KR100331981B1 - 곤충세포를 이용하여 제조된 사람 락토페린 및 그 제조방법 - Google Patents

곤충세포를 이용하여 제조된 사람 락토페린 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곤충세포를 이용하여 제조된 사람 락토페린(Lactoferrin) 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상기 제조방법은 전달 벡터(tansfer vecter)(1)와 재조합 플라스미드(2)를 조합하여 락토페린 유전자가 벡터(pBacPAK) 내의 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터(promotor)의 조절을 받도록 변형한 재조합 발현 벡터(pBacLf)(3)를 제조하고; 상기 재조합 발현 벡터를 헬프 벡터(pBacPAK6)(4)와 함께 배양기내의 곤충세포(Sf9)(5)에 코트랜스펙션(cotransfection)하여 재조합 곤충세포(Sf-Lf)(6)를 제조하고 상기 재조합 곤충세포로부터 재조합 곤충 바이러스를 제조하고; 그리고 상기 재조합 곤충세포(6)로부터 사람 락토페린을 생산하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 재조합 사람 락토페린의 생물학적 검증방법은 재조합 사람 락토페린을 재조합 곤충세포로부터 추출하여 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescence), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 이 콜라이(E. coli)와 같은 병원성 박테리아와 혼합하여 병원성균의 사멸 정도를 측정하는 것이다.

Description

곤충세포를 이용하여 제조된 사람 락토페린 및 그 제조방법{A Human Lactoferrin Produced by Using an Insect Cell and Method the same}
본 발명은 곤충세포를 이용하여 제조된 사람 락토페린(Human lactoferrin) 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 유전자 재조합에 의해 사람 락토페린 유전자를 곤충세포에 형질도입하고, 이를 배양하여 발현시킨 후 이로부터 사람 락토페린을 생성하는 곤충세포를 이용하여 제조된 사람 락토페린 및 그 제조방법에 관한 것이다.
사람 락토페린은 철(iron)과 결합하는 당 단백질인 트랜스페린(transferrin)의 일종으로서 락토트랜스페린(lactotransferrin) 이라고도 한다. 주로 모유, 우유, 침, 눈물, 점액분비물과 다형핵 류코사이트(polymorpho-nuclear leucocytes)의 제2 과립세포(secondary granules) 등에 존재하는데, 1939년 피터 소렌슨(Peter Sorenson)에 의해 처음 발견되었으며, 초기에는 인유(人乳)의 '레드 프로테인(red protein)'으로 명명되었었다.
최초의 락토페린(Lf)은 소의 유즙으로부터 정제 동정되었고, 이후에는 쥐,염소, 토끼, 개, 사람 등 여러 포유동물의 유즙에서도 분리 정제되었다. 락토페린의 함량은 유즙에서 상대적으로 높은데, 특히 초유기간 동안에는 보통 6-8 ㎎/㎖의 함량을 유지한다. 그러나 초유를 거친 모유단계에 이르러서는 2 ㎎/㎖정도로 감소된다. 만일 이 기간동안에 세균에 감염되면 락토페린은 정상적인 농도의 30배 이상으로 급증한다.
사람 락토페린(hLf)은 분자량이 78kDa으로 691개의 아미노산(amino acid)으로 된 단일 폴리펩타이드 체인(single polypeptide chain)으로 구성되어 있다. 상기 단일 폴리펩타이드 체인은 2개의 글로뷸라 로브(globular lobes)로 폴드(fold)되어 있는 2-fold internal repeat로 구성되어 있다. 즉, 사람 락토페린(hLf)은 N-말단 부분을 구성하고 있는 N-로브와 C-말단 부분을 구성하고 있는 C-로브로 되어있다. 이 두 로브는 매우 유사한 구조를 가지고 있어서, N-말단과 C-말단 사이에는 약40% 이상의 아미노산 시퀀스 호몰로지(homology)를 갖는다. 최근 들어 엑스-레이 크리스탈로그라피(x-ray chrystallography)에 의해 락토페린의 3차 구조가 밝혀짐에 따라 락토페린은 N-말단과 C-말단에 각각 하나의 철과 결합할 수 있는 부위가 있어서 한 분자당 두개의 Fe3+이온이 가역적으로 결합할 수 있음을 알게되었다(Anderson 등, 1989). 또한, 이러한 락토페린은 철(iron)의 결합유무에 따라 iron-free(apo type) 상태와 iron-saturated(holo type) 상태로 존재하게 되는데, 락토페린의 생물학적 특성은 철의 결합에 의해 영향을 받게된다. 보통 모유에는 apo-type의 락토페린이 존재하며, 모든 락토페린은 트랜스페린(transferrin)에 비해 산성(acidic) 상태에서 안정성을 갖고 pH의 영향을 받아 철을 방출시킨다.
락토페린은 외분비선(exocrine glands)에서 분비되는 비-면역글로블린 보호 단백질(non-immunoglobulin protective protein) 중의 하나로서 직접 또는 간접적으로 항균작용(anti-bacterial action)을 일으키며, 항 바이러스에 대해서도 영향을 미친다. 락토페린은in vitro와in vivo중 어느 상태에서도 여러 종류의 미생물에게 광범위한 항균작용을 일으킨다. 이러한 락토페린은 iron-free state(apo-type)에서 이 콜라이(E. coli)나 클리브시엘라 뉴모니아(Kleabsiella pneumonia), 에어로벡터 에어로진(Aerobacter aerogenes) 등의 그램-음성 박테리아(Gram-negative bacteria)에 대해 높은 항미생물활성(anti-microbial activities)을 갖는데, 이는 락토페린이 미생물이 필요로 하는 Fe3+이온을 빼앗아 킬레이팅(chelating) 시킴으로서 미생물의 생장을 억제하기 때문이다. 실제로in vitro실험결과, 락토페린은 바실루스(Bacillus), 이 콜라이(E. coli), 살모넬라(Salmonella) 등의 균을 1시간 이내에 99.99% 사멸시켜 항생물질에 뒤지지 않는 살균작용을 보였다. 또한, 락토페린은 철을 빼앗아 미생물의 성장을 억제시키는 작용 기작과 박테리아 생육성(bacteria viability)을 급속하게 감소시키는 작용 기작을 갖고있다. 상기 기작은 락토페린이 그램음성균(Gram-negative bacteria)의 외막(outer membrane)에 손상을 주어 외막의 구성성분인 당지질(lipopolysaccharide)을 다량 방출(release)시킴으로써 투과장벽(permeability barrier)을 파괴하고, 리소자임(lysozyme)이나 리팜피신(rifampicin)같은 소수성 항생제(hydrophobic antibiotics)에 대한 민감성을 증대시켜 저항성을 잃게 하여 사멸되게 한다. 그러나 이렇게 병원체에 대한 살균작용을 갖는 락토페린이 락토바실러스(Lactobacillus)나 비피더스(Bifidus)와 같은 인체에 유용한 세균에 대해서는 항균작용을 일으키지 않는다는 보고가 있다. 따라서, 이렇게 독특한 물질인 락토페린은 세균이나 바이러스 감염으로부터 면역에 미숙한 신생아를 지켜주는 역할을 한다. 락토페린은 혈액 내에도 소량이 포함되어 있는데, 대부분 호중구(neutrophil)에서 분비(secretion)된다. 락토페린은 호중구의 제2 과립세포의 주된 구성성분으로서 염증반응(inflammatory response) 시에 다량 분비된다. 락토페린은 종종 체내에서 리소자임(lysozyme)이나 IgA와 함께 감염된 병원성 미생물에게 직접 작용하여 파괴시킴으로써 미생물 사멸에 상승효과를 주기도 한다. 이와 같이 락토페린은 숙주에 대한 방어 기작에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있으므로, 락토페린을 생성하지 못하는 환자는 각종 질병에 대해 저항성이 훨씬 떨어지고 세균과 곰팡이에 대하여 감염이 증가한다. 그 외에 락토페린은 세포 증식(cell proliferation)이나 철의 전달흡수(iron transport absorption) 등에서도 매개체로서의 역할을 담당한다.
이러한 락토페린의 많은 작용에도 불구하고 사람 락토페린에 대한 연구는 아직 미미한 편이다. 이것은 락토페린이 혈액이나 그 밖의 다른 체액 내에 존재하지만 그 양이 매우 미미하고, 초유(colostral whey)에 상당량이 존재하더라도 초유를 얻을 수 있는 시료에 한계가 있기 때문이다. 최근에는 모유의 중요성이 강조되어 락토페린에 대한 연구가 활성화되고 미생물을 이용한 산업적 응용의 기본토대가 이루어지도록 유전 공학적 방법을 적용하여 사람 락토페린(hLf) DNA를 미생물에 클로닝하고 발현(expression) 시키고자 한다. 그러나 앞에서 언급한 바와 같이 사람 락토페린은 유전 공학에 많이 사용하고 있는 이 콜라이(E. coli) 등을 위한 특별한 재조합 플라스미드가 제작되어지지 않는 한, 이 콜라이를 발현균주로 사용하는 것은 대단히 어려운 일이다.
또한, 생성된 재조합 락토페린의 생물학적 활성의 검증을 하는 것은 매우 중요하다. 왜냐하면, 락토페린 자체가 가지는 항균성으로 인해 일반적으로 사용되는 박테리아나, 효모 등이 대부분 숙주로서 부적합하거나, 혹은 사용된다 하더라도 생성 양이 극히 적어 산업적으로 사용하기가 부적절하기 때문이다. 이를 타개하기 위하여 와드(Ward) 등(1992)은 곰팡이인Aspergillus nidulans나oryzae를 사용하여 재조합 락토페린을 생성하는데 성공하였으나, 그 발현 양이 5-25mg/ℓ로 곤충세포(insect cell)에 비하여 아주 낮은 편이었다. 또한, 이들은 곰팡이들로부터 생성된 재조합 락토페린의 생물학적 활성을 방사선 동위원소가 표지된 Fe56의 결합력으로만 검증하였기 때문에 이들 재조합 락토페린이 실제로 항균 작용을 하는가에 대해서는 의문점이 있다.
따라서, 본 발명자는 종래 기술의 단점을 개선하여 보다 용이하게 사람 락토페린을 대량생산할 수 있는 방법 및 재조합 사람 락토페린의 생물학적 활성을 검증하는 새로운 방법을 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 곤충세포를 이용하여 사람 락토페린을 생산할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사람 락토페린 단백질을 생산하는 재조합 곤충세포를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 곤충세포로부터 생성된 재조합 락토페린을 생물학적으로 검증하기 위한 방법을 제공하기 위한 것이다.
도1은 본 발명의 곤충세포를 이용한 재조합 사람 락토페린의 제조공정을 나타낸 공정도이다.
도2는 본 발명의 재조합 발현 벡터(pBacLf)의 제조과정을 나타낸 공정도이다.
도3은 본 발명의 재조합 발현 벡터(pBacLf)의 제한 효소를 절단한 후의 전기영동 패턴 사진이다.
도4는 본 발명의 재조합 곤충세포(Sf-Lf)로부터 분리된 재조합 바큐로바이러스(Baculovirus) DNA로부터 사람 락토페린 cDNA가 클로닝(cloning) 됨을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다.
도5는 도4으로부터 얻은 재조합 바이러스 DNA로부터 사람 락토페린 DNA가 클로닝되었음을 보여주는 써던 블랏(southern blot) 시험결과를 나타낸 사진이다.
도6는 재조합 곤충세포 Sf-Lf가 사람 락토페린 단백질을 발현하고 생산하는 SDS-PAGE 및 이를 확인하는 웨스턴 블랏(western blot) 시험결과를 나타낸 사진이다.
<도면의 부호에 대한 간단한 설명>
1: 전달 벡터 2: 재조합 플라스미드
3: 발현 벡터 4: 헬프 벡터
5: 곤충세포(Sf9) 6: 재조합 곤충세포(Sf-Lf)
본 발명은 유전자 재조합에 의해 사람 락토페린 유전자를 곤충세포에 형질도입하고, 이를 배양하여 발현시킨 후 이로부터 사람 락토페린을 생산하는 곤충세포를 이용한 사람 락토페린 생산방법에 관한 것이다. 또한, 생산된 재조합 사람 락토페린의 항균성 검증방법에 관한 것이다.
도1 및 도2를 참조하여 본 발명의 곤충세포를 이용한 사람 락토페린 제조방법을 설명한다.
본 발명의 곤충세포를 이용한 사람 락토페린의 제조방법은 전달 벡터(tansfer vecter)(1) 및 재조합 플라스미드(phLf-8)(2)를 조합하여 락토페린 유전자가 벡터(pBacPAK) 내의 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터(promotor)의 조절을 받도록 변형한 재조합 발현 벡터(pBacLf)(3)를 제조하고; 상기 재조합 발현 벡터를 헬프 벡터(pBacPAK6)(4)와 함께 배양기내의 곤충세포(Sf9)(5)에 코트랜스펙션(cotransfection)하여 재조합 곤충세포(Sf-Lf)(6)를 제조하고 상기 재조합 곤충세포로부터 재조합 곤충 바이러스를 제조하고; 그리고 상기 재조합 곤충세포(Sf-Lf)(6)로부터 사람 락토페린을 생산하는 단계로 이루어진다.
상기 재조합 곤충세포 제조단계에서 재조합 곤충세포가 배양된 배양액을 윈심분리하여 상층액에 존재하는 상기 곤충세포로부터 나온 자손 바이러스(progeny virus)를 얻는다.
상기 재조합 곤충 바이러스는 전달 벡터(tansfer vecter)(1)와 재조합 플라스미드(2)를 조합하여 락토페린 유전자가 벡터(pBacPAK) 내의 폴리헤드린 프로모터의 조절을 받도록 변형한 재조합 발현 벡터(pBacLf)(3)를 제조하고; 상기 재조합 발현 벡터를 헬프 벡터(pBacPAK6)(4)와 함께 배양기내의 곤충세포(Sf9)(5)에 코트랜스펙션(cotransfection)한 다음 재조합 곤충세포(Sf-Lf)(6)를 제조하여 배양하고; 그리고 상기 재조합 곤충세포(Sf-Lf)로부터 재조합 곤충 바이러스를 생산하는 단계로 이루지는 방법으로 제조된다.
일반적으로 많이 사용되는 곤충세포는 거염벌레(armyworm)로부터 유래된 Sf9 cell(Spodoptera frugiperda)이다. 본 발명에서도 상기 Sf9 세포주(cell line)를 숙주로 사용한다. 상기 Sf9 세포주는 세포 내에 곤충 바이러스인 바큐로바이러스(Baculovirus)에 의해 감염되면 폴리헤드린(polyhedrin)이라는 점액성 단백질을 많이 합성하며, 이는 바큐로바이러스에 있는 폴리헤드린을 합성하는 폴리헤드린 프로모터가 매우 활성화되어 작용된다는 사실을 말해준다. 지금까지 보고된 바(Kaplan 등, 1990: Davidson 등, 1990, Kaplan 등, 1991)에 의하면 곤충세포 내에서 생성된 폴리헤드린의 양은 1mg/ℓ-500mg/ℓ로 다양하며, 따라서 외부단백질이 발현되는 농도도 단백질이나 유전자에 따라 다양하다. 상기 곤충세포는 고등 동물세포인 포유류 세포(mammalian cell)와 당단백질(glycoprotein), 인산화 반응(phosphorylation), 지방산 아실레이션(fatty acid acylation), 아미드화 반응(amidation), 단백질분해 공정(proteolytic processing) 등이 매우 유사하며, 따라서 곤충 세포에서 발현되는 대부분의 고등생물 단백질은 생물학적으로 활성을 지니고 있게 된다. 본 발명에서 사용한 사람 락토페린도 생물학적 활성을 지닌 것으로 나타난다.
본 발명에서 사용된 발현 벡터는 곤충 바이러스 DNA이며, 가장 많이 사용되는 것은 오토그라파 칼리포니카(Autographa califonica)로 알려진 복합 폴리헤드로시스 바이러스(multiple polyhedrosis virus)(AcMNPV)이다. 바큐로바이러스의 라이프 사이클(life cycle)이나 감염주기는 킹(King) 등의 저서 (King, L.A and R.D. Possee, The Baculovirus Expression System. A laboratory guide, HAPMAN and HALL)에 자세히 기재되어 있다. 본 발명에서는 전술한 바와 같이 바큐로바이러스로부터 유래된 발현 벡터(pBacPAK, Clontech)를 사용한다.
본 발명에서는 재조합 곤충세포가 사람 락토페린을 생성하는 것을 뒷받침 하기 위하여 여러 가지 생화학적, 분자생물학적 방법을 사용한다. 예를 들면, PCR, 써던 블랏(Southern blot), 웨스턴 블랏(western blot) 등을 사용하여 분자 수준에서 유전자 재조합 락토페린을 생성하기 위한 기초적인 연구를 수행한다.
본 발명에서는 곤충세포로부터 생성된 재조합 락토페린의 생물학적 검증을 새로운 방법으로 실시한다. 즉, 재조합 락토페린을 곤충세포로부터 추출하여 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescence), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 또는 이 콜라이(E. coli)와 같은 병원성 박테리아와 혼합하여 병원성균의 최대 1시간내에 사멸 정도를 관찰한다.
한편, 본 발명에서 사용된 재조합 곤충세포(Sf-Lf)는 현탁배양(suspension culture)이 가능하여 플라스크(flask) 배양이 가능하고, 일반적인 고등 생물 세포와는 달리 CO2가 필요 없고, 배양시 FBS(Fetal Bovine Serum)를 사용하지 않아도 된다는 점에서 향 후 대량 생산을 위한 이상적인 시스템이 될 수 있다.
실시예
실시예 1: 곤충세포의 배양 및 재조합 발현 벡터(pBacLf)의 제조
곤충세포로는 스포돕테라 프루기페르다 난소 세포(Spodoptera frugiperda ovary cell)(Sf9)를 사용하였으며, 28℃에서 저온 배양하였다. 상기 곤충세포(Sf9)에 감염(infection)시키기 위한 바이러스(virus)는 AcMNPV, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(pBacPAK 6, Clontech co.)를 사용하였으며, 10% FBS, 락트알부민(lactalbumine) 하이드롤리세이트(hydrolysate)와 항진균 항생제(antimycotic antibiotics)가 포함된 그레이스 배지(Grace's medium)에서 배양하였다.상기 곤충세포 Sf9 cell은 네덜란드 인비트로젠회사에서 구입하여 사용하였다(Invitrogen, PO Box 2312,9704CH Groningen, Netherlands).상기 바이러스 AcMNPV(pBacPAK6)는 미국 클론텍 회사(CLONTECH Laboratories, Inc. 1020 East Meadow Circle, Palo Alto,CA 94303-4230, USA)에서 구입하여 사용하였다.
락토페린 유전자를 바큐로바이러스 유전자 안으로 운반해주기 위해 폴리헤드린 프로모터 부분을 포함하는 5.5kb크기의 전달 벡터(pBacPAK8, Clontech Co.)에 클로닝하기 위해 기존의 재조합 플라스미드로부터 락토페린의 개시암호(start codon)와 신호서열(signal sequence)을 포함하는 2.1kb 완전 유전자(full gene)를 준비하여 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter)와 같은 방향으로 이 콜라이(E. coli)에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 상기 전달벡터(pBacPAK8)은 미국 클론텍 회사(CLONTECH Laboratories, Inc. 1020 East Meadow Circle, Palo Alto,CA 94303-4230, USA)에서 구입하여 사용하였다. 상기 재조합 발현 벡터를 제한효소로 처리하여 락토페린 유전자를 확인하였으며, 이를 pBacLf라고 명명하였다. 상기 발현 벡터(pBacLf)의 제조 공정을 도2에 나타내었다.
도3은 선별된 재조합 발현 벡터(pBacLf)의 제한 효소 절단한 후의 전기영동 패턴을 나타낸 사진이다. 레인(lane) 1은 사이즈 마커(size marker)(λ/BstE I)이며, 레인 2는 재조합 발현벡터(pBacLf)의 슈퍼(super) 코일(coil)이며, 레인 3은 재조합 발현벡터(pBacLf)를 제한효소인 BamH I와 Not I로 처리하여 락토페린 전체 크기 2.1kb에 락토페린 유전자가 절단되어 나타남을 확인한 것이며, 레인 4는 재조합 발현벡터를 제한효소 Eco R V로 처리하여 락토페린 유전자를 확인한 것이며, 레인 5는 재조합 발현벡터(pBacLf)를 제한효소 Sma I로 처리하여 락토페린 유전자를 확인한 것이며, 레인 6는 재조합 발현벡터(pBacLf)를 제한효소 Bgl II로 처리하여 락토페린 유전자를 확인한 것이며, 레인 7은 재조합 발현벡터(pBacLf)를 제한효소 Pst I로 처리하여 락토페린 유전자를 확인한 것이며, 그리고 레인 8은 사이즈 마커를 나타낸 것이다. 도3에 나타난 바와 같이 재조합 발현 벡터를 제한효소인 BamH I과 Not I으로 절단하였을 때 2.1kb에 사람 락토페린 유전자가 나타났다.
실시예 2 : 재조합 곤충세포 Sf-Lf의 선별 및 재조합 바이러스의 동정
Sf9 cell을 10% FBS를 포함하는 그래이스 기초배양기(Grace's basic medium)에 1.0×106세포 정도로 접종하여 4시간 동안 배양한다. 그래이스의 기초배양기로 2번 세척(washing)하여 상온에서 30분간 방치한다. 리포좀-매개(liposome-mediated) 트랜스펙션(transfection) 방법을 이용하기 위해 준비된 재조합 전달 벡터(recombinant transfer vector)와 바이러스 DNA(BacPAK 6, Clontech co.)를 잘 섞어 리포펙틴(lipofectin)과 함께 세포 단층(cell monolayer) 위에 떨어뜨리고 혈청(serum), 항생제(antibiotics)가 포함된 그래이스 배양기에 첨가한 후 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 상등액을 배양액으로 3-5회, 10단계로 희석을 하여 직경 60mm 플레이트(plate)에 단층(monolayer)으로 배양된 Sf9 세포에 접종시켰다. 바이러스가 흡착되면 용해시킨 아가로스(agarose) 함유배지를 세포 위에 굳힌다. 6-7일 후, 뉴추럴 레드(neutral red) 용액으로 염색하여 보면, 죽은 세포는 염색되어 구별이 가능하고 동시에 플라크(plaque)를 형성시킨다. 현미경을 사용하여 재조합 바이러스의 감염에 의해 폴리헤드린 단백질이 나타나지 않는 플라크를 선별하여 파스퇴르 피펫(pasteur pipet)으로 아가로스와 함께 빨아 올려 1㎖의 배지 안에 부유시킨다. 이후 재조합 바이러스가 락토페린 유전자를 포함하고 있는지 증명하기 위해 새로운 그래이스 배양기에서 배양된 Sf 9세포에 재조합 바이러스를 또다시 감염시켜 재조합 바이러스 DNA를 분리(isolation)한 후 아가로스 겔(gel) 전기영동(electrophoresis)으로 DNA의 영동 패턴(pattern)을 비교하였으며, 락토페린을 증폭할 수 있는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)법으로 확인하였고, 제한효소 처리 후 써던 블랏(southern blot)을 통해 2.1kb 락토페린 유전자를 확인하였다.
도4는 재조합 곤충세포(Sf-Lf)로부터 분리된 재조합 바이러스 DNA로부터 2.1kb의 락토페린 cDNA가 클로닝되어 있음을 보여준다. 레인(Lane) 1은 사이즈 마커(size marker)(λ/BstE II)이며, 레인 2는 음성조절(negative control)(pBacPAK8)이며, 레인 3과 4는 재조합 바이러스(viral) DNA를 나타내는 것이다. 레인(Lane) 3에서 나타나듯이 재조합 바이러스) DNA로부터 사람 락토페린(hLf)만 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용하는 2.1kb의 사람 락토페린 cDNA가 증폭되었음을 보여준다.
도5는 도4에서 확인된 사실을 기초로 하여, 재조합 바이러스 DNA를 제한효소BamHI,NotI,AccI 등으로 처리한 후, 써던 블랏(Southern blot)으로 2.1kb의 락토페린 cDNA를 확인 한 것이다. 레인 1은 재조합 바이러스 인텍트(intact) DNA이며, 레인 2는 재조합 바이러스 DNA(BamH I/Not I), 레인 3은 재조합 바이러스 DNA(Acc I)이며, 레인 4는 재조합 바이러스 DNA(BamH I/Not I/Bgl II)이며, 레인 5는 바이러스 DNA로부터 생성된 증폭된 PCR 락토페린 유전자이며, 레인 6은 DIG-Labeled 사이즈 마커이며, 레인 7은 재조합 플라스미드(pBacPAK8) 슈퍼코일(supercoil) DNA이며, 그리고 레인 8은 음성조절(pGEMLf)(BamH I/Not I)을 나타내는 것이다.
음성 대조부(negative control)로서 pBacPAK8을 사용하였으며, 양성대조부(positive control)로는 2.1kb 락토페린 유전자가 포함된 pGEMLf를 제한효소BamHI/NotI으로 절단하여 사용하였다. 프로브(probe)로는 락토페린 cDNA의 N-lobe의 일부분을 DIG-label하여 사용하였으며, 도5에 나타난 바와 같이 재조합 바큐로바이러스 DNA에서 양성 대조부와 동일한 위치 2.1kb에서 띠(band)가 나타남을 알 수 있다. 이로서 본 발명에서 선별한 재조합 바이러스는 사람 락토페린 DNA를 가지고 있는 것이 증명되었다.
실시예 3 : 재조합 곤충세포(Sf-Lf)로부터 사람 락토페린의 형질발현 및 확인
단백질을 발현하는 것을 확인하기 위하여 재조합 세포를 셀 라이시스 버퍼(cell lysis buffer)(50mM Tris-HCl, pH8.0, 5% 2-머캅토에탄올, 0.4% w/v SDS, 10mM EDTA)로 파쇄하여 쿰아시-블루 폴리아크릴아미드 겔 런닝(coomassie-blue polyacrylamide gel running)을 수행하였고 안티-락토페린(anti-Lf)을 이용하여 웨스턴 블랏(western blot)을 수행하였다.
도6에 나타난 바와 같이, 재조합 바이러스 저장물(viral stock)을 곤충세포(Sf9)에 감염시켜 4일째 모아 숙주로 사용된 곤충세포(Sf9)와 함께 세포(cell)를 파쇄하여 상층액을 취하여 SDS-PAGE와 안티-락토페린(anti-Lf) Ab로 웨스턴 블랏(western blot)을 수행한 결과 양성 대조부(positive control)로 사용된 초유와 정제된 락토페린 단백질에서 발색되는 80kDa 위치와 동일한 위치에서 띠(band)가 진하게 발색되었다. 상기와 같은 사실로 볼 때, 재조합 곤충세포(Sf-Lf)에서 사람 락토페린 단백질이 생성됨을 알 수 있다. 레인 1은 프로테인 사이즈 마커이며, 레인 2는 초유상등액(Colostral soup)이며, 레인 3은 곤충세포(Sf9)이며, 그리고 레인 4, 5는 재조합 곤충세포를 나타내는 것이다. 발현된 락토페린을 밀도측정법(Densitometry)에 의하여 정량하였을 때 800mg/ℓ이상 생산하는 것으로 나타났다. 이와 같은 발현양은 앞서 밝힌 아스페르길러스(Aspergillus) 니듈란스(Nidulans)나 아스페르길러스(Aspergillus) 오리제(Oryzae)의 발현된 락토페린 양에 비해 월등히 많은 양이며, 경제적으로도 생산성이 대단히 높은 것이다.
실시예 4 : 재조합 락토페린의 항균 작용 검증
병원성 미생물에 대한 재조합 곤충세포(Sf-Lf)의 항균작용을 측정하기 위해 상기 곤충세포(Sf-Lf)를 냉동해동(freeze and thaw)방법으로 세포를 파쇄하여 상층액을 취하여 병원성 미생물에 250㎍/㎖정도의 락토페린 농도로 섞어준 후 0분, 15분, 30분, 45분, 60분 간격으로 플레이트 카운트 아가 플레이트(plate count agar plate)에 도말하였다.
표1에 나타낸 바와 같이, 락토페린이 포함된 상등액 만으로도 1시간 안에 병원성 미생물이 사멸되는 것을 세포(cell)의 수를 측정하여 알 수 있었다. 음성 대조부(negative control)로는 Sf 세포를 파쇄하여 재조합 Sf-Lf와 같은 방법으로 병원성 미생물에 미세분석(microassay)를 수행하였으나, 세포의 수가 감소되는 현상을 볼 수 없었다.
상기의 결과로부터, 재조합 곤충세포(Sf-Lf)에서 만들어지는 락토페린 단백질이 항균성을 지니고 있음을 확인 할 수 있었다.
상기 표1에서 * 는 동물성 병원균을 나타낸 것이며, @ 는 식품오염세균을 나타낸 것이고, + 는 락토페린과 함께 배양한 것을 나타낸 것이며, - 는 락토페린 없이 배양한 것을 나타낸 것이다.
본 발명의 곤충세포를 이용한 사람 락토페린 제조방법에 따라 제조된 재조합 곤충세포(Sf-Lf)는 현탁배양이 가능하여 플라스크 배양이 가능하며, 일반적인 고등 생물세포와는 달리 이산화탄소(CO2)가 필요 없고, 배양시 FBS(Fetal Bovine Serum)를 사용하지 않아도 되므로 사람 락토페린을 적은 비용으로 손쉽게 대량 생산할 수 있는 발명의 효과를 갖는다.

Claims (6)

  1. 전달 벡터(tansfer vecter)(1)와 재조합 플라스미드(phLf-8)(2)를 조합하여 락토페린 유전자가 벡터(pBacPAK) 내의 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터(promotor)의 조절을 받도록 변형한 재조합 발현 벡터(pBacLf)(3)를 제조하고;
    상기 재조합 발현 벡터를 헬프 벡터(pBacPAK6)(4)와 함께 배양기내의 곤충세포(Sf9)(5)에 코트랜스펙션(cotransfection)하여 재조합 곤충세포(Sf-Lf)(6)를 제조하고 상기 재조합 곤충세포로부터 재조합 곤충 바이러스를 제조하고; 그리고
    상기 재조합 곤충세포(Sf-Lf)(6)로부터 사람 락토페린을 생산하는 단계;
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 곤충세포를 이용한 사람 락토페린의 제조방법.
  2. 제1항에서, 상기 재조합 곤충세포 제조단계에서 재조합 곤충세포가 배양된 배양액을 윈심분리하여 상등액에 존재하는 상기 곤충세포로부터 나온 자손 바이러스(progeny virus)를 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충세포를 이용한 사람 락토페린의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 전달 벡터(tansfer vecter)(1)와 재조합 플라스미드(2)를 조합하여 락토페린 유전자가 벡터(pBacPAK) 내의 폴리헤드린 프로모터의 조절을 받도록 변형한 재조합 발현 벡터(pBacLf)(3)를 제조하고;
    상기 재조합 발현 벡터를 헬프 벡터(pBacPAK6)(4)와 함께 배양기내의 곤충세포(Sf9)(5)에 코트랜스펙션(cotransfection)한 다음 재조합 곤충세포(Sf-Lf)(6)를 제조하여 배양하고; 그리고
    상기 재조합 곤충세포(Sf-Lf)로부터 재조합 곤충 바이러스를 생산하는 단계;
    로 이루지는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 재조합 곤충 바이러스.
  5. 제1항의 방법에 의하여 제조된 사람 락토페린을 병원성 미생물과 혼합하여항균작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 재조합 사람 락토페린의 생물학적 검증방법.
  6. 제5항에서, 상기 병원성 미생물은 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescence) 및 이 콜라이(E. coli)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사람 락토페린의 생물학적 검증방법.
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