CN110229805A - 一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用 - Google Patents

一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，该谷氨酸脱羧酶突变体为下列之一：将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸突变为赖氨酸；将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第163位的丙氨酸突变为丝氨酸。本发明通过序列一致性方法对GAD1407基因编码的氨基酸序列中出现频率最高(保留阈值在60％以上)的8个位点进行定点突变，筛选获得酶活力性和热稳定性显著高于野生型酶的谷氨酸脱羧酶突变体(突变体T383K和A163S)的t1/2分别是野生型的1.74和1.45倍，T50 15分别比野生型提高了2.9℃和1.76℃。

Description

一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用。
背景技术
GABA(γ-Aminobutyric acid或γ-Aminobutanoic acid，简称GABA)是一种有生物活性的化合物，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有预防癌症、减缓心血管疾病、抗惊厥、降血压、镇静安神、醒酒等作用。此外，GABA可用于合成N-吡咯烷酮和尼龙4，在食品、医药和化工等领域应用广泛。
谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD；EC 4.1.1.15)是利用生物法制备GABA的关键酶。在辅酶磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5'-phosphate,PLP)存在下，GAD可专一性地催化L-谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)脱去α-羧基生成GABA。由于天然的GAD催化效率低和稳定性差等缺点，在工业上的应用有限。因此，提高GAD的催化性能对其在工业上的应用有重要的意义。
提高酶催化性能的方法有：利用半理性设计的方法在蛋白质底物口袋区域进行饱和突变；定点突变；引入二硫键；脯氨酸效应；利用FireProt对现有蛋白质进行快速和集中的重新设计等。一般来说，通过以上方法获得催化性能提高的突变株需要筛选大量的随机突变体，工作繁琐。幸运的是，根据序列或结构信息引导的序列一致性对同源基因中特定氨基酸进行突变可以提高定向进化的效率、减少工作量，该方法已成为改善酶催化性能的一种流行方法。
研究表明，同源蛋白质中某位置发生频率较高的氨基酸更有助于提高蛋白质的稳定性。Lehmann等(Lehmann M,Loch C,Middendorf A,et al.The consensus concept forthermostability engineering of proteins:further proof of concept.ProteinEngineering Design and Selection,2002,15(5):403-11.)基于13个同源植酸酶序列，通过序列一致方法合成植酸酶基因，编码的蛋白质在热变性过程中比亲本蛋白更稳定。Xie等(Xie DF,Yang JX,Lv CJ,et al.Construction of stabilized(R)-selective aminetransaminase from Aspergillus terreus by consensus mutagenesis.Journal ofBiotechnology,2019,293:8-16.)基于91个同源转氨酶序列，通过定点突变筛选到6个热稳定性提高的突变酶(I77L,Q97E,H210N,N245D,G292D,I295V)。
发明内容
本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，该谷氨酸脱羧酶突变体通过序列一致性方法筛选获得，与野生型酶相比，其热稳定性显著提高。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其为下列之一：
(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸突变为赖氨酸；
(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第163位的丙氨酸突变为丝氨酸。
本发明中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列是来源于短乳杆菌Lb.brevis CGMCCNo.1306的GAD1407基因的编码蛋白，即野生型酶。
本发明通过Consensus Finder(http://cbs-kazlab.oit.umn.edu/)预测了GAD1407基因及其同源蛋白中稳定的取代氨基酸残基，并对取代氨基酸残基所对应的位点进行定点突变，获得突变体，然后验证这些突变体的热稳定性，得到了热稳定性显著提高的谷氨酸脱羧酶突变体。
与野生型酶相比，上述谷氨酸脱羧酶突变体(即突变体T383K和突变体A163S)的t1/2分别是野生型的1.74和1.45倍，T50 15分别比WT提高了2.9℃和1.76℃。
上述谷氨酸脱羧酶突变体分别是由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸(密码子为ACT)突变为赖氨酸(密码子为AAA)，或者，由第163位的丙氨酸(密码子为GCC)突变为丝氨酸(密码子为AGC)。
本发明还提供了所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。
进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种包含所述编码基因的表达单元。
本发明还提供了一种包含所述表达单元的重组质粒。
本发明还提供了一种包含所述重组质粒的基因工程菌。
可以将目的基因片段整合到基因工程菌的基因组上，以获得稳定表达的谷氨酸脱羧酶突变体的基因工程菌，也可以通过质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的基因工程菌，优选为E.coli BL21(DE3)。
本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体能够催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸。
进一步地，本发明提供了一种催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备表达谷氨酸脱羧酶突变体的基因工程菌，所述谷氨酸脱羧酶突变体如权利要求1所述；
(2)培养所述基因工程菌，制备酶液；
(3)将所述酶液加入至含有底物L-谷氨酸和磷酸吡哆醛的缓冲体系中进行反应，得到γ-氨基丁酸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过序列一致性方法对GAD1407基因编码的氨基酸序列中出现频率最高(保留阈值在60％以上)的8个位点进行定点突变，筛选获得热稳定性显著高于野生型酶的谷氨酸脱羧酶突变体；突变体T383K和突变体A163S的t1/2分别是野生型的1.74和1.45倍，T50 15分别比WT提高了2.9℃和1.76℃。
(2)本发明还运用分子动力学模拟技术和差示扫描荧光法鉴定突变位点对蛋白质热稳定性的影响，并证实突变酶T383K、A163S比野生型具有更高的耐热性。
(3)本发明通过序列一致性方法提高了GAD的催化性能，不仅为GAD的工业应用提供了可靠方法，同时为提高其它酶的催化性能提供了指导。
附图说明
图1为实施例1中经序列一致分析后的8个突变体在GAD三级结构中的位置图(以球表示)及其序列一致性分析结果图；
其中，取代残基用球表示，取代残基对表示为weblogo标志(横坐标表示氨基酸位点，符号高度反映相应氨基酸在该位置的相对频率)。
图2为实施例1中野生型酶(WT)和突变体(H181R/T383K/A163S)的半衰期t1/2。
图3为实施例1中野生型酶(WT)和突变体(H181R/T383K/A163S)的半失活温度T50 15。
图4为实施例2中野生型酶(WT)与突变体的分子动力学模拟分析；
其中，A为313K下野生型酶WT与突变体H181R的RMSD值；
B为313K下野生型酶WT与突变体T383K的RMSD值；
C为313K野生型酶WT与突变体A163S的RMSD值；
D为313K下野生型酶WT与突变体H181R的RMSF值；
E为313K下野生型酶WT与突变体T383K的RMSF值；
F为313K下野生型酶WT与突变体A163S的RMSF值。
图5为实施例3中利用差示扫描荧光法测定的野生型(WT)和突变体(H181R/T383K/A163S)的去折叠情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下列实施例中涉及的材料和试剂若无特殊描述均为常规市售产品。
实施例1
1、突变文库的建立
在NCBI数据库中得到GAD的氨基酸序列(GenBank:ADG02973)，运用ConsensusFinder(http://cbs-kazlab.oit.umn.edu/)搜索GAD的相似序列，并删除过量表达的序列(CD-Hit冗余为0.9)，得到序列一致性分析结果(如表1)，选择保留阈值在60％以上的位点(T408A、T383K、D179E、A163S、I159L、Q156K、D45Y)进行定点突变。
表1突变列表
使用表2中的引物、pET-28a(+)-GAD质粒进行PCR扩增；在37℃条件下，PCR产物经Dpn I进行消化后，采用热激转化法转入到E.coliDH5α感受态细胞中，1h后将复苏液涂布于含有终浓度为50μg/μL卡那霉素的LB固体平板得到定点突变文库。
表2定点突变引物及其序列
下划线表示突变点。
重组质粒送至安徽通用生物系统有限公司进行核苷酸序列测定，将测序正确的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，以获取目标重组菌株。
2、酶的表达与纯化
挑取重组质粒的单菌落接种于5mL含有终浓度为50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h。随后，以2％(V/V)接种量接种于200mL含有终浓度为50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、180rpm下培养细胞。当OD600值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导。25℃、150min诱导8h-12h后，6000r/min、4℃离心10min收集菌体。0.02M的PBS缓冲液(pH 7.8)离心洗涤菌体细胞后，将菌体悬浮于30mL咪唑缓冲液中，冰浴条件下对菌体进行超声破碎(破胞条件：超声15min，工作3s，间歇6s，功率330w)。破胞结束后，细胞破碎液在8000r/min、4℃条件下离心45min，收集粗酶液。
随后，采用Ni-NTA亲和层析法(Ni-NTA层析介质购自北京全式金生物技术有限公司)对粗酶液进行分离纯化，粗酶液经上样、清洗、洗脱后得到纯酶液，操作步骤参照说明书进行。
3、蛋白含量的测定
采用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)建立蛋白含量标准曲线，测定纯酶的浓度，蛋白标准曲线的制备步骤参照说明书进行。
采用SDS-PAGE方法(12％分离胶和5％浓缩胶)鉴定纯化后蛋白的分子量和纯度。
4、动力学稳定性的测定
4.1野生型和突变体动力学稳定性的测定
半衰期(t1/2)的测定：纯酶分别在55℃下孵育10、20、30、40、50、60、70、80min后，迅速放到冰上冷却5min。实验以对酶不进行孵育的酶活为100％，采用第4部分酶活力的测定方法测定残余酶活。所得数据使用Origin 8.0软件的Exp2P型函数拟合曲线，并计算酶活力降低到50％时所对应的时间(t1/2)。
半失活温度(T50 15)的测定：半失活温度(T50 15)是指纯酶在30～70℃下孵育15min后，酶活力降低到50％时所对应的温度，这是表征酶热稳定性的一个重要参数。纯酶分别在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下孵育15min后，迅速放冰上冷却5min。实验以对酶不进行孵育的酶活为100％，采用第4部分酶活力的测定方法测定残余酶活。所得数据运用Origin 8.0软件的Boltzmann S型函数拟合曲线，并计算酶活力降低到50％时所对应的温度。
4.2野生型和突变体动力学稳定性的测定结果
以温度为横坐标，热处理后与处理前比活力的比值为纵坐标作图，计算GAD-WT和突变体半衰期(t1/2)。
如图2所示，55℃下WT的t1/2为24.05min，而突变酶H181R、T383K和A163S的t1/2为15.22min、41.77min、34.89min，分别是GAD-WT的0.63、1.74和1.45倍；55℃条件下处理70min后，GAD-WT的残余酶活力仅为20.20％，而突变酶T383K和A163S的残余酶活力仍有40.74％和29.45％，说明突变酶T383K和A163S比WT更耐高温，对热有更强的抗性。
同样，以温度为横坐标，热处理后与处理前比活力的比值为纵坐标作图，计算半失活温度(T50 10)。
如图3所示，GAD-WT的T50 15为56.21℃，突变酶H181R、T383K和A163S的T50 15为52.96℃、59.20℃和57.97℃，突变酶T383K和A163S分别比GAD-WT提高了2.9℃和1.76℃；60℃条件下处理15min后，GAD-WT的残余酶活力降为25.33％，而突变酶T383K的残余活力为40.25％，突变酶A163S的残余酶活力为33.22％。说明与WT的热稳定性相比，突变酶T383K和A163S的热稳定性增加。
实施例2野生型和突变体的分子动力学模拟
分子动力学(MD)模拟是通过研究蛋白质的折叠与展开，从结构上分析蛋白质稳定性的一种方法。均方根偏差(Root mean square deviation,RMSD)被用来检测蛋白结构整体的稳定性，评估动力学模拟的质量，均方根涨落(Root mean square fluctuation，RMSF)被用来检测蛋白结构局部的稳定性。
Lb.brevis CGMCC 1306GAD野生型和突变体的三维结构，经FoldX软件进行能量最小化处理，运用Yasara软件(版本16.4.6)的Amber 14力场在313K下对其进行长达200nm的分子动力学模拟。
模拟程序：野生型和突变体三维结构用密度为0.98g/L水分子填充后置于距蛋白质表面的立方体中，钠离子和氯离子作为反离子使系统呈电中性，并在pH 4.8的基础上对电离基团的pKa值进行了预测。范德华力(VanderWaals)的截断距离为采用Particle Mesh Ewald(PME)方法计算长程静电相互作用。时间步长为2.5fs，轨迹每25ps保存一次。用Microsoft Excel和origin 8.0软件分析模拟轨迹。
RMSD值是根据所有残基的骨架计算出来的，用来探索蛋白整体结构的灵活性，蛋白结构越灵活其稳定性越差。
通过分析RMSD值(图4A,B,C)，可得出突变位点对GAD热稳定性的影响：GAD野生型(WT)的RMSD在8.5ns处达到平衡，突变体H181R、T383K、A163S分别在6ns、2.5ns、5.8ns处达到平衡。平衡后，WT的RMSD平均为4.802，而突变体H181R、T383K、A163S的RMSD平均分别为6.692、3.725、3.486。MD模拟运行的大部分时间里，突变体H181R的RMSD值高于GAD-WT的RMSD值，突变体T383K和A163S的RMSD值低于GAD-WT的RMSD值，表明突变体H181R的构象灵活性增加，突变体T383K和A163S的构象灵活性降低，即突变体H181R的稳定性下降，突变体T383K和A163S的稳定性增加。
通过分析每个氨基酸的RMSF(图4D,E,F)值，反映出模拟过程中GAD-WT和突变体蛋白结构的局部灵活性。突变体H181R在蛋白质N端以及突变位点的RMSF值比GAD-WT高，突变体A163S在蛋白质N端以及突变位点的RMSF值比野生型低，但是突变体T383K整个蛋白质的RMSF值基本上均比野生型低；说明181位点突变后该区域灵活性增加，稳定性降低，而383、163位点突变后，其区域灵活性降低，稳定性增加。
实施例3差示扫描热量法测量蛋白质热解折叠
示差扫描荧光测定法(differential scanning fluorimetry，DSF)是一种快速、简便研究蛋白质稳定性的方法。当蛋白质展开时，其疏水部分暴露出来，SYPRO Orange dye荧光染料特异性地与蛋白质的疏水部分结合，蛋白质的解折叠状态可通过荧光染料的强度来描述。
DSF方法：49μL 0.15mg/ml的纯酶和1μL 1×SYPRO Orange dye荧光染料(含150mMNaCl，pH 7.8的50mM PBS缓冲液稀释纯酶和荧光染料)混合后，放入荧光定量PCR仪中测定28-56℃下样品随着温度升高荧光强度的变化。每个温度持续30s，升温速率0.7℃/s，激发波长为490nm，发射波长为605nm。实验以缓冲液代替纯酶作为阴性对照，并进行平行实验。
通过DSF(差示扫描荧光法)测量蛋白质对热变性的稳定性。运用软件得到如图5所示的蛋白熔融曲线。
WT的Tm值为40.63℃，而突变型H181R、T383K和A163S的Tm值分别为37.54℃、41.89℃和41.17℃(图5)。与GAD野生型的Tm值相比，H181R的Tm比其低3.09℃，而突变体T383K和A163S的Tm值分别比其高1.26℃、0.44℃，说明181位点由组氨酸突变成精氨酸后，蛋白热稳定性降低，而383位点由苏氨酸突变成赖氨酸以及163位点由丙氨酸突变为丝氨酸后，蛋白具有更高的热稳定性。
序列表
<110> 浙江科技学院
<120> 一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 468
<212> PRT
<213> 短乳杆菌(Lactobacillus)
<400> 1
Met Ala Met Leu Tyr Gly Lys His Thr His Glu Thr Asp Glu Thr Leu
1 5 10 15
Lys Pro Ile Phe Gly Ala Ser Ala Glu Arg His Asp Leu Pro Lys Tyr
20 25 30
Lys Leu Ala Lys His Ala Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Arg Leu Val
35 40 45
Arg Asp Gln Leu Leu Asp Glu Gly Asn Ser Arg Leu Asn Leu Ala Thr
50 55 60
Phe Cys Gln Thr Tyr Met Glu Pro Glu Ala Val Glu Leu Met Lys Asp
65 70 75 80
Thr Leu Glu Lys Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Ala
85 90 95
Glu Ile Glu Asn Arg Cys Val Asn Ile Ile Ala Asn Leu Trp His Ala
100 105 110
Pro Glu Ala Glu Ser Phe Thr Gly Thr Ser Thr Ile Gly Ser Ser Glu
115 120 125
Ala Cys Met Leu Ala Gly Leu Ala Met Lys Phe Ala Trp Arg Lys Arg
130 135 140
Ala Lys Ala Asn Gly Leu Asp Leu Thr Ala His Gln Pro Asn Ile Val
145 150 155 160
Ile Ser Ala Gly Tyr Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Val Tyr Trp
165 170 175
Asp Ile Asp Met His Val Val Pro Met Asp Asp Asp His Met Ser Leu
180 185 190
Asn Val Asp His Val Leu Asp Tyr Val Asp Asp Tyr Thr Ile Gly Ile
195 200 205
Val Gly Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Gly Gln Tyr Asp Asp Leu Ala
210 215 220
Arg Leu Asp Ala Val Val Glu Arg Tyr Asn Arg Thr Thr Lys Phe Pro
225 230 235 240
Val Tyr Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Pro Phe
245 250 255
Ile Glu Pro Glu Leu Lys Trp Asp Phe Arg Leu Asn Asn Val Ile Ser
260 265 270
Ile Asn Ala Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val Gly
275 280 285
Trp Val Ile Trp Arg Asp Gln Gln Tyr Leu Pro Lys Glu Leu Val Phe
290 295 300
Lys Val Ser Tyr Leu Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala Ile Asn Phe
305 310 315 320
Ser His Ser Ala Ser Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe Ile Arg
325 330 335
Phe Gly Phe Asp Gly Tyr Arg Glu Ile Gln Glu Lys Thr His Asp Val
340 345 350
Ala Arg Tyr Leu Ala Lys Ser Leu Thr Lys Leu Gly Gly Phe Ser Leu
355 360 365
Ile Asn Asp Gly His Glu Leu Pro Leu Ile Cys Tyr Glu Leu Thr Ala
370 375 380
Asp Ser Asp Arg Glu Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Asp Arg Leu Leu
385 390 395 400
Met Lys Gly Trp Gln Val Pro Thr Tyr Pro Leu Pro Lys Asn Met Thr
405 410 415
Asp Arg Val Ile Gln Arg Ile Val Val Arg Ala Asp Phe Gly Met Ser
420 425 430
Met Ala His Asp Phe Ile Asp Asp Leu Thr Gln Ala Ile His Asp Leu
435 440 445
Asp Gln Ala His Ile Val Phe His Ser Asp Pro Gln Pro Lys Lys Tyr
450 455 460
Gly Phe Thr His
465
<210> 2
<211> 1408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
atggctatgt tatatggtaa acacacgcat gaaacagatg agacgctcaa accaatcttc 60
ggggccagcg ctgaacgcca cgacctcccc aaatataaat tggcaaagca cgcgctcgag 120
ccccgtgaag ccgatcgatt ggttcgcgat caactattgg atgaaggaaa ctcgcggctg 180
aatctcgcca cgttctgtca gacttacatg gaaccggaag cggttgaact catgaaagat 240
acactggaga aaaacgccat cgataaatcc gagtatcctc ggaccgctga aattgaaaat 300
cgttgcgtta atatcattgc caacctctgg catgctccag aagctgagtc gttcactggc 360
acctcgacga ttggttcctc cgaggcctgc atgctggccg gtttggcgat gaagtttgct 420
tggcgtaagc gcgccaaagc gaacggtctt gacttaactg cccatcaacc taatattgtc 480
atctcagccg gttatcaagt ttgttgggaa aaattctgtg tctattggga catcgacatg 540
catgtcgttc ccatggacga tgaccacatg tccttgaatg tcgatcacgt gttagattac 600
gtggatgact acaccattgg tatcgttggc attatgggca tcacttatac tggacaatac 660
gacgatttag cccgattaga tgccgttgta gagcggtaca atcggacgac taagttcccg 720
gtatatatcc atgtcgatgc cgcttccggc ggattttaca cgccgtttat tgaacccgag 780
ctcaagtggg acttccgttt aaacaacgtg atttccatca atgcctccgg ccacaaatat 840
ggcttggttt atcccggagt cggctgggta atctggcgtg accaacagta tctaccaaaa 900
gagctggtct ttaaggtcag ctacttgggt ggtgaactac ctacgatggc catcaacttc 960
tcccacagtg cctcccaatt aatcggtcag tattacaact ttattcgctt tggttttgat 1020
ggctatcgtg aaattcaaga aaaaactcac gacgttgccc gctatctcgc gaaatcgctc 1080
actaaattag ggggcttttc cctcattaat gacggccacg agttaccgct gatctgttat 1140
gaactcaaag ccgattctga tcgcgaatgg accctctacg atttatccga tcggttatta 1200
atgaagggct ggcaggttcc cacctatccc ttaccaaaaa acatgacgga ccgcgttatt 1260
caacggatcg tggttcgggc tgactttggt atgagtatgg cccacgactt tattgatgat 1320
ctaacccaag ccattcacga tctcgaccaa gcacacatcg ttttccatag tgatccgcaa 1380
cctaaaaaat acggattcac tcactaag 1408
<210> 3
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atggctatgt tatatggtaa acacacgcat gaaacagatg agacgctcaa accaatcttc 60
ggggccagcg ctgaacgcca cgacctcccc aaatataaat tggcaaagca cgcgctcgag 120
ccccgtgaag ccgatcgatt ggttcgcgat caactattgg atgaaggaaa ctcgcggctg 180
aatctcgcca cgttctgtca gacttacatg gaaccggaag cggttgaact catgaaagat 240
acactggaga aaaacgccat cgataaatcc gagtatcctc ggaccgctga aattgaaaat 300
cgttgcgtta atatcattgc caacctctgg catgctccag aagctgagtc gttcactggc 360
acctcgacga ttggttcctc cgaggcctgc atgctggccg gtttggcgat gaagtttgct 420
tggcgtaagc gcgccaaagc gaacggtctt gacttaactg cccatcaacc taatattgtc 480
atctcaagcg gttatcaagt ttgttgggaa aaattctgtg tctattggga catcgacatg 540
catgtcgttc ccatggacga tgaccacatg tccttgaatg tcgatcacgt gttagattac 600
gtggatgact acaccattgg tatcgttggc attatgggca tcacttatac tggacaatac 660
gacgatttag cccgattaga tgccgttgta gagcggtaca atcggacgac taagttcccg 720
gtatatatcc atgtcgatgc cgcttccggc ggattttaca cgccgtttat tgaacccgag 780
ctcaagtggg acttccgttt aaacaacgtg atttccatca atgcctccgg ccacaaatat 840
ggcttggttt atcccggagt cggctgggta atctggcgtg accaacagta tctaccaaaa 900
gagctggtct ttaaggtcag ctacttgggt ggtgaactac ctacgatggc catcaacttc 960
tcccacagtg cctcccaatt aatcggtcag tattacaact ttattcgctt tggttttgat 1020
ggctatcgtg aaattcaaga aaaaactcac gacgttgccc gctatctcgc gaaatcgctc 1080
actaaattag ggggcttttc cctcattaat gacggccacg agttaccgct gatctgttat 1140
gaactcactg ccgattctga tcgcgaatgg accctctacg atttatccga tcggttatta 1200
atgaagggct ggcaggttcc cacctatccc ttaccaaaaa acatgacgga ccgcgttatt 1260
caacggatcg tggttcgggc tgactttggt atgagtatgg cccacgactt tattgatgat 1320
ctaacccaag ccattcacga tctcgaccaa gcacacatcg ttttccatag tgatccgcaa 1380
cctaaaaaat acggattcac tcactaa 1407
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
caggttcccg cgtatccctt accaaaaaac 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
aagggatacg cgggaacctg ccagcccttc 30
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ctgttatgaa ctcaaagccg attctgatcg cg 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gatcagaatc ggctttgagt tcataacaga tc 32
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
atcgacatgc gtgtcgttcc catg 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gggaacgaca cgcatgtcga tgtc 24
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ttgggacatc gaaatgcatg tcgttcc 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
acgacatgca tttcgatgtc ccaatag 27
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
acctaatatt gtcatctcaa gcggttatca agtttgttgg g 41
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
caacaaactt gataaccgct tgagatgaca atattaggtt g 41
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
catcaaccta atctggtcat ctcagccgg 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ggctgagatg accagattag gttgatggg 29
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
aactgcccat aaacctaata ttgtc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
aatattaggt ttatgggcag ttaag 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ccgtgaagcc tatcgattgg ttcg 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
aaccaatcga taggcttcac gggg 24

Claims (8)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，为下列之一：
(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸突变为赖氨酸；
(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第163位的丙氨酸突变为丝氨酸。
2.如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
4.一种包含权利要求2或3所述编码基因的表达单元。
5.一种包含权利要求4所述表达单元的重组质粒。
6.一种包含权利要求5所述重组质粒的基因工程菌。
7.如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸中的应用。
8.一种催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备表达谷氨酸脱羧酶突变体的基因工程菌，所述谷氨酸脱羧酶突变体如权利要求1所述；
(2)培养所述基因工程菌，制备酶液；
(3)将所述酶液加入至含有底物L-谷氨酸和磷酸吡哆醛的缓冲体系中进行反应，得到γ-氨基丁酸。
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