CN105950585B - 一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的S2‑210脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S8‑214脂肪酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的S14‑216脂肪酶或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的S191‑241脂肪酶。本发明通过长时间的高温分子动力学模拟模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，分析了蛋白解折叠的主要区域和湿熔球态形成的关键步骤，有效的筛选出动力学稳定性改造的关键位点。该热稳定的脂肪酶耐热，半衰期长，特别适合在工业上进行应用。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，特别涉及一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用。
背景技术
脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称三酰甘油水解酶，被广泛应用于饲料工业、食品加工、化妆品、洗涤剂、生物医学和生物能源等方面。
耶氏解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母，属于食品安全型酵母，目前通过连续基因干扰分析，，已发现其能编码16种脂肪酶Lip2、Lip4、Lip5、Lip7～19。这些脂肪酶同源性大小不一，且性质差异较大。其中，耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是主要的胞外分泌脂肪酶，其对中长链脂肪酸甘油三酯(C12～C16)具有较高的催化活性，被广泛应用于油脂水解、污水处理、食品加工、生物能源、化学合成以及胰腺缺乏症的治疗等多个领域，具有广泛的应用前景，但当环境温度超过40℃时，该脂肪酶迅速失活，在生产加工、储存、运输等过程中造成较大的损失，成为其在工业上应用的主要瓶颈。因此，有必要对耶氏解脂酵母脂肪酶2改造，提高其热稳定性，以拓宽其应用范围。
在天然蛋白结构中引入新的二硫键是改造蛋白热稳定性的一种重要方法，被广泛应用于各类蛋白的改造，特别是在药物储存和工业应用改造领域。随着预测二硫键算法的不断发展，其中应用较为广泛的是DbD和MODIP算法，通过对Cβ和Sγ原子进行定位，快速搜索并精确地估算χ3二面角，筛选符合条件的二硫键。这两种算法都是基于静态晶体结构的计算，对二硫键的预测具有高准确性，并且已经成功的应用于米黑根毛霉脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶B、华根霉脂肪酶和铜绿假单胞菌脂肪酶等多种脂肪酶的热稳定性设计，但是对筛选热稳定型二硫键的准确度仍然十分有限。
目前对蛋白质热稳定性改造主要分为定向进化、半理性设计和理性设计，其中定向进化和半理性设计需要大量的人力物力，而理性设计需要对蛋白质结构与功能有全面的理解。目前理性设计主要根据蛋白质的晶体静态结构的计算，目前主要利用一下2类筛选方法：
(1)基于蛋白质柔性区域的设计，如B-FITTER、FIRST、分子动力学模拟筛选波动较大的区域。
(2)基于经验力场对蛋白热力学自由能进行计算，筛选蛋白质热力学稳定的突变位点，如FOLDX力场等。
以上均没有深刻理解蛋白质解折叠动力学过程，亦无涉及蛋白质动力学稳定性的设计。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，利用分子动力学模拟筛选出脂肪酶解折叠和湿熔球态形成的关键区域，并分析湿熔球态的形成，有针对性地引入二硫键突变，抑制蛋白湿熔球态和共价聚沉的形成，提高热稳定型二硫键筛选的精确性，并提供一种热稳定的脂肪酶。
本发明的另一目的在于提供所述热稳定的脂肪酶的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述热稳定的脂肪酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种热稳定的脂肪酶，是在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的解折叠和湿熔球态形成的关键区域引入二硫键突变；
所述的关键区域为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列。
所述热稳定的脂肪酶优选为S2-210脂肪酶、S8-214脂肪酶、S14-216脂肪酶或S191-241脂肪酶；
S2-210脂肪酶的氨基酸序列如下：
VCTSTETSHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFHDPRLIFDVSGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDDCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFGQECPDVSKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI；
S8-214脂肪酶的氨基酸序列如下：
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S14-216脂肪酶的氨基酸序列如下：
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S191-241脂肪酶的氨基酸序列如下：
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编码所述热稳定的脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：
S2-210脂肪酶的核苷酸序列如下：
gtgtgtacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctccaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
S8-214脂肪酶的核苷酸序列如下：
gtgtacacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagaaccccgatgtctgtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
S14-216脂肪酶的核苷酸序列如下：
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S191-241脂肪酶的核苷酸序列如下：
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所述热稳定的脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过Gromacs分子动力学软件模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，通过对所得轨迹的波动性分析与蛋白表面水分子的统计，分析出脂肪酶解折叠和湿熔球态形成的关键区域，并进一步对β折叠尾巴区域分区，分析湿熔球态形成的步骤，最后使用Disulfide byDesign软件算法筛选潜在二硫键突变位点；
(2)通过反向PCR突变，将所选出的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌工程菌中，进行扩增培养与质粒提取、测序；
(3)将测序正确的突变质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化入感受态毕赤酵母X33中，进一步通过博来霉素抗性平板筛选和BMMY-罗丹明B产酶平板筛选，得到对应的突变工程菌；
(4)将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液
(5)使用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶；
(6)通过DTNB法测定蛋白质中的游离巯基浓度和总巯基浓度，计算蛋白分子内的二硫键数目，检测引入的二硫键突变是否成键；
(7)通过p-NPP比色法和DSF荧光检测测定突变脂肪酶的热稳定性指标：保温15min后残余50％活性的温度(T50)、50℃下的半衰期(t1/2)、最适反应温度(Topt)以及蛋白熔解温度(Tm)；
(8)通过不同尿素诱导解折叠测定湿熔球态的形成所需要的浓度，确定突变脂肪酶动力学稳定性大小；
(9)将突变脂肪酶在50℃下保温不同的时间，以非还原性SDS-PAGE检测突变脂肪酶的抗聚沉能力大小，得到热稳定的脂肪酶。
步骤(1)中所述的脂肪酶解折叠和湿熔球态形成的关键区域为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列，即β折叠尾巴区域。
步骤(1)中所述的湿熔球态形成的步骤包括初级步骤和关键步骤；耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2底部无规卷曲loop4(氨基酸207位至221位)与N端区域(氨基酸1位至13位)的解离是湿熔球态形成的初级步骤，loop3结构(氨基酸228位至246位)的解离是湿熔球态形成的关键步骤。
步骤(1)中所述的解折叠的区域优选为β折叠尾巴区域(氨基酸180位至280位)。
步骤(2)中所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌TOP10。
步骤(4)中所述的培养的条件优选为摇瓶培养96小时。
所述热稳定型脂肪酶耐热，半衰期长，特别适合在工业上进行应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明利用生物信息学对蛋白质改造属于理性设计的方法。该方法相对于传统的非理性改造方法而言，能节约大量的人力物力，但需要对蛋白质分子进行全面的分析，方能找筛选出有效的改造点。
本发明通过长时间的高温分子动力学模拟筛选出耶氏解脂酵母脂肪酶2解折叠和湿熔球态形成的关键区域，并分析湿熔球态的形成，关注蛋白质在动力学过程中的变化，有针对性地引入二硫键突变，大大提高热稳定型二硫键筛选的准确性。
1)本发明通过在脂肪酶底部无规卷曲loop4(氨基酸207位至221位)与N端区域(氨基酸1位至13位)之间引入二硫键，加强了底部无规卷曲loop4与N端的联系，稳定了β折叠尾部区域(氨基酸180位至280位)的稳定，相对于亲本脂肪酶，S2-210、S8-214、S14-216突变体脂肪酶的Tm值分别提升了10.48℃、7.50℃和5.67℃，50℃半衰期分别达到198、43.87、17.24分钟，分别提升了120、26.58、10.44倍；
2)本发明通过在脂肪酶β7、β8折叠之间的无规卷曲loop3(氨基酸228-246位)与β6折叠和α5螺旋间的无规卷曲(氨基酸188位至氨基酸198位)之间引入的二硫键突变，相对于亲本脂肪酶，S191-241突变体脂肪酶的Tm值提升了5.63℃，50℃半衰期达到14.87分钟，提升了9倍。
以上所述的二硫键突变均有效地抑制了蛋白解折叠、减缓湿熔球态的形成，并减少了脂肪酶之间的共价聚沉反应。
附图说明
图1是不同温度下氨基酸的均方根涨幅曲线图。
图2是熔球态形成区域分析图；其中：图a为盖子1区域、β折叠尾巴区域、β折叠头部区域范围内水分子数量随时间的变化曲线；图b为β折叠尾巴区域的4个亚区范围内的水分子数量随时间变化曲线。
图3是β折叠尾巴区域解折叠波动曲线图；其中，图a为β6、β7、β8、β9折叠的均方根波动随模拟时间的变化曲线，图b为loop2、loop3、loop4的均方根波动随模拟时间的变化曲线。
图4是BMMY-罗丹明B产酶平板筛选图；其中，A-F分别为Lip2、S8-214、S2-210、S14-216、S191-241、S4-266在紫外光下脂肪酶的水解光圈。
图5是还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度的结果图；其中：泳道1-7分别为Lip2、S2-210、8-214、S14-216、S191-241、S198-242、S4-266突变脂肪酶的蛋白条带。
图6是尿素诱导解折叠bis-ANS荧光曲线图。
图7是非还原性SDS-PAGE蛋白检测的结果图；其中：图a、b、c、d、e分别代表Lip2、S2-210、S8-214、S14-216、S191-241在50℃下热处理不同时间。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
材料与试剂：pPICZαA-Lip2毕赤酵母表达载体由上海金斯瑞生物公司全基因合成与构建；质粒提取试剂盒购自Omega贸易有限公司，KOD-PLUS突变试剂盒购自东洋纺公司，ProteinThermal Shift筛选试剂盒购自Thermo公司；TOP10大肠杆菌感受态细胞购自天根生物公司，突变引物由上海生工生物工程公司合成；PmeⅠ限制性内切酶购自New EnglandBiolabs公司；PCR产物纯化回收试剂盒购自大连宝生物公司；电转仪购自Bio-Rad公司；LLB、LLB+Zeocin、YPD、BMGY、BMMY培养基均按照Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒操作手册配制，镍柱纯化试剂盒购自上海生工生物工程公司，其余试剂均为国内外购买的分析纯级别。
实施例1耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠模型建立与二硫键的筛选。
(1)从RCSB PDB晶体数据库中搜索下载Lip2的晶体结构(PDB ID:3O0D)，精度为 晶体为七聚体，每个聚体各有不同程度的原子缺失，因此选取骨架原子完整的A链作为初始模型，使用Swiss-pdb Viewer软件对A链缺失的侧链氨基酸进行修复，并使用Disulfide byDesign软件，将A链中Cys120-Cys123二硫键重构，在模拟中保留A链的所有结晶水，除了三联体中心的HIS289使用HID质子化状态，其余组氨酸均设置为Gromacs默认下pH＝7.00的质子化状态，得到预处理模型；
(2)使用GROMACS 5.04软件对预处理模型进行三维建模，使用Amberff99SB-NMR-ILDN力场的参数，将蛋白放置于十二面体的菱形盒子中央并填充TIP3P水分子与10个Na+中和的体系电荷，并以Steepest算法对整个体系进行能量优化。随后在等温等压体系(NPT)体系下，限制蛋白骨架重原子的运动，在500ps内缓慢地从0K升温至303K，充分平衡酶周围的水分子，体系的温度和压力偶联使用Berendsen算法，得到预平衡模型；
(3)将预平衡模型在2ns内从303K缓慢地升温至目标温度，然后在等温等压体系(NPT)下进行模拟。范德华力截断半径、静电相互作用力截断半径、邻近搜索截断半径均根据AMBER力场推荐，设置为0.9nm。所有的键长采用LINCS算法约束，长程静电相互作用力采用PME算法，计算步长设置为2fs；
(4)对分子模拟所得轨迹进行分析：
1)通过波动性分析解折叠的关键区域：通过Gromacs自带的分析工具gmx_rmsf计算Cα原子的均方根涨幅随解折叠进程的变化，分析骨架氨基酸均方根涨幅曲线，结果如图1所示，在450K温度下底部环形区loop4(氨基酸207位至221位)浮动最大，该区域为容易运动的结构；在473K温度下N端(氨基酸1位至13位)和底部环形区loop4(氨基酸207位至221位)的均方根涨幅大幅增加，该区域可能是脂肪酶发生初步解折叠的区域；在500K温度下脂肪酶整体的均方根涨幅显著提升，主要集中在β折叠头部区域(氨基酸30位至90位)、β折叠尾巴区域、盖子1区域(氨基酸91位至130位)。
2)分析湿熔球态形成的关键区域：根据波动性分析的结果，针对Lip2脂肪酶主要的三个波动区域进行熔球态形成分析，通过在VMD中统计氨基酸范围内的水分子数目随解折叠进程的变化，分析熔球态形成的关键区域和位点。结果如图2所示，水分子进入Lip2脂肪酶的主要区域为β折叠尾巴区域。并且通过进一步将β折叠尾巴区域分为4个亚区进行水分子数目统计，其中亚区1(氨基酸251位至279号)包含盖子2铰链区、β9折叠；亚区2(氨基酸221位至250号)包含β7、8折叠和之间的无规卷曲loop3；亚区3(氨基酸194位至220号)包括底部环形区loop4与α5螺旋；亚区4(氨基酸180位至193号)包含β6折叠与α5螺旋间的无规卷曲，结果显示亚区2周围的水分子数目在解折叠过程中增长最为明显，是湿熔球态形成的主要区域。
3)分析湿熔球态形成的过程：通过Gromacs自带的分析工具gmx_rmsf计算β折叠尾巴区域中每段结构的Cα原子RMSD随时间的变化曲线，以分析熔球态形成的关键结构的波动与步骤。结果如图3所示，在湿熔球态形成的时间区间内loop3、loop4、β7和β8折叠的RMSD急剧上升，暗示着这些区域的运动与熔球态形成直接相关，并且β9折叠与loop4的运动发生在早期，可能是熔球态形成的诱因，但β6折叠在解折叠运动中所受影响不大。
综上所述方法分析出脂肪酶在热变性的过程中解折叠和湿熔球态形成的关键区域为β折叠尾巴区域，其中湿熔球态的形成可分为2个步骤，初级步骤为脂肪酶的底部无规卷曲loop4(氨基酸207位至221位)与N端区域(氨基酸1位至13位)的解离，关键步骤为β7、β8折叠之间的无规卷曲区域(氨基酸228位至246位)结构的解离。
(7)通过Disulfide by Design软件筛选存在于底部无规卷曲loop4(氨基酸207位至221位)与N端区域(氨基酸1位至13位)、β7折叠至β8折叠之间的无规卷曲loop3区域(氨基酸228位至246位)与周围之间的所有二硫键潜在位点。筛选结果显示，筛选出六对潜在的二硫键位点，分别为S2-210、S8-214、S14-216、S191-241、S198-242、S4-266。具体信息如表1所示。
表1 二硫键筛选位点
其中，6段氨基酸序列如下所示：
S2-210：
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S8-214：
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S14-216：
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S191-241：
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S198-242：
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S4-266：
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编码上述序列的脂肪酶的核苷酸序列，如下所示：
S2-210：
gtgtgtacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctccaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
S8-214：
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S14-216：
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S191-241：
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S198-242：
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S4-266：
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实施例2脂肪酶突变体表达质粒的构建
以耶氏解脂酵母脂肪酶2序列(Genbank ID：AJ012632.1)为目的片段，以EcoRⅠ与NotⅠ为限制性酶切位点，全基因合成并构建pPICZαA-Lip2，通过两次连续的反向突变PCR方法引入二硫键突变，点突变所用引物如表2所示。
表2 突变引物汇总
注：斜线加粗处为突变位点
PCR扩增条件为：94℃2min；94℃10s、66℃30s、68℃5min，10个循环。反应体系如下表3所示。
表3 PCR反应体系
扩增产物以DnpⅠ酶消化模板，在琼脂糖凝胶电泳检测突变条带大小后，用T4连接酶连接环化过夜，随后使用热激法将突变质粒转入TOP10大肠杆菌感受态细胞，并涂布于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/ml)平板37℃过夜培养，挑选阳性转化子进行质粒的测序。
实施例3：线性化质粒电转化毕赤酵母、转化子筛选与产酶筛选
将测序正确的阳性转化子于LLB液体培养基过夜扩培后，提取质粒，以PmeⅠ线性化处理并纯化回收，以总量为5μg的质粒线性化产物与X33毕赤酵母感受态混合电击转化。毕赤酵母感受态制备参照Invitrogen公司操作手册。电转程序按照Bio-Rad公司推荐参数设置。
电转完毕立刻加入1mL 1mol/L山梨醇溶液，将菌液在30℃孵育复苏1小时后，均匀涂布于YPDS+Zeocin(Zeocin浓度为200μg/ml)抗性平板上筛选；培养3天后，将生长出的单菌落挑取至BMMY-罗丹明B平板上进行产酶筛选，每12小时添加100μL甲醇诱导；诱导3天后观察脂肪酶水解圈，筛选出正常产酶的基因工程菌。如图4所示，所有的突变体脂肪酶均产生了油脂水解圈，二硫键的引入没有影响工程菌的产酶。
实施例4：工程菌摇床发酵
参考Invitrogen公司毕赤酵母表达试剂盒操作手册并稍作修改，修改内容如下：把工程菌株单菌落接种到2mL YPDS-Zeocin(Zeocin浓度为200μg/mL)液体培养基中进行纯化培养过夜，离心将细胞以BMGY液体培养基重悬并过夜培养，再接种至30mL BMMY液体培养基，以25℃、300r/min培养96小时，每天补充甲醇至终浓度为1％。
实施例5：脂肪酶的分离和纯化
1)超滤浓缩
将100mL发酵液于4℃5000r/min离心5分钟后吸取上清液并用10kDa超滤管于5000r/min 4℃离心50min，收集浓缩酶液。
2)一步法镍柱纯化
①用5mL的含咪唑10mM的Binding Buffer平衡镍柱，充分除去残留的乙醇；
②浓缩酶液与含咪唑120mM的Binding Buffer按照1:1比例混合后添加至镍柱中结合；
③用15mL含咪唑60mM的Washing buffer充分洗脱杂蛋白；
④用15mL含咪唑300mM的Elution Buffer洗脱目标蛋白；
⑤纯化酶液按照上述条件超滤浓缩；
得到纯化的突变脂肪酶，最后以还原性SDS-PAGE垂直电泳检测酶纯度，纯度均在99％以上，结果如图5所示。
实施例6：二硫键测定
1)将纯化蛋白样品以含8M尿素的Tris-Gly缓冲液(50mM，pH＝8.00)稀释至0.5mg/mL。混合均匀后，分装2mL至两支4mL离心管中，A管用于测定游离巯基的浓度，B管用于测定总半胱氨酸含量，并在B管中加入50μLβ-巯基乙醇还原分子内的二硫键，于37℃保温1小时。
2)在B管中加入2mL 30％(w/v)三氯乙酸溶液，37℃水浴1小时，充分沉淀蛋白，随后以12000r/min离心30min，弃上清，沉淀使用2mL 30％三氯乙酸溶液重悬润洗并再次离心，晾干5min，挥发残余的β-巯基乙醇。最后用2mL含8M尿素的Tris-Gly缓冲液(50mM，pH＝8.00)重新溶解沉淀。每管吸取1mL做为空白组，并在剩余反应液中加入10μL DTNB(4mg/mL)显色。孵育30min后以12000r/min离心10min，除去沉淀，吸取上清，并稀释一定的倍数，于412nm测定吸光值，保证其吸光值在0.2-0.8之间。二硫键数量由以下公式计算：
SH＝73.53×A412×D/V----------------(公式1)
SH3＝SH1－SH2----------------(公式2)
SS＝N/2×(SH3/SH1)----------------(公式3)
其中SH为巯基浓度(μmol/mL)，SH3为成键半胱氨酸巯基浓度(μmol/mL)，SH2为游离半胱氨酸巯基浓度(μmol/mL)，SH1为总半胱氨酸巯基浓度(μmol/mL)，A412为除去空白样品后的吸光光度值，D为稀释倍数，V为溶液体积(mL)，SS为蛋白质内部二硫键的数目。
经过二硫键测定，结果如表4所示，除S198-242突变脂肪酶未形成二硫键，其余新引入的二硫键均正确成键。
表4 二硫键数目测定
实施例7：脂肪酶突变体的热稳定性与催化性质的测定。
利用荧光定量PCR仪，按照Protein Thermal Shift试剂盒推荐反应程序测定突变脂肪酶的Tm值，结果如表5所示，除了S4-266突变脂肪酶，其余引入的二硫键均大幅度提升了脂肪酶的Tm，引入的二硫键属于热稳定型二硫键，基于解折叠模型设计二硫键大大提升了设计的成功率。
表5 DSF测定结果
T50测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中精确保温15min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应5min，在20％(w/v)的碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余的相对酶活。
t1/2测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中50℃精确保温0、5、10、15、30、45、60min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应，20％(w/v)碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余的相对酶活。
最适反应温度测定方法：将0.1mg/mL的纯化蛋白溶液加入在30、35、40、45、50、55℃条件下预热的50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应，20％(w/v)碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度下脂肪酶的相对酶活。以上结果如表6所示:
表6 热稳定性测定结果
可见，S2-210、S8-214、S14-216和S191-241突变脂肪酶的热稳定性均显著地提高，其中S2-210在50℃下具有较长的半衰期，并且除S191-241突变脂肪酶外，其余突变脂肪酶的最适反应温度均提升至40℃。
实施例8：尿素解折叠检测湿熔球态的形成。
将0.1mg/mL纯化蛋白溶液与含0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6M尿素的Tris-Hcl缓冲液(50mM，pH＝7.50)均匀混合，常温下静止12个小时，使体系充分平衡后，加入bis-ANS荧光剂(终浓度为50μM)，常温结合1小时后，加入酶标板，在350nm波长激发，以492nm波长采集荧光信号，以荧光信号强度对尿素浓度作图。结果如图6所示，所有突变脂肪酶需要更高的尿素浓度方能完全进入湿熔球态，其中S2-210突变脂肪酶进入湿熔球态所需要的尿素浓度最高，为2.5M，在脂肪酶底部无规卷曲loop4(氨基酸207位至221位)与N端区域(氨基酸1位至13位)之间引入二硫键突变，均抑制了湿熔球态的形成。并且S191-241突变脂肪酶的荧光峰值显著低于其他突变脂肪酶，二硫键显著抑制了湿熔球态进一步地形成，证实β7、β8折叠之间的无规卷曲区域loop3(氨基酸228位至246位)的解离的为湿熔球态形成的关键步骤，与分子模拟结果一致。
实施例9：非还原性SDS-PAGE检测脂肪酶共价聚沉
将50μL 0.5mg/mL纯化蛋白溶液在PCR仪上50℃精确保温5、10、15、30、45、60min。以非还原性SDS-PAGE电泳检测脂肪酶的共价聚沉。结果如图7所示，Lip2脂肪酶在50℃处理5min后，发生了严重聚沉，共价聚体分子量集中在75kDa、110kDa和140kDa左右，随着热处理的时间增加，单体与二聚体均向更高聚体的转变。在引入二硫键突变后，所有的突变脂肪酶的共价聚沉均受到了抑制，其中S2-210、S8-214、S14-216、S191-241突变脂肪酶的聚沉抗性依次递减，其中S2-210、S8-214突变脂肪酶的低聚聚沉主要发生在10～15min的热处理期间，随后以高聚体聚沉为主。S14-216突变脂肪酶、S191-241突变脂肪酶和Lip2脂肪酶的低聚聚沉主要发生在热处理的前5min内，并且S191-241二硫键对loop3结构的限制并没有完全抑制共价聚沉，因此β9折叠与loop4的解离是Cys244游离半胱氨酸暴露的关键原因。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种热稳定的脂肪酶，其特征在于：是在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的解折叠和湿熔球态形成的关键区域引入二硫键突变；
所述的关键区域为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列；所述热稳定的脂肪酶为S2-210脂肪酶、S8-214脂肪酶、S14-216脂肪酶或S191-241脂肪酶；
S2-210脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S8-214脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
S14-216脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S191-241脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.编码权利要求1所述热稳定的脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于：
所述的S2-210脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的S8-214脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的S14-216脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的S191-241脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.权利要求1所述热稳定的脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）通过Gromacs分子动力学软件模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，通过对所得轨迹的波动性分析与蛋白表面水分子的统计，分析出脂肪酶解折叠和湿熔球态形成的关键区域，并进一步对β折叠尾巴区域分区，分析湿熔球态形成的步骤，最后使用Disulfideby Design软件算法筛选潜在二硫键突变位点；
（2）通过反向PCR突变，将所选出的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌工程菌中，进行扩增培养与质粒提取、测序；
（3）将测序正确的突变质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化入感受态毕赤酵母X33中，进一步通过博来霉素抗性平板筛选和BMMY-罗丹明B产酶平板筛选，得到对应的突变工程菌；
（4）将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；
（5）使用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶；
（6）通过DTNB法测定蛋白质中的游离巯基浓度和总巯基浓度，计算蛋白分子内的二硫键数目，检测引入的二硫键突变是否成键；
（7）通过p-NPP比色法和DSF荧光检测测定突变脂肪酶的热稳定性指标：保温15 min后残余50%活性的温度、50℃下的半衰期、最适反应温度以及蛋白熔解温度；
（8）通过不同尿素诱导解折叠测定湿熔球态的形成所需要的浓度，确定突变脂肪酶动力学稳定性大小；
（9）将突变脂肪酶在50℃下保温不同的时间，以非还原性SDS-PAGE检测突变脂肪酶的抗聚沉能力大小，得到热稳定的脂肪酶；步骤（1）中所述的脂肪酶解折叠和湿熔球态形成的关键区域为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述热稳定的脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的湿熔球态形成的步骤包括初级步骤和关键步骤；
所述的初级步骤为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2第207～221位氨基酸序列与第1～13位氨基酸序列的解离；
所述的关键步骤是耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2第228～246位氨基酸序列的解离。
5.权利要求1所述的热稳定型脂肪酶在工业中的应用。
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