CN101423840A - 重组海参溶菌酶的生产方法及由其制得的重组海参溶菌酶 - Google Patents
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Abstract
一种重组海参溶菌酶的生产方法及由其制得的重组海参溶菌酶，该方法是将海参溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168中，经甲醇诱导表达，然后经阳离子交换树脂层析柱纯化后得到重组溶菌酶。本发明的方法采用该基因工程菌生产溶菌酶适合大规模培养和分离提取，生产工艺不复杂，设备要求简单，生产周期短，成本比较低，无环境污染。所制得的重组海参溶菌酶比直接从海参组织中提取的溶菌酶活性提高了30％；与鸡蛋清溶菌酶相比，抑菌谱范围要广很多，尤其对于鸡蛋清溶菌酶不能作用的革兰氏阴性菌抑菌效果更明显。
Description
技术领域
本发明涉及利用生物技术生产重组海参溶菌酶的方法，属于分子生物学制药技术领域。本发明还涉及利用该方法生产出来的重组海参溶菌酶。
背景技术
溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键的水解，导致细胞裂解，内容物逸出而使细菌死亡。它广泛存在于自然界动植物和微生物的组织、体液及分泌物中，在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。对于缺少特异性免疫的无脊椎动物而言，抗菌效应尤为重要，而无脊椎动物组织中分布最广泛的抗菌蛋白即是溶菌酶。不仅如此，溶菌酶还作为无脊椎动物的一种重要的消化酶，通过分解微生物来获得生长所需的部分C、N源。
溶菌酶作为天然的抗菌剂、免疫增强剂和防腐剂目前广泛应用于医药、食品及饲料等行业。近年来随着海洋生物鱼类、虾类、贝类以及海珍品，如海参、鲍鱼等养殖产量的快速增长，随之而来的是海水养殖生产中的品质退化、养殖水平低、疾病泛滥及环境污染等问题。目前在水产品养殖以及畜禽生产中使用抗生素带来的问题也越来越受到人们的关注，一是耐药性问题，二是药物残留问题，其副作用是不可忽视的，人们不希望以牺牲人类健康为代价换取海产品、畜禽产品生产性能的提高。因此，采用该基因工程菌生产的溶菌酶是一种天然无毒的酶制品，它对大部分水生动物和畜禽动物即是体内自身的免疫因子，又可作为养殖生产中的抑菌剂，降解和杀死常见的致病菌。所以，该溶菌酶可以代替抗生素应用于养殖生产中，可以取得安全、品质好、功效高的海产品和畜禽产品。
目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量十分有限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。因此用基因工程手段表达溶菌酶成为很重要的手段。前期的研究者利用RT-PCR和RACE PCR技术，从海参(Stichopus japonicus)体壁中克隆得到一种溶菌酶基因(GenBank：EF036468)；并通过生物信息软件分析得到关于其编码产物的结构特点信息(“海参i型溶菌酶基因及其编码产物的结构特点”，中国生物化学与分子生物学报，2007年7月，23(7)：542～547)。
发明内容
本发明在上述研究结果的基础上，提供一种利用生物技术生产重组海参溶菌酶的方法。
本发明提供一种重组海参溶菌酶的生产方法，是将海参溶菌酶基因(SEQ IDNO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168中，经甲醇诱导表达，然后经阳离子交换树脂层析柱纯化后得到重组溶菌酶。
上述方法中所述的海参溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)是通过从海参肠组织中提取RNA，再通过反转录获得。具体做法是：
①从本地新鲜海参中取出海参肠组织，提取总RAN，并通过反转录扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域，反转录所使用的简并引物为：
HS1-1 5′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′
HS1-2 5′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′
②扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA片段5′末端，所使用的反转录引物RT-Primer(带磷酸标记)和两对巢式PCR引物序列如下：
RT-Primer 5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′
HS1-S1 5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′
HS1-S2 5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′
HS1-A1 5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′
HS1-A2′ 5--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′
③扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA3′末端，所使用的引物序列如下：
HS1-GSP1 5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′
HS1-GSP2 5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′
上述方法中重组质粒的构建是通过PCR、酶切将溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中，其中PCR使用特异性引物HS1-7和HS1-8，引物两端分别引入EcoR I和Not I限制性酶切位点：
HS1-7 5’----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3’
HS1-8 5’----AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT----3’
PCR循环参数为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃1.5min，5个循环；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增产物，用EcoR I和Not I酶切，然后与经同样酶酶切的酵母表达载体pPIC9K相连接形成重组质粒。
上述方法通过下述步骤将重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168中：将重组质粒DNA用Bgl II酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固体培养板上，30℃培养2～3天；将长出的菌落转至含有4mg/ml G418的YPD固体培养基上进行进一步筛选，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中，30℃培养6～7天，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的重组菌株。
上述方法中重组毕赤酵母SMD1168的甲醇诱导表达及重组溶菌酶的纯化工艺为：将重组毕赤酵母SMD1168先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到9.0±0.5时，更换培养基，用原培养物10％体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0.5％(v/v)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清透析去离子，再经过CM-Sephrose FF阳离子交换树脂层析柱，用0.05M pH8.0 Tris-HCl连续洗脱，留取活性峰液，再透析去离子，然后将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。
根据上文所述的重组海参溶菌酶的生产方法，本发明所述的方法的最为优选的技术方案是这样的：
①获取海参溶菌酶基因，包括从海参肠组织中提取总RAN，并通过反转录扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域、扩增海参溶菌酶基因cDNA片段5′末端及3′末端的步骤，其中：
扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域的反转录过程所使用的简并引物为：
HS1-1 5′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′
HS1-2 5′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′
扩增海参溶菌酶基因cDNA片段5′末端，所使用的反转录引物RT-Primer(带磷酸标记)和两对巢式PCR引物序列如下：
RT-Primer 5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′
HS1-S1 5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′
HS1-S2 5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′
HS1-A1 5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′
HS1-A2 5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′
扩增海参溶菌酶基因cDNA3′末端，所使用的引物为：
HS1-GSP1 5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′
HS1-GSP2 5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′
②重组质粒的构建：通过PCR、酶切将步骤①获得的溶菌酶基因(SEQ IDNO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中，其中PCR使用特异性引物HS1-7和HS1-8，引物两端分别引入EcoR I和Not I限制性酶切位点：
HS1-7 5’----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3’
HS1-8 5’----AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT----3’
PCR循环参数为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃1.5min，5个循环；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增产物，用EcoR I和Not I酶切，然后与经同样酶酶切的酵母表达载体pPIC9K相连接形成重组质粒；
③重组质粒的转化及重组菌株的筛选：将重组质粒DNA用Bgl II酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固体培养板上，30℃培养2～3天；将长出的菌落转至含有4mg/ml G418的YPD固体培养基上进行进一步筛选，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中，30℃培养6～7天，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的重组菌株；
④重组菌株的甲醇诱导表达及重组溶菌酶的纯化：将步骤③筛选得到的重组毕赤酵母SMD1168先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到9.0±0.5时，更换培养基，用原培养物10％体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0.5％(v/v)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清透析去离子，再经过CM-Sephrose FF阳离子交换树脂层析柱，用0.05M pH8.0 Tris-HCl连续洗脱，留取活性峰液，再透析去离子，然后将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。
对由上述方法制得的重组海参溶菌酶进行了相关的生物学活性分析，发现该酶具有很强的广谱抗菌作用，对常见的革兰氏阳性菌和阴性菌均具有明显的抑菌作用，尤其是对海水养殖和畜禽生产中常见的致病细菌和弧菌杀菌力极强。并且发现：该重组海参溶菌酶比直接从海参组织中提取的溶菌酶活性提高了30％；与鸡蛋清溶菌酶相比，抑菌谱范围要广很多，尤其对于鸡蛋清溶菌酶不能作用的革兰氏阴性菌抑菌效果更明显。这是在本方案设计之初所未曾预料到的。当然，本发明的方法采用该基因工程菌生产溶菌酶适合大规模培养和分离提取，生产工艺不复杂，设备要求简单，生产周期短，成本比较低，无环境污染。
附图说明
本发明附图1幅，即实施例1中制得的重组海参溶菌酶干粉的SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
1、重组海参溶菌酶的制备
步骤1：海参溶菌酶的克隆和序列分析
(1)从本地新鲜海参中取出海参肠组织，用TRIZOL REAGENT(Invitrogen)试剂从中提取总RNA；用TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域。根据已知不同生物种类的溶菌酶基因的序列，设计简并引物，序列如下：
HS1-1 5′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′
HS1-2 5′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′
首先进行反转录反应，条件为50℃，30min；在进行PCR扩增，反应条件为：94℃，2min；94℃，30s；40℃，30s；72℃，1.5min循环5次；接着94℃，30s；55℃，30s；72℃，1.5min循环28次。将PCR产物回收，并将其连接到载体pMD18-T上，在大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中表达，通过蓝白斑筛选带有目的基因的质粒，提取的质粒产物经测序检测为溶菌酶部分cDNA序列。
(2)根据上述测序的海参溶菌酶cDNA序列及5′Full RACE PCR Kit试剂盒要求，设计1个反转录引物RT-Primer(带磷酸标记)和两对巢式PCR引物，序列如下：
RT-Primer 5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′
HS1-S1 5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′
HS1-S2 5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′
HS1-A1 5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′
HS1-A2 5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′
按照TaKaRa5′Full RACE PCR Kit试剂盒推荐方法，扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA片段5′末端；
(3)根据克隆得到的溶菌酶基因cDNA片段及TaKaRa3’Full RACE PCRKit试剂盒要求设计两个上游引物，序列如下：
HS1-GSP1 5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′
HS1-GSP2 5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′
按照TaKaRa3′Full RACE PCR Kit试剂盒推荐方法，扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA3′末端。
测定所得的海参溶菌酶基因cDN A的全序列为SEQ ID NO.1，序列全长713bp，包括5’非编码区(UTR)246bp，3’UTR 29bp，开放阅读框长度438bp，编码145个氨基酸；在3’端的非编码区中有真核基因polyA加尾信号序列AATAAA的出现。经SignalP软件分析，推测氨基酸序列N端具有20个氨基酸的信号肽MIPQITRSVLLLLIVMAASG，从而可以判定其为胞外表达的效应分子；成熟肽包含125个氨基酸，分子式为C602H921N169O180S13，预测分子量为14kDa，理论等电点为7.65。经同源性比较和分子发育分析，推断所克隆的海刺参溶菌酶为i型溶菌酶。
步骤2：重组表达质粒的构建及转化：
参照克隆得到的海参溶菌酶cDNA设计一对用于真核表达的特异性引物HS1-7和HS1-8，引物两端分别引入EcoR I和Not I限制性酶切位点。
HS1-7 5’----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3’
HS1-8 5’----AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT----3’
用TaKaRa one step RNA PCR Kit(AMV)进行RT-PCR。PCR循环参数为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃ 1.5min，5个循环；94℃30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。经PCR产物凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用EcoR I和Not I酶切扩增产物，与经同样酶酶切的酵母表达载体pPIC9K相连接。筛选重组质粒。
提取质粒DNA，用Bgl II酶解质粒DNA，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固体培养板上，置30℃中培养2～3天。将长出的菌落转至含有高浓度的G418(4mg/ml)的YPD固体培养基上进行进一步筛选，得到高拷贝的转化菌株。将此类酵母菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中，30℃培养一周左右，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的海参溶菌酶表达菌株。
步骤3：重组海参溶菌酶的浓缩纯化
含海参溶菌酶基因的酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟。当OD值达到9.0左右时，更换培养基，用原培养物1/10体积的BMMY培养基，继续培养。每24h添加甲醇，保持甲醇浓度在0.5％，4天后结束培养，收集培养液上清，用于海参溶菌酶的纯化制备。
取培养液上清，装入透析袋中，去离子水透析去盐，4℃透析24h；透析过的培养上清用0.45μm的滤膜过滤，然后用NaOH调节pH至8.0。以每升培养液10毫升CM-Sephrose FF装柱，用0.05M pH 8.0Tris-HCl平衡柱子5～8个柱床体积。将培养液以10～100ml/min的流速上柱。上样结束后，用0.05 M pH8.0Tris-HCl洗脱未结合蛋白，共洗脱4个柱床体积。用含有0.15～0.2M NaCl的0.05M pH 8.0 Tris-HCl溶液洗脱。将洗脱液对去离子水4℃透析24h。将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到重组海参溶菌酶干粉；12％SDS-PAGE鉴定蛋白质，结果如附图1所示。
2、重组海参溶菌酶活性测定
采用浊度法测定上述制得的溶菌酶活性：用60mmol/L、pH6.2的磷酸缓冲液配制一定浊度(A450＝0.6～0.7)的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodleikticus)为底物，取0.1mL酶液加入2.5mL底物(20℃)中，在波长450nm处读取反应体系3min内每隔15s的吸光度。以△A450/min变化0.001个吸光度值为一个活性单位。酶活力＝△A450nm/1min×0.001×0.1mL(△A450nm：1min内吸光度的变化)。
在不同的温度和pH条件下，对重组海参溶菌酶进行了生物学分析。最适作用pH值为6.5，最适作用温度为35℃～45℃。
重组海参溶菌酶酶活力为55U/mg；同样方法测定直接从海参组织中提取的溶菌酶酶活力为40U/mg，前者比后者酶活性提高了37.5％。
3、重组海参溶菌酶抑菌谱的测定
采用管碟法测定重组海参溶菌酶的抑菌圈大小，以其半径(mm)来表示。取革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，以及革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichia coli)，志贺菌(Shigella spp)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，鳗弧菌(Vibrio anguillarium)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。并将这些细菌在LB液体培养基中37℃，200r/min过夜培养，稀释至OD600为0.001左右。取100μL以上所选菌液于牛肉膏蛋白胨培养基中涂匀后，放入无菌牛津杯，于牛津杯中加入重组海参溶菌酶酶液100μL(蛋白含量约10μg)，37℃过夜培养，测量抑菌圈。
取重组海参溶菌酶和鸡蛋清溶菌酶(做对照)，测定两个样品对9种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌圈大小。结果如表1所示：
表1
结果可见，该重组海参溶菌酶对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用，尤其对海产品中常见的革兰氏阴性致病菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌有明显的抑制作用。而市场上普遍销售的鸡蛋清溶菌酶对革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌基本没有抑菌作用，仅对几种革兰氏阳性菌起到一定的抑制作用。说明本发明的重组海参溶菌酶具有很广的抑菌谱，其对革兰氏阴性菌的特殊抑菌能力在海参养殖过程中起到重要作用。
SEQUENCE LISTING
<110>大连工业大学
<120>重组海参溶菌酶的生产方法及由其制得的重组海参溶菌酶
<130>N/A
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>713
<212>DNA
<213>Stichopus japonicus
<400>1
Claims (7)
1、一种重组海参溶菌酶的生产方法，其特征在于该方法是将海参溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168中，经甲醇诱导表达，然后经阳离子交换树脂层析柱纯化后得到重组溶菌酶。
2、根据权利要求1所述的重组海参溶菌酶的生产方法，其特征在于所述的海参溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)是通过从海参肠组织中提取RNA，再通过反转录获得，包括如下步骤：
①从本地新鲜海参中取出海参肠组织，提取总RAN，并通过反转录扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域，反转录所使用的简并引物为：
HS1-1 5′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′
HS1-2 5′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′
②扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA片段5′末端，所使用的反转录引物RT-Primer(带磷酸标记)和两对巢式PCR引物序列如下：
RT-Primer 5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′
HS1-S1 5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′
HS1-S2 5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′
HS1-A1 5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′
HS1-A2 5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′
③扩增海参溶菌酶蛋白基因cDNA3′末端，所使用的引物序列如下：
HS1-GSP1 5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′
HS1-GSP2 5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′。
3、根据权利要求1所述的重组海参溶菌酶的生产方法，其特征在于重组质粒的构建是通过PCR、酶切将溶菌酶基因(SEQ ID NO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中，其中PCR使用特异性引物HS1-7和HS1-8，引物两端分别引入EcoRI和Not I限制性酶切位点：
HS1-7 5’----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3’
HS1-8 5’----AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT----3’
PCR循环参数为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃1.5min，5个循环；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增产物，用EcoR I和Not I酶切，然后与经同样酶酶切的酵母表达载体pPIC9K相连接形成重组质粒。
4、根据权利要求1所述的重组海参溶菌酶的生产方法，其特征在于通过下述步骤将重组质粒转化到毕赤酵母SMD1168中：将重组质粒DNA用Bgl II酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固体培养板上，30℃培养2～3天；将长出的菌落转至含有4mg/ml G418的YPD固体培养基上进行进一步筛选，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中，30℃培养6～7天，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的重组菌株。
5、根据权利要求1所述的重组海参溶菌酶的生产方法，其特征在于重组毕赤酵母SMD1168的甲醇诱导表达及重组溶菌酶的纯化工艺为：将重组毕赤酵母SMD1168先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到9.0±0.5时，更换培养基，用原培养物10％体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0.5％(v/v)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清透析去离子，再经过CM-Sephrose FF阳离子交换树脂层析柱，用0.05M pH8.0 Tris-HCl连续洗脱，留取活性峰液，再透析去离子，然后将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。
6、根据权利要求1所述的重组海参溶菌酶的生产方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
①获取海参溶菌酶基因，包括从海参肠组织中提取总RAN，并通过反转录扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域、扩增海参溶菌酶基因cDNA片段5′末端及3′末端的步骤，其中：
扩增海参溶菌酶的cDNA保守区域的反转录过程所使用的简并引物为：
HS1-1 5′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′
HS1-2 5′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′
扩增海参溶菌酶基因cDNA片段5′末端，所使用的反转录引物RT-Primer(带磷酸标记)和两对巢式PCR引物序列如下：
RT-Primer 5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′
HS1-S1 5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′
HS1-S2 5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′
HS1-A1 5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′
HS1-A2 5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′
扩增海参溶菌酶基因cDNA3′末端，所使用的引物为：
HS1-GSP1 5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′
HS1-GSP2 5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′
②重组质粒的构建：通过PCR、酶切将步骤①获得的溶菌酶基因(SEQ IDNO.1)连接到真核表达载体pPIC9K中，其中PCR使用特异性引物HS1-7和HS1-8，引物两端分别引入EcoR I和Not I限制性酶切位点：
HS1-7 5’----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3’
HS1-8 5’----AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT----3’
PCR循环参数为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃1.5min，5个循环；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增产物，用EcoR I和Not I酶切，然后与经同样酶酶切的酵母表达载体pPIC9K相连接形成重组质粒；
③重组质粒的转化及重组菌株的筛选：将重组质粒DNA用Bgl II酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固体培养板上，30℃培养2～3天；将长出的菌落转至含有4mg/ml G418的YPD固体培养基上进行进一步筛选，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中，30℃培养6～7天，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的重组菌株；
④重组菌株的甲醇诱导表达及重组溶菌酶的纯化：将步骤③筛选得到的重组毕赤酵母SMD1168先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到9.0±0.5时，更换培养基，用原培养物10％体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0.5％(v/v)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清透析去离子，再经过CM-Sephrose FF阳离子交换树脂层析柱，用0.05M pH8.0 Tris-HCl连续洗脱，留取活性峰液，再透析去离子，然后将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。
7、根据权利要求1～6中任一权利要求所述的重组海参溶菌酶的生产方法所制得的重组海参溶菌酶。
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