CN108623652A - 一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用，该方法首先建立待改造蛋白质三维模型，用分子动力学模拟计算待改造蛋白质三维模型的分子热运动，根据氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断待改造蛋白质各部分的热稳定性，确定待改造蛋白质的不稳定结构域，通过定点变异得到待改造蛋白质的突变体，从内部和外部加固不稳定结构域，并选择合适的表达系统进行表达，得到热稳定性改善的蛋白质突变体。野生型脱支普鲁兰酶BDPulA经本发明的方法改造得到热稳定性改善的BDPulA突变体，热处理1h和2h后，残余酶活65.54‑88.1%、52.15‑77.27%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.29‑1.75倍、1.14‑1.67倍；其T1/22.0‑4.5h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的2.0‑4.5倍。

Description

一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用，通过理性设计蛋白质分子loop结构，对源自脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶进行热稳定性改造，结合蛋白质工程定点突变和异源表达技术提高普鲁兰酶的热稳定性，属于生物工程技术领域。
背景技术
酶作为天然的生物催化剂，具有较高的催化效率和底物特异性。酶的催化反应是一个动态的过程，酶分子也是一个整体稳定、局部柔韧的动态体系。无规则回路（loop）是蛋白质三维结构中的二级结构单元，是蛋白质结构中最复杂和最活跃的部分，对蛋白质的稳定性、柔韧性和动态活性起重要作用。许多酶分子的催化活性中心氨基酸位于loop上，以α-淀粉酶为例，位于催化活性中心的Asp328悬挂在19个残基组成的loop上。该loop由15个Hp-π键和两个氢键支撑，其柔韧性和稳定性对α-淀粉酶的催化活性十分重要，是酶分子改造的主要对象。
普鲁兰酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是能高效、专一地水解支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键的一种异淀粉酶，能使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，形成一系列链长不一的直链淀粉。在淀粉加工、生物能源和生物基材料等领域有重要应用。普鲁兰酶一般是在淀粉糖化阶段加入，协同糖化酶糖化，可有效加速糖化过程，提高淀粉利用率和水解效率。目前商业化的糖化酶最适作用温度和pH值分别为60°C和pH4.5，要求开发应用的普鲁兰酶不但具有相似的作用温度和pH，还应当具有良好的热稳定性。自然界中的许多微生物都能产生普鲁兰酶，但普遍存在热稳定性差的问题，制约了其在工业生产中的应用。
为了揭示酶分子的热稳定机制，探索提高酶分子的热稳定性策略，国内外学者进行了许多非常有价值的研究探索，提出了许多有价值的热稳定性模型。温度因子（B-factor）是晶体研究中的一个重要参数，用于描述原子热运动导致的X衍射衰减，体现了晶体中原子电子密度的“模糊度”（diffusion），这个“模糊度”实际上反映蛋白质分子在晶体中的构象状态。温度因子越高，“模糊度”越大，相应部位的构象就越不稳定。晶体学数据得到B-factor是以原子为单位给出，将其换算成相应氨基酸残基的B-factor值，便可分析氨基酸残基的构象稳定性或柔性。Reetz等人为提高枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）脂肪酶的热稳定性，对其X射线晶体结构进行氨基酸B-factor值分析，通过分析氨基酸残基的构象稳定性，选择蛋白质晶体结构中最“柔”的氨基酸位点（B-因子值最大）构建饱和突变体库，迭代突变筛选得到Tm显著提高的突变体（Nat Protoc, 2007, 2:891-903）。邬敏辰等人提出了一种利用分子动力学模拟的方法，提高β-1,4-内切木聚糖酶热稳定性。通过N端序列替换的方法，替换氨基酸B-factor值较高的区域，实现β-1,4-内切木聚糖酶的热稳定性改造（CN 102719457 A）。但是依据B-factor值，分析改造酶分子的热稳定性存在以下问题：1）B-facter主要用于描述蛋白质在结晶温度时候的结构特征，对蛋白质在正常工作温度中的状态无法进行有效表达。2）使用X-射线晶体学方法测定蛋白质B-facter数据的前提是必须获得能对X-射线产生强衍射作用的晶体。而蛋白质的表达、提纯与结晶都极大地增加了蛋白质结构测定的难度。现有蛋白质数据库中仅非常少的蛋白质被报道了晶体结构，因此对于没有B-facter数据的蛋白质，无法构建有效的定向突变策略。3）尽管B-facter数值高低用于描述蛋白质结构的稳定与否，但并不能解释导致蛋白质结构不稳定的具体原因，进而无法给出有效的定点突变方案。仅仅依据对高B-facte值位点的附近区域进行饱和突变，得到的突变体库大，且不必然得到正向突变结果。（Protein Eng, 2003. 16; 109-114;Proteins, 1998, 31: 201-213）。
分子动力学模拟（molecular dynamics simulation, MD）是利用计算机技术来模拟或仿真已有的理论知识，以分子的运动为主要的模拟对象，研究体系中所有粒子的运动状态随时间的演变，分析微观分子或原子的运动轨迹。通过统计力学对相空间取系综平均，进而获得体系相应的物理性质和化学性质。一方面现有实验仪器很难从原子尺度上观察到生物大分子在溶液中的行为，而MD模拟方法可以给出蛋白质、核酸等生物大分子内部运动随时间的最详实的变化情况，从而分析体系的诸多运动性质；另一方面动力学模拟中用到的各种势能参数来源于实验数据，它们对某一原子体系具有共性，能够发现共有规律，通过使用或修正这些势能参数，可以推断它们对于体系某一性质的贡献。本研究开发一种全新的模拟蛋白质热探测法，是利用分子动力学模拟的方法计算蛋白质分子的热运动，记录每个氨基酸Cα碳的位置偏移，分析蛋白质结构不稳定的成因，制定蛋白质定点改造方案。该方法能够有效改善蛋白质的热稳定性，提高蛋白质在热环境中的应用性能。
发明内容
为了提高蛋白质的耐热性，有目的的对蛋白质的氨基酸序列进行修饰，使其符合工业需求。本发明提供了一种蛋白质热稳定性改造的方法——模拟蛋白质热探测法，所述待改造蛋白质同已知结构的模板蛋白质的同源性>50%，具体包括以下步骤：
a）选取蛋白质家族中结构已知的、与待改造蛋白质同源性最高的蛋白质为模板蛋白质，建立待改造蛋白质的三维同源模型结构，得到待改造蛋白质三维模型；
b）用分子动力学模拟计算待改造蛋白质三维模型的分子热运动，每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t1的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到终止温度t2，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算的待改造蛋白质三维模型氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t2的稳定状态；
c）根据在t1和t2时待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P i ：
，
xt1、yt1、zt1分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t1时的三维坐标值，xt2、yt2、zt2分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t2时的三维坐标值；
d）根据每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断待改造蛋白质各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取待改造蛋白质分子从t1升温至t2过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定待改造蛋白质的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因，并从结构域的内部和外部加固该区域，具体方法是：（1）在不稳定结构域内部找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从内部加固不稳定结构域；（2）观察不稳定结构域与周围其它部分的氨基酸的关系，找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从外部加固不稳定结构域；
e）选择合适的表达系统，表达上述定点变异得到的氨基酸序列，得到热稳定性改善的蛋白质突变体。
上述的蛋白质热稳定性改造的方法，所述待改造蛋白质为脱支普鲁兰酶BDPulA324 ，所述BDPulA324为野生型脱支普鲁兰酶BDPulA N端截断108个氨基酸后得到的蛋白质，所述模板蛋白质为2WAN，两者同源性为64%，具体包括以下步骤：
a）将待改造的BDPulA324分子同已知结构的模板蛋白质2WAN分子进行三维同源建模，得到BDPulA324三维模型；
b) 利用分子动力学模拟计算BDPulA324三维模型的分子热运动，设置起始温度t1和终止温度t2，BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t1的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到温度t2，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算的BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t2的稳定状态
c）根据在t1和t2时BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P i ：
，
所述计算式中xt1、yt1、zt1分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t1时的三维坐标值，xt2、yt2、zt2分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t2时的三维坐标值；
d）根据BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断BDPulA324各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取BDPulA324三维模型从t1升温至t2过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定BDPulA324的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因，并从结构域的内部和外部加固该区域，具体方法是：（1）在不稳定结构域内部找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从内部加固不稳定结构域；（2）观察不稳定结构域与周围其它部分的氨基酸的关系，找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从外部加固不稳定结构域；
e）选择合适的表达系统，以野生型脱支普鲁兰酶BDPulA为模板，对上述方法分析得到的氨基酸位点进行定点变异，表达得到热稳定性改善的BDPulA突变体。
优选的，所述起始温度t1和所述终止温度t2分别为300K和340K。
优选的，所述热稳定性改善是指蛋白质活性损失一半时所需要的时间T1/2提高5%以上，所述T1/2的分析检测条件为pH 4.4，温度60℃。
优选的，所述热稳定性改善是指蛋白质的残存活力提高5%以上，所述蛋白质的残存活力分析检测条件为pH 4.4，温度60℃。
优选的，所述定点变异包括单个或多个相对于野生型脱支普鲁兰酶BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基的取代。
优选的，所述定点变异包括单点突变：序列号第390位的缬氨酸突变成天冬酰胺，V390N，得到BDPulA突变体V390N，序列号第390位的缬氨酸突变成丝氨酸，V390S，得到BDPulA突变体V390S；两点突变：序列号第332位的天冬氨酸突变成组氨酸，序列号第398位的天冬氨酸突变成酪氨酸，D332H/D398Y，得到BDPulA突变体D332H/D398Y；三点突变：序列号第322位、第390位以及第398位协同突变为D332H/V390N/D398Y或D332H/V390S/D398Y，得到BDPulA突变体D332H/V390N/D398Y或BDPulA突变体D332H/V390S/D398Y，所述突变序列号为BDPulA324三维模型中对应的氨基酸序列。
优选的，所述BDPulA突变体其氨基酸序列选自SEQ ID NO: 4、6、8、10、12氨基酸序列中的一种。
优选的，所述BDPulA突变体其基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO: 3、5、7、9、11核苷酸序列中的一种，所述核苷酸序列经过密码子优化。
优选的，所述BDPulA突变体其基因核苷酸序列可通过基因合成和/或定点突变的方法得到，并可操作地连接至控制序列，形成表达构建物，所述表达构建物可被转化的宿主细胞识别。
优选的，所述表达构建物被转染到宿主生物中。
优选的，所述宿主生物选自细菌、真菌和真核细胞。
优选的，所述宿主生物选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌种、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和黑曲霉。
本发明的有益效果是：
（1）本发明提供的蛋白质热稳定性改造方法对野生型脱支普鲁兰酶BDPulA分子进行定点改造，得到一种BDPulA突变体，包括含有一个、两个或三个相对于BDPulA氨基酸残基的取代，并且BDPulA突变体具有更好的热稳定性。
（2）BDPulA突变体V390N同野生型脱支普鲁兰酶BDPulA相比，其第390位点的缬氨酸被天冬酰胺取代，390位点的羰基/氨基与413位点的谷氨酰胺上的氨基/羰基通过静电作用形成酰胺桥，加强了390位点与loop内的413位点的作用力，从内部稳定loop（382-421）的结构， BDPulA突变体V390N在热处理1 h和2 h后，残余酶活65.54%、52.65%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.29、1.14倍；其T1/2 2 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的2倍。
（3）BDPulA突变体V390S同野生型脱支普鲁兰酶BDPulA相比，其第390位点的缬氨酸被丝氨酸取代， 390位点上的极性氢与413位点的谷氨酰胺上的羰基氧原子形成氢键，加强了390位点与loop内的413位点的作用力，从内部稳定loop（382-421）的结构，BDPulA突变体V390S在热处理1 h和2 h后，残余酶活80.06%、69.65%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.58、1.51倍；其T1/2 3.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的3.5倍。
（4）BDPulA突变体D332H/D398Y同野生型脱支普鲁兰酶BDPulA相比，其第332位点的天冬氨酸被组氨酸取代，第398位的天冬氨酸被酪氨酸取代，野生型脱支普鲁兰酶BDPulA中332位点和398位点的两个天冬酰胺残基均带负电荷，相互排斥，影响loop（382-421）的稳定性，分别被组氨酸和酪氨酸取代后的322位点和398位点之间可形成稳固的离子对：质子化的组氨酸与酪氨酸形成强的离子-π键，非质子化的组氨酸则与酪氨酸形成极性氢-π键，从外部加强对loop（382-421）的支撑，BDPulA突变体D322H/D398Y在热处理1 h和2 h后，残余酶活66.21%、58.97%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.31、1.27倍；其T1/2 3.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的3.5倍。
（5）BDPulA突变体D332H/V390N/D398Y或BDPulA突变体D332H/V390S/D398Y，其第332位点的天冬氨酸被组氨酸取代，第390位点的缬氨酸分别被天冬酰胺或丝氨酸取代，第398位的天冬氨酸被酪氨酸取代，在BDPulA突变体V390N、V390S和D332H/D398Y的基础上，同时从内部和外部稳定了loop（382-421）的结构，酶分子热稳定性进一步提高。其中BDPulA突变体D322H/V390S/D398Y在热处理1 h和2 h后，残余酶活82.15%、76.94%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.62、1.66倍；其T1/2 大于4.0 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的4.0倍； BDPulA突变体D322H/V390N/D398Y热处理1 h和2 h后，残余酶活88.81%、77.27%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.74、1.67倍；其T1/2 大于4.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的4.5倍以上。
本发明涉及能编码本发明BDPulA突变体氨基酸序列和/或核苷酸序列的表达构建物。本发明不限于任何特定的表达构建物，只要其能够表达本发明突变体的肽。以原核生物表达为例，所述表达构建物还应当包括启动子，任选地，操作子序列，核糖体结合位点和可能的其它序列。
本发明涉及将包含本发明BDPulA突变体氨基酸序列和/或核苷酸序列的表达构建物转染到适合的宿主生物。宿主生物可以是微生物、真核细胞或组织培养物、植物细胞或组织培养物、或真菌细胞或组织培养物。在优选的实施方式中，宿主生物为微生物。优选的宿主微生物包括但不限于：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis和B. deramificicans）、埃希氏大肠杆菌（Eschericia coli）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或黑曲霉（Aspergillus niger）。在最优选的实施方式中，宿主生物是埃希氏大肠杆菌。
需要特别指出的是，本发明所述BDPulA突变体的核苷酸序列均经过密码子优化，适合在大肠杆菌宿主中表达。此处的“密码子优化”是指提高表达水平的技术，其通过用编码相同氨基酸但被宿主生物更有效处理的密码子置换编码序列中的核苷酸密码子进行。不同物种之间的密码子偏好性可显著不同。为提高外源蛋白在特定表达系统（细菌、真菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞）中的表达水平，通过调整外源蛋白密码子的频率，以匹配宿主表达系统密码子的频率。因此，将本发明密码子优化后的核苷酸序列应用于所述所有宿主生物中，可能不能高效表达。
本发明涉及从培养本发明的宿主生物的培养基中分离和纯化本发明的肽。在这点上，本发明不限定于任何特定的分离和纯化技术，只要其产生10%的最低纯度。在更优选的实施方式中，分离和纯化的肽的最低纯度为25%，在甚至更优选的实施方式中，分离和纯化的肽的最低纯度为50%。还在更优选的实施方式中，分离和纯化的肽的最低纯度为75%。在最优选的实施方式中，本发明分离和纯化的肽的最低纯度为90%。最低纯度可通过质量百分比或本领域已知的其它适合的方法测量。
本发明不限于任何分离和纯化本发明的肽的具体纯化方法。本领域已知的任何肽纯化方法都是适合的。合适的纯化方法非限制性实例包括亲和层析、沉淀、大小排阻层析、薄层层析、电泳、大小过滤等。
附图说明
图1：脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型，浅色部分为2WAN三维结构，深色部分为脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型，脱支普鲁兰酶BDPulA324为野生型脱支普鲁兰酶BDPulA N端截断108个氨基酸后的剩余氨基酸；
图2：脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型在t1（300 K）和t2（340 K）时的结构分析，深色部分为t1时的结构，浅色部分为t2时的结构；
图3： BDPulA突变体324 V390S和BDPulA突变体324 V390N结构分析，（A）脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型中的loop（382-342）结构；（B）脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型中，残基Val390和Gln413之间无分子作用力；（C）BDPulA突变体324V390S三维模型中，残基Ser390和Gln413之间形成氢键；（D）BDPulA突变体324 V390N三维模型中，残基Asn390和Gln413之间形成酰胺桥；
图4： BDPulA突变体324D322H/D398Y结构分析，（A）脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型中，残基Asp332和Asp398由于均带负电荷，产生排斥；（B）BDPulA突变体324 D322H/D398Y三维模型中，残基His332和Tyr398之间形成强的离子-π键或极性氢-π键；
图 5：野生型脱支普鲁兰酶BDPulA和BDPulA突变体热稳定性分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。本发明所用实验材料如无特别说明均为市售产品，实验步骤若无特别说明均为本领域技术人悉知的常规操作。
实施例1
脱支普鲁兰酶BDPulA324热稳定性改造
待改造蛋白质为脱支普鲁兰酶BDPulA324，BDPulA324为野生型脱支普鲁兰酶BDPulA N端截断108个氨基酸后得到的蛋白质，模板蛋白质为2WAN，两者同源性为64%，具体包括以下步骤：
a）将待改造的BDPulA324分子同已知结构的模板蛋白质2WAN分子进行三维同源建模，得到BDPulA324三维模型，如图1；
b）利用分子动力学模拟计算BDPulA324三维模型的分子热运动，设置起始温度t1300 K和终止温度t2340 K，BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t1的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到温度t2，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t2的稳定状态，BDPulA324三维模型在t1和t2时的结构如图2所示；
c）根据在t1和t2时BDPulA324三维模型的每个氨基酸的Cα碳原子三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P i ：
，
所述计算式中xt1、yt1、zt1分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t1时的三维坐标值，xt2、yt2、zt2分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t2时的三维坐标值；
d）根据每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断BDPulA324各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取BDPulA324三维模型从t1升温至t2过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定BDPulA324的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因。
实施例2
BDPulA突变体V390N的构建和热稳定性分析
依据脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型的热稳定性分析结果，残基Val390和Gln413之间无分子作用力（图3）。以核苷酸序列SEQ ID NO: 1合成野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的基因DNA，构建质粒pET28a（+）/；以pET28a（+）/为模板设计合成引物，在野生型脱支普鲁兰酶BDPulA氨基酸序列第390位引入单点突变V390N，得到如SEQ ID NO: 4的氨基酸序列和SEQID NO: 3的核苷酸序列，构建质粒pET28a（+）/V390N，经DNA测序、序列比对无误后，将上述构建的质粒pET28a（+）/V390N转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)；挑取阳性克隆于LB液体培养基培养，进入对数生长期后，5%接种量转接至自诱导培养基，于30℃，200 rpm，持续发酵培养40 h，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬、冰浴超声破碎，离心收集得到上清液，镍亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳检测，得到单一条带，条带大小与预期一致，即为BDPulA突变体V390N的蛋白条带；
将纯化的野生型脱支普鲁兰酶BDPulA和BDPulA突变体V390N分别用50 mM pH4.4醋酸钠缓冲液稀释至一定浓度，得到酶溶液，置60℃恒温水浴中，每间隔0.5 h取样，测定残余酶活，测定步骤如下：1）普鲁兰酶水解反应：在酶溶液中分别加入1%普鲁兰糖溶液50 mMpH4.4醋酸钠缓冲液），定容至2 mL反应体系，60℃恒温浴，反应15 min；2）DNS反应：在上述反应体系中迅速加入等体积DNS溶液，混匀终止反应，沸水浴5 min，冰水冷却，540 nm处测量吸光度，计算酶活力；
BDPulA突变体V390N在60℃，pH4.4的条件热处理1 h和2 h后，如图5所示，残余酶活65.54%、52.65%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.29、1.14倍；其T1/2 2.0 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的2.0倍，结合图3可以看到， BDPulA突变体V390N残基Asn390和Gln413之间形成酰胺桥，说明改造后的BDPulA突变体V390N热稳定性显著提高。
实施例3
BDPulA突变体V390S的构建和热稳定性分析
依据脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型的热稳定性分析结果，残基Val390和Gln413之间无分子作用力（图3）。以pET28a（+）/为模板设计合成引物，在野生型脱支普鲁兰酶BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO: 2中第390位引入单点突变V390S，得到如SEQ ID NO: 6的氨基酸序列和SEQ ID NO: 5的核苷酸序列，构建质粒pET28a（+）/V390S，经DNA测序、序列比对无误后，将上述构建的质粒pET28a（+）/V390S转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)；挑取阳性克隆于LB液体培养基培养，进入对数生长期后，5%接种量转接至自诱导培养基，于30℃，200rpm，持续发酵培养40 h，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬、冰浴超声破碎，离心收集得到上清液，镍亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳检测，得到单一条带，条带大小与预期一致，即为BDPulA突变体V390S的蛋白条带；
将纯化的野生型脱支普鲁兰酶BDPulA和BDPulA突变体V390S分别用50 mM pH4.4醋酸钠缓冲液稀释至一定浓度，得到酶溶液，置60℃恒温水浴中，每间隔0.5 h取样，测定残余酶活，测定步骤如下：1）普鲁兰酶水解反应：在酶溶液中分别加入1%普鲁兰糖溶液50 mMpH4.4醋酸钠缓冲液），定容至2 mL反应体系，60℃恒温浴，反应15 min；2）DNS反应：在上述反应体系中迅速加入等体积DNS溶液，混匀终止反应，沸水浴5 min，冰水冷却，540 nm处测量吸光度，计算酶活力；
BDPulA突变体V390S在60℃，pH4.4的条件热处理1 h和2 h后，如图5所示，残余酶活80.06%、69.65%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.58、1.51倍；其T1/2 3.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的3.5倍，结合图3可以看到， BDPulA突变体V390S残基Ser390和Gln413之间形成氢键，说明改造后的BDPulA突变体V390S热稳定性显著提高。
实施例4
BDPulA突变体D322H/D398Y的构建和热稳定性分析
依据脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型的热稳定性分析结果，残基Asp332和Asp398由于均带负电荷，产生排斥。以pET28a（+）/为模板设计合成引物，在野生型脱支普鲁兰酶BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO: 2中第322位和第398位引入两点突变D322H/D398Y，得到如SEQ ID NO: 8的氨基酸序列和SEQ ID NO: 7的核苷酸序列，构建质粒pET28a（+）/D322H/D398Y，经DNA测序、序列比对无误后，将上述构建的质粒pET28a（+）/D322H/D398Y转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)；挑取阳性克隆于LB液体培养基培养，进入对数生长期后，5%接种量转接至自诱导培养基，于30℃，200 rpm，持续发酵培养40 h，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬、冰浴超声破碎，离心收集得到上清液，镍亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳检测，得到单一条带，条带大小与预期一致，即为BDPulA突变体D322H/D398Y的蛋白条带；
将纯化的野生型脱支普鲁兰酶BDPulA和BDPulA突变体D322H/D398Y分别用50 mMpH4.4醋酸钠缓冲液稀释至一定浓度，得到酶溶液，置60℃恒温水浴中，每间隔0.5 h取样，测定残余酶活，测定步骤如下：1）普鲁兰酶水解反应：在酶溶液中分别加入1%普鲁兰糖溶液50 mM pH4.4醋酸钠缓冲液），定容至2 mL反应体系，60℃恒温浴，反应15 min；2）DNS反应：在上述反应体系中迅速加入等体积DNS溶液，混匀终止反应，沸水浴5 min，冰水冷却，540nm处测量吸光度，计算酶活力；
BDPulA突变体D322H/D398Y在60℃，pH4.4的条件热处理1 h和2 h后，如图5所示，残余酶活66.21%、58.97%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.31、1.27倍；其T1/2 3.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的3.5倍，结合图4可以看到，BDPulA突变体D322H/D398Y残基His332和Tyr398之间形成强的离子-π键或极性氢-π键，说明改造后的BDPulA突变体D322H/D398Y热稳定性显著提高。
实施例5
BDPulA突变体D322H/V390S/D398Y的构建和热稳定性分析
依据脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型的热稳定性分析结果，以pET28a（+）/为模板设计合成引物，在野生型脱支普鲁兰酶BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO: 2中第322位、第390位和第398位引入三点突变D322H/V390S/D398Y，得到如SEQ ID NO: 12的氨基酸序列和SEQID NO: 11的核苷酸序列，构建质粒pET28a（+）/D322H/V390S/D398Y，经DNA测序、序列比对无误后，将上述构建的质粒pET28a（+）/D322H/V390S/D398Y转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)；挑取阳性克隆于LB液体培养基培养，进入对数生长期后，5%接种量转接至自诱导培养基，于30℃，200 rpm，持续发酵培养40 h，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬、冰浴超声破碎，离心收集得到上清液，镍亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳检测，得到单一条带，条带大小与预期一致，即为BDPulA突变体D322H/V390S/D398Y的蛋白条带；
将纯化的野生型脱支普鲁兰酶BDPulA和BDPulA突变体D322H/V390S/D398Y分别用50mM pH4.4醋酸钠缓冲液稀释至一定浓度，得到酶溶液，置60℃恒温水浴中，每间隔0.5 h取样，测定残余酶活，测定步骤如下：1）普鲁兰酶水解反应：在酶溶液中分别加入1%普鲁兰糖溶液50 mM pH4.4醋酸钠缓冲液），定容至2 mL反应体系，60℃恒温浴，反应15 min；2）DNS反应：在上述反应体系中迅速加入等体积DNS溶液，混匀终止反应，沸水浴5 min，冰水冷却，540 nm处测量吸光度，计算酶活力；
BDPulA突变体D322H/V390S/D398Y在60℃，pH4.4的条件热处理1 h和2 h后，如图5所示，残余酶活82.15%、76.94%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.62、1.66倍；其T1/24.0 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的4.0倍，说明改造后的BDPulA突变体D322H/V390S/D398Y热稳定性显著提高。
实施例6
BDPulA突变体D322H/V390N/D398Y的构建和热稳定性分析
依据脱支普鲁兰酶BDPulA324三维模型的热稳定性分析结果，以pET28a（+）/为模板设计合成引物，在野生型脱支普鲁兰酶BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO: 2中第322位、第390位和第398位引入三点突变D322H/V390N/D398Y，得到如SEQ ID NO: 10的氨基酸序列和SEQID NO: 9的核苷酸序列，构建质粒pET28a（+）/D322H/V390N/D398Y，经DNA测序、序列比对无误后，将上述构建的质粒pET28a（+）/D322H/V390N/D398Y转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)；挑取阳性克隆于LB液体培养基培养，进入对数生长期后，5%接种量转接至自诱导培养基，于30℃，200 rpm，持续发酵培养40 h，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬、冰浴超声破碎，离心收集得到上清液，镍亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳检测，得到单一条带，条带大小与预期一致，即为BDPulA突变体D322H/V390N/D398Y的蛋白条带；
将纯化的野生型脱支普鲁兰酶BDPulA和BDPulA突变体D322H/V390N/D398Y分别用50mM pH4.4醋酸钠缓冲液稀释至一定浓度，得到酶溶液，置60℃恒温水浴中，每间隔0.5 h取样，测定残余酶活，测定步骤如下：1）普鲁兰酶水解反应：在酶溶液中分别加入1%普鲁兰糖溶液50 mM pH4.4醋酸钠缓冲液），定容至2 mL反应体系，60℃恒温浴，反应15 min；2）DNS反应：在上述反应体系中迅速加入等体积DNS溶液，混匀终止反应，沸水浴5 min，冰水冷却，540 nm处测量吸光度，计算酶活力；
BDPulA突变体D322H/V390N/D398Y在60℃，pH4.4的条件热处理1 h和2 h后，如图5所示，残余酶活88.81%、77.27%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.74、1.67倍；其T1/2 大于4.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的4.5倍以上，说明改造后的BDPulA突变体D322H/V390N/D398Y热稳定性显著提高。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西科学院
<120> 一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用
<130> 2018
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2784
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gatggtaata ccacaacaat tatcgtgcat tactttcgtc cggccggtga ctaccagccg 60
tggagcctgt ggatgtggcc gaaagatggc ggcggtgcag aatatgactt taaccagccg 120
gcagacagtt ttggcgccgt tgccagtgcc gatattccgg gtaaccctag ccaagtgggc 180
attattgtgc gcacccaaga ctggaccaag gacgttagtg cagaccgcta tattgacctg 240
agcaaaggca atgaggtgtg gctggtggag ggcaacagtc agattttcta caatgagaag 300
gatgccgaag atgccgccaa gccggccgtt agtaacgcct atctggacgc cagtaatcag 360
gtgctggtta aactgagtca gccgctgacc ctgggcgaag gtgccagcgg ctttaccgtt 420
cacgatgaca ccgccaataa ggacatcccg gtgaccagcg tgaaagacgc aagcctgggc 480
caggacgtta cagccgtgtt agccggcaca ttccagcata tcttcggcgg cagtgattgg 540
gccccggata atcatagcac cctgctgaag aaggttacca acaatctgta tcagtttagc 600
ggtgacctgc cggaaggcaa ttatcagtac aaggtggcac tgaacgatag ttggaataat 660
ccgagctatc cgagcgataa catcaatctg accgttccgg caggtggtgc ccacgttacc 720
ttcagctata tccctagcac ccacgcagtt tacgatacca ttaataatcc gaatgcagat 780
ttacaggtgg aaagcggcgt gaagaccgat ctggtgacag tgacactggg cgaagacccg 840
gacgttagcc atacactgag tatccagacc gatggctacc aggccaaaca ggtgattccg 900
cgcaatgtgc tgaacagcag tcagtattac tacagcggcg acgatctggg caatacatac 960
acccagaagg caacaacctt caaagtttgg gccccgacca gcacccaagt gaacgttctg 1020
ctgtacgaca gcgcaaccgg tagcgtgacc aagattgtgc cgatgacagc aagtggtcat 1080
ggtgtgtggg aggcaaccgt taatcaaaac ctggagaatt ggtactatat gtatgaggtg 1140
accggccagg gcagtacccg cacagccgtt gatccgtatg ccaccgccat cgcacctaat 1200
ggcacccgcg gcatgatcgt ggatctggca aaaaccgacc ctgccggctg gaatagtgac 1260
aaacatatca cacctaaaaa tatcgaggat gaagtgattt acgagatgga tgtgcgcgac 1320
tttagtattg atccgaacag cggtatgaaa aataaaggta aatatttagc attaacagag 1380
aaaggcacca agggtccgga caacgtgaaa accggtattg acagcctgaa acagctgggc 1440
attacccatg tgcagctgat gccggtgttt gcaagcaata gcgttgacga gaccgacccg 1500
acccaggaca actggggcta cgacccgcgc aactacgatg ttcctgaggg ccagtatgca 1560
accaacgcca atggtaatgc ccgcattaag gagttcaaag agatggtgct gagcctgcac 1620
cgcgaacata ttggtgttaa catggatgtt gtgtataacc ataccttcgc cacccagatc 1680
agtgactttg ataaaattgt gcctgaatat tattaccgca ccgatgatgc aggcaactac 1740
acaaacggca gcggcaccgg taacgagatt gccgccgaac gcccgatggt gcagaaattt 1800
attattgata gcctgaaata ctgggttaac gaatatcaca tcgacggttt ccgcttcgat 1860
ctgatggcct tactgggcaa ggatacaatg agcaaggcag caagcgaact gcatgcaatc 1920
aatccgggta ttgccctgta tggcgaacct tggaccggcg gtacaagcgc actgcctgat 1980
gatcagctgc tgaccaaagg tgcccagaaa ggtatgggcg tggcagtgtt caacgataac 2040
ctgcgcaacg ccttagatgg caacgttttc gacagcagtg cccagggttt tgccaccggc 2100
gccaccggtt taaccgatgc catcaaaaac ggcgttgagg gcagcatcaa cgatttcaca 2160
agcagtccgg gtgagaccat caattatgtt accagccatg ataattacac actgtgggat 2220
aagattgccc tgagcaatcc gaacgatagc gaggcagacc gcatcaaaat ggacgagtta 2280
gcccaggcag tggttatgac cagtcagggt gtgcctttca tgcagggtgg tgaagagatg 2340
ctgcgcacca aaggcggtaa tgataatagc tacaatgcag gcgatgcagt taacgaattt 2400
gactggagcc gcaaagccca gtacccggat gtgttcaact actacagtgg tctgattcac 2460
ctgcgcttag atcatccggc attccgcatg accaccgcca acgagatcaa tagccattta 2520
cagtttttaa atagtccgga aaataccgtt gcttatgaac tgacagatca tgttaacaaa 2580
gataaatggg gtaatattat cgttgtttat aacccgaata agacagtggc caccattaac 2640
ctgccgagcg gcaaatgggc catcaacgca accagcggta aggttggtga gagcaccctg 2700
ggccaagccg agggcagtgt tcaggtgccg ggcatcagca tgatgatcct gcaccaagaa 2760
gtgagcccgg atcatggtaa aaaa 2784
<210> 2
<211> 928
<212> PRT
<213> E.coli BL21(DE3)
<400> 2
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val Ala
35 40 45
Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg
50 55 60
Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu
65 70 75 80
Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe
85 90 95
Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn
100 105 110
Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro
115 120 125
Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr
130 135 140
Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly
145 150 155 160
Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly
165 170 175
Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val
180 185 190
Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr
195 200 205
Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro
210 215 220
Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr
225 230 235 240
Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn
245 250 255
Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val
260 265 270
Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile
275 280 285
Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu
290 295 300
Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln
325 330 335
Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Ile
340 345 350
Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn
355 360 365
Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly
370 375 380
Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn
385 390 395 400
Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly
405 410 415
Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val
420 425 430
Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly
435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys
450 455 460
Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly
465 470 475 480
Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp
485 490 495
Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg
515 520 525
Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile
530 535 540
Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala
580 585 590
Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610 615 620
Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met
660 665 670
Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn
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Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
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Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
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<213> E.coli BL21(DE3)
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tggagcctgt ggatgtggcc gaaagatggc ggcggtgcag aatatgactt taaccagccg 120
gcagacagtt ttggcgccgt tgccagtgcc gatattccgg gtaaccctag ccaagtgggc 180
attattgtgc gcacccaaga ctggaccaag gacgttagtg cagaccgcta tattgacctg 240
agcaaaggca atgaggtgtg gctggtggag ggcaacagtc agattttcta caatgagaag 300
gatgccgaag atgccgccaa gccggccgtt agtaacgcct atctggacgc cagtaatcag 360
gtgctggtta aactgagtca gccgctgacc ctgggcgaag gtgccagcgg ctttaccgtt 420
cacgatgaca ccgccaataa ggacatcccg gtgaccagcg tgaaagacgc aagcctgggc 480
caggacgtta cagccgtgtt agccggcaca ttccagcata tcttcggcgg cagtgattgg 540
gccccggata atcatagcac cctgctgaag aaggttacca acaatctgta tcagtttagc 600
ggtgacctgc cggaaggcaa ttatcagtac aaggtggcac tgaacgatag ttggaataat 660
ccgagctatc cgagcgataa catcaatctg accgttccgg caggtggtgc ccacgttacc 720
ttcagctata tccctagcac ccacgcagtt tacgatacca ttaataatcc gaatgcagat 780
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<213> E.coli BL21(DE3)
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Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly
465 470 475 480
Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Ser Asp
485 490 495
Glu Thr Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg
515 520 525
Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile
530 535 540
Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala
580 585 590
Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610 615 620
Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met
660 665 670
Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn
865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
900 905 910
Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
915 920 925

Claims (13)

1.一种蛋白质热稳定性改造的方法，其特征在于，待改造蛋白质同已知结构的模板蛋白质的同源性>50%，具体包括以下步骤：
a）选取蛋白质家族中结构已知的、与待改造蛋白质同源性最高的蛋白质为模板蛋白质，建立待改造蛋白质的三维同源模型结构，得到待改造蛋白质三维模型；
b）用分子动力学模拟计算待改造蛋白质三维模型的分子热运动，每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t1的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到终止温度t2，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算的待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t2的稳定状态；
c）根据待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在t1和t2时的三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P i ：
，
所述计算式中xt1、yt1、zt1分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t1时的三维坐标值，xt2、yt2、zt2分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t2时的三维坐标值；
d）根据每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断待改造蛋白质各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取待改造蛋白质从t1升温至t2过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定待改造蛋白质的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因，并从结构域的内部和外部加固该区域，具体方法是：（1）在不稳定结构域内部找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从内部加固不稳定结构域；（2）观察不稳定结构域与周围其它部分的氨基酸的关系，找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从外部加固不稳定结构域；
e）选择合适的表达系统，表达上述定点变异得到的氨基酸序列，得到热稳定性改善的蛋白质突变体。
2.如权利要求1所述的蛋白质热稳定性改造的方法，其特征在于，所述待改造蛋白质为脱支普鲁兰酶BDPulA324，所述BDPulA324为野生型脱支普鲁兰酶BDPulA N端截断108个氨基酸后得到的蛋白质，所述模板蛋白质为2WAN，两者同源性为64%，具体包括以下步骤：
a）将待改造的BDPulA324分子同已知结构的模板蛋白质2WAN分子进行三维同源建模，得到BDPulA324三维模型；
b）利用分子动力学模拟计算BDPulA324三维模型的分子热运动，设置起始温度t1和终止温度t2，BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t1的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到温度t2，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t2的稳定状态；
c）根据在t1和t2时BDPulA324三维模型的每个氨基酸的Cα碳原子三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P i ：
，
所述计算式中xt1、yt1、zt1分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t1时的三维坐标值，xt2、yt2、zt2分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t2时的三维坐标值；
d）根据每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断BDPulA324各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取BDPulA324三维模型从t1升温至t2过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定BDPulA324的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因，并从结构域的内部和外部加固该区域，具体方法是：（1）在不稳定结构域内部找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从内部加固不稳定结构域；（2）观察不稳定结构域与周围其它部分的氨基酸的关系，找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从外部加固不稳定结构域；
e）选择合适的表达系统，以野生型脱支普鲁兰酶BDPulA为模板，对上述方法分析得到的氨基酸位点进行定点变异，表达得到热稳定性改善的BDPulA突变体。
3.如权利要求2所述的蛋白质热稳定性改造的方法，其特征在于，所述起始温度t1和所述终止温度t2分别为300K和340K。
4.如权利要求3所述的蛋白质热稳定性改造的方法，其特征在于，所述热稳定性改善是指蛋白质活性损失一半时所需要的时间T1/2提高5%以上，所述T1/2的分析检测条件为pH4.4，温度60℃。
5.如权利要求3所述的蛋白质热稳定性改造的方法，其特征在于，所述热稳定性改善是指蛋白质的残存活力提高5%以上，所述蛋白质的残存活力分析检测条件为pH 4.4，温度60℃。
6.如权利要求3所述的蛋白质热稳定性改造的方法得到的一种热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，所述定点变异包括单个或多个相对于BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO:2中的氨基酸残基的取代。
7.如权利要求6所述的热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，所述定点变异包括单点突变：序列号第390位的缬氨酸突变成天冬酰胺，V390N，得到BDPulA突变体V390N，序列号第390位的缬氨酸突变成丝氨酸，V390S，得到BDPulA突变体V390S；两点突变：序列号第332位的天冬氨酸突变成组氨酸，序列号第398位的天冬氨酸突变成酪氨酸，D332H/D398Y，得到BDPulA突变体D332H/D398Y；三点突变：序列号第332位、第390位以及第398位协同突变为D332H/V390N/D398Y或D332H/V390S/D398Y，得到BDPulA突变体D332H/ V390N/D398Y或BDPulA突变体D332H/ V390S/D398Y，所述序列号为BDPulA324三维模型中对应的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，其氨基酸序列选自SEQ ID NO: 4、6、8、10、12氨基酸序列中的一种。
9.如权利要求6所述的热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，其基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO: 3、5、7、9、11核苷酸序列中的一种，所述核苷酸序列经过密码子优化。
10.如权利要求9所述的热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，所述核苷酸序列可通过基因合成和/或定点突变的方法得到，并可操作地连接至控制序列，形成表达构建物，所述表达构建物可被转化的宿主细胞识别。
11.如权利要求10所述的热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，所述表达构建物被转染到宿主生物中。
12.如权利要求11所述的热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，所述宿主生物选自细菌、真菌和真核细胞。
13.如权利要求12所述的热稳定性改善的BDPulA突变体，其特征在于，所述宿主生物选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌种、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和黑曲霉。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109321552A (zh) * 2018-10-11 2019-02-12 山东隆科特酶制剂有限公司 一种新型普鲁兰酶及其基因、工程菌和制备方法
CN109903818A (zh) * 2019-02-21 2019-06-18 深圳晶泰科技有限公司 基于恒定pH分子动力学模拟的蛋白质质子化状态确定方法
CN110184259A (zh) * 2019-07-09 2019-08-30 江南大学 一种厌氧芽孢杆菌来源普鲁兰酶突变体及其应用
WO2020034615A1 (zh) * 2019-02-21 2020-02-20 深圳晶泰科技有限公司 基于恒定pH分子动力学模拟的蛋白质质子化状态确定方法
CN111808836A (zh) * 2020-07-23 2020-10-23 中国农业科学院农产品加工研究所 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用
WO2022100011A1 (zh) * 2020-11-14 2022-05-19 山西大学 基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011076797A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Biogasol Ipr Aps Thermophilic thermoanaerobacter italicus subsp. marato having high alcohol productivity
CN102719457A (zh) * 2011-12-12 2012-10-10 江南大学 β-1,4-内切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因耐热性改造的理性设计及杂合酶的制备
CN103087145A (zh) * 2013-02-20 2013-05-08 福州大学 一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法
CN103966186A (zh) * 2014-04-08 2014-08-06 南京工业大学 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶a的热稳定性的方法
CN105112433A (zh) * 2015-09-08 2015-12-02 广西科学院 一种新的i型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用
CN106801046A (zh) * 2016-09-13 2017-06-06 中国农业科学院生物技术研究所 热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011076797A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Biogasol Ipr Aps Thermophilic thermoanaerobacter italicus subsp. marato having high alcohol productivity
CN102719457A (zh) * 2011-12-12 2012-10-10 江南大学 β-1,4-内切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因耐热性改造的理性设计及杂合酶的制备
CN103087145A (zh) * 2013-02-20 2013-05-08 福州大学 一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法
CN103966186A (zh) * 2014-04-08 2014-08-06 南京工业大学 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶a的热稳定性的方法
CN105112433A (zh) * 2015-09-08 2015-12-02 广西科学院 一种新的i型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用
CN106801046A (zh) * 2016-09-13 2017-06-06 中国农业科学院生物技术研究所 热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QI-SHI DU等: "Empirical Formulation and Parameterization of Cation–p Interactions for Protein Modeling", 《JOURNAL OF COMPUTATIONAL CHEMISTRY》 *
郭超等: "理性设计改造牛肠激酶的热稳定性", 《中国生物工程杂志》 *
陈阿娜等: "Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶可溶性高效表达及热稳定性分子改造", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109321552A (zh) * 2018-10-11 2019-02-12 山东隆科特酶制剂有限公司 一种新型普鲁兰酶及其基因、工程菌和制备方法
CN109321552B (zh) * 2018-10-11 2021-01-22 山东隆科特酶制剂有限公司 一种新型普鲁兰酶及其基因、工程菌和制备方法
CN109903818A (zh) * 2019-02-21 2019-06-18 深圳晶泰科技有限公司 基于恒定pH分子动力学模拟的蛋白质质子化状态确定方法
WO2020034615A1 (zh) * 2019-02-21 2020-02-20 深圳晶泰科技有限公司 基于恒定pH分子动力学模拟的蛋白质质子化状态确定方法
CN109903818B (zh) * 2019-02-21 2022-03-18 深圳晶泰科技有限公司 基于恒定pH分子动力学模拟的蛋白质质子化状态确定方法
CN110184259A (zh) * 2019-07-09 2019-08-30 江南大学 一种厌氧芽孢杆菌来源普鲁兰酶突变体及其应用
CN110184259B (zh) * 2019-07-09 2020-12-29 江南大学 一种厌氧芽孢杆菌来源普鲁兰酶突变体及其应用
CN111808836A (zh) * 2020-07-23 2020-10-23 中国农业科学院农产品加工研究所 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用
WO2022100011A1 (zh) * 2020-11-14 2022-05-19 山西大学 基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

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