JP2020510404A - エンテロコッカス属細菌に対する新規抗微生物剤 - Google Patents

エンテロコッカス属細菌に対する新規抗微生物剤 Download PDF

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Abstract

本発明はエンテロコッカス属細菌に活性のある抗微生物剤の分野に関する。特に本発明は、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列を含み、前記第１アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、およびこれらの誘導体、から選択され、また前記第２アミノ酸配列は、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチドまたはデフェンシンであることを特徴とするポリペプチドに関する。さらに、本発明はそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、および対応する宿主細胞に関連する。最後に、本発明は、本発明によるポリペプチド、核酸、ベクター、および／または、宿主細胞の、特に医薬分野での利用に関する。

Description

本発明はエンテロコッカス属細菌に活性のある抗微生物剤の分野に関する。特に、本発明は第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列を含み、前記第１アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、およびこれらの誘導体から選択される配列であり、また前記第２アミノ酸配列は、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンであることを特徴とするポリペプチドに関する。さらに、本発明は、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、および対応する宿主細胞に関連する。最後に、本発明は、本発明によるポリペプチド、核酸、ベクター、および／または、宿主細胞の、特に医薬分野での利用に関する。
細菌性病原体は人間の健康に深刻な脅威を与える。殺菌活性または静菌活性を有する様々な種類の薬剤（抗生物質、など）が当技術分野で知られているが、これらに対する微生物耐性、特に抗生物質に対する微生物耐性は確実に高まっている。健康上の懸念を与える病原体の１つにエンテロコッカス属に属するいくつかの細菌がある。これらの病原体は人間、特に院内環境（病院内の環境）にいる人間に、致命的な感染症を引き起こす虞がある。この場合、特に関連する細菌は、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）細菌とエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）細菌であって、これらは全感染症の90％以上を占める。エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）とエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）はグラム陽性菌であって、ヒトの下部腸管、口腔、および膣管に共生的にコロニーを形成する。健康な人の場合、エンテロコッカス・フェカーリス（E. faecalis）とエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）の定着は通常、宿主に悪影響を与えないが、腸球菌による高レベルの抗生物質耐性および毒性因子の獲得により、重篤な問題、特に免疫不全患者に重篤な問題が生じる可能性がある。腸球菌感染により引き起こされる一般的な疾患としては、心内膜炎、腹部膿瘍、菌血症、および尿路感染症が挙げられる。耐性化が高まるにつれ従来の抗生物質の有用性が低くなるため、特に院内環境（病院内の環境）におけるエンテロコッカス属(Enterococcus)細菌の細菌数をコントロールする新規抗微生物剤に一定の需要がある。
本発明は、エンドリシンなど細菌細胞壁を分解する酵素を利用している。エンドリシンはバクテリオファージ（または細菌ウイルス）により通常コードされるペプチドグリカン加水分解酵素である。それらは、ファージ増殖の溶菌サイクルにおいて後期遺伝子発現の間に合成され、かつ細菌ペプチドグリカンの分解を通して感染した細胞からの子孫ウイルス粒子の放出を媒介する。それらは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ムラミダーゼ（リゾチーム）、溶解性トランスグリコシラーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ、またはエンドペプチダーゼのいずれかである。エンドリシンの抗微生物適用は、Gasson（特許文献１）によって、既に1991年に示唆されていた。エンドリシンの殺傷能力は長期に渡って公知であったが、これらの酵素の抗菌薬としての使用は、抗生物質の成功と支配により無視されていた。多剤抗生物質耐性細菌の出現後に初めて、エンドリシンを用いてヒト病原体と戦うというこの単純な概念が注目を浴びた。全く新たなクラスの抗細菌剤を開発するというやむを得ない需要が生じ、「酵素」および「抗生物質」の混成用語である「エンザイビオティクス（enzybiotics）」として使用されるエンドリシンが、完全にこの需要を満たした。2001年に、Fischettiおよび共同研究者は、A群連鎖球菌（streptococcus）に対するバクテリオファージC1エンドリシンの治療的可能性を初めて実証した（（非特許文献１）、本明細書に参照として組み込まれる）。それ以来、多くの刊行物によって、グラム陽性細菌の細菌感染症を制御するための魅力的かつ相補的な代替物としてのエンドリシンが確立されている。続いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（非特許文献２）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）（非特許文献３）、S.アガラクチエ（S. agalactiae）（非特許文献４）、およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（非特許文献５）などの他のグラム陽性病原体に対する様々なエンドリシンが、エンザイビオティクスとしてのそれらの効力を証明した。
当分野では、エンドリシンとさらなるアミノ酸配列ストレッチの組み合わせが、新規な抗微生物剤を創造するものとして記載されている。特許文献２（参照により本明細書に組み込まれる）には、ペプチドがエンドリシンの誘導体と融合することにより、種々の細菌に活性が示されることが開示されている。しかし、エンテロコッカス属(Enterococcus)細菌については、このような融合について具体的な記載はなかった。
したがって、グラム陽性菌に対し活性のある新規な抗菌剤に一定の需要が存在する。特に、エンテロコッカス属に属する細菌に活性のある抗菌剤に需要がある。好ましくは、上記の薬剤はエンテロコッカス菌株からなる多様な集合に対して活性があり、高い活性を呈し、および／または、例えば、十分なｐＨ耐性を有することで、医療技術および薬学的な用途において幅広い有用性を可能にする。
英国特許第２２４３６１１号明細書 国際公開第２０１０／１４９７９５号
Nelson et al., 2001, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:4107-4112 Loeffler et al., 2001，Science 294:2170-2172 Schuch et al., 2002；Nature 418:884-889 Cheng et al., 2005；Antimicrob Agents Chemother. 2005 Jan;49(1):111-117 Rashel et al, 2007; J Infect Dis. 2007 Oct 15;196(8):1237-1247
本目的は、下記の特許請求の範囲において定義される事項により解決される。
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、特に、特定の配列においてペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基からなるポリマーを指す。ポリペプチドのアミノ酸残基は、例えば、炭水化物およびリン酸などの種々の基の共有結合性付加によって修飾されてもよい。ヘムまたは脂質など、他の物質がより緩やかにポリペプチドと会合してもよく、本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語にまた含まれる複合ポリペプチドを生じさせる。本明細書に用いられる当該用語にはタンパク質も含まれる。したがって、「ポリペプチド」の用語は、例えば２以上のアミノ酸ポリマー鎖からなる錯体も含まれている。「ポリペプチド」との用語には、当技術分野で通常用いられる任意選択的な修飾、例えば、ビオチン化、アセチル化、ＰＥＧ化、または、アミノ基、ＳＨ基、またはカルボキシル基（保護基など）、等の化学変化を呈する、ポリペプチドに係る実施形態も含まれている。以下の詳細な説明から明らかになるように、本発明に係るポリペプチドは、非天然由来のポリペプチドであってもよい。例えば、本発明に係るポリペプチドは少なくとも２つのアミノ酸配列が組み合わされた融合タンパク質とすることができ、天然でこの組み合わせは起こらない。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、特定の長さを有するアミノ酸ポリマー鎖に限定されないが、通常は、ポリペプチドは、約５０以上のアミノ酸、約１００以上のアミノ酸、またはさらに約１５０以上のアミノ酸からなる長さを呈する。必ずではないが、通常は、本発明の典型的なポリペプチドは、アミノ酸の長さが約７５０を超えないであろう。
本明細書で使用される「エンドリシン」という用語は、細菌細胞壁を加水分解するのに適したバクテリオファージ由来の酵素を指す。「エンドリシン」は、以下の活性のうち少なくとも1つの活性を有する少なくとも1つの「酵素学的活性ドメイン」（ＥＡＤ）を含む：エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、Ｔ４様ムラミニダーゼ、λ様ムラミニダーゼ、Ｎ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｃ）、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｍ）、Ｎ−アセチル−ムラミダーゼ（リゾチーム）、Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（リゾチーム）またはトランスグリコシラーゼ。加えて、エンドリシンにはまた、酵素学的に不活性であり、かつ宿主細菌の細胞壁に結合する領域である、いわゆるＣＢＤ（細胞壁結合ドメイン）が含まれていてもよい。「エンドリシン」という用語には、天然由来のエンドリシンに修飾、および／または、改変が加わる酵素も含まれる。このような改変および／または修飾には、欠失、挿入および付加などの変異、これらの置換もしくは組み合わせ、および／または、アミノ酸残基の化学的変化が含まれる場合がある。特に好ましい化学的変化は、ビオチン化、アセチル化、ペグ化などの化学的変化、アミノ基、ＳＨ基、もしくはカルボキシル基の化学的変化である。上記エンドリシンは、一般的なレベルでそれぞれの野生型エンドリシンの溶解活性を呈する。しかしながら、この活性は、それぞれの野生型エンドリシンの活性と同一であるか、より高いか、またはより低い場合がある。この活性は、例えば、それぞれの野生型エンドリシンの活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、もしくは約２００％、またはさらにそれ以上であり得る。活性は当技術分野で当業者に周知であるアッセイ、例えば、Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007)またはDonovan DM, Lardeo M, Foster-Frey J. FEMS Microbiol Lett. 2006 Dec;265(1)または同様の刊行物に記載されている、例えば抗菌アッセイなどを用いて測定することができる。
本明細書で用いられる「誘導体」との用語は、それぞれのリファレンス配列と比較して、一以上の付加、欠失、挿入、および／または、置換、およびこれらの組み合わせを呈するアミノ酸配列のことを指す。これには、例えば、欠失／挿入、挿入／欠失、欠失／付加、付加／欠失、挿入／付加、付加／挿入、等の組み合わせが含まれる。当業者であれば、誘導体配列において、レファレンス配列のそれぞれ同じ位置に存在するアミノ酸残基とは異なる、誘導体配列の特定の位置におけるアミノ酸残基の存在は、同じ位置における欠失とそれに続く挿入からなる組み合わせなどではなく、本明細書で定められた置換であることを理解するであろう。むしろ、付加、欠失、および置換からなる一以上の組み合わせについて言及される場合には、配列中の異なる位置における変化の組み合わせは、例えば、N末端部での付加や配列内での欠失について意図している。このようにして得られた配列は各レファレンス配列、例えばある所定の配列番号に対して、一定レベルの配列同一性を呈し、これは好ましくは、少なくとも６０％であることが好ましく、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。好ましい誘導体は親分子のフラグメントであって、例えば親分子の活性を保持し、つまり一般的なレベルでそれぞれの親分子と同じ活性を呈している所定の配列番号である。しかし、上記の活性は、それぞれの親分子と同じとするか、親分子より高くするか、または低くすることができる。また親配列内での保存的アミノ酸置換から生じる誘導体もまた好ましく、例えば、所定の配列番号に対し、一般的なレベルで親分子の活性を保持している誘導体などである。
本明細書において、「〜％の配列同一性」とは以下の通りに理解される。つまり、比較される２つの配列を並べて、配列同士に最大の相関関係が得られるようにする。これには一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入することで、アライメントの大きさを高めることが含まれる場合がある。配列同一性％はその後、比較される配列の各々の全長にわたって決定（グローバルアラインメントと呼ばれる）してもよく、これは同じ又は類似する長さの配列に対して特に好適であり、あるいは短い所定の長さにわたって決定（ローカルアラインメントと呼ばれる）することができて、これは長さが異なる配列に対してより好適である。この意味で、クエリーアミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、クエリーアミノ酸配列に含まれる１００個のアミノ酸に対して、対象となるアミノ酸配列に最大で５回のアミノ酸改変が含まれていることを除いて、対象となるアミノ酸配列の配列がクエリー配列と同一であることを意図している。言い換えると、クエリーアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を持つアミノ酸配列を得るためには、対象となる配列に最大で５％（１００のうち５）のアミノ酸残基を挿入するか、他のアミノ酸で置換するか、または欠失させることができる。２以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当技術分野で周知の通りである。２つの配列の同一性の割合は、数学的アルゴリズムなどを利用することで判断可能である。限定されわけではないが、利用可能な好ましい数学的アルゴリズムの例としては、Karlinらのアルゴリズム（(1993),PNASUSA,90:5873-5877）がある。このようなアルゴリズムはBLASTファミリーのプログラム、例えばBLASTまたはNBLASTのプログラムに組み込まれており（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 or Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402を参照のこと）、NCBLのホームページ（ワールド・ワイド・ウェブサイト「ncbi.nlm.nih.gov」）からアクセス可能であって、またFASTA（(Pearson (1 990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.）にも組み込まれている。他の配列に対してある程度の同一性を有する配列は、これらのプログラムを用いて同定することができる。さらに、ウィスコンシン配列分析パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）のバージョン9.1で利用可能なプログラム（Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395）、例えばBESTFITおよびGAPのプログラムを利用することで２つのポリペプチド配列の同一性％を判断することができる。BESTFITは（SmithおよびWaterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.）の「局所ホモロジー」アルゴリズムを利用し、２つの配列の中で最も類似する単一領域を見出す。本明細書において、レファレンス配列と特定の長さの配列同一性を共有するアミノ酸配列について言及される場合、配列における上記の違いは、好ましくは保存的アミノ酸置換から生じるものである。好ましくは、そのような配列は、例えば、たとえより遅い速度であたっとしても、レファレンス配列の活性を保持している。さらに本明細書において一定割合の配列同一性を「少なくとも」共有する配列について言及されている場合には、100％の配列同一性は、好ましくは含まれない。
本明細書で用いられる「保存的アミノ酸置換」は、十分に類似する物理化学特性を有するアミノ酸からなるグループの中で行ってもよく、当該グループのメンバー間の置換が、分子の生物活性を保存するようになっている（例えば、Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864を参照のこと）。特に、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、アミノ酸が同じクラスのアミノ酸（例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、脂肪族側鎖を持つアミノ酸、正または負に荷電した側鎖を持つアミノ酸、側鎖に芳香族基を持つアミノ酸、アミノ酸の側鎖が水素ブリッジに侵入可能な、例えば、ヒドロキシル官能基をもつ側鎖を有するアミノ酸など）に由来するような置換である。この場合の保存的置換とは、例えば、塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ）を別の塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ）で置換すること、脂肪族アミノ酸残基（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ｌｉｅ）を別の脂肪族アミノ酸残基で置換すること、芳香族アミノ酸残基（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）を別の芳香族アミノ酸残基で置換すること、トレオニンをセリンもしくはロイシンで置換すること、スレオニンをセリンによって、またはロイシンをイソロイシンによって置換することである。さらなる保存的アミノ酸交換が、当業者に公知であろう。
本明細書において使用される「欠失」という用語は、好ましくは、配列内（intrasequentially）またはＮ末端もしくはＣ末端のいずれかでの、それぞれのレファレンス配列と比較した、誘導配列における１、２、３、４、５個の（またはさらに５個より多い）連続したアミノ酸残基の欠如を指す。本発明の誘導体は、このような欠失を２以上呈している場合がある。
本明細書において使用される「挿入」という用語は、好ましくは、それぞれのレファレンス配列と比較した、誘導配列における１、２、３、４、５個の（またはさらに５個より多い）連続したアミノ酸残基の付加的な配列内の存在を指す。本発明の誘導体は、このような挿入を２以上呈している場合がある。
本明細書において使用される「付加」という用語は、好ましくは、それぞれのレファレンス配列と比較した、誘導配列のＮ末端および／またはＣ末端での１、２、３、４、５個の（またはさらに５個より多い）連続したアミノ酸残基の付加的な存在を指す。
本明細書において使用される「置換」という用語は、レファレンス配列の対応する位置に存在しているかまた存在していないアミノ酸残基とは異なる、誘導配列のある特定の位置のアミノ酸残基の存在を指す。本発明の誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の置換を呈する場合がある。上述のように、好ましくは、そのような置換は保存的置換である。
本明細書で用いられる「第２アミノ酸配列」との用語は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内にあるアミノ酸配列のことを指す。上記配列は、カチオン性ペプチド、カチオン性ポリペプチド、両親媒性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、および／または、抗微生物ペプチドからなる配列とすることができる。当該用語は、Ｈｉｓ５−タグ、Ｈｉｓ６−タグ、Ｈｉｓ７−タグ、Ｈｉｓ８−タグ、Ｈｉｓ９−タグ、Ｈｉｓ１０−タグ、Ｈｉｓ１１−タグ、Ｈｉｓ１２−タグ、Ｈｉｓ１６−タグ、およびＨｉｓ２０−タグなどのＨｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ａｖｉ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｇｓｔ−タグ、ＪＳ−タグ、システイン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、もしくは当技術分野において公知である他のタグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のような慣習的なタグを指さない。好ましくは、第２アミノ酸配列は、少なくとも約６から最大で約５０までのアミノ酸残基の長さ、好ましくは最大で約３９までのアミノ酸残基の長さを有する。好ましくは、第２アミノ酸配列は第１アミノ酸配列に対して異種配列であって、例えば、この２つのアミノ酸配列が、１つのポリペプチドの中に自然界で同時に発生することはない。さらに第２アミノ酸配列そのものが下記の酵素の活性のうちいずれかを提供することはない。エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、Ｔ４様ムラミニダーゼ、λ様ムラミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｃ）、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｍ）、Ｎ−アセチル−ムラミダーゼ（リゾチーム）、Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ、または、トランスグリコシラーゼ。通常は、第２アミノ酸ストレッチは酵素活性を一切提供しない。
本明細書で用いられる「第１アミノ酸配」および「第２アミノ酸配列」との用語は、本発明のポリペプチド内の配列に関する決まった順序を意味するものではなく、すなわち第２アミノ酸配列は、第１アミノ酸配列のN末端に存在してもよく、または第１アミノ酸配列のC末端に存在してもよい。さらなる配列因子、例えば介在配列因子が存在してもよい。
本明細書で使用される「カチオン性ペプチド」という用語は、好ましくは、正に荷電したアミノ酸残基を有するペプチドを指す。好ましくは、カチオン性ペプチドは、9.0またはそれより大きいｐＫａ値を有する。通常は、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基のうちの少なくとも４個が、正に荷電し得、例えば、リシンまたはアルギニンであり得る。「正に荷電した」とは、ほぼ生理学的条件で正味の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を指す。本明細書において使用される「カチオン性ペプチド」という用語はまた、ポリカチオン性ペプチドも指すが、例えば、２０％未満、好ましくは１０％未満の正に荷電したアミノ酸残基を含むカチオン性ペプチドもまた含む。
本明細書において使用される「ポリカチオン性ペプチド」という用語は、好ましくは、大部分が正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリシンおよび／またはアルギニン残基で構成されているペプチドを指す。アミノ酸残基の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％が、正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリシンおよび／またはアルギニン残基である場合に、ペプチドは、大部分が正に荷電したアミノ酸残基で構成されている。正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、および／または負に荷電したアミノ酸残基、および／または疎水性アミノ酸残基であり得る。好ましくは、正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、とりわけセリンおよび／またはグリシンである。
本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」（ＡＭＰ）という用語は、好ましくは、例えば、細菌、ウイルス、真菌、酵母、マイコプラズマ、および原生動物に対して殺微生物活性および／または静微生物（microbistatic）活性を有する、あらゆる天然由来のペプチドを指す。したがって、本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」という用語は、とりわけ、抗細菌、抗真菌、抗糸状菌、抗寄生生物、抗原生動物、抗ウイルス、抗感染性、抗伝染性、および／または殺菌、殺藻、殺アメーバ、殺微生物、殺細菌、殺真菌、殺寄生生物、殺原生動物、殺原虫特性を有する任意のペプチドを指す。抗細菌ペプチドが、好ましい。抗微生物ペプチドは、RNアーゼAスーパーファミリーのメンバー、デフェンシン、カテリシジン、グラニュライシン、ヒスタチン、ソリアシン（psoriasin）、ダームシジン、またはヘプシジンであり得る。抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗微生物ペプチドは、ラディッシュ、カイコガ、コモリグモ、カエル、好ましくはアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、アカガエル属のカエル、より好ましくはウシガエル（Rana catesbeiana）、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエル（Bufo gargarizans）、ハエ、好ましくはショウジョウバエ属（Drosophila）、より好ましくはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ミツバチ、マルハナバチ（bumblebee）、好ましくはマルハナバチ（Bombus pascuorum）、ニクバエ、好ましくはセンチニクバエ（Sarcophaga peregrine）、サソリ、カブトガニ、ナマズ（catfish）、好ましくはマナマズ（Parasilurus asotus）、雌牛、豚（pig）、ヒツジ、ブタ（porcine）、ウシ、サル、およびヒトに天然に存在し得る。本明細書では、「抗微生物ペプチド」（AMP）は、とりわけ、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、デフェンシン、および疎水性ペプチドではないが、それにもかかわらず抗微生物活性を呈するペプチドであり得る。
本明細書において使用される「スシペプチド」という用語は、短いコンセンサスリピートを有する補体制御タンパク質（CCP）を指す。スシペプチドのスシモジュールは、多くの異なるタンパク質においてタンパク質-タンパク質相互作用ドメインとして機能する。スシドメインを含有するペプチドは、抗微生物活性を有することが示されている。好ましくは、スシペプチドは、天然に存在するペプチドである。
本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト内に存在するペプチドを指し、デフェンシンは、感染性細菌および／または感染性ウイルスおよび／または真菌などの、外来性物質の破壊システムとしての自然宿主防御系において役割を果たす。デフェンシンは、抗体でない殺微生物、および／または、殺腫瘍性のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。「デフェンシン」の例は、「哺乳動物デフェンシン」、α−デフェンシン、β−デフェンシン、インドリシジン、およびマガイニンである。本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物細胞から単離された形態、または合成的に産生された形態の両方を指し、かつまた、それらの親タンパク質の細胞傷害活性を実質的に保持するが、その配列が１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入または欠失によって変更されている変異体も指す。
本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性官能基および疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。好ましくは、本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性基および疎水性基の規定された配置を有するペプチドを指し、例えば、両親媒性ペプチドは、例えばαヘリックス状であってもよく、主にヘリックスの一方の側に沿って非極性側鎖を有し、残りの表面に沿って極性残基を有する。
本明細書において使用される「疎水性基」という用語は、好ましくは、実質的に水に不溶性であるが、油相において可溶性であり、油相における溶解性が水または水相におけるものよりも高い、アミノ酸側鎖などの、化学基を指す。水中において、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基は、互いに相互作用して非水性環境を形成する。疎水性側鎖を有するアミノ酸残基の例は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、およびプロリン残基である。
本明細書において使用される「疎水性ペプチド」という用語は、好ましくは疎水性基を有するアミノ酸残基で大部分が構成されている疎水性ペプチドを指す。そのようなペプチドは、好ましくは、大部分が疎水性アミノ酸残基で構成されており、すなわち、アミノ酸残基の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも約１００％が、疎水性アミノ酸残基である。疎水性ではないアミノ酸残基は、好ましくは中性であり、好ましくは親水性ではない。
本明細書で「タグ」という用語は、当技術分野において典型的に、a）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の発現を改善する、b）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の精製を容易にする、c）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の固定化を容易にする、および／またはd）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の検出を容易にするために、別のアミノ酸配列に融合されるかまたはそれに含まれる、アミノ酸配列を指す。タグの例は、His5-タグ、His6-タグ、His7-タグ、His8-タグ、His9-タグ、His10-タグ、His11-タグ、His12-タグ、His16-タグ、およびHis20-タグなどのHisタグ、Strep-タグ、Avi-タグ、Myc-タグ、GST-タグ、JS-タグ、システイン-タグ、FLAG-タグ、HA-タグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（MBP）、CAT、GFP、YFPなどである。当業者は、様々な技術的応用に適する莫大な数のタグを知っているであろう。タグは、例えば、そのようなタグ付加されたポリペプチドを、例えば、様々なELISAアッセイ形式における抗体結合または他の技術的応用に適するようにさせることができる。
本明細書において「略生理的なｐＨ」とは、６．５を超えるｐＨ、特に約６．７５から約８．５までの範囲にあるｐＨ、より好ましくは７から７．７５までのｐＨ、さらにより好ましくは７．２から７．６までのｐＨ、これよりさらに好ましくは７．３から７．５までのｐＨを指すものと意図している。最も好ましくは、生理的なｐＨは、約７．４のｐＨである。
本明細書において使用される「含む」という用語は、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）の意味に限定されると解釈されることはない。むしろ、「含む」とは、任意で追加的なものが存在し得ることを暗示する。「含む」という用語は、その範囲内に入る特に構想される態様として、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）および「含むがそれからならない」（すなわち、追加的な他のものの存在を必要とする）を包含し、前者がより好ましい。
本発明の発明者らは、配列番号１で示されるエンドリシン、およびその誘導体、例えば「酵素的に活性のあるドメイン」（ＥＡＤ；配列番号２）または細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ、配列番号３）などは、特定タイプのペプチド、例えば配列番号４または配列番号１００で示される抗微生物ペプチドと組み合わさることにより、エンテロコッカス属に属する細菌に対する抗微生物剤を設計する上で、非常に有用な構成成分となることを、驚くべきことに見出した。この種の化合物は例えば大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis bacteria）に対して高い有用性と活性を示し、また野生型エンドリシン（即ち配列番号１）よりもＰＨ耐性がある。本発明の特に好ましいポリペプチドは、特に生理的なｐＨ（例えば約７．４）において野生型エンドリシン（即ち配列番号１）よりも活性が高く、好ましくは生理的なｐＨにおいて、より酸性度の高いｐＨ（例えば、ｐＨ５．２５またはｐＨ６）のときと比べて同程度か、またはより活性の高い活性を有する。
したがって、本発明は第１の態様において、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列を有するポリペプチドに関し、前記第１アミノ酸配列は以下の配列：
ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、および、
ｉｖ）配列番号２、配列番号３、または配列番号５の何れか１つの誘導体であって、配列番号２、配列番号３、または配列番号５に対してそれぞれ少なくとも８０％の配列同一性を呈する誘導体、
からなる群から選択される配列であり、また
前記第２アミノ酸配列は、抗微生物ペプチド，両親媒性ペプチド，カチオン性ペプチド，疎水性ペプチド，スシペプチドまたはデフェンシンであることを特徴とする。
最も好ましくは、本発明のポリぺプチドに係る第１アミノ酸配列は、
以下の配列：
ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、および
ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、
からなる群から選択される配列である。
本発明のポリペプチドにＣＢＤが含まれる（例えば配列番号３またはその誘導体が含まれる）実施形態では、前記ポリペプチドは、細菌細胞壁、特にグラム陽性菌の細胞壁を分解可能な酵素のアミノ酸配列をさらに含んでいることが好ましい。上記酵素は例えば脊椎動物リゾチーム（例えば、ヒトリゾチームまたはニワトリ卵白リゾチーム）とすることができるが、好ましくは、エンドリシン、オートリシン、またはバクテリオシン（例えば、リソスタフィンなど）である。Ｄｏｎｇらは既に、配列番号１で示される細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）は、リシンＰｌｙ１８７の触媒ドメイン（１−１５７ａａ）など、他の多くの溶解酵素配列に融合可能であることを実証している（Microb Biotechnol. 2015 Mar;8(2):210-20）。当該酵素は、酵素的に活性のある、ブタ連鎖球菌（Streptococcus suis）のホリンのサブユニットとすることもできる。リシンＰｌｙ１８７の触媒ドメイン（１−１５７ａａ）またはＮＣＢＩリファレンス配列ＷＰ＿０２９１７１１０１．１のアミノ酸２−２４２およびこれらの誘導体（例えば配列番号１０４など）をカバーする領域は、配列番号３またはその誘導体と組み合わせて使用される、本発明で考えられる実施形態である。一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、例えば配列番号１０４で示されるアミノ酸配列を含んでいるか、または配列番号１０４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７、５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％よりも大きい配列同一性を呈する、配列番号１０４の誘導体を含んでいる。しかし、最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２に加えて、配列番号３、またはこれらの誘導体を含んでいる。
配列番号２、配列番号３、または配列番号５の誘導体はそれぞれ、配列番号２、配列番号３、または配列番号５に対して、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも８７、５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超える配列同一性を呈する。
本明細書で議論されるすべての実施形態において、本発明のポリペプチドに配列番号１の誘導体が含まれていることが特に好ましい。
配列番号1の特に有用な誘導体は、
配列番号５（配列番号１のＮ末端メチオニンが欠失している）およびこれらの誘導体に加えて、配列番号２もしくは配列番号３、またはこれらの誘導体が含まれる、配列番号１の切断配列を持つポリペプチドである。これらすべての実施形態に共通していることは、本発明のペプチドには、配列番号１のアミノ酸配列が含まれないことである。
本発明に係る第２アミノ酸配列は、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチドまたはデフェンシンからなる群から選択される。
カチオン性／ポリカチオン性のアミノ酸配列の例は下記の表に記載されている。
Figure 2020510404
本発明を実施可能な抗菌性のアミノ酸配列の例は下記の表に記載されている。
Figure 2020510404
Figure 2020510404
 第２アミノ酸配列ストレッチは、Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19. 「The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria」に記載されているスシペプチドとすることができる。特に好ましいのは、配列番号８４に示されるスシ１ペプチドである。他の好ましいスシペプチドは、スシペプチドＳ１およびスシペプチドＳ３、ならびにその多数体（multiple）である；（Tanら、FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13。
好ましい疎水性ペプチドは、配列番号８５で示されるアミノ酸配列を有するワルマフ（Walmagh）１、およびアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号８６）を有する疎水性ペプチドである。
好ましい両親媒性ペプチドは、配列番号８７で示されるＴ４リゾチームのα４ヘリックス、および配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有するＷＬＢＵ２−バリアント、および配列番号８９で示されるワルマフ２である。
最も好ましくは、第２アミノ酸配列は配列番号４または配列番号１００で示されるアミノ酸配列である。例えば、本発明に係るポリペプチドには、第１アミノ酸配列として配列番号５またはその誘導体が含まれ、また第２アミノ酸配列として配列番号４が含まれる場合がある。同様にして、本発明に係るポリペプチドには、第１アミノ酸配列として配列番号５またはその誘導体が含まれ、また第２アミノ酸配列として配列番号１００が含まれる場合がある。本発明に係るポリペプチドは、場合によっては、第１アミノ酸配列として配列番号３もしくはその誘導体が含まれ、また第２アミノ酸配列として配列番号１００が含まれる場合がある。
本発明のポリペプチドにある第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の配列に関し、第２アミノ酸配列が第１アミノ酸配列のＮ末端に配置されていることが好ましい。好ましくは、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列は互いに直接結合されているか、または１〜１０までのアミノ酸残基、好ましくは１〜５までのアミノ酸残基、より好ましくは１〜２までのアミノ酸残基を持つ短いリンカーを介して結合されている。リンカー配列は、好ましくは一以上のグリシン残基を有するフレキシブル配列である。このようなリンカーの例として、グリシン／セリンリンカー、ＧＧＧＧＳ（配列番号９０）の配列がある。
特に、本発明のポリペプチドが宿主細胞により組換えで発現される場合、本発明のポリペプチドがＮ末端にメチオニン残基を含むのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、１つまたは複数のタグ配列を追加的に含み得る。このようなタグ配列は、例えば、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置していてもよい。好ましい実施形態では、１つまたは複数のタグ配列は、ポリペプチドのＣ末端側に位置しており、例えばＣ末端に直接配置されている。１つまたは複数のタグ配列は、本発明のポリペプチドの残りの部分に、例えば直接または短いリンカーを介して連結されていてもよい（上を参照）。タグについての多数の例が、当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかは、既に上述されている。本発明の文脈において、特に好ましいタグ配列は、Ｈｉｓ−タグ、好ましくは配列番号９１記載のＨｉｓタグである。
本発明によるポリペプチドの長さは、原則として限定されていないが、好ましくは、長さは過度に長くはない。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、約４００アミノ酸を超えない、好ましくは約３５０アミノ酸を超えない全体の長さを有する。
本発明に係る好ましいポリペプチドには配列番号９２が含まれ、例えば配列番号９３を含むポリペプチドまたは配列番号９４を含むポリペプチドである。また配列番号９２、配列番号９３および配列番号９４の誘導体も考えられ、例えばそれぞれの誘導体は、それぞれのレファレンス配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する。本発明のさらに好ましいポリペプチドは、配列番号１０１のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは配列番号１０１に対し少なくとも８０％の配列同一性を呈する前記ポリペプチドの誘導体、配列番号１０２のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは配列番号１０２に対し少なくとも８０％の配列同一性を呈する前記ポリペプチドの誘導体、配列番号１０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは配列番号１０３に対し少なくとも８０％の配列同一性を呈する前記ポリペプチドの誘導体、配列番号１０４のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは配列番号１０４に対し少なくとも８０％の配列同一性を呈する前記ポリペプチドの誘導体、または配列番号１０５のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは配列番号１０５に対し少なくとも８０％の配列同一性を呈する前記ポリペプチドの誘導体である。
本発明に係るポリペプチドは、好ましくはエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）細菌のペプチドグリカンを分解する機能により特徴づけられる。酵素が活性的な場合にはペプチドグリカン層の分解により混濁が下がり、これは光学的に測定することができる（例えば、Ｂｒｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０： ５３１−５３３， （２００７）を参照のこと）。
本発明はまた本発明の一以上のポリペプチドをコードする核酸にも関する。本発明の核酸は核酸として考えられるすべての形態をとりえる。特に、本発明による核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらのハイブリッドであり得る。これらは一本鎖でも二本鎖でも構わない。これらは小さな転写物のサイズ、またはバクテリオファージゲノムなど全ゲノムのサイズを有していても構わない。本明細書において、本発明の一以上のポリペプチドをコードする核酸は、センス鎖を反映している核酸とすることができる。同様にして、アンチセンス鎖もまた包含されている。核酸には、本発明のポリペプチドの発現のために異種プロモーターが包含されていてもよい。
本発明に係る核酸には、ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、ｉｖ）誘導体であって、ｉ）、ｉｉ）、またはｉｉｉ）とそれぞれ少なくとも８０％の配列同一性を呈するｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）の何れか１つの誘導体、からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする第１核酸配列と、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチドまたはデフェンシンをコードする第２核酸配列と、が含まれる。
好ましくは、本発明の核酸には、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は含まれない。
本発明の核酸には、ｉ）配列番号９５で示される核酸配列、ｉｉ）配列番号９６で示される核酸配列、ｉｉｉ）配列番号９７で示される核酸配列、およびｉｖ）配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７と同じアミノ酸配列をそれぞれコードする、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７の何れか１つの誘導体、からなる群から選択される少なくとも１つの配列含まれていてもよい。
本発明の核酸にはまた、配列番号９８で示されるアミノ酸配列が含まれていてもよい。
本発明に係る好ましい核酸には、第１核酸配列として配列番号９７で示される核酸配列と、第２核酸配列として配列番号９８で示される核酸配列が含まれる。特に好ましい核酸配列は配列番号９９を含む核酸配列である。
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係る核酸を含むベクターに関する。このようなベクターは、例えば本発明のポリペプチドを発現させる発現ベクターとすることができる。この発現は構造的発現または誘導的な発現とすることができる。本ベクターはまた、クローニングの目的のために本発明のポリペプチドの核酸配列を含むクローニングベクターであり得る。
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、および／または、本発明に係るベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、特に細菌細胞および酵母細胞からなる群から選択することができる。特に好ましい宿主細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、および／または、本発明に係る宿主細胞を含む組成物に関する。好ましい組成物には、本発明に係るポリペプチドが含まれる。好ましくは、本発明に係る組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含む。このような組成物は薬学的組成物とすることができる。さらには、本発明に係る組成物は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、および／または、本発明に係る宿主細胞、を含む骨セメントとすることができる。本発明に係るポリペプチド（例えば配列番号９３を含むポリペプチドなど）を含む骨セメントが、特に好ましい。本発明に係る組成物にはさらに生体材料、例えば整形外科用途に用いられる生体材料も包含することができる。当業者であれば、この意味で考えられる数多くの材料を容易に認識するであろう。
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、人体もしくは動物体を手術もしくは治療により手当する方法で用いられる本発明に係る組成物、または人体もしくは動物体に施される診断方法に用いられる本発明に係る組成物に関する。
本発明はまた、エンテロコッカス属に属する細菌による感染症の治療もしくは防止に係る方法で用いられる本発明に係るポリペプチド（また同様にして本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に関する。特に本発明は、エンテロコッカス属に属する細菌による感染症の治療もしくは防止に係る方法で用いられる本発明に係るポリペプチド（また同様にして本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に関し、前記ポリペプチドには第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列が含まれ、前記第１アミノ酸配列は、ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、およびｉｖ）配列番号２、配列番号３、または配列番号５の何れか１つの誘導体であって、配列番号２、配列番号３、または配列番号５に対してそれぞれ少なくとも８０％の配列同一性を呈する誘導体、からなる群から選択される配列であり、また前記第２アミノ酸配列は、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンであることを特徴とする。
本発明のポリペプチドに関する上記の開示は、エンテロコッカス属に属する細菌による感染症の治療もしくは防止に係る方法で用いられるポリペプチド（また、このようなポリペプチドをコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このような核酸もしくはベクターを含む宿主細胞、ならびに／または、このようなポリペプチド、核酸、および／もしくは、宿主細胞を含む組成物）についても想定される。特に、配列番号５およびその誘導体の詳細な開示は、エンテロコッカス属に属する細菌による感染症の治療もしくは防止に係る方法で用いられるポリペプチドに関する実施形態として想定される。
本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、人体もしくは動物体を手術もしくは治療により手当する方法で用いられる本発明に係る組成物、または人体もしくは動物体に施される（例えば、細菌感染症の治療および防止のための）診断方法に用いられる本発明に係る組成物、が用いられる態様に関して、本発明者らは具体的に、上記のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、および組成物を、略生理ｐＨで使用すること、例えば約７．２から約７．６までのｐＨで、より好ましくは約７．４のｐＨで使用することを想定している。
本発明はまた、被験体にいるエンテロコッカス属に属する細菌を原因とする感染症の治療または防止に係る方法に関し、前記方法には被験体を、本発明に係るポリペプチド（または同様に、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に接触させることが含まれている。特に、本発明はまた、被験体にいるエンテロコッカス属に属する細菌を原因とする感染症の治療または防止に係る方法に関し、前記方法には被験体を、第１アミノ酸配列および第２アミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させることが含まれており、前記第１アミノ酸配列は以下の配列：ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、および、ｉｖ）配列番号２、配列番号３、または配列番号５の何れか１つの誘導体であって、配列番号２、配列番号３、または配列番号５に対してそれぞれ少なくとも８０％の配列同一性を呈する誘導体、からなる群から選択される配列であり、また前記第２アミノ酸配列は、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチドまたはデフェンシンであることを特徴とする。
この場合にも、本発明のポリペプチドに関する上記の開示は、上記の治療方法で用いられるポリペプチド（また、核酸、ベクター、宿主細胞、および／または、組成物）についても想定される。特に、配列番号５およびその誘導体の詳細な開示は、エンテロコッカス属に属する細菌による感染症の治療もしくは防止に係る方法で用いられるポリペプチドに関する実施形態として想定される。
本発明に係る治療方法に関して、本発明者らは具体的に、上記のペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、および組成物を、略生理ｐＨで使用すること、例えば約７．２から約７．６までのｐＨで、より好ましくは約７．４のｐＨで使用することを想定している。
さらなる態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）の、特に院内環境または診療所で、無生物の表面、組成物、および／または、物体を消毒するための、使用に関する。好ましくは、これは略生理ｐＨ、例えば約７．２から約７．６までのｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨで施される。
さらなる実施態様において、本発明は無生物の表面、組成物および／または物体が、細菌で汚染されること、特に大便連鎖球菌、および／または、エンテロコッカス・フェシウム細菌で汚染されることを防止するための、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）の使用に関する。この場合にも、これは好ましくは略生理ｐＨ、例えば、約７．２から約７．６までのｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨで使用される。
本発明のポリペプチドに関する上記の開示は、本発明に係る使用についても想定される。特に、配列番号５およびその誘導体の詳細な開示は、使用されるポリペプチドに関する実施形態として想定される。
さらなる態様において、本発明は、特に院内環境または診療所で、無生物の表面、組成物、および／または、物体を消毒する方法に関し、前記方法には無生物の表面、組成物、および／または、物体を、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に接触させることが含まれる。本方法は好ましくは略生理ｐＨで、例えば約７．２から約７．６までのｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨで実行される。
さらなる実施態様において、本発明は無生物の表面、組成物および／または物体が細菌で汚染されること、特に大便連鎖球菌、および／または、エンテロコッカス・フェシウム細菌で汚染されることを防止する方法に関し、本方法には無生物の表面、組成物および／または物体を、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）と接触させることが含まれる。本方法は好ましくは、略生理ｐＨが反映されているｐＨ状態で、例えば約７．２から約７．６までのｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨで実行される。
本発明のポリペプチドに関する上記の開示は、本発明の殺菌方法および本発明の汚染防止方法についても想定されている。特に、配列番号５およびその誘導体の詳細な開示は、上記方法で使用されるポリペプチドに関する実施形態として想定されている。
以下において、本発明の様々な実施形態および態様を説明する具体的な実施例が提示される。しかしながら、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本発明の様々な変更は、本明細書に記載されたものに加えて、前述の説明および以下の実施例から当業者に明白であろう。このような変更はすべて添付の特許請求の範囲内に含まれる。
実施例１：エンテロコッカス・フェカーリス細菌に対する野生型エンドリシンと比較した抗菌活性の増加
ＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地でエンテロコッカス・フェカーリス細菌を一晩培養し、同培地に１０倍で希釈させた。約０．６の光学濃度ＯＤ６００の細菌をペレット化し、緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）中で洗浄し、同緩衝液に１０倍で希釈させた。５０μｌの細菌溶液を、５０μｌのタンパク質溶液（３００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に１０μｇ，ｐＨ７．４）または対照群（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，３００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４）と混合させた。使用されたタンパク質は配列番号１で示される野生型エンドリシン（ｗｔ）および配列番号９３を含む本発明に係るポリペプチドであった。各サンプルを６０分間３７℃で緩やかに攪拌しながら培養した。２５μｌの非希釈サンプルと１×ＰＢＳ緩衝溶液中の１０倍希釈系列をＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、これらを３７℃で一晩培養した。コロニーを計数して増殖抑制を調べた。
表３は野生型エンドリシンおよび本発明に係るポリペプチドを用いて培養した後の、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ＨＣ−１９０９−５の増殖抑制を示している。エンドリシンを用いた培養により９９．９９％（４ｌｏｇ）の細菌除去に至った。融合タンパク質を用いた培養後には９９．９９９％（≧５ｌｏｇ）以上が達成された。４回の１０倍希釈が行われ、５ｌｏｇの対数減少の試験計数限界に達した。
Figure 2020510404
実施例２：野生型エンドリシンと比較したエンテロコッカス・フェカーリス細菌に対する広範囲にわたるｐＨでの抗菌活性の増加
ＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地でエンテロコッカス・フェカーリス細菌を培養し、同培地に１０倍で希釈させた。約０．６の光学濃度ＯＤ６００の細菌をペレット化し、様々な緩衝液中で洗浄した。使用された緩衝液は以下の通りであった。１００ｍＭのリンゴ酸二ナトリウム塩、ｐＨ５およびｐＨ６の緩衝液、ならびに１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４の混合物、ｐＨ７．４およびｐＨ８の緩衝液。細菌をその後、異なる緩衝液（上を参照）に１０倍で希釈させた。５０μｌの細菌溶液を、５０μｌのタンパク質溶液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，３００ｍＭのＮａＣｌ中に１０μｇ，ｐＨ７．４）または対照群（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，３００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４）と混合させた。使用されたタンパク質は配列番号１で示される野生型エンドリシン（ｗｔ）および配列番号９３を含む本発明に係るポリペプチドであった。細菌とタンパク質を混合した後の最終ｐＨ値は以下の通りであった：ｐＨ５．２５，ｐＨ６．５，ｐＨ７．４およびｐＨ７．７５。各サンプルを６０分間３７℃で緩やかに攪拌させながら培養した。２５μｌの非希釈サンプルと１×ＰＢＳ緩衝溶液中の１０倍希釈系列をＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、これらを３７℃で一晩培養した。コロニーを計数して増殖抑制を調べた。４回の１０倍希釈が行われ、５ｌｏｇの対数減少の試験計数限界に達した。
表４はエンテロコッカス・フェカーリス株ＨＣ−１９０９−５を野生型エンドリシンと本発明に係るポリペプチドで培養した後の、様々なｐＨ条件下での増殖抑制を示している。野生型エンドリシンに対してｐＨ５．２５からｐＨ７．７５まで９９〜９９．９％（２〜３ｌｏｇ）の細菌除去が認められ、塩基性のｐＨで活性が減少していた。融合タンパク質では９９．９９〜９９．９９７％（４〜４．５ ｌｏｇ）の細菌除去に到達し、塩基性のｐＨでの活性減少は僅かであった。
Figure 2020510404
 同様の結果（幅広いｐＨ域で基本的に一定の抗菌活性があり、特に７．４の生理的なｐＨで大きな活性消失がない）は本発明の他のポリペプチドでも達成可能であって、このようなものとしては追加でＨｉｓ−タグ（例えば、配列番号９４または配列番号１０３）を含むポリペプチド、または配列番号１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と追加の触媒ドメイン（例えば配列番号１０４で示される配列）を含むポリペプチドなどが挙げられる。このようなポリペプチドの例として配列番号１０５を含むポリペプチドがある。
実施例３：腸球菌株の多様な集合に対する幅広い抗菌活性
ＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地で細菌を一晩培養し、同培地に１０倍で希釈させた。約０．６の光学濃度ＯＤ６００の細菌をペレット化し、緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）中で洗浄し、同緩衝液に１０倍で希釈させた。５０μｌの細菌溶液を、５０μｌのタンパク質溶液（３００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に１０μｇ，ｐＨ７．４）または対照群（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，３００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４）と混合させた。使用されたタンパク質は配列番号１で示される野生型エンドリシン（ｗｔ）および配列番号９３を含む本発明に係るポリペプチドであった。各サンプルを６０分間３７℃で緩やかに攪拌しながら培養した。２５μｌの非希釈サンプルと１×ＰＢＳ緩衝溶液中の１０倍希釈系列をＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、これらを３７℃で一晩培養した。コロニーを計数して増殖抑制を調べた。４回の１０倍希釈が行われ、５ｌｏｇの対数減少の試験計数限界に達した。
下記の表５は、様々なエンテロコッカス・フェカーリス（E. faecalis）株、エンテロコッカス・フェシウム（E. Faecium）株、および他のエンテロコッカス属株の増殖抑制を示している。平均して、９９．９９８７％（４．９ｌｏｇ）の細菌除去が確認された。
Figure 2020510404

Claims (22)

  1. 第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列を含み、
    前記第１アミノ酸配列は、
    ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
    ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、
    ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、および
    ｉｖ）配列番号２、配列番号３、または配列番号５で示されるアミノ酸配列のうち何れか１つの誘導体であって、配列番号２、配列番号３、または配列番号５と、それぞれが少なくとも８０％の配列同一性を呈する誘導体、
    からなる群から選択される配列であって、
    前記第２アミノ酸配列は、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチドまたはデフェンシンである、
    ことを特徴とするポリペプチド。
  2. 前記第１アミノ酸配列が、
    ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
    ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、および
    ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、
    からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドに配列番号３もしくはその誘導体で示される配列、およびさらなるアミノ酸配列が含まれ、前記さらなるアミノ酸配列は、細菌の細胞壁、特にグラム陽性菌の細胞壁を分解可能な酵素であることを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 前記酵素が配列番号１０４で示されるアミノ酸配列であるか、または配列番号１０４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは９９％を超える配列同一性を呈している配列番号１０４の誘導体、であることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 前記ポリペプチドに配列番号２のアミノ酸配列と配列番号３のアミノ酸配列が含まれていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記誘導体が配列番号２、配列番号３、または配列番号５のそれぞれに対して、少なくとも８５％、少なくとも８７、５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超える配列同一性を呈することを特徴とする請求項１または３に記載のポリペプチド。
  7. 前記第２アミノ酸配列が、
    ｉ）配列番号４、配列番号３１〜８３、および配列番号１００からなる群から選択される抗微生物ペプチド、
    ｉｉ）配列番号８７、配列番号８８および配列番号８９からなる群から選択される両親媒性ペプチド、
    ｉｉｉ）配列番号６〜３０からなる群から選択されるカチオン性ペプチド、
    ｉｖ）配列番号８４で示されるスシペプチド、または、
    ｖ）配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される疎水性ペプチド、
    であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記第２アミノ酸配列が配列番号４または配列番号１００で示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. ｉ）前記第１アミノ酸配列は配列番号５もしくはその誘導体であり、前記第２アミノ酸配列は配列番号４であり、特に前記ポリペプチドに配列番号９３のアミノ酸配列もしくは、配列番号９３と少なくとも８０％の配列同一性を呈する配列番号９３の誘導体が含まれるか、または、
    ｉｉ）前記第１アミノ酸配列は配列番号５もしくはその誘導体であり、前記第２アミノ酸配列は配列番号１００であり、特に前記ポリペプチドに配列番号１０３のアミノ酸配列もしくは、配列番号１０３と少なくとも８０％の配列同一性を呈する配列番号１０３の誘導体が含まれるか、または、
    ｉｉｉ）前記第１アミノ酸配列は配列番号３もしくはその誘導体であり、前記第２アミノ酸配列は配列番号１００であり、特に前記ポリペプチドに追加で配列番号１０４のアミノ酸配列もしくは、配列番号１０４と少なくとも８０％の配列同一性を呈する配列番号１０４の誘導体が含まれる、
    ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 前記ポリペプチドがエンテロコッカス属細菌のペプチドグリカン、特にエンテロコッカス・フェカーリス細菌、および／または、エンテロコッカス・フェシウム細菌のペプチドグリカンを分解することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記ポリペプチドは、ｐＨ７．４などの略生理的なｐＨで、
    野生型酵素（配列番号１）と比較してより活性が高く、および／または、
    略生理的なｐＨのときに、ｐＨ５．２５あるいはｐＨ６など、より酸性度の高い生理的ｐＨのときと比較して、実質的に同程度かまたはより高い活性を呈することを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のエンドリシンと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、が含まれることを特徴とする組成物。
  13. 前記組成物が骨セメントであるかまたは生体材料を含むことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
  14. 人体もしくは動物体を手術もしくは治療により手当する方法、または人体もしくは動物体に施される診断方法で使用されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記ポリペプチドまたは前記組成物が、細菌感染症の防止または治療、特にエンテロコッカス・フェカーリス細菌、および／または、エンテロコッカス・フェシウム細菌による感染症の防止または治療に使用されることを特徴とする、請求項１４に記載された使用のためのポリペプチドまたは組成物。
  16. 前記ポリペプチドまたは前記組成物が、略生理的なｐＨ、例えば約７．２〜約７．６のｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨで使用されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載された使用のためのポリペプチドまたは組成物。
  17. 無生物の表面、組成物、および／または、物体を、特に院内環境または診療所で消毒するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用、または請求項１２に記載の組成物の使用。
  18. 無生物の表面、組成物、および／または、物体の細菌による汚染を防止するため、特にエンテロコッカス・フェカーリス細菌、および／または、エンテロコッカス・フェシウム細菌による汚染を防止するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用、または請求項１２に記載の組成物の使用。
  19. 前記ポリペプチドまたは前記組成物が、略生理的なｐＨ、例えば約７．２〜７．６のｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨで使用されることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の使用。
  20. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  21. 請求項２０に記載の核酸を含むベクター。
  22. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２０に記載の核酸、および／または、請求項２１に記載のベクター、を含む宿主細胞。
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