CN116121331A - 一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法，具体操作为将指示菌液体稀释到一定的浓度，然后制备带菌BMMY培养基筛选平板，采用pPIC9K表达载体构建表达重组质粒，再利用毕赤酵母菌株的构建方法制备含有重组目的基因的毕赤酵母菌，挑选已制备好的含有重组蛋白的毕赤酵母菌株接种于上述带菌BMMY培养基筛选平板上，置于29℃培养箱培养24h‑48h，即可对毕赤酵母表达产物抑菌活性进行检测。本发明提供的检测方法前期不需再进行液体摇培诱导表达，直接在平板上将诱导表达和抑菌活性检测同步进行，且一张平板能够同时验证多组转化子，缩短了毕赤酵母表达产物抑菌活性检测时间，提高检测效率。

Description

一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法
技术领域
本发明涉及生物测定技术领域，尤其涉及一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法。
背景技术
抗菌肽（Antibacterial peptide）是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点。随着研究的不断深入，越来越显示出了其在医学、兽医学等相关领域的独特应用价值。
有关抗菌肽的研究均集中于提取、分离纯化及基因表达等方面，抗菌肽基因表达的表达产物必须跟踪测定抑菌活性，否则就失去了基因诱导表达的意义。在抗菌肽基因表达研究中多是毕赤酵母作为表达载体进行表达，表达产物进行抑菌活性检测时需先进行液体摇培表达诱导，诱导表达48-72h后再进行抑菌活性的检测，检测方法多是采用平板抑菌活性检测方法，而且液体摇培表达期间每24h需要添加甲醇，操作步骤繁琐，完成检测需耗费好几天，检测效率较低；另外甲醇添加和取样过程中有可能会给表达产物带来杂菌污染，从而影响后期的抑菌活性检测结果。为此，我们提出了一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法，解决以上的问题。
发明内容
本发明提供一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法，化繁为简，能够在不影响检测质量的前提下缩短毕赤酵母表达产物抑菌活性检测时间，提高毕赤酵母表达产物抑菌活性检测效率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法，包括：
1.对指示菌液体进行摇培及稀释，将指示菌液体稀释到检测抑菌活性所需的浓度。
2. 制备带菌BMMY培养基筛选平板；
制备BMMY培养基，BMMY培养基灭菌完成后加入10mL 1M磷酸钾缓冲液、10mL硫酸铵溶液、34μL 10*YNB、2mL无水甲醇；待培养基冷却到室温，加入上述稀释的指示菌液体菌液，制备带菌BMMY培养基筛选平板。
3. 转化子接种；
采用pPIC9K表达载体构建表达重组质粒，再利用毕赤酵母菌株的构建方法制备含有重组目的基因的毕赤酵母菌，挑取含有重组蛋白的毕赤酵母菌株接种于带菌BMMY培养基筛选平板上，置于29℃培养箱培养24h-48h。
其中，所述的步骤1中指示菌为所要检测的不同毕赤酵母表达产物对应的菌种。
优选的，所述步骤3中含有重组蛋白的毕赤酵母菌株的重组蛋白为腐生子囊菌抗菌肽Plectasin，所述步骤1中指示菌为金黄色葡萄球菌，所述稀释的金黄色葡萄球菌菌体浓度为4*cfu/mL。
本发明所述的一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法，简化了表达产物抑菌活性检测步骤，前期不需再进行液体摇培诱导表达，直接在平板上将诱导表达和抑菌活性检测同步进行，且一张平板能够同时验证多组转化子，缩短了毕赤酵母表达产物抑菌活性检测时间，提高检测的效率，另外本发明提供的抑菌活性检测方法不需每24h增加甲醇，从而避免了甲醇添加过程中带来的杂菌污染，相应提高了抑菌活性检测结果的准确性。
附图说明
1. 图1：含有重组蛋白的毕赤酵母菌株及毕赤酵母对照菌株的转化子接种图；538为含有重组蛋白的毕赤酵母菌株；20为毕赤酵母对照菌株。
2. 图2：培养48h的含有重组蛋白的毕赤酵母菌株及毕赤酵母对照菌株的抑菌实验结果图；538为含有重组蛋白的毕赤酵母菌株；20为毕赤酵母对照菌株。
具体实施方式
实施例
本发明提供一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法，下面以腐生子囊菌抗菌肽Plectasin为例，结合具体实施例进行说明。
酵母提取物购于OXOID公司；
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸铵、无水甲醇、琼脂购于国药集团化学试剂有限公司；
YNB购于北京索莱宝科技有限公司；
细菌菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
除非特别指明，本发明以下实施例所用的试剂均为分析纯试剂，且可从常规渠道商购获得。
1.试剂的配制与灭菌
1） 10*YNB无菌水的配制及过膜除菌：
称取13.4g YNB粉末溶于100mL蒸馏水，0.22μm过滤除菌，4℃保存。
2） 1M磷酸钾缓冲液配制：
分别配制1M 磷酸氢二钾（称取174g，定容至1L蒸馏水中）、1M 磷酸二氢钾（称取136g，定容至1L蒸馏水中）溶液；量取132mL 1M 磷酸氢二钾和868mL1M 磷酸二氢钾，调整pH至7.0，121℃高压灭菌。
3） LB液体培养基的配制
称取1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g NaCl溶于100mL蒸馏水，pH调整为7.0后121℃高压灭菌。
4） BMMY培养基的配制
1g硫酸铵加入10mL无菌水，溶解后pH调整为7.0并过膜除菌；2mL无水甲醇过膜除菌；称取1g酵母提取物，2g蛋白胨，2g琼脂溶于80mL蒸馏水，pH调整为7.0后121℃高压灭菌。
2. 指示菌液体摇培及稀释
挑取金黄色葡萄球菌单菌接种于10mL LB液体培养基中，37℃摇床培养4h至菌体浓度为4*cfu/mL。
3. 带菌BMMY培养基筛选平板的制备
BMMY培养基灭菌完成后加入10mL 1M磷酸钾缓冲液、10mL硫酸铵溶液、34μL 10*YNB、2mL无水甲醇。待培养基冷却至不烫手后，加入终浓度为4*10cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液，制备带菌BMMY培养基筛选平板。
4. 转化子接种
采用pPIC9K表达载体构建表达重组质粒，再利用毕赤酵母菌株的构建方法制备含有重组目的基因的毕赤酵母菌，挑取含有重组蛋白的毕赤酵母菌株及毕赤酵母对照菌株接种于带菌BMMY培养基筛选平板上，置于29℃培养箱培养48h，实验结果表明，与毕赤酵母对照菌株对比，待检测含有重组蛋白的毕赤酵母菌株对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性。

Claims (4)

1.一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法，包括：
1）.对指示菌液体进行摇培及稀释，将指示菌液体稀释到检测抑菌活性所需的浓度；
2）.制备带菌BMMY培养基筛选平板；
制备BMMY培养基，BMMY培养基灭菌完成后加入10mL 1M磷酸钾缓冲液、10mL硫酸铵溶液、34μL 10*YNB、2mL无水甲醇；待培养基冷却到室温，加入上述稀释的指示菌液体菌液，制备带菌BMMY培养基筛选平板；
3）.转化子接种；
采用pPIC9K表达载体构建表达重组质粒，再利用毕赤酵母菌株的构建方法制备含有重组目的基因的毕赤酵母菌，挑取含有重组蛋白的毕赤酵母菌株接种于带菌BMMY培养基筛选平板上，置于29℃培养箱培养24h-48h；
其中，所述指示菌种类为检测的不同毕赤酵母表达产物对应的菌种。
2.根据权利要求1所述的一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法中的所述步骤3中含有重组蛋白的毕赤酵母菌株的重组蛋白为腐生子囊菌抗菌肽Plectasin。
3.根据权利要求2所述的一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法中的所述步骤1）中指示菌为金黄色葡萄球菌，所述稀释的金黄色葡萄球菌菌体浓度为4* cfu/mL。
4.根据权利要求3所述的一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法中的所述步骤3中培养箱培养48h。
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