CN109468301A - 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109468301A
CN109468301A CN201811524189.9A CN201811524189A CN109468301A CN 109468301 A CN109468301 A CN 109468301A CN 201811524189 A CN201811524189 A CN 201811524189A CN 109468301 A CN109468301 A CN 109468301A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
val
gly
ser
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811524189.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109468301B (zh
Inventor
杨立荣
吴绵斌
赵炯烽
林建平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Rongrui Technology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202010637210.7A priority Critical patent/CN111944783B/zh
Priority to CN201811524189.9A priority patent/CN109468301B/zh
Publication of CN109468301A publication Critical patent/CN109468301A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109468301B publication Critical patent/CN109468301B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6454—Glycerides by esterification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述脂肪酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所示。本发明通过多序列比对和二硫键预测结果，对米根霉脂肪酶ROL进行热稳定性改造，大幅度的提高了米根霉脂肪酶ROL的热稳定性，同时，借助计算机模拟技术，对热稳定性提高的原理进行了分子层面的解释。本发明提供的脂肪酶突变体的热稳定性显著提升，再结合其本身具备的高Sn‑1,3选择性，使其更具工业化应用价值。

Description

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油 单酯或二酯。由于脂肪酶能催化一系列反应，在生物催化领域占据了重要的位置。迄今为止， 已经有多种脂肪酶实现了在工业生产中的价值，包括脂肪酶RML、CALB等。但是，也有许 多脂肪酶虽然在某些方面有独特的优势，但是由于其催化能力低下或者稳定性差，难以实现 大规模的应用，例如米根霉脂肪酶ROL(Rhizopus oryzae lipase)具有良好的1,3-位置特异性， 优先催化中长链脂肪酸，虽然具有很好的选择性，但是由于热稳定性差，极大地限制了它们 的使用。
为了提高酶的热稳定性，近年来，研究者们已经开发出多种方法，如固定化、介质工程 和蛋白质工程。与前两种方法相比，蛋白质工程更加理性化，能从本质上提高酶的热稳定性 且效果更佳，逐渐成为了热稳定性改造的主流方法。
蛋白质工程提高酶的热稳定性的方法包括非理性设计(定向进化)、半理性设计和理性设 计三种方法。如专利文献CN 101974499 A公开了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，以华根 霉脂肪酶基因为模板，利用定向进化技术(易错PCR、DNA Shuffling和定点突变)获得了热稳 定性显著提高的脂肪酶突变体。
专利文献CN 102660517 A公开了一种运用半理性设计的方法对南极假丝酵母脂肪酶B 基因进行多轮定点饱和突变获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体方法为：对南极假丝酵 母脂肪酶B基因的晶体结构进行分析，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子分析， 确定B因子较高的残基作为饱和突变的热点，建立突变体库并筛选获得热稳定显著提高的突 变体。
理性设计是一种高效且省时的酶改造方法，被广泛应用于蛋白质工程中。理性设计借助 于计算机的计算，为酶改造提供了合理的改造方案，在很大的程度上减少了酶筛选的工作。 在理性设计的帮助下，许多酶获得性能强化的突变体。
因此，如何提高米根霉脂肪酶ROL的热稳定性是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过热点突变和引入二硫键的方法，获得热稳定性进一步提 高的脂肪酶突变体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脂肪酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)筛选与米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase)同源且具有热稳定性的氨基酸序列，通过 分析序列一致性，选择与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为需要突变的位点；
(2)获取米根霉脂肪酶的晶体结构，通过在线网站Disulfide by Design 2分析潜在的二硫键 位置；
(3)结合步骤(1)和步骤(2)的分析结果，设计定点突变引物，以米根霉脂肪酶基因为模板， 进行定点突变，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；
(4)从定点突变文库中筛选获得米根霉脂肪酶热稳定性提高的突变体。
步骤(1)中，米根霉脂肪酶ROL与米黑根毛霉脂肪酶RML(Rhizomucor mieheilipase)和嗜 热假单胞菌脂肪酶TLL(Thermomyces lanuginosa lipase)进行比对，获得有可能会影响脂肪酶热 稳定性的位点，这些位点为Q15N、A24S、V41I、L68A、Y124L、E129D、T184A、V209L、 S223Y、D262G。
步骤(2)中，所述的潜在的二硫键位点为A106C-F185C，F112C-A149C，E190C-E238C， R203C-S253C，A186C-L217C，F196C-G220C，Y20C-F173C，D49C-K72C，V141C-A151C。
步骤(3)和(4)中，针对每个突变位点，设计引物，以米根霉脂肪酶基因为模板进行定点PCR 扩增，获得单位点突变及二硫键位点突变的突变体，筛选热稳定性提高的突变体，优选的位 点为V209L，D262G，E190C-E238C；进一步地，根据上述的结果进行组合突变，筛选获得 热稳定性显著提高的突变体，优选的突变位点为V209L-D262G，V209L-E190C-E238C，D262G-E190C-E238C，V209L-D262G-E190C-E238C。
所述定点突变引物为：
上游引物(V209L)：5'-GACATTGTTCCACACCTACCACCACAATCA-3'，
下游引物(V209L)：5'-TGATTGTGGTGGTAGGTGTGGAACAATGTC-3'；
上游引物(D262G)：5'-CACTTATCCTACTTTGGGATTAATGAGGGG-3'，
下游引物(D262G)：5'-CCCCTCATTAATCCCAAAGTAGGATAAGTG-3'；
上游引物(E190C)：5'-TTTGCCTATTATGTTTGTTCCACTGGCATACCA-3'，
下游引物(E190C)：5'-TGGTATGCCAGTGGAACAAACATAATAGGCAAA-3'；
上游引物(E238C)：5'-CAAATTTGTACTTCCTGTATTGAAACCAAAGAC-3'，
下游引物(E238C)：5'-GTCTTTGGTTTCAATACAGGAAGTACAAATTTG-3'。
本发明提供了利用上述方法获得的脂肪酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11或SEQ IDNO.13 所示。
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶突变体是第209位的氨基酸由亲本脂肪酶的V 突变为L，该突变体在55℃下的半衰期为51.25min，而ProROL的半衰期为11.7min。
氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的脂肪酶突变体是第262位的氨基酸由D突变为G，该 突变体在55℃下的半衰期为49.37min。
氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的脂肪酶突变体是第190位的氨基酸由E突变为C，第 238位的氨基酸由E突变为C，该突变体在55℃中保温15分钟后仍保留了约93％的初始活性， 而ProROL在经过相同的处理后仅保留了其初始活性的37％；在60和65℃下的半衰期分别 为210和15分钟，相较于野生型脂肪酶，分别提高了72.4倍和8.3倍。
氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的脂肪酶突变体是第209位的氨基酸由V突变为L，第 262位的氨基酸由D突变为G，该突变体在55℃中保温30分钟后仍保留了约76％的初始活性。
氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的脂肪酶突变体是第209位的氨基酸由V突变为L，第 190位的氨基酸由E突变为C，第238位的氨基酸由E突变为C，该突变体在65℃中保温30分钟后仍保留了约42％的初始活性。
氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的脂肪酶突变体是第262位的氨基酸由D突变为C， 第190位的氨基酸由E突变为C，第238位的氨基酸由E突变为C，该突变体在65℃中保温30分钟后仍保留了约45％的初始活性。
氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的脂肪酶突变体是第209位的氨基酸由V突变为L， 第262位的氨基酸由D突变为C，第190位的氨基酸由E突变为C，第238位的氨基酸由E 突变为C；该突变体在65℃温育30分钟后仍保留了约53.6％的初始活性；在65℃下的半衰 期为37.93分钟，是ProROL的20倍。
本发明还提供了编码所述的脂肪酶突变体的基因。作为优选，所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQID NO.12或SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供了包含所述的基因的表达单元。表达单元的启动子可以为毕赤酵母醇氧化 物酶启动子AOX1。
本发明还提供了包含所述的表达单元的重组质粒。所述重组质粒的原始载体为质粒 pPIC9K。
本发明还提供了包含所述的重组质粒的转化子。所述转化子的宿主细胞为毕赤酵母 GS115。
相较于野生型米根霉脂肪酶，突变体酶在较高温条件下具有较好的热力学稳定性，更适 合工业应用。本发明还提供了所述脂肪酶突变体在油脂加工或生物柴油生产中的应用。所述 的油脂加工如通过酯化法制备不同脂肪酸链的1,3-甘油二酯、通过转酯化反应制备1,3-二油 酰基-2-棕榈酰甘油酯等。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果：
本发明通过多序列比对和二硫键预测结果，对米根霉脂肪酶ROL进行热稳定性改造，大 幅度的提高了米根霉脂肪酶ROL的热稳定性，同时，借助计算机模拟技术，对热稳定性提高 的原理进行了分子层面的解释。本发明提供的脂肪酶突变体的热稳定性显著提升，再结合其 本身具备的高Sn-1,3选择性，使其更具工业化应用价值。
附图说明
图1为脂肪酶ROL与RML和TLL的序列比对结果。
图2为ProROL与突变体在55℃下的失活曲线。
图3为野生型ROL的三维结构及其突变体的结构模型。ProROL(A)中的V209与突变体 V209L(B)中的L209的相互作用；ProROL(C)和突变体D262G(D)的3D模型的表面。红色区域是R262和G262的表面。
图4为引入二硫键的突变体在55℃下保温15min后的残留活力。
图5为突变体E190C/E238C在55℃、60℃和65℃下的失活曲线。
图6为ProROL(A)突变位置周围的相互作用和E190C/E238C变体(B)中的等同位置周围 的相互作用；ProROL和突变体E190C/E238C的RMSD(C)和RMSF(D)。
图7为组合突变体V209L/E190C/E238C，D262G/E190C/E238C和V209L/D262G/E190C/E238C在65℃下的失活曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨 在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1
1、热点氨基酸的选取
使用在线分析网站ClustalW(http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行多序列比对。来 源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶RML和来源于嗜热假单胞菌(Thermomyces lanuginosa)的脂肪酶TLL具有比米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶ROL更好的耐热性，且与ROL 具有较高的同源性，序列同源性分别为53.4％和29.7％。因此，选择这两种脂肪酶与ROL进 行多序列比对，以鉴定可增强ROL热稳定性的潜在位点。
每个序列都以FASTA格式上传，结果上传到Espript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ cgi-bin/ESPript.cgi)并绘制以进行更直观的对齐。
结果如图1所示，标有星号的氨基酸残基表示基于多序列比对结果选择的可能影响ROL 的热稳定性的潜在位点。其中83，86，88，89和93位的氨基酸残基位于ROL的盖子(lid)上， 因此未选择用于突变。
根据比对结果，通过全质粒PCR进行点突变(Q15N，A24S，V41I，L68A，Y124L，E129D，T184A，V209L，S223Y和D262G)，PCR引物见表1。
表1基于多序列比对结果的突变引物设计表
突变前的基因通过PCR扩增并用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，连接至经同样的酶切的质粒 pPIC9k上，转化至大肠杆菌BL21中，提取质粒测序正确之后经Sac Ⅰ的线性化，转化至毕赤酵母GS115中。
点突变的重组质粒用对应的引物进行全质粒PCR之后，用Dpn Ⅰ进行消化并转化至大肠 杆菌BL21中，经Sac Ⅰ的线性化，进一步转化至毕赤酵母GS115中。验证正确的酵母转化 子在BMMG培养基(100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％无氨基酸 酵母氮源(YNB)，1％硫酸铵，4x10-5％生物素，1％甘油)中培养至OD600为1-6，收集菌体，重 新分散于BMMY培养基(100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％无氨 基酸酵母氮源(YNB)，1％硫酸铵，4x10-5％生物素，1％甲醇)中，每隔24h添加1％(w/w)的甲 醇进行诱导培养。整个培养过程维持200rpm，30℃。诱导培养96h后，离心除去菌体，测定上清液的酶活力。
2、热稳定性的测定
酶活的测定：用橄榄油滴定法测定脂肪酶的水解活力。将橄榄油聚乙烯醇溶液(20g/L) 以1:4的体积比混合，形成橄榄油乳液，将其用作底物。将适量的酶加入10ml磷酸盐缓冲液 (25mM，pH7.5)和8ml橄榄油乳液的混合溶液中，在30℃反应10分钟后，加入20ml乙醇终 止反应。用氢氧化钠溶液滴定反应释放的游离脂肪酸。
酶活性定义为水解橄榄油以每分钟释放1μmol脂肪酸所需的酶量。
其中V1为滴定消耗的NaOH体积(mL)；V0为滴定空白样消耗的NaOH体积(mL)；T为 反应时间(min)。
脂肪酶酶液在55℃下保温不同时间后，测定其水解橄榄油乳化液的活力，计算相对于的 温度下脂肪酶的热稳定性。
通过橄榄油滴定法测定突变体和ProROL在55℃下测定的热稳定性。突变体Y124L，E129D，T184A和S223Y相对于野生型而言，没有显示出热稳定性的增强(数据未显示)。然而，突变体Q15N，A24S，V41I，L68A，V209L，D262G在热稳定性方面表现出不同程度的 改善(图2)。在这些突变体中，V209L和D262G显示出最佳的热稳定性，在55℃下的半衰期 分别为51.25和49.37min，而ProROL的半衰期为11.7min。
3、同源建模和分子模拟
突变体的同源建模由discovery studio 4.0完成。通过Pymol软件(http://www.pymol.org)绘 制分子结构。所有分子动力学(MD)模拟均由Discovery Studio 4.0包(Accelrys，San Diego，CA， USA)进行。
分子模拟方法参考文献。对于模拟，使用CHARMm力场和Momany-Rone部分电荷来分配原子类型。保留结晶水分子以模拟水合壳。根据标准动力学级联协议进行MD模拟。详细地说，它由5个步骤组成。第一步和第二步是最小化步骤。最速下降最小化方法和共轭梯度最小化方法的最大步骤设定为10,000，并且RMS梯度分别设定为0.2和0.0001。加热步骤设定为300K，持续100ps。平衡和生产步骤为1ns和10ns，相应步骤的回火温度分别为300K 和330K。生产类型是NVT。应用隐式溶剂模型，将介电常数设定为1，将隐式溶剂介电常数 设定为80，每2ps保存生产步骤的轨迹，并分析5000帧进行比较。
结果如图3所示，当ROL第209位的缬氨酸突变为亮氨酸时，没有形成新的键(图3A/B)。 然而，该Leu与相邻氨基酸(R179和V206)之间的氢键键长减小了，而氢键在稳定蛋白质的结 构中起重要作用，因此导致了酶的稳定性提高。
当262位的精氨酸被甘氨酸取代时，突变体的热稳定性也得到了一定程度的提高。分析 突变前后的结构，发现262位的氨基酸位于蛋白质表面的loop区，并且在该点进行突变后没 有形成新的键或相互作用(图3C/D)。然而，有类似的工作报道，当在特定位点引入甘氨酸的 突变后有可能导致蛋白质热稳定性的提高。对于这个现象的合理解释是ROL蛋白表面含有 D262的loop区在酶的热稳定性中起重要作用。而甘氨酸是最简单的氨基酸，在该loop中引 入甘氨酸的突变可以减轻构象应变并消除不利的空间相互作用，从而增强蛋白质的热稳定性。
实施例2
1、二硫键的设计
将ROL的晶体结构(PDB ID：1LGY)上传至Disulfide by Design 2(DbD2， http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php)，并执行运算。在对蛋白质结构进行初步分析后，开始预测蛋白质结构，分析潜在的二硫键位置。结果表明，32对氨基酸残基在突变成半胱氨酸后可能形成二硫键(表2)。根据能量，不良接触，热迁移率，序列分离等对预测结果进行评分和分类。根据打分结果，选择打分最高(＞90)的9对氨基酸进行突变。
表2二硫键设计结果
通过全质粒PCR在脂肪酶ROL的特定位点引入半胱氨酸。PCR引物如表3所示。
表3基于二硫键设计结果的突变引物设计表
2、热稳定性的测定
酶活的测定：用橄榄油滴定法测定脂肪酶的水解活力。将橄榄油聚乙烯醇溶液(20g/L) 以1:4的体积比混合，形成橄榄油乳液，将其用作底物。将适量的酶加入10ml磷酸盐缓冲液 (25mM，pH7.5)和8ml橄榄油乳液的混合溶液中，在30℃反应10分钟后，加入20ml乙醇终 止反应。用氢氧化钠溶液滴定反应释放的游离脂肪酸。酶活性定义为水解橄榄油以每分钟释 放1μmol脂肪酸所需的酶量。
脂肪酶酶液在55℃下保温不同时间后，测定其水解橄榄油乳化液的活力，计算相对于的 温度下脂肪酶的热稳定性。
突变体在55℃下保温15min后测定残留活力，结果如图4所示。其中一些突变显示出了 热稳定性的提高，其中，突变体E190C/E238C的热稳定性得到了明显的提高，其在55℃中保 温15分钟后仍保留了约93％的初始活性，而ProROL在经过相同的处理后仅保留了其初始活 性的37％。然而，二硫键的引入并不总能增强稳定性，并且仍难以预测二硫键的稳定作用。 这是因为在引入二硫化物后可能失去原有的有利相互作用，并且可能与引入的二硫键周围的 氨基酸残基形成不利的接触。
进一步，测定突变体E190C/E238C在60℃和65℃下的热稳定性(图5)。突变体在60℃和 65℃下的热稳定性比亲本蛋白质明显提高了。ProROL在60和65℃下的半衰期分别为2.9和 1.8min，而突变体E190C/E238C在对应温度下的半衰期分别为210和15分钟，分别提高了 72.4倍和8.3倍。
3、ProROL和E190C/E238C在分子水平上的构象变化
新形成的二硫键C190/C238位于蛋白质表面，远离酶的催化中心，增加了酶的热稳定性 (图6)。在该突变体中，通过新形成的二硫键交联限制了无规卷曲和α螺旋的结构，降低了未 折叠状态的构象熵，从而提高蛋白质的热稳定性。
借助Discovery studio 4.0模拟引入二硫键的突变前后的蛋白结构变化。分子动力学模拟 在330K下进行，模拟时间为10ns。如图6C所示，突变体E190C/E238C的总分子均方根偏 差(RMSD)低于其突变前的RMSD。这表明在热处理期间，WROL的结构变得比E190C/E238C 的结构更松散，因此C190/C238二硫键的引入改善了蛋白质结构的整体刚性。总分子均方根 波动(RMSF)也表明E190C/E238C的总体结构比PreROL的结构刚性更大，从而使酶的热稳定 性增强。
实施例3
通过热点和二硫键的组合突变提高热稳定性
通过将影响酶热稳定性的氨基酸位点进行组合突变，很可能获得热稳定性进一步提高的 突变体。基于上面获得的结果，我们对ROL进行组合突变，突变位点选择V209L，D262G 与E190C和E238C。突变体V209L-D262G在55℃中保温30分钟后仍保留了约76％的初始 活性；
由于突变体E190C/E238C在65℃下显示出了热稳定性提高，因此对组合突变的热稳定性 测试同样选择在65℃下进行。如图7所示，与突变体E190C/E238C相比，所有的组合突变体 均显示出了热稳定性的增强，其中，三点突变体V209L-E190C-E238C在65℃中保温30分钟 后仍保留了约42％的初始活性；D262G-E190C-E238C在65℃中保温30分钟后仍保留了约45％ 的初始活性。四点突变体V209L/D262G/E190C/E238C显示出最佳的热稳定性，该突变体在 65℃温育30分钟后仍保留了约53.6％的初始活性。该变体在65℃下的半衰期为37.93分钟， 是ProROL的20倍。这个四点突变体的热稳定性甚至优于最常用的商业化脂肪酶RML。两 点突变体V209L/D262G在65℃下的热稳定性较差，因此未给出具体数据。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu
1 5 10 15
Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val
20 25 30
Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn
85 90 95
Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe
100 105 110
Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Ile Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly
165 170 175
Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
Leu Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile Glu
225 230 235 240
Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
260 265
<210> 2
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcctgttt ctggaaagtc tggttctagt actacagcag tatctgcttc tgataactcc 60
gcattgcctc ctttgatttc ttcaagatgc gcacctccat ctaataaggg atccaaatca 120
gaccttcaag ctgaacctta ttacatgcag aagaacacag agtggtacga atcacatggt 180
ggaaatctga caagtatcgg aaagagagac gataacctgg ttggtggaat gactttggat 240
ctacctagtg atgctcctcc tatttcactg tctggctcta ctaattcagc atctgatggt 300
ggtaaagttg ttgctgctac tactgctcaa attcaggagt ttaccaagta cgctggtatt 360
gctgcaactg cttattgtcg ttctgttgta ccaggtaaca aatgggattg tgtacagtgt 420
cagaagtggg ttcctgatgg aaagatcatc acaaccttta catccctgct tagtgataca 480
aacggttacg tcttgagaag tgataaacag aagaccatct acttggtgtt ccgaggtacc 540
aactcatttc gtagtgctat cacggatatt gtctttaact tctccgacta caaacccgtc 600
aaaggtgcca aagtgcatgc cggattccta agttcttatg aacaagtcgt gaacgattat 660
ttcccagtgg ttcaagagca attgacggcc aatccaactt acaaagtaat agtcaccggt 720
catagtttgg gtggagcaca agccttacta gccggaatgg acttatatca aagagagcca 780
agattgtctc caaagaactt gtcaatattc acggtcggag gaccaagagt tggcaatccc 840
acatttgcct attatgttga atccactggc ataccatttc aaaggactgt tcacaagagg 900
gacattgttc cacacctacc accacaatca tttgggtttc tacaccccgg cgttgaatct 960
tggattaagt ccgggacttc caatgtccaa atttgtactt ccgaaattga aaccaaagac 1020
tgttccaatt ccatagtccc cttcacctca ttattagacc acttatccta ctttgacatt 1080
aatgaggggt cctgcttgta a 1101
<210> 3
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu
1 5 10 15
Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val
20 25 30
Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn
85 90 95
Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe
100 105 110
Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Ile Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly
165 170 175
Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile Glu
225 230 235 240
Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
260 265
<210> 4
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcctgttt ctggaaagtc tggttctagt actacagcag tatctgcttc tgataactcc 60
gcattgcctc ctttgatttc ttcaagatgc gcacctccat ctaataaggg atccaaatca 120
gaccttcaag ctgaacctta ttacatgcag aagaacacag agtggtacga atcacatggt 180
ggaaatctga caagtatcgg aaagagagac gataacctgg ttggtggaat gactttggat 240
ctacctagtg atgctcctcc tatttcactg tctggctcta ctaattcagc atctgatggt 300
ggtaaagttg ttgctgctac tactgctcaa attcaggagt ttaccaagta cgctggtatt 360
gctgcaactg cttattgtcg ttctgttgta ccaggtaaca aatgggattg tgtacagtgt 420
cagaagtggg ttcctgatgg aaagatcatc acaaccttta catccctgct tagtgataca 480
aacggttacg tcttgagaag tgataaacag aagaccatct acttggtgtt ccgaggtacc 540
aactcatttc gtagtgctat cacggatatt gtctttaact tctccgacta caaacccgtc 600
aaaggtgcca aagtgcatgc cggattccta agttcttatg aacaagtcgt gaacgattat 660
ttcccagtgg ttcaagagca attgacggcc aatccaactt acaaagtaat agtcaccggt 720
catagtttgg gtggagcaca agccttacta gccggaatgg acttatatca aagagagcca 780
agattgtctc caaagaactt gtcaatattc acggtcggag gaccaagagt tggcaatccc 840
acatttgcct attatgttga atccactggc ataccatttc aaaggactgt tcacaagagg 900
gacattgttc cacacgttcc accacaatca tttgggtttc tacaccccgg cgttgaatct 960
tggattaagt ccgggacttc caatgtccaa atttgtactt ccgaaattga aaccaaagac 1020
tgttccaatt ccatagtccc cttcacctca ttattagacc acttatccta ctttgggatt 1080
aatgaggggt cctgcttgta a 1101
<210> 5
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu
1 5 10 15
Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val
20 25 30
Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn
85 90 95
Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe
100 105 110
Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Ile Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly
165 170 175
Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Cys Ser Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Cys Ile Glu
225 230 235 240
Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
260 265
<210> 6
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttcctgttt ctggaaagtc tggttctagt actacagcag tatctgcttc tgataactcc 60
gcattgcctc ctttgatttc ttcaagatgc gcacctccat ctaataaggg atccaaatca 120
gaccttcaag ctgaacctta ttacatgcag aagaacacag agtggtacga atcacatggt 180
ggaaatctga caagtatcgg aaagagagac gataacctgg ttggtggaat gactttggat 240
ctacctagtg atgctcctcc tatttcactg tctggctcta ctaattcagc atctgatggt 300
ggtaaagttg ttgctgctac tactgctcaa attcaggagt ttaccaagta cgctggtatt 360
gctgcaactg cttattgtcg ttctgttgta ccaggtaaca aatgggattg tgtacagtgt 420
cagaagtggg ttcctgatgg aaagatcatc acaaccttta catccctgct tagtgataca 480
aacggttacg tcttgagaag tgataaacag aagaccatct acttggtgtt ccgaggtacc 540
aactcatttc gtagtgctat cacggatatt gtctttaact tctccgacta caaacccgtc 600
aaaggtgcca aagtgcatgc cggattccta agttcttatg aacaagtcgt gaacgattat 660
ttcccagtgg ttcaagagca attgacggcc aatccaactt acaaagtaat agtcaccggt 720
catagtttgg gtggagcaca agccttacta gccggaatgg acttatatca aagagagcca 780
agattgtctc caaagaactt gtcaatattc acggtcggag gaccaagagt tggcaatccc 840
acatttgcct attatgtttg ttccactggc ataccatttc aaaggactgt tcacaagagg 900
gacattgttc cacacgttcc accacaatca tttgggtttc tacaccccgg cgttgaatct 960
tggattaagt ccgggacttc caatgtccaa atttgtactt cctgtattga aaccaaagac 1020
tgttccaatt ccatagtccc cttcacctca ttattagacc acttatccta ctttgacatt 1080
aatgaggggt cctgcttgta a 1101
<210> 7
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu
1 5 10 15
Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val
20 25 30
Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn
85 90 95
Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe
100 105 110
Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Ile Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly
165 170 175
Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
Leu Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile Glu
225 230 235 240
Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
260 265
<210> 8
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttcctgttt ctggaaagtc tggttctagt actacagcag tatctgcttc tgataactcc 60
gcattgcctc ctttgatttc ttcaagatgc gcacctccat ctaataaggg atccaaatca 120
gaccttcaag ctgaacctta ttacatgcag aagaacacag agtggtacga atcacatggt 180
ggaaatctga caagtatcgg aaagagagac gataacctgg ttggtggaat gactttggat 240
ctacctagtg atgctcctcc tatttcactg tctggctcta ctaattcagc atctgatggt 300
ggtaaagttg ttgctgctac tactgctcaa attcaggagt ttaccaagta cgctggtatt 360
gctgcaactg cttattgtcg ttctgttgta ccaggtaaca aatgggattg tgtacagtgt 420
cagaagtggg ttcctgatgg aaagatcatc acaaccttta catccctgct tagtgataca 480
aacggttacg tcttgagaag tgataaacag aagaccatct acttggtgtt ccgaggtacc 540
aactcatttc gtagtgctat cacggatatt gtctttaact tctccgacta caaacccgtc 600
aaaggtgcca aagtgcatgc cggattccta agttcttatg aacaagtcgt gaacgattat 660
ttcccagtgg ttcaagagca attgacggcc aatccaactt acaaagtaat agtcaccggt 720
catagtttgg gtggagcaca agccttacta gccggaatgg acttatatca aagagagcca 780
agattgtctc caaagaactt gtcaatattc acggtcggag gaccaagagt tggcaatccc 840
acatttgcct attatgttga atccactggc ataccatttc aaaggactgt tcacaagagg 900
gacattgttc cacacctacc accacaatca tttgggtttc tacaccccgg cgttgaatct 960
tggattaagt ccgggacttc caatgtccaa atttgtactt ccgaaattga aaccaaagac 1020
tgttccaatt ccatagtccc cttcacctca ttattagacc acttatccta ctttgggatt 1080
aatgaggggt cctgcttgta a 1101
<210> 9
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu
1 5 10 15
Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val
20 25 30
Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn
85 90 95
Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe
100 105 110
Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Ile Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly
165 170 175
Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Cys Ser Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
Leu Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Cys Ile Glu
225 230 235 240
Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
260 265
<210> 10
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttcctgttt ctggaaagtc tggttctagt actacagcag tatctgcttc tgataactcc 60
gcattgcctc ctttgatttc ttcaagatgc gcacctccat ctaataaggg atccaaatca 120
gaccttcaag ctgaacctta ttacatgcag aagaacacag agtggtacga atcacatggt 180
ggaaatctga caagtatcgg aaagagagac gataacctgg ttggtggaat gactttggat 240
ctacctagtg atgctcctcc tatttcactg tctggctcta ctaattcagc atctgatggt 300
ggtaaagttg ttgctgctac tactgctcaa attcaggagt ttaccaagta cgctggtatt 360
gctgcaactg cttattgtcg ttctgttgta ccaggtaaca aatgggattg tgtacagtgt 420
cagaagtggg ttcctgatgg aaagatcatc acaaccttta catccctgct tagtgataca 480
aacggttacg tcttgagaag tgataaacag aagaccatct acttggtgtt ccgaggtacc 540
aactcatttc gtagtgctat cacggatatt gtctttaact tctccgacta caaacccgtc 600
aaaggtgcca aagtgcatgc cggattccta agttcttatg aacaagtcgt gaacgattat 660
ttcccagtgg ttcaagagca attgacggcc aatccaactt acaaagtaat agtcaccggt 720
catagtttgg gtggagcaca agccttacta gccggaatgg acttatatca aagagagcca 780
agattgtctc caaagaactt gtcaatattc acggtcggag gaccaagagt tggcaatccc 840
acatttgcct attatgtttg ttccactggc ataccatttc aaaggactgt tcacaagagg 900
gacattgttc cacacctacc accacaatca tttgggtttc tacaccccgg cgttgaatct 960
tggattaagt ccgggacttc caatgtccaa atttgtactt cctgtattga aaccaaagac 1020
tgttccaatt ccatagtccc cttcacctca ttattagacc acttatccta ctttgacatt 1080
aatgaggggt cctgcttgta a 1101
<210> 11
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu
1 5 10 15
Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val
20 25 30
Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn
85 90 95
Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe
100 105 110
Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Ile Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly
165 170 175
Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Cys Ser Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Cys Ile Glu
225 230 235 240
Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
260 265
<210> 12
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttcctgttt ctggaaagtc tggttctagt actacagcag tatctgcttc tgataactcc 60
gcattgcctc ctttgatttc ttcaagatgc gcacctccat ctaataaggg atccaaatca 120
gaccttcaag ctgaacctta ttacatgcag aagaacacag agtggtacga atcacatggt 180
ggaaatctga caagtatcgg aaagagagac gataacctgg ttggtggaat gactttggat 240
ctacctagtg atgctcctcc tatttcactg tctggctcta ctaattcagc atctgatggt 300
ggtaaagttg ttgctgctac tactgctcaa attcaggagt ttaccaagta cgctggtatt 360
gctgcaactg cttattgtcg ttctgttgta ccaggtaaca aatgggattg tgtacagtgt 420
cagaagtggg ttcctgatgg aaagatcatc acaaccttta catccctgct tagtgataca 480
aacggttacg tcttgagaag tgataaacag aagaccatct acttggtgtt ccgaggtacc 540
aactcatttc gtagtgctat cacggatatt gtctttaact tctccgacta caaacccgtc 600
aaaggtgcca aagtgcatgc cggattccta agttcttatg aacaagtcgt gaacgattat 660
ttcccagtgg ttcaagagca attgacggcc aatccaactt acaaagtaat agtcaccggt 720
catagtttgg gtggagcaca agccttacta gccggaatgg acttatatca aagagagcca 780
agattgtctc caaagaactt gtcaatattc acggtcggag gaccaagagt tggcaatccc 840
acatttgcct attatgtttg ttccactggc ataccatttc aaaggactgt tcacaagagg 900
gacattgttc cacacgttcc accacaatca tttgggtttc tacaccccgg cgttgaatct 960
tggattaagt ccgggacttc caatgtccaa atttgtactt cctgtattga aaccaaagac 1020
tgttccaatt ccatagtccc cttcacctca ttattagacc acttatccta ctttgggatt 1080
aatgaggggt cctgcttgta a 1101
<210> 13
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu
1 5 10 15
Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val
20 25 30
Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn
85 90 95
Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe
100 105 110
Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Ile Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly
165 170 175
Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Cys Ser Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
Leu Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Cys Ile Glu
225 230 235 240
Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
260 265
<210> 14
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttcctgttt ctggaaagtc tggttctagt actacagcag tatctgcttc tgataactcc 60
gcattgcctc ctttgatttc ttcaagatgc gcacctccat ctaataaggg atccaaatca 120
gaccttcaag ctgaacctta ttacatgcag aagaacacag agtggtacga atcacatggt 180
ggaaatctga caagtatcgg aaagagagac gataacctgg ttggtggaat gactttggat 240
ctacctagtg atgctcctcc tatttcactg tctggctcta ctaattcagc atctgatggt 300
ggtaaagttg ttgctgctac tactgctcaa attcaggagt ttaccaagta cgctggtatt 360
gctgcaactg cttattgtcg ttctgttgta ccaggtaaca aatgggattg tgtacagtgt 420
cagaagtggg ttcctgatgg aaagatcatc acaaccttta catccctgct tagtgataca 480
aacggttacg tcttgagaag tgataaacag aagaccatct acttggtgtt ccgaggtacc 540
aactcatttc gtagtgctat cacggatatt gtctttaact tctccgacta caaacccgtc 600
aaaggtgcca aagtgcatgc cggattccta agttcttatg aacaagtcgt gaacgattat 660
ttcccagtgg ttcaagagca attgacggcc aatccaactt acaaagtaat agtcaccggt 720
catagtttgg gtggagcaca agccttacta gccggaatgg acttatatca aagagagcca 780
agattgtctc caaagaactt gtcaatattc acggtcggag gaccaagagt tggcaatccc 840
acatttgcct attatgtttg ttccactggc ataccatttc aaaggactgt tcacaagagg 900
gacattgttc cacacctacc accacaatca tttgggtttc tacaccccgg cgttgaatct 960
tggattaagt ccgggacttc caatgtccaa atttgtactt cctgtattga aaccaaagac 1020
tgttccaatt ccatagtccc cttcacctca ttattagacc acttatccta ctttgggatt 1080
aatgaggggt cctgcttgta a 1101

Claims (9)

1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11或SEQ IDNO.13所示。
2.编码如权利要求1所述的脂肪酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14所示。
4.一种包含如权利要求2或3所述的基因的表达单元。
5.一种包含如权利要求4所述的表达单元的重组质粒。
6.一种包含如权利要求5所述的重组质粒的转化子。
7.一种脂肪酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选与米根霉脂肪酶同源且具有热稳定性的氨基酸序列，通过分析序列一致性，选择与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为需要突变的位点；
(2)获取米根霉脂肪酶的晶体结构，通过在线网站Disulfide by Design 2分析潜在的二硫键位置；
(3)结合步骤(1)和步骤(2)的分析结果，设计定点突变引物，以米根霉脂肪酶基因为模板，进行定点突变，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；
(4)从定点突变文库中筛选获得米根霉脂肪酶热稳定性提高的突变体。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述定点突变引物为：
V209L
上游引物：5'-GACATTGTTCCACACCTACCACCACAATCA-3'，
下游引物：5'-TGATTGTGGTGGTAGGTGTGGAACAATGTC-3'；
D262G
上游引物：5'-CACTTATCCTACTTTGGGATTAATGAGGGG-3'，
下游引物：5'-CCCCTCATTAATCCCAAAGTAGGATAAGTG-3'；
E190C
上游引物：5'-TTTGCCTATTATGTTTGTTCCACTGGCATACCA-3'，
下游引物：5'-TGGTATGCCAGTGGAACAAACATAATAGGCAAA-3'；
E238C
上游引物：5'-CAAATTTGTACTTCCTGTATTGAAACCAAAGAC-3'，
下游引物：5'-GTCTTTGGTTTCAATACAGGAAGTACAAATTTG-3'。
9.如权利要求1所述的脂肪酶突变体在油脂加工或生物柴油生产中的应用。
CN201811524189.9A 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用 Active CN109468301B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010637210.7A CN111944783B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用
CN201811524189.9A CN109468301B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811524189.9A CN109468301B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010637210.7A Division CN111944783B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109468301A true CN109468301A (zh) 2019-03-15
CN109468301B CN109468301B (zh) 2021-03-05

Family

ID=65676402

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010637210.7A Active CN111944783B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用
CN201811524189.9A Active CN109468301B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010637210.7A Active CN111944783B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN111944783B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110176272A (zh) * 2019-04-18 2019-08-27 浙江工业大学 一种基于多序列联配信息的蛋白质二硫键预测方法
CN110229805A (zh) * 2019-06-28 2019-09-13 浙江科技学院 一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
CN112375751A (zh) * 2021-01-18 2021-02-19 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 脂肪酶突变体及其应用
CN113215130A (zh) * 2021-05-11 2021-08-06 集美大学 磷脂酶c突变体、制备方法及其应用
CN115369099A (zh) * 2021-05-19 2022-11-22 中国科学院广州能源研究所 一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法
CN116121331A (zh) * 2022-12-15 2023-05-16 江苏亢钧生物科技有限公司 一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023158372A2 (en) * 2022-02-18 2023-08-24 Wilmar International Limited Engineering of rhizopus oryzae lipase to increase its thermostability for the production of structured triacylglycerols
CN114807091A (zh) * 2022-04-14 2022-07-29 云南师范大学 一种耐热性提高的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762277A (zh) * 2015-04-22 2015-07-08 江南大学 糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586203B (zh) * 2009-11-11 2013-04-17 江南大学 定向进化构建的催化活力提高的脂肪酶突变体
US9783750B2 (en) * 2012-02-16 2017-10-10 Smartflow Technologies, Inc. Biodiesel fuel production, separation methods and systems
CN104046602A (zh) * 2014-06-24 2014-09-17 东北农业大学 一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法
CN107858338B (zh) * 2017-11-29 2020-05-15 华南农业大学 一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762277A (zh) * 2015-04-22 2015-07-08 江南大学 糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SALAH，R.B.，等: "lipase precursor,partial [Rhizopus oryzae].", 《GENBANK登录号AAZ31460.1》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110176272A (zh) * 2019-04-18 2019-08-27 浙江工业大学 一种基于多序列联配信息的蛋白质二硫键预测方法
CN110229805A (zh) * 2019-06-28 2019-09-13 浙江科技学院 一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
CN110229805B (zh) * 2019-06-28 2020-11-17 浙江科技学院 一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
CN112375751A (zh) * 2021-01-18 2021-02-19 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 脂肪酶突变体及其应用
CN112375751B (zh) * 2021-01-18 2021-04-06 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 脂肪酶突变体及其应用
WO2022151568A1 (zh) * 2021-01-18 2022-07-21 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 脂肪酶突变体及其应用
CN113215130A (zh) * 2021-05-11 2021-08-06 集美大学 磷脂酶c突变体、制备方法及其应用
CN115369099A (zh) * 2021-05-19 2022-11-22 中国科学院广州能源研究所 一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法
CN115369099B (zh) * 2021-05-19 2023-06-09 中国科学院广州能源研究所 一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN116121331A (zh) * 2022-12-15 2023-05-16 江苏亢钧生物科技有限公司 一种高效检测毕赤酵母表达产物抑菌活性的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109468301B (zh) 2021-03-05
CN111944783B (zh) 2021-09-07
CN111944783A (zh) 2020-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109468301A (zh) 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用
CN105950585B (zh) 一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用
CN106047838B (zh) 一种高催化活性的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用
JP6592434B2 (ja) 脂質の製造方法
CN105143447B (zh) 具有木糖异构酶活性的蛋白质及其用途
Eriksen et al. Orthogonal fatty acid biosynthetic pathway improves fatty acid ethyl ester production in Saccharomyces cerevisiae
CN109161538A (zh) 一种热稳性提高的脂肪酶突变体及其应用
JP6319889B2 (ja) アシル−ａｃｐチオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法
Wang et al. A GFP-fusion coupling FACS platform for advancing the metabolic engineering of filamentous fungi
CN110982801A (zh) 转氨酶突变体及其构建方法和应用
CN109750012A (zh) 一种脂肪酶突变体及其应用
Bandhu et al. Overproduction of single cell oil from xylose rich sugarcane bagasse hydrolysate by an engineered oleaginous yeast Rhodotorula mucilaginosa IIPL32
Ye et al. Optimising nutrients in the culture medium of Rhodosporidium toruloides enhances lipids production
Zhao et al. Enhancing the thermostability of Rhizopus oryzae lipase by combined mutation of hot-spots and engineering a disulfide bond
CN113249239A (zh) 一种高产藏红花酸的酿酒酵母及其构建方法和应用
CN113604444B (zh) 一种催化活性提高的羧酸还原酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及应用
CN114561434B (zh) 裂殖壶菌发酵生产epa和dha的方法
JP2013500004A (ja) 炭水化物オキシダーゼ
JP6332855B2 (ja) アシル−ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法
CN108220268B (zh) 一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌
CN106754448A (zh) 一种重组酵母菌株及其应用
CA2727894A1 (en) Recombinant cells and plants for synthesis of very long chains fatty acid (vlcfa)
An et al. Improving phospholipase activity of PLA1 by protein engineering and its effects on oil degumming
Su et al. Development and application of a novel screening method and experimental use of the mutant bacterial strain Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 for production of butanol via fermentation of fresh cassava
JP6226464B2 (ja) チオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221111

Address after: 310000 1705, Building 2, Europe America Center, World Trade Lijing City, Xihu District, Hangzhou, Zhejiang

Patentee after: Zhejiang Rongrui Technology Co.,Ltd.

Address before: 310013 Yuhang Tang Road, Xihu District, Hangzhou, Zhejiang 866

Patentee before: ZHEJIANG University

TR01 Transfer of patent right