CN105462998B - 一种双功能酸性脲酶结构基因及其表达和应用 - Google Patents

一种双功能酸性脲酶结构基因及其表达和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸性脲酶结构基因及其表达和应用。本发明是将来源于普罗维登斯菌JN‑B815(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326)的脲酶结构基因ureABC连接到大肠杆菌表达载体pET‑28a上，然后将重组质粒pET‑28a‑ureABC导入E.coli BL21(DE3)。用此重组菌能表达含有结构亚基的可溶性酸性脲酶。经镍柱纯化后，此脲酶体现出与原始菌中提取的酸性脲酶具有相同的性质，同时体现出脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活。

Description

一种双功能酸性脲酶结构基因及其表达和应用
技术领域
本发明涉及一种酸性脲酶，特别是一种酸性双功能脲酶基因，属于生物工程技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(EC)是一种广泛存在于发酵食品和酒精饮料中，自然生成的具有致癌性的物质，由乙醇和尿素反应产生。由于氨基甲酸乙酯的致癌性，严格控制食品及酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量已经备受关注。
尿素作为产生氨基甲酸乙酯的前体物质，主要由发酵过程中精氨酸代谢产生。因此，从去除尿素的水平来控制酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量是一种比较可行的方案。目前，通过向酒精饮料中添加适量脲酶以酶解法的方式去除尿素被视作最具高效性和特异性的方法。
尽管有许多被认知的细菌脲酶和植物脲酶已经被广泛研究，但由于其最适pH均在中性或碱性，大多数脲酶在实际应用中均受到限制。并且，我国出口黄酒中所用脲酶均为日本进口，国际上关于氨基甲酸乙酯降解酶的报道也较少。因此，表达和生产一种酒用酸性脲酶(最适pH2-5，乙醇耐受性达10％-20％)用以提升我国酿酒业的品质以及拓展国际市场具有重要意义。
本发明中重组大肠杆菌所表达的可溶性脲酶，虽只具有脲酶的结构亚基，但体现出与原始菌产酸性脲酶具有相同的双功能酶性质，表现出能同时分解尿素及氨基甲酸乙酯的特性。这一特性使得酸性脲酶对于黄酒中EC含量的控制具有双重作用。进而能进一步降低黄酒中EC的含量，为将来此类双功能酶在黄酒中的应用奠定了基础。
发明内容
本发明的第一个目的提供一种新的双功能脲酶基因核苷酸序列如下所述：
1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2)在SEQ ID NO.1基础上进行过缺失、突变修饰，同源率高于90％，且具有脲酶及氨基甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。
含有权利要求1所述脲酶结构基因的基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明要求保护的范围。
所述普罗维登斯菌JN-B815由本实验室筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326。
本发明的第二个目的是提供重组E.coli BL21(DE3)诱导表达可溶性脲酶的方法。
本发明的第五个目的是脲酶在黄酒中的应用。
本发明技术方案：一种胞内表达来源于普罗维登斯菌JN-B815酸性脲酶的重组E.coli BL21(DE3)的构建方法，是将来源于普罗维登斯菌JN-B815的酸性脲酶结构基因ureABC导入E.coli BL21(DE3)中得到基因工程菌。利用构建好的工程菌发酵制备含有结构亚基的可溶性脲酶，并对酸性脲酶进行纯化。
克隆方法可以采用化学合成法或PCR方法，本实验以PCR方法为例，但不限于PCR方法，具体步骤为：
(1)用酸性脲酶结构基因序列设计一对引物Fs、Rs，以普罗维登斯菌JN-B815基因组为模板扩增出目的基因ureABC：
Fs：CCGGAATTCATGCAATTAACCCCAAGGGAAATTGAA(EcoRⅠ)；
Rs：ACGCGTCGACTTAACCAAAGAAATAACGTTGGTTCAT(SalⅠ)；
下划线表示酶切位点碱基序列。
(2)将目的基因ureABC连接至pET-28a载体上，获得重组载体pET-28a-ureABC,转化E.coli JM109涂布于含有卡那抗性的LB固体平板上，培养12h，挑取阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，提取质粒，进行双酶切验证。验证正确的重组载体送往上海生工进行测序。
(3)将重组载体转化E.coli BL21(DE3)，获得重组E.coli BL21(DE3)。并以1％的接种量接种于50mL的LB中，其中含卡那霉素50μg/mL，37℃、200rpm培养至OD600值0.8～1.0之间，加入IPTG至终浓度0.5mM，25℃、200rpm培养10h。
(4)将所得发酵液10000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀用10mL 25mM pH7.0的柠檬酸(pH4.5)缓冲液重新悬浮，超声破碎后，离心收集上清，获得脲酶粗酶液。
(5)将步骤4)中所得粗酶用镍柱亲和层析进行纯化。流动相A为含20mM咪唑的柠檬酸缓冲液，流动相B为含500mM咪唑的柠檬酸缓冲液。
所述酸性脲酶基因来源于对本实验室筛选菌株普罗维登斯菌JN-B815提取基因组进行克隆。酸性脲酶结构基因ureABC如SEQ ID NO.1。
所述表达菌株为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
所获得结构亚基基因表达脲酶的粗酶液经镍柱亲和层析进行分离纯化，获得电泳纯的酸性脲酶。
经纯化所得可溶性酸性脲酶，体现出与原始酶相同的双功能酶活性。且脲酶与EC降解酶活性比保持原酶一致，约为3:1。脲酶比酶活为2.1U/mg，氨基甲酸乙酯降解酶比酶活为0.6U/mg。脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活均测于pH为4.5的柠檬酸缓冲液条件下。
经发酵条件优化，可溶性脲酶最高产量达0.69U/mL，氨基甲酸乙酯降解酶酶活达0.22U/mL。
所用实验室模拟黄酒以先向柠檬酸缓冲液pH4.5中加无水乙醇至体积分数为16％，后添加尿素至终浓度50mg·L-1，配制而成。
模拟黄酒中尿素含量测定方法：二乙酰一肟法。
酶活测定方法：采用靛酚蓝反应(Berthelot reaction)比色法
酶活定义：在常压，37℃，pH4.5条件下，每分钟分解底物尿素或氨基甲酸乙酯产生1μmol氨为1个酶活力单位。其中，尿素降解酶和氨基甲酸乙酯降解酶活力的测定分别采用尿素和氨基甲酸乙酯作为底物。
本发明的有益效果：成功的构建了一种能可溶性表达结构亚基脲酶的重组菌，并对脲酶进行纯化。证实了该酸性脲酶同时具有氨基甲酸乙酯降解酶活性，为酸性脲酶在酒类饮料中的应用提供了优良的基础。
附图说明
图1阳性转化子菌落PCR电泳图(M：Marker；1、2为真阳性，其他均为假阳性)。
图2重组载体双酶切电泳图(M：Marker，1：重组载体2：重组载体EcoRⅠ单酶切3：SalⅠ单酶切4：EcoRⅠ，SalⅠ双酶切)
图3重组E.coli BL21(DE3)全细胞SDS-PAGE图(M：Marker，1：重组载体诱导，2：重组载体未诱导，3：pET-28a空载诱导)
图4不同温度诱导重组E.coli BL21(DE3)SDS-PAGE图(M：Marker，1：：重组载体未诱导上清，2：重组载体未诱导沉淀，3：重组载体30℃诱导上清，4：重组载体30℃沉淀，5：重组载体25℃诱导上清，6：重组载体25℃诱导沉淀，7：重组载体20℃诱导上清)
图5不同IPTG添加量对脲酶产量的影响
图6不同诱导温度对脲酶产量的影响
图7不同诱导时间对脲酶产量的影响
具体实施方式
LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0；
大肠杆菌E.coli JM109(DE3)、E.coli BL21(DE3)和pET-28a载体由本研究室保藏
T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、琼脂糖凝胶电泳Marker及共用Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，SDS-PAGE电泳Marker购自碧云天生物科技有限公司。
实施例1重组载体构建
通过化学合成法或PCR克隆法获得脲酶结构基因ureABC，本发明以PCR克隆法为例进行介绍。
为实现酸性脲酶基因在大肠杆菌中的表达，以酸性脲酶结构基因ureABC设计一对基因引物。
Fs：CCGGAATTCATGCAATTAACCCCAAGGGAAATTGAA(EcoRⅠ)；
Rs：ACGCGTCGACTTAACCAAAGAAATAACGTTGGTTCAT(SalⅠ)；
下划线表示酶切位点碱基序列。
以普罗维登斯菌基因组为模板，Fs及Rs为引物扩增目的基因。PCR体系为(50μL)：PrimerSTAR酶25μL；基因组1μL；Fs 1μL；Rs 1μL；ddH2O 22μL。PCR条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，59℃退火30s，72℃延伸3min；72℃后延伸10min；35个循环。
将扩增获得的目的基因与质粒pET-28a用EcoRI和SalⅠ分别单酶切，单酶切体系如下：
双酶切体系(40μL)体系：目的基因/质粒12μL，限制酶2μL，双蒸水22μL，Buffer4μL。37℃，EcoR I和SalⅠ酶切反应6h，胶回收目的条带。
将双酶切后的目的基因与载体按8:1的比率混合，16℃过夜连接并转化E.coliJM109。涂布于含氨苄抗性(100μg/mL)的LB培养基中培养12-16h。挑取单菌落进行LB摇瓶培养扩增及双酶切验证，验证正确的进行序列测定，测序正确的即为重组载体。
大肠杆菌感受态细胞的制作：
(1)挑取E.coliJM109单菌落接种到5mL LB试管培养过夜，37℃，200rpm(10h)；
(2)以1％接种量接到50mLLB三角摇瓶中，37℃培养2-3h，至OD600达到0.5左右；
(3)将菌体转至无菌的，用冰预冷的50mL离心管，在冰上放置10min，使培养物冷却，4℃、4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使培养液流尽，收集菌体细胞；
(4)用10mL预冷的0.1mol/L的CaCl2悬浮细胞，冰上放置30min；
(5)4℃、4000rpm离心10min，弃上清，加入4mL预冷的含0.1mol/LCaCl2的20％甘油溶液，悬浮细胞，冰上放置；
(6)将感受态细胞分装至无菌的2mL离心管中，每管200ul，保存于-80℃冰箱。
并将构建成功重组载体转入E.coli BL21(DE3)获得重组E.coli BL21(DE3)。
实施例2重组E.coli BL21(DE3)诱导表达可溶性酸性脲酶挑取以上重组E.coliBL21(DE3)，并以1％的接种量接种于50mL的LB中，其中含卡那霉素50μg/mL，NiSO40.05g/L，37℃、200rpm培养至OD600值0.8～1.0之间，加入IPTG至终浓度0.5mM，25℃、200rpm培养10h。将所得发酵液10000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀用10mL 25mM pH4.5的柠檬酸缓冲液重新悬浮，超声破碎后，离心收集上清，获得脲酶粗酶液。
实施例3酸性脲酶的纯化将上步获得脲酶粗酶液置于中性PBS缓冲液中透析24h。经柱体积为30mL的镍柱进行亲和层析纯化。流动相A为含20mM咪唑PBS，流动相B为含500mM的PBS，流速为0.5mL/min。最终获得脲酶经SDS-PAGE验证达到电泳纯。经纯化所得可溶性酸性脲酶，体现出与原始酶相同的双功能酶活性。且脲酶与EC降解酶的比活比例保持与原酶一致，约为3:1。脲酶比酶活为2.1U/mg，氨基甲酸乙酯降解酶比酶活为0.6U/mg。
实施例4脲酶发酵条件优化
(1)将实施例4中的重组E.coli BL21(DE3)接种于LB中，并置于温度分别为16℃、20℃、25℃、30℃、37℃中进行不同诱导温度诱导，其中优选25℃，见图6。
(2)将实施例4中的重组E.coli BL21(DE3)接种于LB中，并添加不同终浓度IPTG进行诱导，见图5。
(3)将实施例4中的重组E.coli BL21(DE3)接种于LB中，并以不同的诱导时间进行诱导，其中优选10小时，见图7。
经发酵条件优化后，重组E.coli BL21(DE3)最终产酶量有所增加，脲酶酶活达0.68U/mL，氨基甲酸乙酯降解酶酶活达0.22U/mL。
实施例7脲酶在模拟黄酒中的应用
向实验室自制模拟黄酒50mL中加入5U实施例5中的脲酶，将装有模拟黄酒的容器封闭，室温下静置。每隔6h，用二乙酰一肟法测定模拟黄酒中尿素含量，结果如表1所示，30h后，尿素除去率大于50％。
表1

Claims (10)

1.一种双功能脲酶结构基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述脲酶结构基因的基因工程菌。
3.含有权利要求1所述脲酶结构基因的表达载体或克隆载体。
4.权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为重组E.coli BL21(DE3)。
5.构建权利要求4所述重组E.coli BL21(DE3)的方法，其特征在于将权利要求1所述脲酶结构基因导入E.coli BL21(DE3)中得到一种基因工程菌；步骤为：
(1)克隆权利要求1所述的双功能脲酶结构基因到表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-ureABC；
(2)将步骤1)中所构建的重组质粒pET-28a-ureABC送去测序；
(3)将测序正确的重组质粒pET-28a-ureABC转化E.coli BL21(DE3)获得重组E.coliBL21(DE3)。
6.一种制备权利要求1所述双功能脲酶结构基因的表达产物的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将权利要求4中所述的重组E.coli BL21(DE3)活化后培养至OD600值0.8～1.0之间，加入IPTG诱导培养；
(2)将所得发酵液高速离心，细胞沉淀用柠檬酸缓冲液重新悬浮，超声破碎后，高速离心收集上清，获得脲酶粗酶液或加工后获得酶制剂产品。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组E.coli BL21(DE3)的诱导温度为27℃进行诱导培养。
8.权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组E.coli BL21(DE3)诱导培养10小时。
9.权利要求1所述双功能脲酶结构基因在黄酒酿造中的应用。
10.权利要求2所述基因工程菌在黄酒酿造中的应用。
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酸性脲酶与氨基甲酸乙酯降解酶产生菌的筛选及酶的特性;杨广明;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20150215;摘要及第33-37页第3.7节

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