌落。

2、挑取一活化的单菌落于200mL BMGY液体培养基中，于30℃，250rpm摇床培养，至培养基OD₆₀₀达到2.0～6.0。

3、6000rpm离心5min收集菌体，用无菌超纯水洗涤菌体1～2次。

4、将菌体转移至200mL BMMY诱导培养基中，于30℃，200rpm摇床培养。

5、每隔24h从BMMY培养基中取出1mL菌液于1.5mL离心管中，同时补加甲醇至终浓度为1％(v/v)，于8000rpm离心5min，取上清液，存于-20℃，待测。

实施例7  nisin-rbLF-N融合蛋白的鉴定

收集到的上清液经SDS-PAGE电泳，nisin-rbLF-N基因全长324bp，其编码的融合蛋白由108个氨基酸构成，其N端23个氨基酸是前导肽，预计所编码的融合蛋白约为10KD。(图7)

实施例8  去糖基化和酶裂解融合蛋白nisin-rbLF-N

取80μL冻干溶解后的上清液于小离心管中，加入90μL变性缓冲液(0.5％SDS，1％巯基乙醇)，煮沸10min后加入10μL GT反应缓冲液(50mmPBS缓冲液，PH7.5)，10μL的10％NP-40，100U(0.2μL)的PNGaseF，37℃水浴过夜。向去糖基化后的表达上清液中加入0.15w/v％胃蛋白酶，37℃酶解6h后于80℃灭酶活10min，6000×g离心20min，取上清用于活性检测。

实施例9  融合蛋白nisin-rbLF-N抗菌活性的初步检测

对酵母转化子进行甲醇诱导表达，诱导4天，5000rpm条件下离心5min后分离菌体和上清液，将10ml上清液置于冻干机中进行冻干后溶于3ml无菌水中，-20℃保存。取去糖基化并酶切后的上清液，采用琼脂扩散法检测抗菌活性，测试菌株为干酪乳杆菌(G+菌)和大肠杆菌(G-菌)。抑菌活性检测表明，nisin-rbLF-N融合蛋白具有革兰氏阳性菌抗性和革兰氏阴性菌抗性。对照中，未诱导的以及转入空载体的酵母发酵液中均未出现透明圈。表明编码融合蛋白nisin-rbLF-N的基因已成功整合于宿主基因组中，并开始表达目的蛋白。(图8和图9)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种融合基因，其含有编码乳酸链球菌素的nisin基因和编码牛乳铁蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。

2.如权利要求1所述的融合基因，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。

3.含有权利要求1或2所述融合基因的载体。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其出发载体为pPIC9K。

5.含有权利要求3或4所述载体的工程菌。

6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，其为毕赤酵母。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，其为毕赤酵母GS115。

8.构建权利要求7所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)根据密码子的简并性，设计并合成适于在BL21中表达的nisin基因，将优化后的nisin基因克隆于pMD19-T载体，以合成的pMD19-T/nisin质粒为模板，用引物F1、R1进行PCR扩增nisin基因，纯化回收PCR产物；以从牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增rbLF-N基因，纯化回收PCR产物；以纯化回收后的nisin基因和rbLF-N基因为模板，用引物F1、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因，纯化回收PCR产物；

其中，F1：5’-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’；

R1：5’-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’；

F2：5’-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’；

R2：5’-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’；

2)将步骤1)中合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到载体pPIC9K中；

3)将步骤2)的含有nisin-rbLF-N融合基因的pPIC9K载体转入毕赤酵母GS115中，然后进行重组克隆的筛选，获得重组毕赤酵母GS115工程菌，冷冻保存。

9.权利要求7所述工程菌的诱导培养方法，包括如下步骤：

1)将重组酵母冻存菌种接于YPD平板上活化，28℃培养2d，至长出单菌落；

2)挑取一活化的单菌落于200mL BMGY液体培养基中，于30℃，250rpm培养，直至培养基的OD₆₀₀达到2.0～6.0；

3)6000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗涤菌体1～2次；

4)将菌体转移至200mL BMMY诱导培养基中，于28～30℃，200rpm诱导培养1～2d。

10.如权利要求9所述的诱导培养方法，其特征在于，步骤4)的诱导培养温度为28℃，诱导培养时间为2d。

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