KR20040087208A

KR20040087208A - 메탄올자화효모인 피치아 패스토리스를 이용하여 인간락토페린을 생산하는 방법, 이 방법에 의해 제조된 인간락토페린 및 피치아 패스토리스 균주

Info

Publication number: KR20040087208A
Application number: KR1020030021486A
Authority: KR
Inventors: 이현환; 남은주; 김영호
Original assignee: (주) 디지탈바이오텍
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2003-04-04
Publication date: 2004-10-13
Also published as: KR100468596B1

Abstract

본 발명은 인간 락토페린(Lactoferrin)을 메탄올자화효모(Methylotrophic yeast)를 이용하여 대량으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신호서열을 포함하는 인간 락토페린 유전자를 메탄올자화효모인피치아 패스토리스(Pichia pastoris)에 형질 도입하고, 이를 발효 배양하여 발현시키는 것에 의해 인간 락토페린을 대량으로 생산하는 방법, 이 방법에 의해 제조된 인간 락토페린 및피치아 패스토리스균주에 관한 것이다.

Description

메탄올자화효모인 피치아 패스토리스를 이용하여 인간 락토페린을 생산하는 방법, 이 방법에 의해 제조된 인간 락토페린 및 피치아 패스토리스 균주 {Method for production of human lactoferrin using methylotrophic yeast, Pichia pastoris, human lactoferrin manufactured thereby and Pichia pastoris}

인간 락토페린은 철과 결합하는 당단백질인 트렌스페린(Transferrin)의 일종으로 락토트렌스페린(Lactotransferrin)이라고도 한다. 주로 모유, 우유, 눈물, 침이나 점액분비물, 다형핵 류코사이트(Polymorphonuclear leucocyte)의 제 2과립세포(Secondary granule)등에 존재하는데, 1939년 피터 소렌스(Peter Sorenson)에 의해 처음 발견되었으며, 초기에는 인유(人乳)의 '레드 프로테인(red protein)'으로 명명되었다.

최초의 락토페린(Lf)은 소의 유즙으로부터 분리, 정제 동정되었고, 이후에는 쥐, 염소, 토끼, 개, 인간 등 여러 포유동물의 유즙에서도 분리 정제되었다. 락토페린의 함량은 유즙에서 상대적으로 높은데, 특히 초유기간동안은 보통 6~8㎎/㎖의 함량을 유지한다. 그러나, 초유를 거친 모유단계에 이르러서는 2㎎/㎖ 정도로 감소되는데, 만일 이 기간내에 세균 등의 감염이 있는 경우 락토페린의 농도는 정상의 30배 이상으로 급증한다.

인간 락토페린(Human Lactoferrin; hLf)은 691개의 아미노산(Amino acid)으로 구성된 분자량 78kDa의 당 단백질(Glycoprotein)로서, 단일 폴리펩타이드체인(Single polypeptide chain)으로 구성되어 있다. 상기 단일 폴리펩타이드 체인은 2개의 글로뷸라 로브(2 globular lobes)로 폴드(fold)되어 있는 2-fold internal repeat로 구성되어 있다. 즉, 인간 락토페린(hLf)은 N-말단부분을 구성하고 있는 N-로브와 C-말단을 구성하고 있는 C-로브로 되어 있다. 이 두 로브는 매우 유사한 구조를 가지고 있어서, N-말단과 C-말단 사이에는 약 40% 이상의 아미노산 시퀀스호몰로지(Sequence homology)를 갖는다. 최근들어 X-ray 크리스탈로그라피(chrystallography)에 의해 락토페린의 3차 구조가 밝혀짐에 따라 락토페린은 N-말단과 C-말단에 각각 하나의 철과 결합할 수 있는 부위가 있어서 한 분자당 두 개의 Fe³⁺이온이 가역적으로 결합할 수 있음을 알게 되었다. 또한, 이러한 락토페린은 철의 결합유무에 따라 아포 타입(Apo-type)상태와 홀로 타입[holo type; 철이 포화된(Iron-saturated)] 상태로 존재하게 되는데, 락토페린의 생물학적 특성은 철의 결합에 의해 영향을 받게 된다. 보통 모유에서는 아포 타입의 락토페린이 존재하며, 모든 락토페린은 트랜스페린(transferrin)에 비해 산성상태에서 안정성을 갖고 pH의 영향을 받아서 철을 방출한다.

락토페린은 외분비선(exocrine glands)에서 분비되는 비-면역글로블린 보호 단백질(non-immunoglobulin protective protein) 중의 하나로서 직접 또는 간접적으로 항균작용(anti-bacterial action)을 일으키며, 항 바이러스에 대해서도 영향을 미친다. 락토페린은in vitro와in vivo중 어느 상태에서도 여러 종류의 미생물에게 광범위한 항균작용을 일으킨다. 이러한 락토페린은 철이 존재하지 않는 상태(apo-type)에서 대장균(E.coli)이나 클리브시엘라 뉴모니아(Kleabsiellapneumonia), 에어로벡터 에어로진(Aerobacter aerogenes) 등의 그램-음성 박테리아(Gram-negative bacteria)에 대해 높은 항미생물활성(anti-microbial activities)을 갖는데, 이는 락토페린이 미생물이 필요로 하는 Fe³⁺이온을 빼앗아 킬레이팅(chelating) 시킴으로서 미생물의 생장을 억제하기 때문이다. 실제로in vitro실험결과, 락토페린은 바실러스(Bacillus), 대장균(E.coli), 살모넬라(Salmonella) 등의 균을 1시간 이내에 99.99% 사멸시켜 항생물질에 뒤지지 않는 살균작용을 보였다. 또한, 락토페린은 철을 빼앗아 미생물의 성장을 억제시키는 작용 기작과 박테리아 생육성(bacteria viability)을 급속하게 감소시키는 작용 기작을 갖고 있다. 상기 기작은 락토페린이 그램음성균(Gram-negative bacteria)의 외막(outer membrane)에 손상을 주어 외막의 구성성분인 당지질(lipopolysaccharide)을 다량 방출(release)시킴으로써 투과장벽(permeability barrier)을 파괴하고, 리소자임(lysozyme)이나 리팜피신(rifampicin)같은 소수성 항생제(hydrophobic antibiotics)에 대한 민감성을 증대시켜 저항성을 잃게 하여 사멸시키는 것이다. 그러나 이렇게 병원체에 대한 살균작용을 갖는 락토페린이 락토바실러스(Lactobacillus)나 비피더스(Bifidus)와 같은 인체에 유용한 세균에 대해서는 항균작용을 일으키지 않는다는 보고가 있다. 따라서, 이렇게 독특한 물질인 락토페린은 세균이나 바이러스 감염으로부터 면역에 미숙한 신생아를 지켜주는 역할을 한다.

락토페린은 혈액 내에도 소량이 포함되어 있는데, 대부분 호중구(neutrophil)에서 분비(secretion)된다. 락토페린은 호중구의 제2 과립세포의 주된 구성성분으로서 염증반응(inflammatory response) 시에 다량 분비된다. 락토페린은 종종 체내에서 리소자임(lysozyme)이나 IgA와 함께 감염된 병원성 미생물에게 직접 작용하여 파괴시킴으로써 미생물 사멸에 상승효과를 주기도 한다. 이와 같이 락토페린은 숙주에 대한 방어 기작에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있으므로, 락토페린을 생성하지 못하는 환자는 각종 질병에 대해 저항성이 훨씬 떨어지고 세균과 곰팡이에 대하여 감염이 증가한다. 그 외에 락토페린은 세포 증식(cell proliferation)이나 철의 전달흡수(iron transport absorption) 등에서도 매개체로서의 역할을 담당한다.

이러한 락토페린의 많은 작용에도 불구하고 인간 락토페린에 대한 연구는 아직 미비한 편이다. 이것은 락토페린이 혈액이나 그 밖의 다른 체액 내에 존재하지만 그 양이 매우 미미하고, 초유(colostral whey)에 상당량이 존재하더라도 초유를 얻을 수 있는 시료에 한계가 있기 때문이다. 그러나, 최근에 모유의 중요성이 강조되어 락토페린에 대한 연구가 활성화되고, 유전공학의 발달에 따라 인간 락토페린(hLf) DNA를 미생물에 클로닝하고 발현(expression)시키고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 상기에서 언급한 바와 같이 락토페린은 항균작용을 가지고 있기 때문에 미생물에서 발현이 어려운 실정이다. 특히, 유전 공학에서 많이 사용하고 있는 대장균(E.coli)등에서 발현시키기 위해서는 매우 복잡한 발현체계가 필요한 문제점이 있다.

따라서, 종래 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 곤충세포(한국특허 제331981호), 락토페린에 내성을 나타내는 효모 세포(한국특허공개 제 2000-11800호)를 이용하여 유전공학적 방법으로 인간 락토페린을 제조하는 방법이 개발되었다.

본 발명자들도 상기한 문제점을 해결하면서 인간 락토페린을 대량으로 생산할 수 있는 방법에 대하여 계속 연구를 한 결과, 신호서열을 포함하는 인간 락토페린의 유전자가 알콜옥시다아제(Alcohol Oxidase) 프로모터(Promoter)의 조절을 받도록 재조합 발현벡터를 제작한 후, 이를 메탄올자화효모인피치아 패스토리스세포 내로 형질 전환하여 재조합 효모를 제조하고, 이를 발효 배양하는 것에 의해 인간 락토페린을 대량으로 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 락토페린을 대량으로 생산할 수 있는 향상된 인간 락토페린의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 방법에 의해 생산된 인간 락토페린을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 방법에 사용되는 재조합 발현벡터 pDBThLf-3KS를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 락토페린의 대량 생산을 위해 사용되는데 재조합 효모피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 생산 방법을 나타낸 순서도이다.

도 2는 락토페린 유전자의 구조 및 프라이머 결합 부위를 나타낸다.

도 3은 pGEM 벡터에 클로닝한 락토페린을 PCR로 확인한 전기영동사진이다.

도 4는 인간 락토페린을 효모벡터인 pPIC3.5K에 클로닝하여 제작한 재조합 발현벡터 pDBThLf-3KM과 pDBTHLf-3KS의 모식도이다.

도 5는 재조합 효모의 게놈 내로 삽입된 락토페린의 유전자를 확인한 PCR 전기영동사진이다.

<도면 부호에 대한 설명>

레인 1 : 사이즈 마커(λ/BstEII)

레인 2 : 양성 대조군(락토페린 유전자를 함유하는 플라스미드)

레인 3 : 음성 대조군(재조합 효모균주 SM-3.5K)

레인 4 : 재조합 효모균주 SM5-3KM 유전자

레인 5 : 재조합 효모균주 SM5-3KS 유전자

도 6은 재조합 효모내의 락토페린 전체 RNA를 전기영동한 사진이다.

<도면 부호에 대한 설명>

레인 1 :피치아 패스토리스SMD1168 RNA

레인 2 : 재조합 효모균주 SM-3.5K RNA

레인 3 : 재조합 효모균주 SM5-3KM RNA

레인 4 : 재조합 효모균주 SM5-3KS RNA

도 7은 재조합 효모내의 락토페린 전사를 확인하기 위한 RT-PCR 전기영동사진이다.

<도면 부호에 대한 설명>

레인 1 : 사이즈 마커(λ/BstEII)

레인 2 :피치아 패스토리스SMD1168 RNA

레인 3 : 재조합 효모균주 SM-3.5K RNA

레인 4 : 재조합 효모균주 SM5-3KM RNA

레인 5 : 재조합 효모균주 SM5-3KS RNA

도 8은 SM5-3KM과 SM5-3KS 각 균주에서 생성된 락토페린의 발현양을 비교하기 위한 웨스턴 블럿 사진이다.

<도면 부호에 대한 설명>

레인 1 : 단백질 사이즈 마커

레인 2 : 락토페린 표준 단백질

레인 3 : 재조합 효모균주 SM-3.5K의 전체 단백질

레인 4 : 재조합 효모균주 SM5-3KM의 전체 단백질

레인 5 : 재조합 효모균주 SM5-3KS의 전체 단백질

도 9는피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)로부터 생산된 락토페린의 항균성을 확인한 실험결과 사진이다.

도 10은피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)의 추출물을 순차적으로 희석(serial dilution)하여 항균효과를 실험한 결과사진이다.

도 11은피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)로부터 생산된 락토페린의 다양한 균에 대한 항균효과를 실험한 결과의 사진이다.

도 12는피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)의 성장곡선이다.

도 13은피치아패스토리스 SM5-3KS(KCTC 10409BP)에서 발현된 락토페린의 양을 시간별로 비교하기 위하여, 웨스턴 블럿을 수행한 결과의 사진이다.

<도면 부호에 대한 설명>

레인 1 : 단백질 사이즈 마커

레인 2 : 락토페린 표준 단백질

레인 3 : 발현되지 않은(Non-induced) 재조합 효모균주 SM5-3KS의 전체 단백질

레인 4~7 : 발현된 재조합 효모균주 SM5-3KS의 전체 단백질(시간 경과)

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 인간 락토페린의 생산 방법은 신호서열(signal peptide)을 포함하는 락토페린 유전자가 알콜 옥시다아제(alcohol oxidase) 프로모터(promoter)의 조절을 받도록 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현벡터를 메탄올자화효모인피치아 패스토리스에 형질 전환시켜 재조합 효모를 얻는 단계; 및 상기 재조합 효모를 발효 배양하는 단계로 이루어짐을 특징으로 한다(도 1 참조).

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 종래의 방법보다 향상된 방법으로 인간 락토페린을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것으로,피치아 패스토리스에서의 대량 발현이 효율적으로 이루어지도록 신호서열을 포함하는 2.1Kb의 인간 락토페린 유전자가 알콜옥시다아제(Alcohol oxidase) 프로모터의 조절을 받도록 제작한 재조합 발현벡터를 사용한다.

본 발명에서 사용한피치아 패스토리스는 고등동물세포(Mammalian cell)의 형질발현시스템 즉, 프로세싱(Processing) 폴딩(Folding), 전사후수식(Post-translational modification)과 매우 유사하기 때문에 발현되는 외부 단백질은 생물학적으로 활성을 지니게 되며, 산업적, 유전공학적으로 많이 이용되고 있는 효모인 사카로마이세스 세르비지에(Saccharomycescerevisiae)와 매우 유사한 특성을 가지고 있기 때문에 분자생물학적, 유전학적, 생화학적 기술의 적용이 매우 유용하다.

본 발명에서 사용한 벡터 pPIC3.5K(Sreekrishna et. al., High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeastPichiapastoris. J. BasicMicrobiol., 1988, 4, 265-278)는 메탄올자화효모에서 유래된 효모-대장균 셔틀벡터(Yeast-E.colishuttle vector)로, 효모내의 DNA와 유사성을 가지고있기 때문에 형질전환하면 효모의 게놈(Genome)내로 들어갈 수 있다.

본 발명에서는 재조합 효모가 인간 락토페린을 생성하는 것을 뒷받침하기 위하여 PCR, 웨스턴 블럿(Western blot)등 생화학적, 분자생물학적인 방법을 사용하여 연구를 수행한다.

본 발명에서 발현된 락토페린은 인간 초유 유래의 락토페린과 동일한 항균효과를 보였으며, 발효 배양을 통해 인간 락토페린의 대량 발현이 가능함을 확인하였다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 인간 락토페린 cDNA의 직접선별 및 재조합 벡터의 제조

락토페린 유전자가 있는 cDNA 라이브러리에서 락토페린의 유전자만 선별적으로 증폭하고 변형한 후 벡터에 클로닝하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 신호서열(signal sequence)을 포함하는 유전자와 포함하지 않는 유전자를 각각 증폭하였다. 인간 락토페린 유전자의 구조는 도 2에 나타내었다.

PCR을 위해 사용된 프라이머들(도 2 참조)은 다음과 같으며(하기에서 -부분은 제한효소부분을 나타내고,ATG는 시작코돈을TTA는 정지코돈을 나타낸다.), PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성(denaturation)을 수행한 다음 35사이클 증폭을 수행하였다. 변성은 95℃에서 1분, 어닐링은 55℃에서 2분, 신장(extension)은 72℃에서3분간 수행하였다. 그리고 마지막 35 사이클에서는 72℃에서 10분간 신장시간을 늘려 반응을 마쳤다.

Lf-SF : 5' GCGGATCCACCATGAAACTTGTCTTCCTCG 3'

Lf-MF : 5' GCGGATCCACCATGGGCCGTAGGAGAAGGA 3'

Lf-ERB : 5' GAATTCTTACTTCCTGAGAAATTCACAG 3'

상기 방법에 의해서 제조된 인간 락토페린의 유전자는 3' 양 말단에 아데닌(A)를 포함하고 있기 때문에, 양 말단에 티민(T)을 가지고 있는 pGEM-T easy 벡터(Promega사, USA)에 라이게이션을 수행하여, 재조합 플라스미드 pGEM-S 와 pGEM-M을 제작하였다. 이중, pGEM-S 는 락토페린의 신호서열을 포함하고, pGEM-M 은 신호서열이 제거된 락토페린을 포함한다. 상기 재조합 플라스미드들을 대장균인 Top10F'에 형질 전환하여 형질 전환체를 제조하였다. 이렇게 삽입한 유전자는 상기 에서와 동일한 프라이머와 조건을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 락토페린 유전자가 올바르게 삽입된 것을 확인하였다(도 3 참조).

실시예 2 :재조합 발현벡터(pDBThLf-3KM, pDBThLf-3KS)의 제조

락토페린 유전자를피치아 패스토리스(Pichia pastoris)로 운반하고 게놈내에 삽입, 발현하기 위해 재조합 발현벡터를 제조하였다. 즉, 상기 실시예 1의 재조합 플라스미드인 pGEM-M과 pGEM-S를 각각 제한효소인BamHI 과EcoRI로 절단한 후 2.1Kb의 성숙형 인간 락토페린 유전자를 준비한 후, 8.2Kb의 AOX 프로모터 부분을 포함하는 발현벡터인 pPIC3.5K의 각각에 알콜옥시다아제 프로모터와 같은 방향으로 삽입하여 재조합 발현벡터 pDBThLf-3KM, pDBThLf-3KS를 제작하였다. 도 4에 재조합 발현벡터 pDBThLf-3KM과 pDBThLf-3KS의 구조를 나타내었다.

실시예 3 :재조합 효모(SM5-3KM, SM5-3KS)의 제조 및 선별

락토페린 유전자를 메탄올자화효모인피치아 패스토리스에 운반하고 게놈내에 삽입하여 재조합피치아 패스토리스균주를 제조하기 위해 상기 실시예 2에서 제조된 발현벡터 pDBThLf-3KM과 pDBThLf-3KS를 각각 제한효소SalI으로 절단하여 선형(linear form)의 DNA를 형성하였다. 이렇게 되면 이 선형 DNA는 효모의 게놈내에 존재하는 히스티디놀 탈수소효소(Histidinol dehydrogenase)를 코딩하고 있는 His 4 유전자 내로 삽입이 가능하게 되고,피치아 패스토리스균주의 게놈내로 락토페린 유전자를 포함하는 선형의 DNA가 삽입되면 히스티딘이 결여된 선택 배지(MD, MM)에서 자랄 수 있다.

우선 형질전환을 위해피치아 패스토리스SMD1168(Sreekrishna et. al., High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeastPichia pastoris. J. BasicMicrobiol., 1988, 4, 265-278)을 YPD배지(1%의 효모추출액, 2%의 펩톤 및 2%의 덱스트로스)에 접종하여 30℃에서 하루 동안 배양한 후 이를 다시 YPD배지에 접종하여 OD₆₀₀이 1.2가 될 때까지 배양하였다. 상기 제조된 배양액을 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 제거한 다음, 같은 양의 멸균된 증류수로 현탁시켰다. 현탁된 세포는 다시 원심분리 과정을 거쳐 1/2부피의 멸균된 증류수로 현탁시킨 다음, 다시 원심 분리 과정을 거쳐 1/25부피의 1M의 솔비톨(sorbitol)과 1/500부피의 1M 솔비톨을 이용하여 동일한 방법으로 반복하여 세척하였다. 이렇게 세척한 세포 80㎕에 Tris-EDTA 완충용액 (pH 7.5) 10㎕에 녹아있는 10㎍의 선형DNA 각각을 섞어준 후 전기천공(eletroporation)용 큐벳(cuvette)에 넣고 10분간 얼음속에서 배양한 후 1500V, 25㎌, 200Ω으로 전기천공을 수행하였다. 이 세포에 차가운 1M의 솔비톨 1㎖을 첨가한 후 선택배지인 MD(1.34% YNB(Yeast nitrogen base), 4×10^-5% 비오틴, 2% 덱스트로스, 15g 한천/ℓ)에 200㎕씩 도말하여 30℃에서 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다. 이렇게 형성된 콜로니는 MD와 MM배지(1.34% YNB, 4×10^-5% 비오틴, 0.5% 메탄올, 15g 한천/ℓ)에 접종하여 MD, MM에서 둘 다 자라는 효모를 선별하였고, 이렇게 선별된피치아 패스토리스SMD1168 기원의 재조합 효모를피치아 패스토리스SM5-3KM 및피치아패스토리스 SM5-3KS라 명명하였다.

이후 재조합 효모의 게놈 내부에 락토페린 유전자가 포함되어 있는지 알아보기 위해 선별된 효모의 유전자를 분리한 후 락토페린 유전자만을 선별적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR법으로 확인하였다. 또한, 비교를 위하여 벡터 pPIC3.5K만이 삽입된 형질전환체 SM-3.5K를 가지고 PCR을 수행하였다. 여기서 사용된 프라이머는 상기 실시예 1의 Lf-SF, Lf-MF 및 Lf-ERB 프라이머를 사용하였으며, 조건은 실시예 1에서와 동일하다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5로부터 재조합 효모들의 유전자 내부에 2.1 Kb의 락토페린 유전자가 삽입되었다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4 :재조합 효모로부터 인간 락토페린 유전자의 전사확인

PCR을 통해 락토페린 유전자의 삽입을 확인한 형질전환체피치아 패스토리스SM5-3KM과피치아패스토리스 SM5-3KS를 완전배지에서 3일간 배양한 다음, 원심분리하여 균체를 회수하고, RNA를 뽑기 위해 AE 완충액에 녹인 후, 10%의 SDS와 포화된 페놀을 첨가하고, 아이스 에탄올 바스에서 방치시킨 다음, 페놀/클로로포름을 넣어 추출시킨 뒤, 상층액만 회수하여 2V의 에탄올로 RNA를 침전시킨 후 DEPC-처리된 정제수에 녹여 전체 RNA를 얻었다(도 6 참조).

위와 같이 얻은 전체 RNA를 가지고 RT-PCR을 수행하였다. 프라이머는 상기 실시예 1의 Lf-SF, Lf-MF 및 Lf-ERB 프라이머를 사용하였으며, PCR 증폭조건은 다음과 같다. 1 단계 PCR 키트를 이용하고, 94℃에서 3초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 68℃에서 신장 1분씩 총 35 사이클을 PCR하여 확인하였다.

PCR에 의해 확인된 형질전환체피치아패스토리스 SM5-3KM와피치아패스토리스 SM5-3KS,피치아 패스토리스숙주 SMD1168 및 벡터 pPIC3.5K만이 삽입된 형질전환체 SM-3.5K의 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행한 결과,피치아 패스토리스숙주 SMD1168과 벡터만이 삽입된 형질전환체 SM-3.5K에서는 검출되지 않는 2.1kb 인간 락토페린 유전자의 밴드가 형질전환체피치아패스토리스 SM5-3KM과피치아패스토리스 SM5-3KS에서 증폭되어 나타났다. 이를 통해 인간 락토페린 유전자의 mRNA가 전사(transcription)되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

실시예 5 :재조합효모로부터 인간 락토페린의 발현(Expression)및 확인

실시예 3에서 선별된 재조합 효모는 전술한 바와 같이 알콜옥시다아제(Alcohol oxidase) 프로모터(promoter)의 조절을 받고 있기 때문에 메탄올에 의해서 쉽게 발현이 유도된다. 따라서, 재조합 효모피치아패스토리스 SM5-3KM과피치아패스토리스 SM5-3KS를 BMGY(1%의 효모 추출액, 2%의 펩톤, 100㎖의 인산칼륨 완충액(pH 6.0), 1.34%의 YNB, 4×10^-5%의 비오틴(Biotin), 1%의 글리세롤/ℓ)배지에 접종 한 후, 2일간 세포의 양을 늘려준 후 이 세포의 일부를 BMMY(1%의 효모 추출액, 2%의 펩톤, 100㎖의 인산칼륨 완충액(pH 6.0), 1.34%의 YNB, 4×10^-5%의 비오틴 0.5%의 메탄올/ℓ)배지 옮겨 주어 발현을 유도하였다.

락토페린의 발현을 확인하기 위하여, 락토페린 신호서열을 가지지 않는 pDBThLF-3KM에 의해 삽입된 재조합 효모피치아패스토리스 SM5-3KM과 락토페린 신호서열을 가지고 있는 pDBThLf-3KS에 의해 삽입된 재조합 효모피치아패스토리스 SM5-3KS, 각각의 재조합 효모 배양액에서 동일 숫자의 효모균주를 추출·파쇄하고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행한 후, 웨스턴 블럿을 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8로부터 락토페린 신호서열을 가지지 않는 재조합 효모피치아 패스토리스SM5-3KM 배양액에서 추출한 효모균주에서는 락토페린의 발현을 전혀 확인할 수 없었고, 락토페린 자체의 신호서열을 가지고 있는 재조합 효모피치아패스토리스 SM5-3KS 균주만이 효모내에서 락토페린을 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다.

이를 통하여, 락토페린의 신호서열은 효모내의 락토페린의 발현과 안정에 도움을 주며, 락토페린 신호서열 없이는 효모내에서 락토페린의 발현을 이룰 수 없음을 간접적으로 확인하였다.

이후, 재조합 효모균주에서 발현된 재조합 락토페린의 작용을 검증하기 위한실험에서는 락토페린 자체의 신호서열을 가지고 있고, 그 발현이 안정적인 재조합 효모피치아패스토리스 SM5-3KS만을 이용하여 실험을 수행하였다.

한편, 상기한 재조합 효모피치아패스토리스 SM5-3KS를 2003년 1월 13일자로 한국과학기술원 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10409BP를 부여받았다.

실시예 6:재조합 락토페린의 항균 작용 검증

피치아패스토리스 SM5-3KS(KCTC 10409BP)를 용해(lysis)하여(인산나트륨 완충액, pH 7.2, beadbeater) 얻은 조추출물을 여과하여 전체 세포 오염물(whole cell contamination)을 제거하고 TGY 베이스 한천 플레이트(base agar plate)위에 시험 미생물로 마이크로코코스 플라버스(Micrococcusflavus) ATCC 10240 및 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcusaureus) ATCC 13301를 접종한 TGY soft 한천을 부어 표면을 건조시킨 후, 위에서 준비한 조추출물을 10㎕씩 점적하여 하룻밤 동안 배양하였다. 그 결과, 음성 대조군으로 사용한피치아 패스토리스SMD1168과 pPIC3.5K만이 도입된 형질전환체 SM-3.5K에서는 아무런 헤일로(halo)가 나타나지 않은 반면,피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)에서는 halo를 확인할 수 있어, 재조합 효모인피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)만이 항균 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다(도 9 참조).

또한, 항균성을 나타내는 재조합피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)로부터 생산된 락토페린의 항균력을 확인하였다. 즉, 조추출물 시료를 2배 순차 희석법(two-fold serial dilution)으로 희석하여 그 항균활성을 테스트한 결과, 마이크로코코스플라버스에서는 1/20D까지 활성을 보인 반면 스타필로코코스아우레우스에서는 1/40D 까지 항균활성이 확인되었다(도 10 참조). 이를 기준으로 대략 계산하면 스타필로코코스아우레우스는 약 2.04ng, 마이크로코코스플라버스에서는 약 4.09ng의 재조합 인간 락토페린이 항균 활성을 나타낸다는 대략적인 계산을 할 수 있다.

더불어 재조합 락토페린의 항균성 범위를 알아보기 위하여, 다양한 균에 대한 항균성을 측정한 결과, 매우 다양한 범위의 미생물에 대하여 항균효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 11 참조).

상기한 결과들로부터, 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 인간 락토페린은 다양한 범위의 미생물에 대한 항균성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7:재조합 락토페린의 대량발현 연구

락토페린을 함유하는 재조합 효모피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)를 대량 배양하여(발효) 락토페린의 수율을 높이고자 발효조를 이용하여 발현을 유도하고 그 수율을 확인하였다.

플라스크 배양에서 발현과 항균활성을 확인한피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)를 5ℓ자르 발효조(jar fermenter)에서 스케일업(scale up)하였다. 종배양은 BMGY 200㎖에서 수행하였으며, OD₆₀₀=20에서 본배양을 위해 BMGY로 옮겼다. 세포량을 증가시키기 위하여 BMGY 배지에서 세포량을 증가시킨 후, DNS로 당을 정량하여 당이 거의 소비됐을 때(접종 후 36시간, OD₆₀₀=43) 메탄올 배양을 한뒤, 24시간 동안 배양(OD₆₀₀=52)하였다. 그 결과, 세포량은 OD₆₀₀=52까지 증가하였다(도 12 참조).

또한, 시간의 경과에 따른피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)에서 발현되는 락토페린 발현양을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 보는 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 OD에 비례하여 발현양이 증가한다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 재조합 효모는 고등 진핵생물의 발현시스템 즉, 프로세싱(Processing), 폴딩(Folding), 전사후 수식(Post-translational modification)과 매우 유사하기 때문에 발현되는 락토페린이 생물학적으로 활성을 지니게 되며, 동물세포 등과 같은 다른 진핵생물의 형질발현시스템 보다 쉽고 저렴하게 대량생산 할 수 있는 효과를 갖는다. 더구나, 락토페린의 신호서열이 효모내의 락토페린의 발현과 안정에 도움을 주며, 락토페린 신호서열 없이는 효모내에서 락토페린의 발현을 이룰 수 없음을 간접적으로 확인하였다.

Claims

신호서열(signal peptide)을 포함하는 락토페린 유전자가 알콜 옥시다아제(alcohol oxidase) 프로모터(promoter)의 조절을 받도록 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

상기 재조합 발현벡터를 메탄올자화효모(Methylotrophic yeast)인피치아 패스토리스(Pichia pastoris)에 형질 전환시켜 재조합 효모를 얻는 단계; 및

상기 재조합 효모를 발효배양하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는피치아 패스토리스를 이용하여 인간 락토페린을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터가 pDBThLf-3KS임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 효모가피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP)임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 효모의 발효배양은 BMGY(1%의 효모 추출액, 2%의 펩톤, 100㎖의 인산칼륨 완충액(pH 6.0), 1.34%의 YNB, 4×10^-5%의 비오틴(Biotin), 1%의 글리세롤/ℓ) 배지에서 종배양한 후, 동일 배지에서 본배양을 수행함을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 인간 락토페린.
피치아 패스토리스SM5-3KS(KCTC 10409BP).