CN113444709A - 一种κ-卡拉胶酶突变体及其应用 - Google Patents

一种κ-卡拉胶酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种κ‑卡拉胶酶突变体及其应用，突变体是由如SEQ ID NO.1所示序列编码的野生型κ‑卡拉胶酶分别经过其第42、51、155或198位氨基酸突变而产生的突变体。与野生型κ‑卡拉胶酶相比，这些突变体的热稳定性得到了一定的提高，野生型酶(WT)在60℃热处理40min后仅保留了3.90％的相对酶活力，而突变酶Q42V、I51H、K155A、G198S分别保留了29.23％、6.12％、18.50％、19.77％的相对酶活力。从而使κ‑卡拉胶酶在卡拉胶寡糖工业生产中具有良好的应用前景。

Description

一种κ-卡拉胶酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种κ-卡拉胶酶突变体及其应用。
背景技术
卡拉胶是一种硫酸线性多糖，由β-D-半乳糖和α-D-半乳糖通过β-1,4糖苷键和α-1,3糖苷键交替连接形成的骨架结构。根据1,4-连接残留物中存在或不存在3,6-脱水-D-半乳糖，以及硫酸盐基团的数量和位置而不同，常见的商业化卡拉胶包括kappa(κ-)、lambda(λ-)、iota(ι-)三种，其二糖单元上分别含有1个、2个和3个硫酸基团。κ-卡拉胶的降解产物κ-卡拉胶寡糖分子量和粘度降低，溶解性好，易吸收，并且具有免疫调节、抗肿瘤、抑制血管生成、抗氧化、抗病毒等多种有益生物活性，在药品、食品、化妆品等领域具有很强的应用潜力。因此，卡拉胶的降解及降解效率的提高十分重要。
卡拉胶酶是糖苷水解酶，通过断裂卡拉胶多糖链中的β-1,4糖苷键，形成低分子量的卡拉胶寡糖，κ-卡拉胶酶是指能够特异性降解κ-卡拉胶的糖苷水解酶。由于卡拉胶在低于40℃的条件下会发生凝固，需要在较高的温度下进行降解，然而，目前大多数报道的κ-卡拉胶酶热稳定性较差，容易失活，限制了κ-卡拉胶酶在卡拉胶寡糖生产中的应用。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种κ-卡拉胶酶突变体，其具有较高的热稳定性和水解卡拉胶能力。
为此，在本发明的第一个方面中，提供了一种κ-卡拉胶酶突变体，其由如SEQ IDNO.1所示序列编码的野生型κ-卡拉胶酶分别经过其第42、51、155或198位氨基酸突变而产生的突变体。
根据本发明的实施例，所述突变体是将野生型κ-卡拉胶酶的第42、51、155或198位氨基酸进行突变。与野生型κ-卡拉胶酶相比，这些突变体的热稳定性得到了一定的提高，野生型酶在60℃热处理40min后仅保留了3.90％的相对酶活力，而突变酶Q42V、I51H、K155A、G198S分别保留了29.23％、6.12％、18.50％、19.77％的相对酶活力，从而使κ-卡拉胶酶在卡拉胶寡糖工业生产中具有良好的应用前景。
可选地，所述野生型κ-卡拉胶酶的第42位氨基酸由Gln变为Val，第51位氨基酸由Ile变为His，第155位氨基酸由Lys变为Ala，第198位氨基酸由Gly变为Ser。
可选地，所述突变方式为定点突变。
在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述κ-卡拉胶酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5所示。
在本发明的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述κ-卡拉胶酶突变体的基因。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为野生型和突变型κ-卡拉胶酶的SDS-PAGE分析；
图2为野生型和突变型κ-卡拉胶酶的热稳定性；
图3为野生型和突变型κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶的能力。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
实施例1构建κ-卡拉胶酶突变体
突变酶重组表达载体的构建：
以携带野生型κ-卡拉胶酶编码基因(SEQ ID NO.1)的载体为模板进行定点突变，构建突变酶重组表达载体，引物按照突变试剂盒Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2引物设计要求设计定点突变引物，突变引物如表1所示。其中，定点突变参照突变试剂盒MutExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2的说明书进行操作。突变获得的突变酶Q42V的编码基因为SEQ ID NO.2，突变酶I51H的编码基因为SEQ ID NO.3，突变酶K155A的编码基因为SEQID NO.4，突变酶G198S的编码基因为SEQ ID NO.5。
表1突变引物表
Figure BDA0003147534770000031
目标质粒扩增：
Figure BDA0003147534770000032
依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行PCR。PCR反应参数：95℃ 30s，95℃15s，60℃ 15s，72℃ 45s，30次循环，72℃ 5min，4℃保存。
扩增产物DpnⅠ消化：
DpnⅠ 1μL
扩增产物 40～50μL
轻轻吸打混匀后，短暂离心收集至管底，置于37℃恒温反应1～2h。
重组反应：
Figure BDA0003147534770000033
Figure BDA0003147534770000041
使用移液枪轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。置于37℃恒温反应30min后，降至4℃或立即置于冰上冷却。
重组产物转化表达宿主：
(1)在冰上解冻E.coli BL21感受态细胞。
(2)取10μL重组表达载体加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
(3)42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2～3min。
(4)加入900μL LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200～250rpm)。
(5)5000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬。
(6)菌体涂布于LB固体培养基平板(含50μg/mL卡那霉素)，37℃恒温箱中倒置培养12～16h。
κ-卡拉胶酶突变体阳性重组子的鉴定：
PCR体系：
Figure BDA0003147534770000042
依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行PCR。PCR反应参数：95℃ 3min，95℃45s，60℃ 45s，72℃ 45s，30次循环，72℃ 5min，4℃保存。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR阳性的重组子进行DNA序列分析，确认突变体酶的DNA序列。
κ-卡拉胶酶的诱导表达和纯化：
含有突变型或野生型κ-卡拉胶酶基因的基因工程菌菌液按照1％的接种量接种于50mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、180rpm培养12h，进行菌种的活化。将活化后的菌液按照1％的接种量转接到200mL LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃、180rpm培养至OD600达到0.6～0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，16℃低温诱导表达18～24h。将诱导表达的菌液于5000rpm、4℃下离心15min，去上清，菌体用15mL预冷的缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬。在冰浴条件下，进行超声破碎，将破碎后的裂解液4℃、12000rpm离心25min，获得上清，即为粗酶液。参照GEHealthcare Life Sciences公司的金属镍螯合琼脂糖凝胶6FF使用说明书，利用亲和层析对重组蛋白进行分离纯化。采用SDS-PAGE分析纯化后目标蛋白的分子量及纯度。
利用亲和层析得到野生型酶和突变酶的单一蛋白条带，SDS-PAGE分析如图1所示。突变酶的分子质量与野生型酶一致，大小约为48.8kDa。
实施例2κ-卡拉胶酶突变体的部分酶学性质测定
将10μL酶液(实施例1获得的)与490μL含有0.5％(w/v)浓度的κ-卡拉胶溶液(以50mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 8.0配制)分别在不同温度下(40、45、50、55、60℃)反应15min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min后冷却至室温，测定520nm处吸光值。酶活力最高时的温度为最适反应温度，并以此温度下的酶活力为100％。
分别用50mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 6.0、7.0、8.0)，Tris-HCl缓冲液(pH 8.0、9.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0、10.0、11.0)配制0.5％(w/v)浓度的κ-卡拉胶溶液。取490μL底物溶液，加入10μL酶液，在最适温度下反应15min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min后冷却至室温，测定520nm处吸光值。以最高酶活力为100％。
将野生型酶和突变酶分别在40℃～60℃下热处理40min后，测定酶的残余活力，剩余酶活性降低为初始酶活性50％左右时的温度即为T50值。
结果如表2所示，野生型酶和突变酶的最适反应温度均为50℃，最适反应pH均为8.0。突变酶的热半失活温度T50相较于野生型酶都有提高，野生型酶的T50为43.9℃，而Q42V、I51H、K155A、G198S的T50分别为51.4℃、46.1℃、47.3℃、47.4℃，分别提高了7.5℃、2.2℃、3.4℃、3.5℃。
表2κ-卡拉胶酶突变体的部分酶学性质
Figure BDA0003147534770000051
将野生型酶和突变酶分别在40℃～60℃下热处理40min后，剩余酶活力如图2所示。野生型酶仅保留了3.90％的相对酶活力，而突变酶Q42V、I51H、K155A、G198S分别保留了29.23％、6.12％、18.50％、19.77％的相对酶活力。由此可见，与野生型酶相比，突变酶的热稳定性有一定的提高。热稳定性提高的突变酶在寡糖工业生产中具有良好的应用前景。
实施例3κ-卡拉胶酶突变体
用50mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 8.0)制备10mL含有0.5％(w/v)的κ-卡拉胶底物溶液，加入1U的酶液，45℃恒温反应2h，分别于15、30、60、90、120min取样500μL，沸水浴灭活10min，利用DNS法测定野生型酶及突变酶的还原糖生成量。
将野生型酶和突变酶分别在45℃恒温反应2h后，还原糖含量变化如图3所示。野生型酶降解κ-卡拉胶得到的还原糖含量达到0.20mg/mL，而突变酶在45℃恒温反应2h后，其还原糖含量在0.23～0.25mg/mL的范围内，普遍高于野生型酶，表明突变酶对κ-卡拉胶的水解效率高于野生型酶。
综上，根据本发明的实施例，采用定点突变技术将野生型酶进行定点突变，通过将其第42位氨基酸由Gln变为Val，第51位氨基酸由Ile变为His，第155位氨基酸由Lys变为Ala，第198位氨基酸由Gly变为Ser，突变酶的热稳定性得到了一定的提高，在卡拉胶寡糖的工业生产中有良好的应用潜力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种κ-卡拉胶酶突变体及其应用
<130> 无
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
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tactggcatc gtcaaatgaa tctcacatta tcacaaggcc tacgcgcgcc gcatacacaa 720
tggaaatgta atcaatttta cccatcagcg aataaatcag ccgaaggctt cccaacatca 780
atggaagttg attatgtaag aacgtgggta aaggtgggca ataacaactc tgatccaggc 840
gaggggcagt catgtcctaa cacctttgta gctgttaata gtgttcaact aagtgcagca 900
aaacaaacac ttcgaaaggg ccagtctaca acgctagaaa gcacagttct tccaaactgt 960
gcaaccaaca agaaagtcat ttattcatca agcaataaga acgtggcaac tgtgaacagt 1020
gctggagttg taaaagcgag gagcaaaggc acagcgacta ttacggttaa aactaagaac 1080
aaagggaaag tagataaatt aaccataacg gttaattaa 1119
<210> 5
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctgatatac aaccacctat tgcaaaacca ggcgaaacat ggattttaca agcgaagcgc 60
tcagatgagt ttgatataaa agatgctaca aagtggaact ttcaaaccga aaactatggt 120
gtatggtcgt ggaaaaatga aaatgcgaca gtatcaaacg gaaaactaaa attaaccact 180
aaaagagagt ctcataaacg tacattttgg gacggttgta accagcagca agttacaaat 240
tatccacttt attatacctc gggtgttgct aaatcaagag ctacaggtaa ctacggttat 300
tacgaagcaa gaattaaggg agcgagcaca tttcctggtg tatctcctgc gttttggatg 360
tatagcacca ttgaccgttc attaacgaaa gaaggggatg tccaatatag cgaaatagac 420
gtagtagaac ttactcaaaa aagtgccgtg agagagtctg atcatgactt acataatatt 480
gtggtaaaaa atggcaaacc aacatggatg cgcccaagct cgtttcctca gacaaaccat 540
aacggatacc atctaccttt cgatcctcga aatgactttc acacctatgg tgtcaatgtg 600
actaaagaca aaatcacttg gtacgtagat ggtgaaattg tgggcgaaaa ggataactta 660
tactggcatc gtcaaatgaa tctcacatta tcacaaggcc tacgcgcgcc gcatacacaa 720
tggaaatgta atcaatttta cccatcagcg aataaatcag ccgaaggctt cccaacatca 780
atggaagttg attatgtaag aacgtgggta aaggtgggca ataacaactc tgatccaggc 840
gaggggcagt catgtcctaa cacctttgta gctgttaata gtgttcaact aagtgcagca 900
aaacaaacac ttcgaaaggg ccagtctaca acgctagaaa gcacagttct tccaaactgt 960
gcaaccaaca agaaagtcat ttattcatca agcaataaga acgtggcaac tgtgaacagt 1020
gctggagttg taaaagcgag gagcaaaggc acagcgacta ttacggttaa aactaagaac 1080
aaagggaaag tagataaatt aaccataacg gttaattaa 1119

Claims (5)

1.一种κ-卡拉胶酶突变体，其特征在于，由如SEQ ID NO.1所示序列编码的野生型κ-卡拉胶酶分别经过其第42、51、155或198位氨基酸突变而产生的突变体。
2.如权利要求1所述的κ-卡拉胶酶突变体，其特征在于，所述野生型κ-卡拉胶酶的第42位氨基酸由Gln变为Val，第51位氨基酸由Ile变为His，第155位氨基酸由Lys变为Ala，第198位氨基酸由Gly变为Ser。
3.如权利要求1所述的κ-卡拉胶酶突变体，其特征在于，所述突变方式为定点突变。
4.一种编码权利要求1所述的κ-卡拉胶酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5所示。
5.一种构建体，其特征在于，包含如权利要求4所述的基因。
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