CN113215130A - 磷脂酶c突变体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种磷脂酶C突变体、制备方法及其应用，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该突变体是将源自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSL3野生型磷脂酶C的第96位苯丙氨酸F突变成精氨酸R；第153位谷氨酰胺Q突变成脯氨酸P。与野生型重组PLC相比，该突变体的热稳定性得到了显著改善，最佳反应温度从80℃提高到90℃，是目前报道的最高反应温度；在该温度下孵育50min仍可保留56％左右的酶活。该突变体的kcat和kcat/Km分别是野生型的5.64倍和2.37倍，且对底物的适应性也有所改善。同源建模分析表明，突变导致无规则卷曲比例下降并抑制了特定loop的活动，从而显著提高突变体的热稳定性和活性。圆二色谱显示Helix的增加也进一步从结构上说明了突变体比野生型具有更好的热稳定性和催化效率。

Description

磷脂酶C突变体、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种磷脂酶C突变体、制备方法及其应用。

背景技术

磷脂酶C(Phospholipase C，PLC,EC3.1.4.3)是一种专一水解甘油磷脂C3键的水解酶，其水解产物为磷酸单脂和二酰甘油，普遍存在于原核及真核生物中。PLC在抗血小板新药研究、高血压等病理研究以及食品工业添加剂、尤其是植物油脱胶等方面具有广阔的应用前景。目前，从长远角度来看，PLC应用于油脂酶法脱胶最具工业应用前景。用磷脂酶C进行脱胶有很多优点：无副产品，安全性高，脱胶过程中少量的水足以发挥水解作用，避免了水解作用产生大量废水污染环境的问题，提高了脱胶油得率。目前国内尚无商业化的PLC，工业化使用的PLC主要是Novoeymes公司进口酶。

产磷脂酶C的微生物种类较多，易于大规模生产，因此源自微生物的磷脂酶C已成为工业用酶的最主要来源。微生物天然磷脂酶C产量低，纯化步骤繁琐，且细菌性来源的磷脂酶C大多是毒力因子，在生产应用中存在安全隐患。重组磷脂酶C由遗传背景清楚的大肠杆菌表达，在工业应用中不存在安全问题。利用大肠杆菌大量发酵可提高磷脂酶C的产量，为满足工业生产奠定良好基础。但目前微生物重组PLC存在活性低，特别是热稳定性较差等问题。目前已报道的PLC最佳酶活温度在40-70℃左右。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种磷脂酶C突变体，其具有较好的热稳定性和催化效率。

为此，在本发明的第一个方面中，提供了一种磷脂酶C突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明的实施例，所述突变体是将野生型磷脂酶C的第96位苯丙氨酸F突变成精氨酸R；第153位谷氨酰胺Q突变成脯氨酸P。与野生型重组PLC相比，该突变体的热稳定性得到了显著改善，最佳反应温度从80℃提高到90℃，是目前报道的最高反应温度；在该温度下孵育50min仍可保留56％左右的酶活。该突变体的kcat和kcat/Km分别是野生型的5.64倍和2.37倍，且对底物的适应性也有所改善。同源建模分析表明，突变导致无规则卷曲比例下降并抑制了特定loop的活动，从而显著提高突变体的热稳定性和活性。圆二色谱结果显示Helix的增加也进一步从结构上说明了突变体比野生型具有更好的热稳定性和催化效率。

在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述磷脂酶C的突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的第三方面中，提供了一种获得上述磷脂酶C突变体的方法，包括：

(1)分析野生型磷脂酶C的B因子值，找出可能显著影响磷脂酶C稳定性的关键氨基酸残基；

(2)分析氨基酸残基的二级结构和结构域进行二次筛选，得候选突变体；

(3)通过短时分子动力学模拟分析候选突变体的结构稳定性，选取均方根偏差和总能量最低的突变体验证；

(4)将步骤(3)选出的突变体的基因克隆入原核表达载体中，构建重组载体；

(5)将所述重组载体转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白，以获得磷脂酶C突变体。

根据本发明的实施例，该方法基于web的I-TASSER服务器(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)，以蜡样芽孢杆菌(Bacillus Cereus)的PLC(PDB ID:1ah7)为多线程模板。从蛋白质结构学的角度使磷脂酶C的性能得到改变，使其稳定性增强，不仅可以降低研发成本，而且还能加快工业化应用的进程。

在本发明的第四个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述磷脂酶C突变体的基因。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为磷脂酶C-PLC二级结构；

图2为磷脂酶C-PLC突变位点氨基酸残基；

图3为分子动力学模拟获得的均方根偏差-RMSD；

图4为分子动力学模拟获得的均方根涨落-RMSF；

图5为pSmart-Ⅰ-PLC-M双酶切、PCR验证；

图6为重组突变PLC纯化结果；

图7为野生型PLC和突变PLC酶活最佳温度；

图8为野生型PLC和突变PLC酶活热稳定性；

图9为野生型PLC和突变PLC底物特异性比较；

图10为野生型PLC和突变PLC圆二色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

需要说明的是，实验所用试剂为：

野生型重组磷脂酶C(参考该文献制备SS-mPEG chemical modification ofrecombinant phospholipase C for enhanced thermal stability and catalyticefficiency.International Journal of Biological Macromolecules,2018,111:1032–1039)，异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)、硫酸卡那霉素、氨苄青霉素、限制性内切酶Sac I、Xho I均购于Takara公司，其他试剂均为国产分析纯。

25mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)：称取0.1514g Tris于适量蒸馏水中，搅拌使其溶解，再用0.025mol/L盐酸调节至pH 7.2，定容至50mL即可。

0.25mmol/L对硝基苯酚：准确称取0.0139g对硝基苯酚溶于10mL无菌水中，混匀，得到10mmol/L对硝基苯酚溶液，从中取出0.25mL定容至10mL。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1筛选磷脂酶C突变体

重组磷脂酶C三维结构的构建：基于web的I-TASSER服务器(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)，以蜡样芽孢杆菌(Bacillus Cereus)的PLC(PDB ID:1ah7)为多线程模板。PLC突变体的理性设计包括三个步骤：一是通过分析野生型PLC的B因子值，找出可能显著影响PLC稳定性的关键氨基酸残基；二是通过分析相关残基的二级结构和结构域进行二次筛选，位于或靠近催化域的氨基酸残基排除在突变之外，以避免破坏PLC的活性。选择位于环上或附近的氨基酸残基；三是通过短时分子动力学模拟分析候选突变体的结构稳定性，选取均方根偏差(RMSD)和总能量最低的PLC突变体进行后续实验验证。

PLC三维结构模拟结果如图1和图2显示，PLC的活性位点及其周围的loops，以及关键氨基酸残基(图1)。因为蛋白loop结构相对于螺旋不稳定，并对替代更有耐受性，因此定位在Loop附近的Phe96 and Gln153是优选的突变位点(图2)。Phe96定位于loop的Y70-Q99，包含能与碱性氨基酸形成盐桥的Asp76.因此将Phe96突变为赖氨酸和精氨酸，与Asp76形成盐桥从而稳定结构。通过200ps分子动力学模拟，分析野生型PLC、F96R和F96K的结构稳定性。

分子动力学模拟过程以RMSD值和RMSF值来评价突变前后磷脂酶C的稳定性。如图3所示，突变重组磷脂酶C的RMSD值从整体上低于野生型重组磷脂酶C的值。突变重组磷脂酶C的RMSF值的波动性小于野生型重组磷脂酶C(图4)。可见突变重组磷脂酶C的热稳定性有所提高。

实施例2重组磷脂酶C突变体PLC-LFQRP3的制备

重组克隆载体pMD19-T-PLC的构建：突变体核酸序列(SEQ ID NO：2)由上海生工合成。连接到pMD19-T克隆质粒，构建重组克隆载体pMD19-T-PLC，将重组克隆载体pMD19-T-PLC转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，涂布于LB(Amp⁺)固体平板(含4μL 200mg/mL IPTG、40μL 20mg/mL X-gal、50μg/mL Amp)，37℃过夜培养。挑取白斑进行菌落PCR验证，将阳性菌落过夜培养，提取质粒进行双酶切鉴定，最后对阳性质粒进行测序。

重组表达载体pSmart-Ⅰ-PLC的构建：将含pMD19-T-PLC重组质粒的大肠杆菌Top10和含空载pSmart-Ⅰ大肠杆菌菌株BL21以1:50的比例分别接种于LB液体培养基(分别含终浓度为50μg/mL的Amp和Kan抗生素)，37℃培养过夜。使用天根质粒小提取试剂盒分别对两株菌进行质粒提取，具体方法详见试剂盒使用说明书，核酸微量分析仪测定质粒浓度。分别对pMD19-T-PLC重组质粒和空载表达载体pSmart-Ⅰ进行双酶切(酶切体系：pMD19-PLC-M/pSmart-Ⅰ各4μl、10×M Buffer 3μl、Sac I/Xho I核酸内切酶各1.53μl、无菌水补充至30μl，于37℃酶切1h)。使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒，纯化目的基因PLC和质粒pSmart-Ⅰ，具体方法见试剂盒使用说明书。将目的基因突变PLC、pSmart-Ⅰ质粒及连接液Solution I充分混匀后，低速离心，置于16℃连接16h，将连接产物热击转化大肠杆菌感受态细胞BL21，转化产物涂布于LB固体培养基(含终浓度为50μg/mL的Kan抗生素)，37℃培养过夜。使用天根质粒小提取试剂盒提取质粒并进行质粒双酶切及PCR验证，结果如图5(M1：λ-HindⅢdigest DNA marker；1：重组表达质粒；2：重组表达质粒双酶切后；3：质粒PCR；M2：100bpDNA ladder marker)，表明重组表达载体pSmart-Ⅰ-PLC构建成功。

突变体PLC-LFQRP3的诱导表达及纯化：将上述获得的重组大肠杆菌BL21于37℃摇床培养至OD_600nm达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导剂，20℃下诱导培养7-8h。离心收集菌体，用25mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)重悬细胞，超声破碎，于12000rpm，4℃离心10min，收集蛋白上清液进行SDS-PAGE电泳分析。

突变体PLC-LFQRP3的纯化：将蛋白上清液经0.22μm滤膜过滤后用镍柱进行纯化，获得分子量约为45kD的融合蛋白，融合蛋白经SUMO蛋白酶酶切后再次过镍柱纯化得到纯度较高的目的蛋白PLC-LFQRP3，结果见图6(M：蛋白Maker；1：融合蛋白；2：切去标签的PLC)，与预期分子量大小28KDa接近。

实施例3重组磷脂酶C突变体PLC-LFQRP3的性能测定

(1)酶活力测定

p-NPPC法定量测酶活：磷脂酶C可以水解卵磷脂的结构类似物p-NPPC，生成黄色的对硝基苯酚，该产物在410nm的吸收峰最大。因此将反应后的酶液置于410nm处测定吸光值，可知产物对硝基苯酚的量，利用对硝基苯酚做标准曲线，定量计算相应酶活力。

酶反应体系组成：0.25mol/L Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液，1mmol/L ZnCl2，60％山梨醇(w/v)，10mmol/L p-NPPC。将20μL的酶样品加入到200μL反应体系中，37℃保温30min。酶活单位的定义：在pH 7.2，温度为37℃的条件下，每分钟水解NPPC生成1nmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位(U)。

(2)最适温度及热稳定性

在pH 7.2条件下，分别在25℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃(及100℃)等温度下测定野生型和重组磷脂酶C的相对酶活，确定其最适温度。分别在50℃，60℃，70℃，80℃、90℃和100℃水浴50min(对照置于4℃)，然后分别在野生型和突变酶的最适温度下测定剩余酶活，分析磷脂酶C的热稳定性。

结果如图7和图8所示，由图7可知，与野生型PLC(WT PLC)相比，重组突变PLC的最适温度由80℃提高到90℃。由图8可知，突变重组PLC的热稳定性较野生型明显提高，特别是在90℃保温50min后酶活由原来的9％升至56％。

(3)PLC-LFQRP3的底物特异性分析

采用无机定磷法测定磷脂酶C底物特异性。反应体系：25mM Tris-HCl pH 7.2，250μg·mL-1底物(分别为：PC，磷脂酰胆碱；PG，磷脂酰甘油；PS，磷酯酰丝氨酸；PI，磷脂酰肌醇及SM，鞘磷脂)，20U酶液(酶活采用p-NPPC法测定)，总体积为200μL。

分别称取10mg上述各种底物，溶于1mL25 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)中得到10mg/mL底物溶液。吸取25μL上述底物溶液于1.5mL EP管中，再加入875μL 25mmol/L Tris-HCl，冰上超声波处理(参数：功率40％、时间10s)，最后加入100μL 20U酶液(对照组为25mmol/LTris-HCl pH 7.2)于37℃水浴。分别在1h、2h、3h、4h后，取出200μL反应溶液加入到装有1mL氯仿/甲醇(W/V＝2:1)溶液的EP管中混匀，12000rpm离心10min，吸取200μL上层水相测定可溶性磷含量。

突变重组磷脂酶C对磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰甘油(PG)及鞘磷脂(SM)的水解特异性结果如图9所示。从图中可以看出，磷脂酶C具有广泛的作用底物，均可水解PI，PC，PS，PG，对SM也有了一定的水解能力，且相同时间下突变重组磷脂酶C对PC亲和力最大。而且突变子显示了更好的底物适应性。对PS and SM的水解活性增强。

(4)酶动力学参数测定

将底物磷脂酰胆碱(PC)的浓度设置为0mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L、18mmol/L及20mmol/L。分别吸取25μLPC溶液于1.5mL EP管中，再加入875μL 25mmol/L Tris-HCl，冰上超声波处理，最后加入100μL 20U酶液(对照组为25mmol/L Tris-HCl)于37℃水浴30min后，取出200μL反应溶液加入到装有1mL氯仿/甲醇(W/V＝2:1)溶液的EP管中混匀，12000rpm离心10min，吸取200μL上层水相测定可溶性磷含量。以浓度的倒数为横坐标，反应速率的倒数为纵坐标作图，计算Km、Vmax及Kcat值。

突变前后磷脂酶C对磷脂酰胆碱(PC)的动力学结果如表1：突变磷脂酶C的Vmax为1153.95μmol mg^-1min^-1，未突变磷脂酶C的Vmax为204.47μmol mg^-1min^-1，虽然重组磷脂酶C的Km 0.32mM，比突变重组磷脂酶C的Km小，但是突变重组磷脂酶C催化效率1155.49(s^-1mM^-1)远大于重组磷脂酶C的488.28(s^-1mM^-1)，提高了136.6％，如表1所示，在工业生产中，催化效率能够更加有效的反映酶的工作效率。

表1突变前后磷脂酶C的动力学参数

Table 1.Kinetic parameters of the WT PLC and F96R/Q153P

(5)圆二色谱分析

在室温条件下，使用Chirascan圆二色谱仪对纯化的磷脂酶C进行蛋白质二级结构测定，所使用的比色皿厚度为0.1cm，测定参数为：扫描波长范围190～260nm，扫描速度1nm/s，光谱间隔1nm，反应时间2s。

用圆二色谱检测突变前后的磷脂酶C，光谱图见图10。由磷脂酶C在223nm和209nm处出现双负峰，符合双槽曲线的特征，在192nm处出现正峰，属于典型的α-螺旋结构。其中，突变重组磷脂酶C的α-螺旋结构较未突变磷脂酶C含量明显增加，可见，突变重组磷脂酶C比野生型重组磷脂酶C更稳定。

综上，根据本发明的实施例，利用计算机辅助模拟对重组磷脂酶C进行合理的突变设计。突变重组磷脂酶C，90℃保温50min仍剩余56％酶活，其热稳定性得到大幅度提高。突变磷脂酶C的Vmax为1153.95μmol mg^-1min^-1，未突变磷脂酶C的Vmax为204.47μmol mg^-1min^-1，虽然重组磷脂酶C的Km 0.32mM，比突变重组磷脂酶C的Km小，但是突变重组磷脂酶C催化效率1155.49(s^-1mM^-1)远大于重组磷脂酶C的488.28(s^-1mM^-1)，提高了136.6％，在工业生产中，催化效率能够更加有效的反映酶的工作效率。因此，本申请的磷脂酶C突变体比野生型具有更好的热稳定性和催化效率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 磷脂酶C突变体、制备方法及其应用

<130> 无

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His Glu Asn Asn Gly Gly Ser Lys Ile Lys Ile Val His Arg Trp Ser

1 5 10 15

Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val

20 25 30

Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln

35 40 45

Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly

50 55 60

Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe

65 70 75 80

Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Arg

85 90 95

Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly

100 105 110

Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly

115 120 125

Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala

130 135 140

Asn Phe Thr Asn Leu Ser Tyr Pro Pro Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu

145 150 155 160

Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn

165 170 175

Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Asp Trp Ile His Gly

180 185 190

Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn Asp Asn

195 200 205

Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp

210 215 220

Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp

225 230 235 240

Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr

245 250 255

Gly Asn Arg

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catgaaaata atgggggaag taaaataaaa atagttcacc gttggtctgc tgaagataaa 60

cataaagaag gcgtaaattc tcatttatgg attgtaaacc gtgcgattga tattatgtct 120

cgcaatacaa cacttgtaaa acaagatcga gttgcacaat taaatgaatg gcgtacggag 180

ttagagaacg gtatttatgc tgctgactat gaaaatcctt attatgataa tagcacattt 240

gcttcacatt tctatgatcc agacaatgga aaaacatata ttccacgcgc aaagcaggca 300

aaagaaactg gagctaaata ttttaaatta gctggtgaat catataaaaa taaagatatg 360

aaacaagcat tcttctattt aggattatct cttcattatt taggagatgt aaaccaaccg 420

atgcatgcag caaactttac aaatctttcg tatccaccgg gattccattc taaatatgaa 480

aactttgtag atacgataaa agataattat aaagtaacgg atggaaatgg atattggaat 540

tggaaaggta caaatccaga agattggatc catggagcgg cagtagtggc gaaacaagat 600

tactctggaa ttgtaaatga taatacgaaa gattggttcg taaaagcagc tgtgtcacaa 660

gaatatgcag ataaatggcg tgctgaagtt acaccgatga caggtaagcg attaatggat 720

gcccaacgtg ttactgctgg atacattcag ctttggttcg atacatatgg caatagataa 780

Claims (4)

1.一种磷脂酶C突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码权利要求1所述的磷脂酶C突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种获得权利要求1所述的磷脂酶C突变体的方法，其特征在于，包括：

(1)分析野生型磷脂酶C的B因子值，找出可能显著影响磷脂酶C稳定性的关键氨基酸残基；

(2)分析氨基酸残基的二级结构和结构域进行二次筛选，得候选突变体；

(3)通过短时分子动力学模拟分析候选突变体的结构稳定性，选取均方根偏差和总能量最低的突变体验证；

(4)将步骤(3)选出的突变体的基因克隆入原核表达载体中，构建重组载体；

(5)将所述重组载体转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白，以获得磷脂酶C突变体。

4.一种构建体，其特征在于，包含如权利要求2所述的基因。

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