KR102560651B1

KR102560651B1 - 엔테로코커스 박테리아에 대한 신규한 항미생물제

Info

Publication number: KR102560651B1
Application number: KR1020197014385A
Authority: KR
Inventors: 만프레드 비블; 에바 쉬르마이어; 마틴 그리슬
Original assignee: 뤼산도 아게
Priority date: 2016-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2023-07-26
Also published as: CN110087675A; WO2018073416A1; JP7288851B2; SG11201902876TA; BR112019007979A2; KR20190067236A; MX2019004439A; EA201990856A1; AU2017345217B2; JP2020510404A; AU2017345217A1; CA3041190A1; EP3528837A1; US20190330608A1

Abstract

본 발명은 Enterococcus 박테리아에 대해 활성인 항미생물제 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 제1 및 제2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로, 상기 제1 아미노산 서열은 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 5; 및 그의 유도체로부터 선택된 것이고; 제2 아미노산 서열은 항미생물 펩티드, 양극성 펩티드, 양이온성 펩티드, 소수성 펩티드, 스시 펩티드 또는 디펜신이다. 추가로, 본 발명은 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 그러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 상응하는 숙주 세포에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드. 핵산. 벡터, 및/또는 숙주 세포의 특히 약학 분야에서의 적용에 관한 것이다.

Description

엔테로코커스 박테리아에 대한 신규한 항미생물제

본 발명은 엔테로코커스(Enterococcus) 박테리아에 대해 활성인 항미생물제 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 제1 및 제2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로, 상기 제1 아미노산 서열은 서열번호 2; 서열번호 3; 서열번호 5; 및 그의 유도체로부터 선택된 서열이고; 상기 제2 아미노산 서열은 항미생물 펩티드, 양극성 펩티드, 양이온성 펩티드, 소수성 펩티드, 스시 펩티드 또는 디펜신이다. 추가로, 본 발명은 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 그러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 상응하는 숙주 세포에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 및/또는 숙주세포의 특히 약학 분야에서의 적용에 관한 것이다.

박테리아성 병원체는 인간 건강에 중대한 위협이 된다. 살균성 또는 정균성 활성을 갖는 다양한 유형의 제제가 당업계에 알려져 있지만(예를 들어 항생제), 특히 항생제에 대한 미생물 내성이 꾸준히 증가하고 있다. 건강 우려를 나타내는 병원체 중 하나는 Enterococcus 속의 몇몇 박테리아이다. 그들은 특히 병원 내(병원) 환경에서 인간의 생명을 위협하는 감염을 일으킬 수 있다. 이 문맥에서 특히 관련이 있는 Enterococcus faecalis 및 Enterococcus faecium 박테리아는 감염의 90% 초과를 차지한다. Enterococcus faecalis 및 Enterococcus faecium는 인간의 하부 장, 구강, 및 질 관(vaginal tract)에서 공생적으로 대량 서식하는 그람-양성 박테리아이다. 건강한 개인에서, E. faecalis 및 E. faecium 군집은 정상적으로는 숙주에 악영향을 끼치지 않지만; 장구균(enterococci)에 의한 독성 인자 및 높은 수준의 항생제 내성의 획득은 특히 면역력이 약화된 환자에서 심각한 문제를 일으킬 수 있다. 장구균 감염으로 인한 일반적인 질병은 심내막염(endocarditis), 복부 농양(abdominal abscesses), 균혈증(bacteremia) 및 요로 감염을 포함한다. 증가하는 내성은 기존의 항생제의 유용성을 감소시키므로, 예를 들어 병원내(병원) 환경에서 Enterococcus 박테리아의 수를 조절하기 위한 신규한 항미생물제에 대한 끊임없는 요구가 있다.

본 발명은 박테리아 세포벽을 분해하는 효소, 예컨대 엔도리신의 용도를 발명한다. 엔도리신은 통상적으로 박레티오파지(또는 박테리아 바이러스)가 암호화하는 펩티도글리칸 가수분해효소이다. 그들은 파지 증식의 용해 회로에서 후기 유전자 발현 동안 합성되고 박테리아성 펩티도글리칸의 분해를 통해 감염된 세포로부터 자손 비리온의 방출을 조정한다. 그들은 N-아세틸-β-D-뮤나리다아제(리소자임), 용해성 트랜스글리코실라아제, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제, N-아세틸뮤라모일-L-알라닌 아미다아제 또는 엔도펩티다아제 중 하나이다. 엔도리신의 항미생물 응용은 1991년 Gasson(GB2243611)에 의해 이미 제안된 바 있다. 엔도리신의 살상 능력은 오랫동안 알려져 왔지만, 항생제의 성공과 지배로 인해 이러한 효소의 항균제로서의 사용은 무시되었다. 여러 항생제 내성 박테리아의 출현 이후, 엔도리신으로 인간 병원체와 싸운다는 단순한 개념이 관심을 받았다. 완전히 새로운 유형의 항균제를 개발해야 한다는 압도적인 요구가 나왔고 엔도리신은 효소와 항생제를 합친 용어인 효소항생제(enzybiotics)로 사용되어 이러한 요구를 완벽하게 충족시켰다. 2001년, Fischetti와 동료들은 A군의 연쇄구균(streptococci)에 대한 박테리오파지 Cl 엔도리신의 치료학적 잠재성을 첫 번째로 확인하였다(Nelson et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:4107-4112; 본원에 참조로 포함됨). 그 후부터 여러 문헌들은 엔도리신을 그람-양성 박테리아에 의한 박테리아 감염을 조절하는데 매력적이고 상호보완적인 대체제로 정립하였다. 그 후 다른 그람-양성 병원체, 예컨대 Streptococcus pneumoniae(Loeffler et al., 2001, Science 294:2170-2172), Bacillus anthracis(Schuch et al., 2002; Nature 418:884-889), S. agalactiae(Cheng et al., 2005; Antimicrob Agents Chemother. 2005 Jan;49(1):111-117) 및 Staphylococcus aureus(Rashel et al, 2007; J Infect Dis. 2007 Oct 15;196(8):1237-1247)에 대한 다른 엔도리신들에 대해 효소항생제로서의 그들의 효능이 입증되었다(모두 본원에 참조로 포함됨).

당업계에는 신규한 항미생물제를 만들기 위해 추가의 아미노산 서열 구간을 갖는 엔도리신의 조합이 기술되어있다. 국제공개공보 제2010/149795호(본원에 참조로 포함됨)는 다양한 박테리아에 대해 활성을 나타내는 엔도리신의 유도체와 펩티드의 융합체를 개시한다. 그러나, 이러한 융합체는 Enterococcus 박테리아에 대해서 구체적으로 기술되지는 않았다.

따라서, 그람 양성 박테리아에 대해 활성인 신규한 항균제 여전히 필요하다. 특히, Enterococcus 속의 박테리아에 대해 활성인 항균제가 필요하다. 바람직하게는, 상기 제제는 다양한 세트의 Enterococcus 균주에 대해서 활성이고, 증가된 활성을 보이고/거나 예를 들어 충분하게 pH 내성이어서 의료 기술 및 약학분야에서 적용시 넓은 유용성을 허용한다.

본 목적은 청구범위에서 정의된 대상에 의해 해결되었고 아래 설명된다.

본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 특히 특정 서열에서 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 예를 들어 다양한 기 예컨대 탄수화물 또는 포스페이트의 공유 결합으로 변형될 수 있다. 다른 물질은, 예컨대 헴(heme) 또는 지질과 같이 폴리펩티드에 더 느슨하게 관련되어 복합(conjugated) 폴리펩티드를 만들 수 있는데, 이 역시 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"에 포함되는 것이다. 본원에서 사용된 용어는 또한 단백질을 포함하는 것으로 의도된 것이다. 따라서, 용어 "폴리펩티드"는 또한 예를 들어 두 개 이상의 아미노산 중합체 사슬의 복합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 예를 들어 비오티닐화, 아세틸화, 페길화, 아미노-, SH- 또는 카르복실기(예를 들어 보호기)의 화학적 변화 등, 당업계에서 흔히 사용되는 임의의 변화를 나타내는 폴리펩티드의 실시양태를 포함한다. 하기 설명으로부터 명백하겠지만, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 비-자연 발생 폴리펩티드일 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 자연에서는 합쳐지지 않는 적어도 두 개의 아미노산 서열이 합쳐진 융합 단백질일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미노산 중합체 사슬의 특정 길이로 한정되지 않고, 통상적으로 폴리펩티드는 약 50개 초과의 아미노산, 약 100개 초과의 아미노산 또는 심지어 약 150개 초과의 아미노산 길이를 나타낼 것이다. 통상적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 본 발명의 전형적인 폴리펩티드는 약 750개를 초과하지 않는 아미노산 길이이다.

본원에서 사용된 용어 "엔도리신"은 박테리아성 세포벽을 가수분해하는데 적절한 박테리오파지-유래 효소를 지칭한다. 엔도리신은 다음 활성 중 적어도 하나를 갖는 적어도 하나의 "효소적으로 활성인 도메인(EAD)"를 포함한다: 엔도펩티다아제, 키티나아제, T4 유사 뮤라미니다아제, 람다 유사 뮤라미니다아제, N-아세틸-뮤라모일-L-알라닌-아미다아제(아미다아제), 뮤라모일-L-알라닌-아미다아제, 뮤라미다아제, 용해성 트랜스글리코실라아제(C), 용해성 트랜스글리코실라아제(M), N-아세틸-뮤라미다아제(리소자임), N-아세틸-글루코사미다아제 또는 트랜스글리코실라아제. 추가로, 엔도리신은 효소적으로 불활성이면서 숙주 박테리아의 세포벽에 결합하는 부분, 이른바 CBD(세포벽 결합 도메인)를 함유할 수 있다. 용어 "엔도리신"은 또한 자연적으로 발생하는 엔도리신과 비교하여 변형 및/또는 변경을 포함하는 효소를 포함한다. 그러한 변경 및/또는 변형은 예컨대 결실, 삽입 및 부가, 치환, 또는 그들의 조합 및/또는 아미노산 잔기의 화학적 변화와 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 화학적 변화는 비오티닐화, 아세틸화, 페길화, 아미노-, SH- 또는 카르복실기의 화학적 변화이다. 상기 엔도리신은 각각의 야생형 엔도리신의 용해 활성의 일반적인 수준을 보인다. 그러나, 상기 활성은 각각의 야생형 엔도리신의 활성과 같거나, 높거나, 낮을 수 있다. 상기 활성은 예를 들어 각각의 야생형 엔도리신의 활성의 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 적어도 약 200%일 수 있거나 더 많을 수 있다. 활성은 통상의 기술자에 의해 당업계에 잘 알려진 분석, 예를 들어 Briers et al.(J. Biochem. Biophys Methods; 2007; 70: 531-533) 또는 Donovan et al.(J. FEMS Microbiol Lett. 2006 Dec;265(1) 및 유사한 문헌들에 기술된 항균제 분석법으로 측정될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "유도체"는 각각의 기준 서열과 비교하여 하나 이상의 부가, 결실, 삽입, 및/또는 치환 및 그의 조합을 나타내는 아미노산 서열을 지칭한다. 이는 예를 들어 결실/삽입, 삽입/결실, 결실/부가, 부가/결실, 삽입/부가, 부가/삽입 등의 조합을 포함한다. 통상의 기술자는 그러나 유도체 서열 중 특정 위치에서 기준 서열 중 각각의 동일 위치에 존재하는 것과는 다른 아미노산 잔기가 존재하는 경우, 이것이 예를 들어 동일 위치에서의 결실 및 추가 삽입의 조합이 아니라 본원에서 정의하는 치환이라는 점을 이해할 것이다. 오히려, 만약 본원에서 하나 이상의 부가, 삽입, 결실 및 치환의 조합이 언급된다면, 예를 들면 N-말단에서의 부가 및 서열 내 결실과 같이 서열 중 구분되는 위치에서의 변화들의 조합으로 의도된 것이다. 그러나 유래된 서열은 각각의 기준 서열, 예를 들어 주어진 서열번호와 특정 수준의 서열 상동성, 바람직하게 적어도 60%, 예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 나타낼 것이다. 바람직한 유도체는 모분자의 단편, 예를 들어, 모분자의 활성을 보유하는, 즉 각각의 모분자와 일반적인 수준의 동일한 활성을 나타내는 주어진 서열번호이다. 그러나, 상기 활성은 각각의 모분자와 동일하거나, 높거나, 낮을 수 있다. 또한 바람직한 유도체는 모서열 내의 보존적 아미노산 치환으로부터 결과되는 것들, 예를 들어 역시 일반적인 수준으로 모분자의 활성을 보유하는 주어진 서열번호이다.

본원에서 사용된 용어 "% 서열 상동성"은 다음과 같이 이해되어야 한다: 비교되는 두 서열은 양 서열의 최대 상관을 제공하도록 정렬됨. 이는 정렬 정도를 높이기 위하여 하나 또는 두 개의 서열에 "간격"을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. % 상동성은 그 후 비교되는 각 서열의 전체 길이(소위 글로벌 정렬)에 대해 결정될 수 있는데 이는 동일하거나 유사한 길이 또는 보다 짧은 서열에 대해 특히 적합하며, 정의된 길이(소위 국소 정렬)는 동일하지 않은 길이의 서열에 더 적합하다. 위 맥락에서, 예를 들어 문의(query) 아미노산 서열에 대해 95%의 "서열 상동성"을 갖는 아미노산 서열은 대상 아미노산 서열이 문의 아미노산 서열의 100개의 아미노산 당 5개의 아미노산 변경까지 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 대상 아미노산 서열의 서열이 문의 서열과 동일하다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 다른 말로, 문의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 상동성의 서열을 갖는 아미노산 서열을 얻기 위해서는, 대상 서열 중의 아미노산 잔기의 5%까지(100개 중 5개)는 삽입되거나 다른 아미노산으로 치환되거나 결실될 수 있다. 두 개 이상의 서열의 상동성 및 상동(homology)을 비교하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 두 서열이 동일한지에 대한 퍼센트는 예를 들어 수학적인 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 사용될 수 있는 바람직한, 그러나 이에 제한되지 않는, 수학적 알고리즘의 예는 Karlin et al.(1993), PNAS USA, 90:5873-5877의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 인터넷에서 NCBI 홈페이지인 ncbi.nlm.nih.gov를 통해 접근 가능한 BLAST 패밀리 프로그램, 예를 들어 BLAST 또는 NBLAST 프로그램(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 또는 Altschul et al.(1997), Nucleic acids Res, 25:3389-3402 참조) 및 FASTA(Pearson(1990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman(1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448)에 통합되어 있다. 다른 서열과 특정 정도로 동일한 서열은 이들 프로그램을 사용하여 확인될 수 있다. 추가로, 위스콘신 서열 분석 패키지 버전 9.1(Devereux et al, 1984, Nucleic aics Res., 387-395)에서 입수 가능한 프로그램, 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP을 사용하여 두 개의 폴리펩티드 서열 간의 % 상동성을 측정할 수 있다. BESTFIT는 Smith and Waterman(1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.의 "국소 상동" 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 최고로 유사한 단일 구역을 찾는다. 본원에서 기준 서열에 대한 서열 상동성의 특정 정도를 공유하는 아미노산 서열을 언급한다면, 그러한 서열 중의 차이는 바람직하게는 보존적 아미노산 치환으로 인한 것이다. 바람직하게, 그러한 서열은 예를 들어 더 느린 속도일 수 있겠지만 기준 서열의 활성을 보유한다. 추가로, 만약 "적어도" 특정 퍼센트의 서열 상동성을 공유하는 서열이 언급된다면, 100% 서열 상동성은 바람직하게 포함되지 않는다.

본원에서 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 충분히 유사한 물리화학적 특성을 갖는 아미노산기 내에서 일어날 수 있어서, 기(group)의 구성원(member) 간의 치환이 분자의 생물학적 활성을 보존할 것이다(예를 들어, Grantham, R.(1974), Science 185, 862-864 참조). 특히, 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는 아미노산이 동일한 종류의 아미노산(예를 들어, 염기성 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산, 양전하 또는 음전하로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산, 측쇄에 방향족기를 갖는 아미노산, 측쇄가 수소 결합을 이룰 수 있는 아미노산, 예를 들어 히드록실 기능을 갖는 측쇄 아미노산)으로부터 유래된 것인 치환이다. 보존적 치환은 본 발명에서 예를 들어 염기성 아미노산 잔기(Lys, Arg, His)를 다른 염기성 아미노산 잔기(Lys, Arg, His)로 치환하는 것, 지방족 아미노산 잔기(Gly, Ala, Val, Leu, lie)를 다른 지방족 아미노산 잔기로 치환하는 것, 방향족 아미노산 잔기(Phe, Tyr, Trp)를 다른 방향족 아미노산 잔기로 치환하는 것, 트레오닌을 세린으로 치환하거나 류신을 이소류신으로 치환하는 것이다. 추가의 보존적 아미노산 교환은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

본원에서 사용된 용어 "결실"은 바람직하게는 각각의 기준 서열과 비교할 때 유도체 서열 중에서 1, 2, 3, 4, 5개(또는 심지어 5개 초과)의 연속적 아미노산 잔기의 서열 내 또는 N- 또는 C-말단에서의 부재를 지칭한다. 본 발명의 유도체는 그러한 결실을 하나, 두 개 이상을 보일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "삽입"은 바람직하게는 각각의 기준 서열과 비교할 때 유도체 서열 중에서 1, 2, 3, 4, 5개(또는 심지어 5개 초과)의 연속적 아미노산 잔기의 서열 내에서의 추가적인 존재를 지칭한다. 본 발명의 유도체는 그러한 삽입을 하나, 두 개 이상을 보일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "부가"는 바람직하게는 각각의 기준 서열과 비교할 때 유도체 서열 중에서 1, 2, 3, 4, 5개(또는 심지어 5개 초과)의 연속적 아미노산 잔기의 N- 및/또는 C-말단에서의 추가적인 존재를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "치환"은 유도체 서열의 특정 위치에서, 기준 서열에서 상응하는 위치에서 존재하거나 부재하는 아미노산 잔기와는 다른 아미노산 잔기의 존재를 지칭한다. 본 발명의 유도체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 그러한 치환을 보일 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 바람직하게 그러한 치환은 보존적 치환이다.

본원에서 사용된 용어 "제2 아미노산 서열"은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 아미노산 서브서열을 지칭한다. 상기 서열은 양이온성 펩티드, 다가양이온성 펩티드, 양극성 펩티드, 소수성 펩티드, 스시 펩티드 및/또는 항미생물 펩티드의 서열일 수 있다. 이 용어는 His-태그, 예컨대 His5-태그, His6-태그, His7-태그, His8-태그, His9-태그, His10-태그, His11-태그, His12-태그, His16-태그 및 His20-태그, Strep-태그, Avi-태그, Myc-태그, Gst-태그, JS-태그, 시스테인-태그, FLAG-태그 또는 당업계에 알려진 다른 태그와 같은 통상적인 태그, 티오레독신 또는 말토오스 결합 단백질(MBP)을 지칭하는 것은 아니다. 바람직하게, 제2 아미노산 서열은 적어도 약 6개 내지 최대 약 50개, 바람직하게는 최대 약 39개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 바람직하게, 제2 아미노산 서열은 제1 아미노산 서열과 비상동이고, 예를 들어 두 아미노산 서열은 자연에서 단일의 폴리펩티드에 같이 나타나지 않는다. 추가로, 제2 아미노산 서열 자체는 다음 효소적 활성 중 어느 것도 나타내지 않는다: 엔도펩티다아제, 키티나아제, T4 유사 뮤라미니다아제, 람다 유사 뮤라미니다아제, N-아세틸-뮤라모일-L-알라닌-아미다아제(아미다아제), 뮤라모일-L-알라닌-아미다아제, 뮤라미다아제, 용해성 트랜스글리코실라아제(C), 용해성 트랜스글리코실라아제(M), N-아세틸-뮤라미다아제(리소자임), N-아세틸-글루코사미다아제 또는 트랜스글리코실라아제. 통상적으로, 제2 아미노산 구간은 어느 효소적 활성도 전혀 나타내지 않을 것이다.

본원에서 사용된 용어 "제1 아미노산 서열" 및 "제2 아미노산 서열"은 본 발명의 폴리펩티드 내에서의 서열의 내재적 순서를 암시하는 것은 아니고, 즉, 제2 아미노산 서열은 제1 아미노산 서열의 N-말단 또는 제1 아미노산 서열의 C-말단일 수 있다. 또한 예를 들어 간섭하는 서열 요소가 있을 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "양이온성 펩티드"는 바람직하게는 양전하로 하전된 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭한다. 바람직하게 양이온성 펩티드는 9.0 이상의 pKa-값을 가진다. 통상적으로, 양이온성 펩티드의 적어도 4개의 아미노산 잔기, 예를 들어 리신 또는 아르기닌이 양전하로 하전될 수 있다. "양전하로 하전"은 약 생리적인 조건에서 순(net) 양전하를 갖는 아미노산 잔기의 측쇄를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "양이온성 펩티드"는 또한 다가양이온성 펩티드를 지칭할 뿐만 아니라, 예를 들어 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만으로 양전하로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 양이온성 펩티드도 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "다가양이온성 펩티드"는 바람직하게는 대부분 양전하로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기로 구성된 펩티드를 지칭한다. 만약 아미노산 잔기의 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100 %가 양전하로 하전된 아미노산 잔기, 특히 리신 및/또는 아르기닌 잔기인 경우, 펩티드는 대부분 양전하로 하전된 아미노산 잔기로 이루어진다. 양전하로 하전된 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기는 중성적으로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 음전하로 하전된 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기일 수 있다. 바람직하게 양전하로 하전된 아미노산 잔기가 아닌 아미노산 잔기는 중성적으로 하전된 아미노산 잔기, 특히 세린 및/또는 글리신이다.

본원에서 사용된 용어 "항미생물 펩티드"(AMP)는 바람직하게는 예를 들어 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 효모, 마이코플라즈마 및 원생동물에 대해 미생물 살균성 및/또는 미생물 정균성 활성을 갖는 임의의 자연적으로 발생한 펩티드를 지칭한다. 그러므로, 본원에서 사용된 용어 "항미생물 펩티드"는 특히 항박테리아, 항곰팡이, 항진균, 항기생충, 항원생동물, 항바이러스, 항감염, 항전염 및/또는 멸균, 살조, 살아메바, 살미생물, 살균, 살진균, 살기생충, 살원생동물, 살원충 능력을 갖는 임의의 펩티드를 지칭한다. 바람직한 것은 항박테리아성 펩티드이다. 항미생물 펩티드는 RNase A 슈퍼 패밀리의 구성원, 디펜신, 카테리시딘, 그래눌리신, 히스타틴, 서리아신, 더미시딘 또는 헵시딘일 수 있다. 항미생물 펩티드는 곤충, 어류, 식물, 거미류, 척추동물 또는 포유류에서 자연적으로 발생할 수 있다. 바람직하게 항미생물 펩티드는 무, 실크 나방, 늑대 거미, 개구리, 바람직하게는 Xenopus laevis, 라나(Rana) 개구리, 더욱 바람직하게 Rana catesbeiana, 두꺼비, 바람직하게 아시아 두꺼비(Bufo gargarizans), 파리, 바람직하게 초파리, 더욱 바람직하게 Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, 꿀벌, 호박벌, 바람직하게 Bombus pascuorum, 쉬파리, 바람직하게 Sarcophaga peregrine, 전갈, 투구게, 메기, 바람직하게 Parasilurus asotus, 소, 집돼지, 양, 돼지류, 소류, 원숭이 및 인간에서 나올 수 있다. 본원에서 사용된 "항미생물 펩티드"(AMP)는 특히 양이온성 펩티드, 다가양이온성 펩티드, 양극성 펩티드, 스시 펩티드, 디펜신, 및 소수성 펩티드가 아닌 펩티드일 수 있지만, 그럼에도 불구하고 항미생물 활성을 보인다.

본원에서 사용한 용어 "스시 펩티드"는 짧은 컨센서스 반복을 갖는 보체 조절 단백질(CCP)을 지칭한다. 스시 펩티드의 스시 모듈은 많은 다른 단백질에서 단백질-단백질 상호작용 도메인으로 기능한다. 스시 도메인을 함유하는 펩티드는 항미생물 활성을 갖는 것으로 나타났다. 바람직하게, 스시 펩티드는 자연적으로 발생한 펩티드이다.

본원에서 사용한 용어 "디펜신"은 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간에 존재하는 펩티드를 지칭하고, 디펜신은 고유의 숙주의 방어 시스템에서 외부 물질, 예를 들어 감염성 박테리아 및/또는 감염성 바이러스 및/또는 곰팡이를 파괴하는 역할을 한다. 디펜신은 비-항체 미생물 살균성 및/또는 종양파괴성 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드이다. "디펜신"의 예는 "포유류 디펜신", 알파-디펜신, 베타-디펜신, 인돌리시딘 및 마가이닌이다. 본원에서 사용된 용어 "디펜신"은 동물 세포로부터 분리된 형태 또는 합성적으로 생성된 형태 모두를 지칭하고, 그들의 모단백질의 세포독성 활성을 실질적으로 보유하지만 서열이 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실로 변형된 변이체도 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "양극성 펩티드"는 친수성 및 소수성 작용기 모두를 갖는 펩티드를 지칭한다. 바람직하게, 본원에서 사용된 용어 "양극성 펩티드"는 친수성 및 소수성기의 정해진 배열을 갖는 펩티드를 지칭하고, 예를 들어 양극성 펩티드는 예를 들어 나선의 한 면을 따라 우세적으로 비극성 측쇄를 갖고 그 표면의 나머지 부분을 따라 극성 잔기를 갖는 알파 나선일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "소수성기"는 바람직하게는 화학 기, 예컨대 실질적으로 수불용성이지만 오일상에서는 용해성으로 오일상에서의 용해도가 물 또는 수상에서의 것보다 더 높은 아미노산 측쇄를 지칭한다. 물에서, 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 다른 것과 상호작용하여 비수성 환경을 발생시킨다. 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 예는 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 시스테인, 알라닌, 티로신 및 프롤린 잔기이다.

본원에서 사용된 용어 "소수성 펩티드"는 바람직하게는 대부분 소수성 기를 갖는 아미노산 잔기로 구성된 소수성 펩티드를 지칭한다. 그러한 펩티드는 바람직하게 대부분 소수성 잔기, 즉, 아미노산 잔기의 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 적어도 약 100%가 소수성 아미노산 잔기로 구성된다. 소수성이지 않은 아미노산 잔기는 바람직하게 중성이고 바람직하게 친수성이 아니다.

본원에서 사용된 용어 "태그"는 당업계에서 통상적으로 a) 전체 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 발현의 증가, b) 전체 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 정제 촉진, c) 전체 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 고정(immobilisation) 촉진, 및/또는 d) 전체 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 검출 촉진을 위해 다른 아미노산 서열에 융합된 또는 포함된 아미노산 서열을 지칭한다. 태그의 예로는 His 태그, 예컨대 His5-태그, His6-태그, His7-태그, His8-태그, His9-태그, His10-태그, His11-태그, His12-태그, His16-태그 및 His20-태그, Strep-태그, Avi-태그, Myc-태그, GST-태그, JS-태그, 시스테인-태그, FLAG-태그, HA-태그, 티오레독신 또는 말토오스 결합 단백질(MBP), CAT, GFP, YFP 등이 있다. 통상의 기술자는 다른 기술 응용에 적합한 방대한 수의 태그를 알 것이다. 태그는 예를 들어 그렇게 태그된 폴리펩티드를 예를 들어 다른 ELISA 분석 포맷에서의 항체 결합 또는 다른 기술 적용에 적합하게 만들 수 있다.

본원에서 사용된 "약 생리적 pH"는 6.5보다 높은 pH, 특히 약 6.75 내지 약 8.5, 더욱 바람직하게는 7 내지 7.75, 보다 더욱 바람직하게는 7.2 내지 7.6, 보다 더욱 바람직하게는 7.3 내지 7.5의 범위의 pH를 지칭하는 것으로 의도된 것이다. 가장 바람직하게, 생리적 pH는 약 7.4의 pH이다.

본원에서 사용된 용어 "포함한다"는 "구성된다"(추가적인 다른 요소의 존재를 배제)는 의미로 한정되어서 해석되어서는 안된다. 오히려, "포함한다"는 임의적으로 추가적인 요소가 존재할 수 있음을 암시하는 것이다. 용어 "포함한다"는 특히 "구성되는"(추가적인 다른 요소의 존재를 배제) 및 "포함하지만 구성되는 것은 아닌"(추가적인 다른 요소의 존재를 필요)의 범위에 포함되는 가상의 실시양태를 포괄한다.

본 발명의 발명자는 놀랍게도 서열번호 1에 따른 엔도리신 및 이의 유도체, 예컨대 그들의 "효소적으로 활성인 도메인"(EAD; 서열번호 2) 또는 세포벽 결합 도메인(CBD, 서열번호 3)이 Enterococcus 속의 박테리아에 대한 항미생물제를 설계할 때 굉장히 유용한 요소인 펩티드의 특정 유형, 예컨대 서열번호 4 또는 서열번호 100에 따른 항미생물 펩티드과의 조합이라는 점을 발견하였다. 그러한 화합물은 예를 들어 Enterococcus faecalis 박테리아에 대해 증가된 유용성 및 활성을 보이고, 야생형 엔도리신(서열번호 1)에 비해 더욱 pH 내성이다. 특히 바람직한 본 발명의 폴리펩티드는 특히 약 생리적 pH(예를 들어, 약 pH 7.4)에서 야생형 엔도리신(즉, 서열번호 1)에 비해 더욱 활성일 것이고 바람직하게 약 생리적 pH에서 더 산성인 pH(예를 들어, pH 5.25 또는 6)에서보다 본질적으로 동일하거나 심지어 증가된 활성을 보일 것이다.

그러므로, 본 발명의 제1 측면은 제1 및 제2 아미노산 서열을 포함하고, 제1 아미노산 서열이 하기 서열의 군에서 선택되는 것에 관한 것이다:

i) 서열번호 2에 따른 아미노산 서열;

ii) 서열번호 3에 따른 아미노산 서열;

iii) 서열번호 5에 따른 아미노산 서열; 및

iv) 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 5와 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 5 중 어느 하나의 유도체.

상기 제2 아미노산 서열은 항미생물 펩티드, 양극성 펩티드, 양이온성 펩티드, 소수성 펩티드, 스시 펩티드 또는 디펜신이다.

가장 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드의 제1 아미노산 서열은 하기 서열의 군으로부터 선택된 서열이다:

i) 서열번호 2에 따른 아미노산 서열;

ii) 서열번호 3에 따른 아미노산 서열; 및

iii) 서열번호 5에 따른 아미노산 서열.

본 발명의 폴리펩티드가 CBD를 포함하는 실시양태(예를 들어, 서열번호 3 또는 그의 유도체를 포함)에서, 폴리펩티드가 추가적으로 박테리아, 특히 그람 양성 박테리아의 세포벽을 분해시킬 수 있는 효소의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 효소는 예를 들어 척추동물 리소자임(예를 들어, 인간 또는 흰색 달걀 리소자임)일 수 있지만, 바람직하게는 엔도리신, 오토리신 또는 박테리오리신(예를 들어, 리소스타핀)이다. Dong et al.(Microb Biotechnol. 2015 Mar;8(2):210-20)에 이미 예시된 바와 같이, 서열번호 1의 세포벽 결합 도메인(CBD)는 다른 많은 용해성 효소 서열, 예컨대 리신 Ply187의 효소성 도메인(1-157aa)과 융합될 수 있다. 효소는 Streptococcus suis의 홀린(holin)의 효소적으로 활성인 서브유닛일 수도 있다. 리신 Ply187의 효소성 도메인(1-157aa) 또는 NCBI 기준 서열 WP_029171101.1의 아미노산 2-242를 커버하는 영역 및 그들의 변이체, 예를 들어 서열번호 104는 서열번호 3 또는 그의 유도체와 조합으로 사용될 수 있는 본원발명의 가능한 실시양태이다. 한 실시양태에서, 본원발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들어 서열번호 104 또는 서열번호 104와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87.5%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 99% 초과의 서열 상동성을 보이는 서열번호 104의 유도체에 따른 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러나 가장 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 2 및 서열번호 3 또는 그의 각각의 유도체를 포함한다.

서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 유도체 각각은 바람직하게 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 5와 적어도 85%, 적어도 87.5%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 99% 초과의 서열 상동성을 보인다.

본원에서 논의한 모든 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드가 서열번호 1의 유도체를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 특히 유용한 서열번호 1의 유도체는 서열번호 5(서열번호 1에서 N-말단 메티오닌이 없음) 및 그의 유도체, 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 그들 각각의 유도체를 포함하는 서열번호 1의 절단된(truncated) 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 이들 실시양태 모두에 공통적인 것은 본 발명의 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하지 않는다는 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 제2 아미노산 서열은 항미생물 펩티드, 양극성 펩티드, 양이온성 펩티드, 다가양이온성 펩티드, 소수성 펩티드, 스시 펩티드 또는 디펜신으로 구성된 군으로부터 선택된다.

양이온성/ 다가양이온성 아미노산 서열의 예는 하기 표에 열거되어 있다.

[표 1]

본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 항미생물 아미노산 서열의 예는 하기 표에 열거되어 있다.

[표 2]

제2 아미노산 서열 구간은 Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19, 스시 펩티드: 그람-음성 박테리아에 대한 구조적 특징 및 작용방식에 기술된 스시 펩티드일 수 있다. 특히 바람직한 것은 서열번호 84에 따른 스시 1 펩티드이다. 다른 바람직한 스시 펩티드는 스시 펩티드 S1 및 S3 및 그들의 복수들(multiples)이다(Tan et al, FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13).

바람직한 소수성 펩티드는 서열번호 85에 따른 아미노산 서열을 갖는 Walmagh 1 및 아미노산 서열 Phe-Phe-Val-Ala-Pro(서열번호 86)을 갖는 소수성 펩티드이다.

바람직한 양극성 펩티드는 서열번호 87에 따른 T4 리소자임의 알파4-헬릭스 및 서열번호 88에 따른 아미노산 서열을 갖는 WLBU2-변이체 및 서열번호 89에 따른 Walmagh　2이다.

가장 바람직하게, 제2 아미노산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 100에 따른 아미노산 서열이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 제1 아미노산 서열로 서열번호 5 또는 그의 유도체 및 제2 아미노산 서열로 서열번호 4를 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 제1 아미노산 서열로 서열번호 5 또는 그의 유도체 및 제2 아미노산 서열로 서열번호 100을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 대체적으로 제1 아미노산 서열로 서열번호 3 또는 그의 유도체 및 제2 아미노산 서열로 서열번호 100을 포함할 수도 있다.

본 발명의 폴리펩티드 내의 제1 및 제2 아미노산 서열의 배열과 관련하여, 제2 아미노산 서열이 제1 아미노산 서열의 N-말단에 위치하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 제1 및 제2 아미노산 서열은 서로 직접적으로 또는 1개 내지 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 개 내지 5개의 아미노산 잔기, 보다 더욱 바람직하게는 1개 내지 2개의 아미노산의 짧은 링커를 통해 연결된다. 링커 서열은 바람직하게 하나 이상의 글리신 잔기를 포함하는 유연한(flexible) 서열이다. 그러한 링커의 예는 글리신-세린 링커 또는 서열 GGGGS(서열번호 90)이다.

특히 본 발명의 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 발현되는 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 N-말단에 메티오닌 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는 추가적으로 하나 이상의 태그 서열을 포함할 수 있다. 그러한 태그 서열은 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 태그 서열은 폴리펩티드의 C-말단 부분, 예를 들어 C-말단에 바로 위치한다. 하나 이상의 태그 서열은 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 나머지에 직접 또는 짧은 링커를 통해 연결될 수 있다(상기 참조). 다양한 예가 당업계에 알려져 있고, 그 중 몇몇은 이미 상기에 언급되어 있다. 본 발명의 문맥상, 특히 바람직한 태그 서열은 His-태그, 바람직하게는 서열번호 91에 따른 His 태그이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드의 길이는 원칙적으로 제한되지 않지만, 바람직하게 길이는 과도하게 크지 않을 것이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 약 400개의 아미노산을 초과하지 않는, 바람직하게는 약 350개의 아미노산을 초과하지 않는 전체 길이를 갖는다.

본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 서열번호 92, 예컨대 서열번호 93을 포함하는 또는 서열번호 94를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 고려되는 것은 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94의 유도체로, 예를 들어 각각은 각각의 기준 서열에 대해 적어도 80%의 서열 상동성을 보인다. 본 발명에 따른 추가적으로 바람직한 폴리펩티드는 서열번호 101 또는 서열번호 101과 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 102 또는 서열번호 102와 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 103 또는 서열번호 103와 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이고, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열번호 104 또는 서열번호 104와 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 105 또는 서열번호 105와 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 바람직하게 Enterococcus 박테리아의 펩티도글리칸을 분해하는 능력으로 특징된다. 만약 효소가 활성이라면, 펩티도글리칸 층의 분해는 탁도의 저하를 야기할 것이고, 광도계로 측정될 수 있다(예를 들어, Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533,(2007) 참조).

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 독창적인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에도 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 핵산으로 인지될 수 있는 모든 형태를 가질 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 핵산은 RNA, DNA 또는 혼성체일 수 있다. 그들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 그들은 작은 전사체 또는 전체 유전체 크기, 예컨대 박테리오파지 유전체의 크기를 가질 수 있다. 본원에서 사용될 때는, 본 발명의 하나 이상의 독창적인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 센스 가닥을 반영하는 핵산일 수 있다. 마찬가지로, 안티센스 가닥 또한 포함된다. 핵산은 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 비상동인 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산은 하기 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 항미생물 펩티드, 양극성 펩티드, 양이온성 펩티드, 소수성 펩티드, 스시 펩티드 또는 디펜신을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다:

i) 서열번호 2에 따른 아미노산 서열;

ii) 서열번호 3에 따른 아미노산 서열;

iii) 서열번호 5에 따른 아미노산 서열; 및

iv) 각각 i), ii), 또는 iii)과 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 i), ii), 및 iii) 중 어느 하나의 유도체.

바람직하게, 본 발명의 핵산은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.

본 발명의 핵산은 하기 서열의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다:

i) 서열번호 95에 따른 핵산 서열;

ii) 서열번호 96에 따른 핵산 서열;

iii) 서열번호 97에 따른 핵산 서열; 및

iv) 각각 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97 중 어느 하나의 유도체.

본 발명의 핵산은 또한 서열번호 98에 따른 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 핵산은 제1 핵산 서열로 서열번호 97 및 제2 핵산 서열로 서열번호 98에 따른 핵산 서열을 포함한다. 특히 바람직한 것은 서열번호 99를 포함하는 핵산 서열이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 그러한 벡터는 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현은 구성적(constitutive)이거나 유도적(inducible)일 수 있다. 벡터는 또한 클로닝 목적으로 본 발명의 폴리펩티드의 핵산 서열을 포함하는 클로닝 벡터일 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 및/또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 특히 박테리아 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 숙주 세포는 E.　coli 세포이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함한다. 그러한 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 골시멘트일 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 93을 포함하는 폴리펩티드)를 포함하는 골시멘트가 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 추가적으로 생물 재료, 예를 들어 정형외과적 용도로 사용되는 생물재료를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 이와 관련하여 많은 수의 가능한 재료를 이미 알고 있을 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 인간 또는 동물에 수행되는 수술 또는 요법 또는 진단 방법으로 인간 또는 동물을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 Enterococcus 속의 박테리아에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드(및 마찬가지로 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물)에 관한 것이다. 특히 본 발명은 Enterococcus 속의 박테리아에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드(및 마찬가지로 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물)에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 제1 및 제2 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 아미노산 서열은 하기 서열의 군으로부터 선택되고:

i) 서열번호 2에 따른 아미노산 서열;

ii) 서열번호 3에 따른 아미노산 서열;

iii) 서열번호 5에 따른 아미노산 서열; 및

iv) 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 5와 적어도 80%의 서열 상동성을 보이는 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 5 중 어느 하나의 유도체,

본 발명의 폴리펩티드에 대해 상기 개시한 것은 Enterococcus 속의 박테리아에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드(및 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 그러한 핵산을 포함하는 벡터, 그러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및/또는 그러한 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물)에 대한 것으로 고려된다. 특히, 서열번호 5 및 그의 유도체에 대한 상세한 개시는 Enterococcus 속의 박테리아에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드의 실시양태로 고려된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물을 인간 또는 동물에 수행되는 수술 또는 요법 또는 진단 방법으로 인간 또는 동물을 치료하는 방법에서 사용하는 측면(예를 들어, 박테리아 감염의 치료 및 예방)에 관하여, 본 발명자들은 구체적으로 상기 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 조성물을 약 생리적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 7.6의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 사용하는 것을 고려한다.

본 발명은 또한 대상체에서 Enterococcus 속의 박테리아에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 대상체를 본 발명에 따른 폴리펩티드(또는 마찬가지로 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특히, 본 발명은 대상체에서 Enterococcus 속의 박테리아에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 대상체를 제1 및 제2 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 제1 아미노산 서열은 하기 서열의 군으로부터 선택된 서열이고:

i) 서열번호 2에 따른 아미노산 서열;

ii) 서열번호 3에 따른 아미노산 서열;

iii) 서열번호 5에 따른 아미노산 서열; 및

다시 말하자면, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 상기 개시는 폴리펩티드(및 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 조성물)가 상기 치료 방법으로 사용되는 것으로도 고려된다. 특히, 서열번호 5 및 그의 유도체에 대한 상세한 개시는 Enterococcus 속의 박테리아에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드의 실시양태로 고려된다.

본 발명에 따른 치료 방법과 관련하여, 본 발명자들은 또한 구체적으로 상기 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 조성물을 약 생리적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 7.6의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 사용하는 것을 고려한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 특히 병원내 환경 또는 의원에서 무생물 표면, 조성물, 및/또는 물건을 소독하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드(또는 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물)의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 이는 약 생리적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 7.6의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 이루어진다.

추가의 측면에서, 본 발명은 무생물 표면, 조성물, 및/또는 물건의 박테리아에 의한 오염을 방지하기 위한, 특히 Enterococcus faecalis 및/또는 Enterococcus faecium 박테리아에 의한 오염을 방지하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드(또는 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물)의 용도에 관한 것이다. 다시 말하지만, 이는 바람직하게 약 생리적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 7.6의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 이루어진다.

본 발명의 폴리펩티드에 대한 상기 개시는 본 발명에 따른 용도를 위한 것으로도 고려된다. 특히, 서열번호 5 및 그의 유도체에 대한 상세한 개시는 폴리펩티드가 사용되는 실시양태로 고려된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 특히 병원내 환경 또는 의원에서 무생물 표면, 조성물 및/또는 물건을 소독하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 무생물 표면, 조성물 및/또는 물건을 본 발명에 따른 폴리펩티드(또는 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 바람직하게 약 생리적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 7.6의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 수행된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 무생물의 표면, 조성물 및/또는 물건의 박테리아에 의한 오염을 방지, 특히 Enterococcus faecalis 및/또는 Enterococcus faecium 박테리아에 의한 오염을 방지하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 무생물 표면, 조성물 및/또는 물건을 본 발명에 따른 폴리펩티드(또는 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법 또한 바람직하게 약 생리적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 7.6의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 수행된다.

본 발명의 폴리펩티드에 대한 상기 개시는 본 발명의 소독 방법 및 본 발명의 오염 방지 방법을 위한 것으로도 고려된다. 특히, 서열번호 5 및 그의 유도체에 대한 상세한 개시는 폴리펩티드가 상기 방법에서 사용되는 실시양태로 고려된다.

실시예

하기에서는, 다양한 실시양태 및 본 발명의 측면을 설명하는 특정 실시예가 개시된다. 그러나, 본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태에 의해 그 보호범위가 한정되어서는 안된다. 실제로는 앞선 설명 및 하기 실시예로부터 통상의 기술자는 본원에 기술된 사항에 대한 본 발명의 다양한 변형을 손쉽게 할 수 있을 것이다. 그러한 모든 변형은 첨부된 특허의 보호범위에 속한다.

실시예 1: 야생형 엔도리신과 비교한 E .　 faecalis 박테리아에 대한 증가된 항균 활성

E. faecalis 박테리아를 밤새 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양하고, 동일한 배지에서 1:10으로 희석시켰다. 약 0.6의 광학 밀도 OD₆₀₀에서 박테리아를 펠렛화하였고(pelleted), 버퍼(10 mM HEPES, pH 7.4)로 세척하였으며, 동일한 버퍼로 1:10으로 희석시켰다. 50 μl의 박테리아 용액을 50 μl의 단백질 용액(20 mM HEPES, 300 mM NaCl 중 10 μg, pH 7.4) 또는 대조군(20 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 7.4)과 혼합하였다. 사용된 단백질은 서열번호 1에 따른 야생형 엔도리신(wt) 및 서열번호 93을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드였다. 샘플들을 60분 동안 섭씨 37도에서 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 희석되지 않은 샘플의 25 μl 및 1 x PBS 버퍼에서의 1:10 희석 시리즈들을 LB 한천 플레이트에 둘렀고 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다. 군집의 수를 세었고 성장 감소를 측정하였다.

하기 표 3은 야생형 엔도리신 및 본 발명에 따른 폴리펩티드와 함께 배양 후 E. faecalis HC-1909-5의 성장 감소를 보여준다. 엔도리신과 함께 배양한 것은 99.99%(4 log)의 박테리아 제거를 야기했다. 융합 단백질과 함께 배양한 후에는 99.999%(= 5 log) 초과를 달성했다. 네 개의 1:10 희석액은 5 log 감소의 한계를 측정하는 시험에 사용되었다.

[표 3]

실시예 2: 광범위한 pH 범위에서 야생형 엔도리신과 비교한 E .　 faecalis 박테리아에 대한 증가된 항균 활성

E. faecalis 박테리아를 밤새 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양하고, 동일한 배지에서 1:10으로 희석시켰다. 약 0.6의 광학 밀도 OD₆₀₀에서 박테리아를 펠렛화하였고(pelleted), 다른 버퍼들로 세척하였다. 사용된 버퍼는 다음과 같았다: pH 5 및 6에 대해서는 100 mM 말산 디소듐염, pH 7.4 및 pH 8에 대해서는 1 M Na₂HPO₄ 및 1 M NaH₂PO₄의 혼합물. 박테리아를 그 후 다른 버퍼들(상기 참조)로 1:10으로 희석하였다. 50 μl의 박테리아 용액을 50 μl의 단백질 용액(20 mM HEPES, 300 mM NaCl 중 10 μg, pH 7.4) 또는 대조군(20 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 7.4)과 혼합하였다. 사용된 단백질은 서열번호 1에 따른 야생형 엔도리신(wt) 및 서열번호 93을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드였다. 박테리아 및 단백질의 혼합 후 최종 pH 값은 다음과 같았다: pH 5.25, pH 6.5, pH 7.4 및 pH 7.75. 샘플들을 60분 동안 섭씨 37도에서 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 희석되지 않은 샘플의 25 μl 및 1 x PBS 버퍼에서의 1:10 희석 시리즈들을 LB 한천 플레이트에 둘렀고 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다. 군집의 수를 세었고 성장 감소를 측정하였다. 네 개의 1:10 희석액은 5 log 감소의 한계를 측정하는 시험에 사용되었다.

하기 표 4는 다른 pH에서 야생형 엔도리신 및 본 발명에 따른 폴리펩티드와 함께 배양 후 E. faecalis 균주 HC-1909-5의 성장 감소를 보여준다. 야생형 엔도리신의 경우 pH 5.25-pH 7.75에서 99-99.9%(2-3 log)의 박테리아 제거가 관찰되었고, 염기성 pH에서는 활성이 감소되었다. 융합 단백질에서는 99.99-99.997%(4-4.5 log)의 박테리아 제거가 달성되었고 염기성 pH에서는 아주 약간만 활성이 감소되었다.

[표 4]

유사한 결과(예를 들어, 광범위한 pH 범위에서 본질적으로 일정한 항-박테리아 활성, 특히 생리적 pH인 7.4에서 심각한 활성 손실 없음)가 본 발명의 다른 폴리펩티드들, 예컨대 추가적으로 His-태그(예를 들어, 서열번호 94 또는 서열번호 103)을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 1의 세포벽 결합 도메인(CBD) 및 추가적 효소성 도메인, 예를 들어 서열번호 104에 따른 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의해서도 달성되었다. 그러한 폴리펩티드의 예는 서열번호 105를 포함하는 폴리펩티드이다.

실시예 3: 다양한 세트의 Enterococci 균주에 대한 광범위한 항균 활성

박테리아를 밤새 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양하고, 동일한 배지에서 1:10으로 희석시켰다. 약 0.6의 광학 밀도 OD₆₀₀에서 박테리아를 펠렛화하였고(pelleted), 버퍼(10 mM HEPES, pH 7.4)로 세척하였으며, 동일한 버퍼로 1:10으로 희석시켰다. 50 μl의 박테리아 용액을 50 μl의 단백질 용액(20 mM HEPES, 300 mM NaCl 중 10 μg, pH 7.4) 또는 대조군(20 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 7.4)과 혼합하였다. 사용된 단백질은 서열번호 1에 따른 야생형 엔도리신(wt) 및 서열번호 93을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드였다. 샘플들을 60분 동안 섭씨 37도에서 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 희석되지 않은 샘플의 25 μl 및 1 x PBS 버퍼에서의 1:10 희석 시리즈들을 LB 한천 플레이트에 둘렀고 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다. 군집의 수를 세었고 성장 감소를 측정하였다. 네 개의 1:10 희석액은 5 log 감소의 한계를 측정하는 시험에 사용되었다.

하기 표 5는 다른 Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, 및 다른 Enterococcus 균주의 성장 감소를 보여준다. 평균적으로, 99.9987(4.9 log)의 박테리아 제거가 측정되었다.

[표 5]

SEQUENCE LISTING <110> Lysando AG <120> New antimicrobial agents against Enterococcus bacteria <130> LYS-044 PCT <150> EP16194788 <151> 2016-10-20 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 314 <212> PRT <213> Enterococcal bacteriophage phi1 <400> 1 Met Ser Asn Ile Asn Met Glu Thr Ala Ile Ala Asn Met Tyr Ala Leu 1 5 10 15 Lys Ala Arg Gly Ile Thr Tyr Ser Met Asn Tyr Ser Arg Thr Gly Ala 20 25 30 Asp Gly Thr Gly Asp Cys Ser Gly Thr Val Tyr Asp Ser Leu Arg Lys 35 40 45 Ala Gly Ala Ser Asp Ala Gly Trp Val Leu Asn Thr Asp Ser Met His 50 55 60 Ser Trp Leu Glu Lys Asn Gly Phe Lys Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu 65 70 75 80 Trp Ser Ala Lys Arg Gly Asp Val Val Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Gly Ser Ala Gly His Val Val Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln 100 105 110 Ile Ile His Cys Thr Trp Lys Ser Ala Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val 115 120 125 Asp Asn Glu Ala Thr Thr Cys Pro Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr 130 135 140 Arg Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val 145 150 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Ser Leu Arg Lys Ala Gly Ala 35 40 45 Ser Asp Ala Gly Trp Val Leu Asn Thr Asp Ser Met His Ser Trp Leu 50 55 60 Glu Lys Asn Gly Phe Lys Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu Trp Ser Ala 65 70 75 80 Lys Arg Gly Asp Val Val Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala Ser Gly Gly 85 90 95 Ser Ala Gly His Val Val Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln Ile Ile His 100 105 110 Cys Thr Trp Lys Ser Ala Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val Asp Asn Glu 115 120 125 Ala Thr Thr Cys Pro Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr Arg Leu Asn 130 135 140 Gly Gly Ser Thr Pro Pro 145 150 <210> 3 <211> 65 <212> PRT <213> Enterococcal bacteriophage phi1 <400> 3 Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr Thr Arg Lys Asn 1 5 10 15 Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu Tyr Pro Gly Gln 20 25 30 Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly Tyr Ile Trp Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro Val Gly Lys Glu 50 55 60 Ala 65 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Buforin II vertebrate <400> 4 Thr Arg Ser Ser Arg Ala 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Ranalexin Frog <400> 45 Phe Leu Gly Gly Leu Ile Val Pro Ala Met Ile Cys Ala Val Thr Lys 1 5 10 15 Lys Cys <210> 46 <211> 26 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Melittin bee <400> 46 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 47 <211> 25 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Lycotoxin 1 Spider <400> 47 Ile Trp Leu Thr Ala Leu Lys Phe Leu Gly Lys His Ala Ala Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ala Lys Gln Gln Leu Ser Lys Leu 20 25 <210> 48 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Parasin 1 Fish <400> 48 Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Ser <210> 49 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Buforin I Toad <400> 49 Ala Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg 20 25 30 Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr 35 <210> 50 <211> 34 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Dermaseptin 1 Frog <400> 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215 220 Glu Tyr Leu Ile Val Asn Lys Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu Ser 225 230 235 240 Gln Asp Ile Glu Gly Gly Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys 245 250 255 Pro Lys Leu Pro Ala Gly Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn 260 265 270 Gly Asn Ala Pro Ile Thr Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser 275 280 285 Gln Thr Ala Thr Pro Leu Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly 290 295 300 Trp Lys Ser Ala Glu Gly Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg 305 310 315 320 Tyr Ile Pro Val Arg Pro Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys 325 330 335 <210> 93 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcal bacteriophae phi1 endolysin plus Buforin II <400> 93 Met Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val 1 5 10 15 His Arg Leu Leu Arg Lys Gly Ser Ser Asn Ile Asn Met Glu Thr Ala 20 25 30 Ile Ala Asn Met Tyr Ala Leu Lys Ala Arg Gly Ile Thr Tyr Ser Met 35 40 45 Asn Tyr Ser Arg Thr Gly Ala Asp Gly Thr Gly Asp Cys Ser Gly Thr 50 55 60 Val Tyr Asp Ser Leu Arg Lys Ala Gly Ala Ser Asp Ala Gly Trp Val 65 70 75 80 Leu Asn Thr Asp Ser Met His Ser Trp Leu Glu Lys Asn Gly Phe Lys 85 90 95 Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu Trp Ser Ala Lys Arg Gly Asp Val Val 100 105 110 Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala Ser Gly Gly Ser Ala Gly His Val Val 115 120 125 Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln Ile Ile His Cys Thr Trp Lys Ser Ala 130 135 140 Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val Asp Asn Glu Ala Thr Thr Cys Pro Tyr 145 150 155 160 Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr Arg Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro 165 170 175 Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val Lys Val Leu Lys His Ala Thr Asn Trp 180 185 190 Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ala Lys Met Ala Ser Phe Val Lys Gly Gly 195 200 205 Thr Phe Glu Val Lys Gln Gln Arg Pro Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Asn 210 215 220 Gln Glu Tyr Leu Ile Val Asn Lys Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu 225 230 235 240 Ser Gln Asp Ile Glu Gly Gly Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser 245 250 255 Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile 260 265 270 Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser 275 280 285 Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu 290 295 300 Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly 305 310 315 320 Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe 325 330 335 Lys <210> 94 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcal bacteriophae phi1 endolysin plus Buforin II and HisTag <400> 94 Met Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val 1 5 10 15 His Arg Leu Leu Arg Lys Gly Ser Ser Asn Ile Asn Met Glu Thr Ala 20 25 30 Ile Ala Asn Met Tyr Ala Leu Lys Ala Arg Gly Ile Thr Tyr Ser Met 35 40 45 Asn Tyr Ser Arg Thr Gly Ala Asp Gly Thr Gly Asp Cys Ser Gly Thr 50 55 60 Val Tyr Asp Ser Leu Arg Lys Ala Gly Ala Ser Asp Ala Gly Trp Val 65 70 75 80 Leu Asn Thr Asp Ser Met His Ser Trp Leu Glu Lys Asn Gly Phe Lys 85 90 95 Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu Trp Ser Ala Lys Arg Gly Asp Val Val 100 105 110 Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala Ser Gly Gly Ser Ala Gly His Val Val 115 120 125 Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln Ile Ile His Cys Thr Trp Lys Ser Ala 130 135 140 Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val Asp Asn Glu Ala Thr Thr Cys Pro Tyr 145 150 155 160 Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr Arg Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro 165 170 175 Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val Lys Val Leu Lys His Ala Thr Asn Trp 180 185 190 Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ala Lys Met Ala Ser Phe Val Lys Gly Gly 195 200 205 Thr Phe Glu Val Lys Gln Gln Arg Pro Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Asn 210 215 220 Gln Glu Tyr Leu Ile Val Asn Lys Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu 225 230 235 240 Ser Gln Asp Ile Glu Gly Gly Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser 245 250 255 Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile 260 265 270 Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser 275 280 285 Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu 290 295 300 Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly 305 310 315 320 Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe 325 330 335 Lys Leu Glu His His His His His His 340 345 <210> 95 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding SEQ ID NO2 <400> 95 atcaatatgg aaaccgccat tgcaaatatg tatgcactga aagcacgtgg cattacctat 60 agcatgaatt atagccgtac cggtgcagat ggcaccggtg attgtagcgg caccgtttat 120 gatagcctgc gtaaagccgg tgcaagtgat gcaggttggg ttctgaatac cgatagcatg 180 catagctggc tggaaaaaaa tggctttaaa ctgattgccc agaacaaaga atggtcagca 240 aaacgtggtg atgtggtgat ttttggtaaa aaaggtgcaa gcggtggtag cgcaggtcat 300 gttgttatct ttattagcag cacccagatt attcactgta cctggaaaag cgcaaccgca 360 aatggtgttt atgttgataa tgaagcaacc acctgtccgt atagcatggg ttggtatgtt 420 tatcgtctga atggtggtag cacccctccg 450 <210> 96 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding SEQ ID NO:3 <400> 96 gaggccacct ttattaacgg caatgcaccg attaccaccc gtaaaaacaa accgagcctg 60 agcagccaga ccgcaacacc gctgtatccg ggtcagagcg ttcgttatct gggctggaaa 120 tcagcagaag gttatatttg gatttatgcc accgatggtc gttatattcc ggttcgtccg 180 gttggtaaag aagca 195 <210> 97 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding enterococcal phage phi1 endolysin w/o initial methionine <400> 97 agcaacatca atatggaaac cgccattgca aatatgtatg cactgaaagc acgtggcatt 60 acctatagca tgaattatag ccgtaccggt gcagatggca ccggtgattg tagcggcacc 120 gtttatgata gcctgcgtaa agccggtgca agtgatgcag gttgggttct gaataccgat 180 agcatgcata gctggctgga aaaaaatggc tttaaactga ttgcccagaa caaagaatgg 240 tcagcaaaac gtggtgatgt ggtgattttt ggtaaaaaag gtgcaagcgg tggtagcgca 300 ggtcatgttg ttatctttat tagcagcacc cagattattc actgtacctg gaaaagcgca 360 accgcaaatg gtgtttatgt tgataatgaa gcaaccacct gtccgtatag catgggttgg 420 tatgtttatc gtctgaatgg tggtagcacc cctccgaaac cgaataccaa aaaagttaaa 480 gttctgaaac acgccaccaa ttggagcccg agcagcaaag gtgccaaaat ggcaagcttt 540 gttaaaggtg gtacgtttga agttaaacag cagcgtccga ttagctacag ctatagcaat 600 caagaatatc tgatcgtgaa taaaggcacc gttctgggtt gggtgctgag ccaggatatt 660 gaaggtggtt atggtagcga tcgtgttggt ggtagtaaac cgaaactgcc tgcaggtttt 720 acaaaagaag aggccacctt tattaacggc aatgcaccga ttaccacccg taaaaacaaa 780 ccgagcctga gcagccagac cgcaacaccg ctgtatccgg gtcagagcgt tcgttatctg 840 ggctggaaat cagcagaagg ttatatttgg atttatgcca ccgatggtcg ttatattccg 900 gttcgtccgg ttggtaaaga agcatggggc acctttaaa 939 <210> 98 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding Buforin II vertebrate <400> 98 acccgtagct ctcgtgctgg cctgcagttt ccggttggtc gcgtgcaccg tctgctccgc 60 aaa 63 <210> 99 <211> 1011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding enterococcal bacteriophae phi1 endolysin plus Buforin II <400> 99 atgacccgta gctctcgtgc tggcctgcag tttccggttg gtcgcgtgca ccgtctgctc 60 cgcaaaggat ccagcaacat caatatggaa accgccattg caaatatgta tgcactgaaa 120 gcacgtggca ttacctatag catgaattat agccgtaccg gtgcagatgg caccggtgat 180 tgtagcggca ccgtttatga tagcctgcgt aaagccggtg caagtgatgc aggttgggtt 240 ctgaataccg atagcatgca tagctggctg gaaaaaaatg gctttaaact gattgcccag 300 aacaaagaat ggtcagcaaa acgtggtgat gtggtgattt ttggtaaaaa aggtgcaagc 360 ggtggtagcg caggtcatgt tgttatcttt attagcagca cccagattat tcactgtacc 420 tggaaaagcg caaccgcaaa tggtgtttat gttgataatg aagcaaccac ctgtccgtat 480 agcatgggtt ggtatgttta tcgtctgaat ggtggtagca cccctccgaa accgaatacc 540 aaaaaagtta aagttctgaa acacgccacc aattggagcc cgagcagcaa aggtgccaaa 600 atggcaagct ttgttaaagg tggtacgttt gaagttaaac agcagcgtcc gattagctac 660 agctatagca atcaagaata tctgatcgtg aataaaggca ccgttctggg ttgggtgctg 720 agccaggata ttgaaggtgg ttatggtagc gatcgtgttg gtggtagtaa accgaaactg 780 cctgcaggtt ttacaaaaga agaggccacc tttattaacg gcaatgcacc gattaccacc 840 cgtaaaaaca aaccgagcct gagcagccag accgcaacac cgctgtatcc gggtcagagc 900 gttcgttatc tgggctggaa atcagcagaa ggttatattt ggatttatgc caccgatggt 960 cgttatattc cggttcgtcc ggttggtaaa gaagcatggg gcacctttaa a 1011 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 His Pro Gln Tyr Asn Gln Arg 1 5 <210> 101 <211> 322 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcal bacteriophae phi1 endolysin plus peptide, w/o starting methionine <400> 101 Ser Asn Ile Asn Met Glu Thr Ala Ile Ala Asn Met Tyr Ala Leu Lys 1 5 10 15 Ala Arg Gly Ile Thr Tyr Ser Met Asn Tyr Ser Arg Thr Gly Ala Asp 20 25 30 Gly Thr Gly Asp Cys Ser Gly Thr Val Tyr Asp Ser Leu Arg Lys Ala 35 40 45 Gly Ala Ser Asp Ala Gly Trp Val Leu Asn Thr Asp Ser Met His Ser 50 55 60 Trp Leu Glu Lys Asn Gly Phe Lys Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu Trp 65 70 75 80 Ser Ala Lys Arg Gly Asp Val Val Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala Ser 85 90 95 Gly Gly Ser Ala Gly His Val Val Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln Ile 100 105 110 Ile His Cys Thr Trp Lys Ser Ala Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val Asp 115 120 125 Asn Glu Ala Thr Thr Cys Pro Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr Arg 130 135 140 Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val Lys 145 150 155 160 Val Leu Lys His Ala Thr Asn Trp Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ala Lys 165 170 175 Met Ala Ser Phe Val Lys Gly Gly Thr Phe Glu Val Lys Gln Gln Arg 180 185 190 Pro Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Asn Gln Glu Tyr Leu Ile Val Asn Lys 195 200 205 Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu Ser Gln Asp Ile Glu Gly Gly Tyr 210 215 220 Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly Phe 225 230 235 240 Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr Thr 245 250 255 Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu Tyr 260 265 270 Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly Tyr 275 280 285 Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro Val 290 295 300 Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys Gly Ser His Pro Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Gln Arg <210> 102 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcal bacteriophae phi1 endolysin plus peptide <400> 102 Met Ser Asn Ile Asn Met Glu Thr Ala Ile Ala Asn Met Tyr Ala Leu 1 5 10 15 Lys Ala Arg Gly Ile Thr Tyr Ser Met Asn Tyr Ser Arg Thr Gly Ala 20 25 30 Asp Gly Thr Gly Asp Cys Ser Gly Thr Val Tyr Asp Ser Leu Arg Lys 35 40 45 Ala Gly Ala Ser Asp Ala Gly Trp Val Leu Asn Thr Asp Ser Met His 50 55 60 Ser Trp Leu Glu Lys Asn Gly Phe Lys Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu 65 70 75 80 Trp Ser Ala Lys Arg Gly Asp Val Val Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Gly Ser Ala Gly His Val Val Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln 100 105 110 Ile Ile His Cys Thr Trp Lys Ser Ala Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val 115 120 125 Asp Asn Glu Ala Thr Thr Cys Pro Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr 130 135 140 Arg Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val 145 150 155 160 Lys Val Leu Lys His Ala Thr Asn Trp Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ala 165 170 175 Lys Met Ala Ser Phe Val Lys Gly Gly Thr Phe Glu Val Lys Gln Gln 180 185 190 Arg Pro Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Asn Gln Glu Tyr Leu Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu Ser Gln Asp Ile Glu Gly Gly 210 215 220 Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly 225 230 235 240 Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr 245 250 255 Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly 275 280 285 Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro 290 295 300 Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys Gly Ser His Pro Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Gln Arg <210> 103 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcal bacteriophae phi1 endolysin plus HisTag and peptide <400> 103 Met Ser Asn Ile Asn Met Glu Thr Ala Ile Ala Asn Met Tyr Ala Leu 1 5 10 15 Lys Ala Arg Gly Ile Thr Tyr Ser Met Asn Tyr Ser Arg Thr Gly Ala 20 25 30 Asp Gly Thr Gly Asp Cys Ser Gly Thr Val Tyr Asp Ser Leu Arg Lys 35 40 45 Ala Gly Ala Ser Asp Ala Gly Trp Val Leu Asn Thr Asp Ser Met His 50 55 60 Ser Trp Leu Glu Lys Asn Gly Phe Lys Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu 65 70 75 80 Trp Ser Ala Lys Arg Gly Asp Val Val Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Gly Ser Ala Gly His Val Val Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln 100 105 110 Ile Ile His Cys Thr Trp Lys Ser Ala Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val 115 120 125 Asp Asn Glu Ala Thr Thr Cys Pro Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr 130 135 140 Arg Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val 145 150 155 160 Lys Val Leu Lys His Ala Thr Asn Trp Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ala 165 170 175 Lys Met Ala Ser Phe Val Lys Gly Gly Thr Phe Glu Val Lys Gln Gln 180 185 190 Arg Pro Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Asn Gln Glu Tyr Leu Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu Ser Gln Asp Ile Glu Gly Gly 210 215 220 Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly 225 230 235 240 Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr 245 250 255 Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly 275 280 285 Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro 290 295 300 Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys Gly Ser His His His His 305 310 315 320 His His His Pro Gln Tyr Asn Gln Arg 325 <210> 104 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aa 2-242 of Streptococcus suis enzyme (WP_029171101.1); C136S <400> 104 Gly Val Asn Ile Glu Thr Ala Leu Arg Trp Met Ser Asp Arg Lys Gly 1 5 10 15 Arg Val Thr Tyr Ser Met Asp Tyr Arg Asn Gly Pro Asn Ser Phe Asp 20 25 30 Cys Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ser Ala Gly Ala Ile Ser 35 40 45 Ala Gly Trp Ala Val Asn Thr Glu Tyr Glu His Asp Trp Leu Leu Lys 50 55 60 Asn Gly Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Asn Thr Asp Trp Asp Ala Lys Arg 65 70 75 80 Gly Asp Ile Phe Ile Trp Gly Arg Arg Gly Gln Ser Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Gly His Thr Gly Ile Phe Ile Asp Pro Asp Asn Ile Ile His Cys Asn 100 105 110 Tyr Ala Arg Asn Ser Ile Thr Val Asp Asn Tyr Asn Gln Thr Ala Ala 115 120 125 Ala Ser Gly Trp Met Tyr Ser Tyr Val Tyr Arg Leu Ala Asn Gln Thr 130 135 140 Ser Thr Ala Gly Lys Ser Leu Glu Thr Leu Val Gln Glu Thr Leu Ala 145 150 155 160 Gly Lys Tyr Gly Asn Gly Asp Gln Arg Lys Ala Ala Leu Gly Asn Gln 165 170 175 Tyr Glu Ala Val Met Ala Val Ile Asn Gly Lys Ala Thr Ala Pro Lys 180 185 190 Lys Thr Val Asp Gln Leu Ala Gln Glu Val Ile Ala Gly Lys His Gly 195 200 205 Asn Gly Glu Ala Arg Lys Gln Ser Leu Gly Ala Asp Tyr Pro Ala Val 210 215 220 Gln Lys Arg Val Thr Glu Leu Leu Lys Lys Gln Pro Ser Glu Pro Ser 225 230 235 240 Lys <210> 105 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aa 2-242 of Streptococcus suis enzyme (WP_029171101.1); C136S, plus enterococcal bacteriophae phi1 endolysin CBD plus HisTag and peptide <400> 105 Met Gly Val Asn Ile Glu Thr Ala Leu Arg Trp Met Ser Asp Arg Lys 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Tyr Ser Met Asp Tyr Arg Asn Gly Pro Asn Ser Phe 20 25 30 Asp Cys Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Ala Leu Met Ser Ala Gly Ala Ile 35 40 45 Ser Ala Gly Trp Ala Val Asn Thr Glu Tyr Glu His Asp Trp Leu Leu 50 55 60 Lys Asn Gly Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Asn Thr Asp Trp Asp Ala Lys 65 70 75 80 Arg Gly Asp Ile Phe Ile Trp Gly Arg Arg Gly Gln Ser Ala Gly Ala 85 90 95 Gly Gly His Thr Gly Ile Phe Ile Asp Pro Asp Asn Ile Ile His Cys 100 105 110 Asn Tyr Ala Arg Asn Ser Ile Thr Val Asp Asn Tyr Asn Gln Thr Ala 115 120 125 Ala Ala Ser Gly Trp Met Tyr Ser Tyr Val Tyr Arg Leu Ala Asn Gln 130 135 140 Thr Ser Thr Ala Gly Lys Ser Leu Glu Thr Leu Val Gln Glu Thr Leu 145 150 155 160 Ala Gly Lys Tyr Gly Asn Gly Asp Gln Arg Lys Ala Ala Leu Gly Asn 165 170 175 Gln Tyr Glu Ala Val Met Ala Val Ile Asn Gly Lys Ala Thr Ala Pro 180 185 190 Lys Lys Thr Val Asp Gln Leu Ala Gln Glu Val Ile Ala Gly Lys His 195 200 205 Gly Asn Gly Glu Ala Arg Lys Gln Ser Leu Gly Ala Asp Tyr Pro Ala 210 215 220 Val Gln Lys Arg Val Thr Glu Leu Leu Lys Lys Gln Pro Ser Glu Pro 225 230 235 240 Ser Lys Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys Pro Lys Leu Pro Ala 245 250 255 Gly Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile 260 265 270 Thr Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro 275 280 285 Leu Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu 290 295 300 Gly Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg 305 310 315 320 Pro Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys Gly Ser His His His 325 330 335 His His His His Pro Gln Tyr Asn Gln Arg 340 345

Claims

서열번호 92, 93, 94, 101, 102, 103 및 105로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 Enterococcus 박테리아 또는 Enterococcus faecalis 및 Enterococcus faecium 박테리아 중 1종 이상의 펩티도글리칸을 분해하는 것인, 폴리펩티드.
제2항에 있어서, 폴리펩티드가 pH 7.4에서 서열번호 1을 갖는 야생형 효소보다 더 활성이거나, pH 7.4에서 pH 5.25에서와 비교할 때 본질적으로 동일 또는 증가된 활성을 보이거나, 둘 모두인, 폴리펩티드.
제1항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
제4항에 있어서, 조성물이 골시멘트이거나 생물재료를 포함하는 것인, 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 인간 또는 동물에 수행되는 수술 또는 요법 또는 진단 방법으로 인간 또는 동물을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
제6항에 있어서, 조성물이 박테리아 감염의 치료 또는 예방에 사용되는 것인, 조성물.
제7항에 있어서, 조성물이 Enterococcus faecalis 박테리아 또는 Enterococcus faecium 박테리아 또는 둘 모두에 의한 박테리아 감염의 치료 또는 예방에 사용되는 것인, 조성물.
제5항에 있어서, 조성물이 pH 7.4에서 사용되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서, 무생물 표면, 조성물 및 물건 중 하나 이상을 소독하기 위한, 조성물.
제4항에 있어서, 무생물 표면, 조성물, 및 물건 중 하나 이상의 박테리아에 의한 오염을 방지하기 위한, 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 조성물이 pH 7.4에서 사용되는 것인, 조성물.
제1항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
제13항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제1항에 따른 폴리펩티드, 제13항에 따른 핵산, 및 제14항에 따른 벡터 중 하나 이상을 포함하는 숙주세포.
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