CN105462949A - 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方法和用途，该突变体的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明还公开了一种包含编码谷氨酸脱羧酶突变体基因的表达单元、重组质粒和转化子。本发明根据与嗜热古细菌(Thermococcus？kodakarensis)GAD氨基酸序列的比对信息，采用定点突变的方法在短乳杆菌GAD对应的氨基酸位点引入脯氨酸残基，通过理性设计提高GAD的热稳定性，该突变酶在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的过程中具有更好的热稳定性，有利于GABA的工业化生产。

Description

一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方法和用途。
背景技术
谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15)以磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶，能专一性地催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate，GABA)的酶。GABA广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，在哺乳动物中枢神经系统中具有抑制过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。此外，GABA具有预防血管硬化、延缓衰老、修复皮肤、降血压、镇静安神、改善睡眠和记忆力等多种重要的生理功能，被广泛应用于医药卫生、功能食品和动物饲料等行业。2009年，我国卫生部正式批准GABA为“新资源食品”。
在工业生产过程中，良好的热稳定性是理想的生物催化剂所应具备的特征之一。工业生物催化过程中酶不仅处于不断“消耗”的过程，而且操作过程中会有针对性地采用更高的温度，以提高反应速率，增加底物溶解度，降低体系粘度等，因此对酶的热稳定性提出了更高的要求。细菌中GAD酶在50℃以上极易失活，这严重制约GAD在工业生产中的应用。
本课题组前期筛选到一种生产γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306，对该菌株的GAD基因进行克隆，构建重组质粒pET28a(+)-GAD1407，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，实现了可溶性表达(申请号201010567447.9的专利文献)。但是，实验表明谷氨酸脱羧酶在55℃下的半衰期仅为30.9min，非常不利于GAD在GABA生物制备中的应用，其耐热性稳定性有待进一步提高。
定点突变(site-directedmutagenesis)是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(基因组或质粒)中引入特定碱基对的技术(包括碱基的添加、删除、点突变等)，通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，可迅速、高效的提高DNA所表达目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
大量研究表明，蛋白质分子中引入脯氨酸(Prolinetheory)可以降低蛋白质去折叠的骨架熵，增加蛋白质的刚性，显著提高蛋白质的热稳定性。但是蛋白质的热稳定性受诸多因素的影响，因此并非所有的脯氨酸替换都能提高蛋白质的热稳定性，只有在合适的位点进行脯氨酸替换才能真正改善其热稳定性。
公告号为CN103031322B的专利文献公开了一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因，其核苷酸序列在第311位有定点突变。公告号为CN103031323B的专利文献公开了一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定点突变。研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在在60℃和70℃下的热稳定性。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
HaruyukiAtomi等(JournalofBacteriology，2014，196)报道嗜热古细菌ThermococcuskodakarensisGAD的最适反应温度达到80℃，该酶在80℃和90℃的半衰期分别为10h和5.5h。应用同源比对策略，对热稳定性差的野生型蛋白质进行改造将是提高蛋白质热稳定性的有效手段。
发明内容
本发明根据与嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)GAD氨基酸序列的比对信息，采用定点突变的方法在短乳杆菌GAD对应的氨基酸位点引入脯氨酸残基，通过理性设计提高GAD的热稳定性，获得的突变体比野生型GAD具有更好的热稳定性，提高了GAD在工业上的应用价值。
一种谷氨酸脱羧酶突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明研究的基础是来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306的GAD1407基因。本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列的第364位由甘氨酸G突变为脯氨酸P，该突变体(G364P)的半失活温度(T50 15)为61.6℃，比野生型酶提高2.5℃；在55℃下的半衰期(t1/2)为45.4min，比野生型酶延长14.5min。
本发明提供了编码所述谷氨酸脱羧酶突变体的基因。本发明将编码野生型谷氨酸脱羧酶第364位甘氨酸的密码子GGG替换为编码脯氨酸的CCG，该突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供了包含所述基因的表达单元、重组质粒和转化子。
作为优选，所述表达单元的启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，谷氨酸脱羧酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。
作为优选，所述重组质粒的原始载体为质粒pET28a(+)。
作为优选，所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
本发明还提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将来自嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)的谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列与野生型谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行比对，选择来自嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)的谷氨酸脱羧酶中脯氨酸所对应的野生型谷氨酸脱羧酶氨基酸位点为突变位点；
(2)针对所述突变位点替换为脯氨酸设计定点突变引物，以野生型谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行PCR扩增，扩增产物转化至宿主细胞，表达获得定点突变体；
(3)从所有突变体中筛选获得热稳定性最高的酶突变体。
该方法可有效增加突变成功的概率，降低筛选工作量，提高实验效率。采用该方法获得的突变体比野生型GAD具有更好的热稳定性，从而证明了本发明通过同源比对策略选择突变位点的筛选方案是可行的。
作为优选，所述野生型谷氨酸脱羧酶分离自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)。
本发明对短乳杆菌GAD氨基酸序列与嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)GAD氨基酸序列对比，引入脯氨酸的突变位点分别为M70、K89、S162、A224、A242、A261、G277、Y284、V306、V323、G364、G372、A427，采用PCR定点突变的方法对上述位点进行突变，获得突变酶。通过测定半失活温度(T50 15)和半衰期(t1/2)对突变酶的热稳定性进行表征，最终获得一种GAD热稳定性提高的突变体(G364P)。
作为优选，制备核苷酸序列如SEQIDNO.1的GAD突变体的定点突变引物为：
G364P-F：5’-ATCGCTCACTAAATTACCGGGCTTTTCCCTCATTAAT-3’；
G364P-R：5’-TAATGAGGGAAAAGCCCGGTAATTTAGTGAGCGATTTC-3’。
本发明还提供了所述谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸中的应用。
本发明具备的有益效果：本发明与嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)GAD氨基酸序列比对，采用定点突变的方法在在短乳杆菌GAD对应的氨基酸位点引入脯氨酸残基，该方法有效提高正突变概率，节省时间，提高实验效率及可行性，并筛选得到热稳定性优于野生酶的突变酶，该方法能为其它酶的热稳定性改造提供借鉴和应用。该突变酶在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的过程中具有更好的热稳定性，有利于GABA的工业化生产。
附图说明
图1为野生酶GAD(gi|2953880)与嗜热古细菌ThermococcuskodakarensisGAD(gi|5716007)的氨基酸序列比对图。
图2为质粒pET28a(+)-gad的基因图谱。
图3为定点突变原理示意图。
图4为GAD突变体G364P的SDS-PAGE图，其中1：Proteinmarker；2：40mM咪唑洗脱的样品；3：100mM咪唑洗脱样品；4：250mM咪唑洗脱样品。
图5为突变酶G364P和野生酶GAD在pH4.8条件下的半失活温度(T50 15)，其中A为野生酶GAD，B为突变酶G364P。
图6为突变酶G364P和野生酶的半衰期t1/2，其中A为野生酶GAD，B为突变酶G364P。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实例进行具体说明。
本发明研究的基础是来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306中的GAD基因。其中短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306已在中国专利申请200510049189.4和中国专利申请200510049187.5中公开，由浙江大学保藏在中国普通微生物保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)。本申请使用的菌株由浙江大学馈赠。
表达宿主菌E.coliBL21(DE3)为浙江大学生物工程研究所保藏；pET28a(+)-GAD1407重组质粒由浙江大学生物保存；FastDigestDpnI限制酶购自FermentasInternationalInc.Canada；PrimeStarMaxDNA聚合酶购自TaKaRa公司；Ni-NTAagarose层析介质购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNAMarker、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。培养基为LB培养基，表达培养基为TB(胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4mL/L、KH2PO417mmol/L、K2HPO472mmol/L)培养基，均含有50μg/mL卡那霉素。
本发明根据与古细菌(Thermococcuskodakarensis)中GAD氨基酸序列的比对(图1)，采用定点突变的方法在短乳杆菌GAD对应的氨基酸位点引入脯氨酸残基，引入脯氨酸的突变位点分别为M70、K89、S162、A224、A242、A261、G277、Y284、V306、V323、G364、G372、A427，采用PCR定点突变的方法对上述位点进行突变，获得突变酶。通过测定半失活温度(T50 15)和半衰期(t1/2)对突变酶的热稳定性进行表征，最终获得一种GAD热稳定性最高的突变体。定点突变原理的示意图，如图3所示。该突变体经过测序证实为G364P，其核苷酸序列在第1090及1091位碱基处发生突变，由编码甘氨酸(Gly)的密码子GGG突变为编码脯氨酸(Pro)的密码子CCG。研究发现，此位点密码子突变后得到的变体基因编码的GAD热稳定性有显著增强。
实施例1
一、构建突变体
根据短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)GAD1407的谷氨酸脱羧酶基因设计13对定点突变引物，其中突变体G364P的引物如下：
G364P-F：5’-ATCGCTCACTAAATTACCGGGCTTTTCCCTCATTAAT-3’；
G364P-F：5’-TAATGAGGGAAAAGCCCGGTAATTTAGTGAGCGATTTC-3’；
以pET28a(+)-GAD1407质粒(图2)为模板，进行定点PCR扩增(图3)。PCR扩增体系为50μL，包含：PrimeSTARMaxDNAPolymerase25μL，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，1μL质粒模板(100ng/μL)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。
PCR扩增程序为：98℃变性1min后，进入扩增循环，即98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共循环30次，最后再72℃延伸7min。PCR产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。
所得定点PCR反应产物用DpnI在37℃下酶解2h以消除父本模板，酶解产物采用热激法转化入化学感受态细胞E.coliDH5α，转化液涂布含有卡那霉素(50μg/μL)的LB固体平板上，于37℃培养12h。
二、突变酶和野生型GAD的表达和纯化
随机挑取1-3个单菌落，培养并提取质粒，样品送至通用生物系统(安徽)有限公司测定核苷酸序列，以确定是否引入预期的突变。将引入预期突变的质粒转化入E.coliBL21(DE3)中，挑取单菌落接种至加有5mLLB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以2％比例(体积比)的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的100mL的TB培养基中，37℃，180r/min培养至OD600值为0.6～0.8时，加入适量体积的IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，然后在25℃，150r/min条件下诱导培养8h后收集菌体。
诱导结束后，4℃下6000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用去离子水洗涤1～2次，除尽培养基后，用原发酵液体积1/10的pH7.5的磷酸裂解缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞14min(功率33％，工作3s，间隙6s)，在4℃、12000r/min的条件下离心20min，收集上清液，同法对上清液再次离心，收集上清液即得到含有GAD的粗酶液。
采用Ni-NTA亲和层析柱对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样(loading)、清洗(washing)和洗脱(eluting)，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度(图4)。
所用缓冲液配制如下：
裂解缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，0.3MNaCl，20mM咪唑，pH7.5；
洗柱缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，0.3MNaCl，40mM咪唑，pH7.5；
洗脱缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，0.3MNaCl，100mM咪唑，pH7.5；
洗脱缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，0.3MNaCl，250mM咪唑，pH7.5；
透析缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，pH7.5。
三、酶活性的标准曲线
将GABA和L-谷氨酸钠(L-MSG)标准品分别用0.2mol/L的NaHCO3溶液(pH9.8)配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、5、10mM不同浓度的标准溶液，然后取0.5mL，再加入等量的DNS-Cl丙酮(8g/L)溶液，避光置于30℃下衍生1h，采用高效液相色谱法(HPLC法)测定，以峰面积Area(mAU·s)对浓度(mM)进行线性回归。
四、酶活力的测定
取400μL底物溶液(pH4.8、0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，含0.01mmol/LPLP、100mmol/L底物L-MSG)加入到1.5mL离心管中，置于37℃金属浴中预热，然后加入20μL纯酶(1mg/mL)迅速混匀，在37℃的条件下反应15min，反应结束后，取样品0.1mL加入0.2mol/LpH9.8的NaHCO30.9mL以终止反应，离心，然后取0.5mL，再加入等量DNS-Cl丙酮(8g/L)溶液，避光，置于30℃下衍生1h，衍生后的样品经0.22μm微孔滤膜过滤后采用高效液相色谱法(HPLC法)测定反应生成的GABA的含量，以测定酶的活力。
HPLC操作条件如下：色谱分离柱为HypersilODS2C18(250mm×4.6mm)(伊利特公司)，紫外检测波长为254nm，进样量为10μL，控制柱温25℃，流动相A为甲醇，流动相B为：四氢呋喃：甲醇：0.05mol/L醋酸钠(pH6.2)(5：75：420，V/V/V)。梯度洗脱程序见表1。
表1HPLC梯度洗脱程序
五、酶的热力学参数的测定
半失活温度(T50 15)：酶在特定温度下孵育15min后，酶活力丧失一半的温度，这是表征酶热稳定性的一个重要参数。分别将野生酶和突变酶在在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃条件下分别保温15min后，立即冰浴上放置5min，然后采用酶活力测定的方法测定纯酶的比活力，以表征酶的热稳定性。以温度为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，计算半失活温度(T50 15)。
实验结果如图5所示，G364P突变体与野生型的T50 15分别为61.6℃、59.1℃，G364P突变体相比野生型酶提高2.5℃。
半衰期(t1/2)是指特定温度下酶活力丧失一半的时间，是表征酶热稳定性的另一个重要参数。将父本酶和突变酶在55℃下分别保温10、20、30、40、50、60、70min，保温结束后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以时间为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，作图可以计算出酶活力降低为50％时所对应的保温时间(t1/2)。
结果如图6所示，G364P的t1/2为45.4min，比野生型酶延长14.5min。
由此说明，364位点发生的G364P替换增强了该蛋白的热稳定性，减缓了酶的热失活速率，使得突变酶可以耐受更高的温度而不丧失活力。这一特性将有利于G364P突变体在GABA大规模生物制备中的应用。

Claims (10)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.编码权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达单元。
5.如权利要求4所述的表达单元，其特征在于，启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。
6.一种包含权利要求4所述表达单元的重组质粒。
7.一种包含权利要求6所述重组质粒的转化子。
8.一种谷氨酸脱羧酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将来自嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)的谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列与野生型谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行比对，选择来自嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)的谷氨酸脱羧酶中脯氨酸所对应的野生型谷氨酸脱羧酶氨基酸位点为突变位点；
(2)针对所述突变位点替换为脯氨酸设计定点突变引物，以野生型谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行PCR扩增，扩增产物转化至宿主细胞，表达获得定点突变体；
(3)从所有突变体中筛选获得热稳定性最高的酶突变体。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述野生型谷氨酸脱羧酶分离自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)；
所述定点突变引物为：
G364P-F：5’-ATCGCTCACTAAATTACCGGGCTTTTCCCTCATTAAT-3’；
G364P-R：5’-TAATGAGGGAAAAGCCCGGTAATTTAGTGAGCGATTTC-3’。
10.如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸中的应用。
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