CN103087145A - 一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，本发明方法先通过生物信息学和分子动力学模拟计算，寻找在蛋白质分子氨基酸序列中对热稳定性贡献最大的氨基酸残基位点。据此设计出对该残基位点进行除该残基本身以外的19种必须氨基酸残基替换的突变体，并通过分子动力学计算，预测出蛋白质分子的突变体相对于野生型的热稳定性的高低。本发明的基于理性设计的技术流程对蛋白质分子热稳定性的改造可以有效的改造蛋白质分子的热稳定性，从而获得所需要的蛋白质分子。本发明方法简单可行。

Description

一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法。 

背景技术

蛋白质分子是由20种氨基酸组成的多聚体，蛋白质分子的功能与其空间三维结构密切相关，三维结构的些许改变，就会影响到蛋白质的功能。因此，只要能有目的性地改变蛋白质的空间三维结构，就有可能改变某一特定蛋白质的功能，使其向着有利于人类使用的方向发生进化。 

蛋白质的空间三维结构，与其一级结构的氨基酸组成密切相关，20种氨基酸的排列组合，最终决定了蛋白质的三维结构。因此，只要改变一级结构中的部分氨基酸，就有可能改变蛋白质的三维结构。众所周知，蛋白质序列是由mRNA上的三联密码子翻译生成的，而mRNA是由编码DNA（CDS）转录而成。目前，64个密码子均已被破译，因此，只要改变编码DNA的序列，就可以定向改变蛋白质的氨基酸组成。 

所谓基于“理性设计”的定向进化技术，即研究者根据一定的实验目的，例如提高蛋白质的耐热性、提高耐酸性等等，有目的的改造蛋白质的编码序列，使其符合需求。此类研究，其难点就在于如何找出有效的改造点，以及如何改造。 

要回答上述问题，必须很明确地了解有待进化的某一特定蛋白质的结构与功能的关系。蛋白质的结构，一般可以通过X-ray或者NMR等方法进行解析，目前人类已经通过实验方法解析出70695种（统计于2011年1月18日）蛋白质的三维结构，均储存在PDB（Protein Data Bank，www.pdb.org）数据库中。该数据库中的数据每日都在不断的添加与更新，正以迅猛的速度增长。 

众所周知，自然界所存在的蛋白质分子种类有数百亿种，目前所知的7万多种蛋白质结构只是冰山一角，不足以一窥全貌。使用X-ray或者NMR等实验方法进行蛋白质分子结构解析，一来，需要数百万甚至数千万的大型仪器设备，二来，即便拥有良好的实验设备，由于方法上的局限，解析蛋白质结构也是困难重重，例如X-ray方法需要将蛋白质分子结晶才可以进行测定，但是并非所有的蛋白质分子都能很容易地结晶，而NMR方法虽然能在溶液中测定蛋白质分子结构，但是其所测分子的大小受到限制，即使使用目前最先进的1000MHz核磁共振仪（代号AVANCE1000，由德国布鲁克公司制造，目前全世界仅有一台样机，安装于法国里昂Centre de Resonance Magnétique Nucléaire à Très Hauts Champs），也只能测定大约50KDa的蛋白质分子。 

目前，Genbank、EMBL和DDBJ三大数据库中储存的蛋白质序列的数目正以几何级数增长，而PDB数据库中记录的蛋白质三维结构信息数目的增长速度远远落后于此。而通过实验方法获得蛋白质结构的难度极大，因此，使用同源建模技术（Homology Modeling）获得蛋白质的三维结构就成为现代生物学家常用的一种生物信息学方法。 

同源建模的主要步骤是找寻与目标序列同源而且已有实验测定结构的蛋白质作为模板，之后构建目标序列的三维空间模型。同源建模要求两条序列比对的同源性至少大于30%，当然，同源性越高，意味着所构建模型的准确度也越高。 

目前，常用的蛋白质同源建模程序有Swiss-Model、CPHmodel、SDSC1、3D-jigsaw、InsightII、sybyl、COMPOSER、Modeller等等。 

在测定蛋白质三维结构之后，如何将其与蛋白质的功能相联系，是一个世界性难题，由于每种蛋白质都不尽相同，没有固定的方法模式可循，因此，要研究一个蛋白质的结构与功能的关系，此前，只能根据蛋白质的特性，设计相应的实验，进行研究。 

但是，近年来日益成熟的分子模拟技术，为解决上述问题提供了一个可能的途径。

分子模拟是以高性能计算机技术为工具，以量子化学、统计力学为理论基础的一门新兴学科。它主要包括了“计算量子化学”（计算分子的性质）和“分子模拟”（模拟分子聚集体的行为，从而计算分子系统的宏观性质）。 

在分子模拟技术出现的早期，即被应用于生物领域。分子模拟技术可以用来模拟分子的各种动态行为、玻璃态的分子结构、分子运动的特征、蛋白质的折叠与去折叠等等。 

常见的分子力场有Amber（Assisted Model Building with Energy Refinement）和Charmm（Chemistry at HARvard Molecular Mechanics）。这两种力场在分子模拟领域得到了广泛的运用。 

Amber用于蛋白质、核酸、糖等生物大分子的计算模拟。AMBER提供两部分内容，一是用于模拟生物分子的一组分子力学力场，这些力场无版权限制，也用于其它一些模拟程序中，二是提供了用于分子模拟的程序，包含源代码和演示。 

CHARMM是一个被广泛承认并应用的分子模拟程序，用于生物大分子的模拟，包括分子动力学、能量最小化和蒙特卡罗模拟等等。程序采用的CHARMM力场，可以为用户提供处理各种小分子、大分子（包括蛋白质、核酸和糖）的经验化能量计算。 

由于在方法、理论和计算技术方面所取得的成就，分子模拟技术取得了引人瞩目的进展，已成为物理、化学、材料、生命科学等研究中的有力工具，是科学家在除了实验与理论研究之外，了解、认识微观世界的“第三种手段”。 

在全面获得了上述“结构”和“功能”的信息之后，研究者才能有效地对蛋白质进行理性的设计。 

发明内容

为提高蛋白质的耐热性，有目的的改造蛋白质的编码序列，使其符合需求。本发明提供了一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法；本发明方法操作简单，在蛋白质分子热稳定性改造领域具有重要意义。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

本发明提供一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，所述方法包括以下步骤：

野生型蛋白质分子的三维结构的获得、B value值的计算、蛋白质突变体分子的三维结构建模、利用分子动力学模拟的方法理性设计改造蛋白质分子的热稳定性的策略、确定所需的突变类型、进行蛋白质分子的热稳定性改造；所述野生型蛋白质分子是指作为起点出发的待改造的蛋白质分子，是自然界已有的蛋白质分子或是已经经过人工改造的蛋白质分子。

所述野生型蛋白质分子的三维结构的获得是通过蛋白质三维结构建模方法模拟获得或是通过实验测定方法获得。 

所述蛋白质三维结构建模方法为同源建模法或重头计算法或其它任何蛋白质分子三维结构建模方法；所述B value值的计算是通过软件计算或人工笔算的方法；所述软件是指任何能计算B value值的软件。 

本发明的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，所述方法包括以下具体步骤： 

a、野生型蛋白质分子的三维结构的获得：采用蛋白质三维结构建模方法模拟获得蛋白质分子的三维结构或是通过实验测定方法获得蛋白质分子的三维结构，即为野生型蛋白质的三维结构；

b、B value值的计算：使用能计算B value值的软件，计算步骤a中获得的野生型的蛋白质分子三维结构中各个氨基酸残基的B value值；选取B value值从大到小位于前五位的任一氨基酸残基位点作为突变位点；

c、突变体三维结构建模：用除该突变位点本身的氨基酸残基以外的19种必须氨基酸残基替换该突变位点的氨基酸残基，得到19种突变体的蛋白质分子序列，对19种突变体蛋白质分子序列进行蛋白质三维结构建模，获得19种突变体的蛋白质分子的三维结构；

d、利用分子动力学模拟的方法理性设计改造蛋白质分子的热稳定性的策略：上述步骤得到1种野生型和19种突变体的蛋白质三维结构共20种，使用分子动力学模拟程序包对这20种三维结构分别进行分子动力学加热过程或冷却过程模拟，计算模拟结束后产生的结构的RMSD值相对于起始晶体结构的RMSD值的变化值；所述RMSD值是指模拟过程中产生的结构相对于晶体结构随时间变化的均方根偏差；

e、确定所需的突变类型：根据步骤d中所述的RMSD变化值，选取所需要的突变类型；如果需要热稳定性提高的蛋白质分子，选取RMSD变化值比野生型小的突变型；如果需要热稳定性降低的蛋白质分子，则选取RMSD变化值比野生型大的突变型；

f、进行蛋白质分子的热稳定性改造：对需要热稳定性改造的蛋白质分子，分别构建野生型和所需的突变型的表达载体，并使用相应的蛋白质表达系统进行蛋白的表达，之后使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标蛋白分子，再进行热稳定性的测定，最终获得热稳定性提高或降低的蛋白分子。

所述步骤d中进行分子动力学加热模拟：模拟过程中需要设置一个温度跃迁的过程，包括升温过程或者降温过程；分子模拟体系中的蛋白质分子需要添加溶液环境，如水环境。 

优选的，本发明的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，所述方法包括以下具体步骤： 

a、野生型蛋白质分子的三维结构的获得：采用同源建模技术模拟蛋白质分子的三维结构；所述同源建模工作使用UCSF的Modweb服务器进行，选择Best scoring model和Longest well scoring model，程序自动搜索PDB数据库中合适的模型作为同源建模的模板并给出目标蛋白的模拟结构，即为野生型的蛋白质分子的三维结构；

b、B value值的计算：使用CASTER and B-FITTER evolution-tools软件，计算野生型的蛋白质分子三维结构中各个氨基酸残基的B value值；选取B value值从大到小位于前五位的任一氨基酸残基位点作为突变位点；

c、突变体三维结构建模：用除该突变位点本身的氨基酸残基以外的19种必须氨基酸残基替换该突变位点的氨基酸残基，得到19种突变体的蛋白质分子序列，对19种突变体蛋白质分子序列进行同源建模，获得19种突变体的蛋白质分子的三维结构；同源建模方法同步骤a；

d、利用分子动力学模拟的方法理性设计改造蛋白质分子的热稳定性的策略：上述步骤得到1种野生型和19种突变体的蛋白质三维结构共20种，使用分子动力学模拟程序包对这20种三维结构分别进行分子动力学加热模拟，计算模拟结束后产生的各自结构的RMSD值相对于各自起始晶体结构的RMSD值的变化值，所述RMSD值是指模拟过程中产生的结构相对于晶体结构随时间变化的均方根偏差；所述分子动力学加热模拟采用Amber程序包，模拟结果的分析采用VMD程序包；

e、确定所需的突变类型：根据步骤d中的RMSD变化值，选取所需要的突变类型；对于需要热稳定性提高的蛋白，选取RMSD变化值比野生型小的突变型；对于需要热稳定性降低的蛋白则选取RMSD变化值比野生型大的突变型；

f、进行蛋白质分子的热稳定性改造：对需要热稳定性改造的蛋白分子，分别构建野生型和所需的突变型的表达载体，并使用相应的蛋白质表达系统进行蛋白的表达，之后使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标蛋白分子，再进行热稳定性的测定，最终获得热稳定性提高或降低的蛋白分子。

优选的，一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，所述方法包括以下具体步骤： 

a、野生型蛋白质分子的三维结构的获得：采用同源建模技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶的三维结构；所述同源建模工作使用UCSF的Modweb服务器进行；选择Best scoring model和Longest well scoring model，程序自动搜索PDB数据库中合适的模型作为同源建模的模板并给出目标蛋白的模拟结构，即为野生型梅花鹿过氧化氢酶的三维结构；

b、B value值的计算：使用CASTER and B-FITTER evolution-tools软件，计算野生型梅花鹿过氧化氢酶三维结构中各个氨基酸残基的B value值；选取B value值最大的氨基酸残基位点作为突变位点；

c、突变体三维结构建模：用除该突变位点本身的氨基酸残基以外的19种必须氨基酸残基替换该突变位点的氨基酸残基，得到19种突变体的梅花鹿过氧化氢酶蛋白序列，对19种突变体的梅花鹿过氧化氢酶蛋白序列进行同源建模，获得19种突变体的梅花鹿过氧化氢酶蛋白分子的三维结构；同源建模方法同步骤a；

d、利用分子动力学模拟的方法理性设计蛋白质分子的热稳定性：分子动力学模拟采用Amber程序包，模拟结果的分析采用VMD程序包，并计算20种梅花鹿过氧化氢酶蛋白氨基酸序列主链模拟前后的RMSD变化值；所述20种梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子包括1种野生型和19种突变型；所述RMSD值是指模拟过程中产生的结构相对于晶体结构随时间变化的均方根偏差；

e、确定所需要的突变类型：根据步骤d中的RMSD变化值，选取所需要的突变类型；选取RMSD变化值比野生型小且最小的两种突变型，即热稳定性提高的两种梅花鹿过氧化氢酶蛋白；选取RMSD变化值比野生型大且最大的两种突变型，即热稳定性降低的两种梅花鹿过氧化氢酶蛋白；

f、进行蛋白质分子的热稳定性改造：对需要热稳定性改造的梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子，分别构建野生型和步骤e中所述的4种突变型的表达载体，并转化毕赤酵母发酵诱导酶蛋白的表达，之后使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标酶蛋白分子，再进行热稳定性的测定，最终获得热稳定性提高的两个酶蛋白质分子和热稳定性降低的两个酶蛋白质分子；

步骤e中所述表达载体采用pPICZαC质粒构建，毕赤酵母为GS115；

步骤e中所述的4种突变型的表达载体的构建是将构建好的野生型蛋白表达载体进行定点突变所获得的；所述定点突变的具体步骤如下：使用Toyobo KOD-neo酶进行全质粒高保真定点突变PCR反应；反应液配方和PCR程序如下：

KOD PCR反应液：10 X PCR buffer for KOD-plus-neo  5μl；2mM dNTPs      5μl；

25mM MgSO₄  3μl；  10mM的引物1.5μl；模板  50ng；KOD-plus-neo       1μl；ddH₂O补足至 50μl；

全质粒定点突变的PCR程序：94℃，2min；98℃ 10s，55℃ 30s，68℃ 30s/kb、25个循环；72℃，7min；

取上述PCR反应液，向其中加入DpnI限制性内切酶，37℃反应至少1h；之后，取上述DpnI反应液，直接转化大肠杆菌感受态细胞；将转化液涂布在添加有适当抗生素的培养基平板上，至单菌落形成；挑取单菌落，使用液体培养基培养，提取质粒备用，同时测序验证突变是否成功。

所述抗体吸附法是当所表达的蛋白质分子带有标签时，使用等量的特异性识别该标签的抗体吸附住来自于不同样品的目标蛋白质分子，由于使用的抗体等量，所吸附住的来自于不同样品的目标蛋白质分子也等量，这些等量的目标蛋白质分子用于后续测定，避免在测定蛋白质分子活性和蛋白质分子的热稳定性时，由于蛋白质分子数量的不同，造成测定结果的不同；所述标签为His-tag或GST-tag或MBP-tag或其它蛋白质融合表达标签； 

所述使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标蛋白质分子的具体步骤为：

1、用包被液:抗对应标签的抗体= 1:1混合，加于酶标板，每孔200μl，4℃过夜；

2、弃上清，加封闭液，200μl/孔，37℃，静置2h；

3、加入洗涤液，100μl/孔，静止3min，弃上清，重复3次；

4、加入发酵上清液，37℃，静置1h；

5、弃上清，洗3次，方法同步骤3；

所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，其制备为：Na₂CO₃ 0.16g；NaHCO₃ 0.29g； 补水到100mL

所述洗涤液为0.01mol/L pH7.4 Tris-HCl-Tween20，其制备为：Tris 2.42g；0.1mol/L HCl 13mL；Tween20 0.5mL，补水到1000mL；

所述终止液为2mol/L H₂SO₄，其制备为：浓H₂SO₄ 22.4mL ，加水177.6mL；

所述封闭液，按质量体积比计，为向包被液中添加3% 的脱脂牛奶，即为封闭液。 

所述热稳定性提高的两个梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。 

所述热稳定性降低的两个梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。 

本发明的显著优点：本发明先通过生物信息学和分子动力学模拟计算，寻找蛋白质分子中对热稳定性贡献最大的氨基酸残基位点。据此设计出对该残基位点进行除该残基本身以外的19种必须氨基酸残基替换的突变体，并通过分子动力学计算，预测出这19种蛋白质分子的突变体相对于野生型的热稳定性的高低。本发明的基于理性设计的技术流程对蛋白质分子热稳定性的改造可以有效的改造蛋白质分子的热稳定性，从而获得所需要的蛋白质分子。本发明方法简单可行，对于蛋白质分子热稳定性改造领域具有重要意义。 

附图说明

图1是质粒与PCR产物酶切效果图；其中M为TaKaRa 250bp DNA ladder marker；1为Cla1和Xba1酶切后并纯化的亚克隆cat基因片段；2为Cla1和Xba1酶切后并纯化的pPICZαC质粒； 

图2是菌落PCR效果图；其中M为TaKaRa 250 bp DNA ladder marker；1-5为菌落PCR产物；

图3是突变体C测序部分结果；其中黑影部分为突变位点的测序结果；

图4是突变体T测序部分结果；其中黑影部分为突变位点的测序结果；

图5是突变体P测序部分结果；其中黑影部分为突变位点的测序结果；

图6是突变体S测序部分结果；其中黑影部分为突变位点的测序结果。

具体实施方式

下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。 

实施例1

本实施例选取来源自梅花鹿的过氧化氢酶（Catalase，以下简称CAT）作为研究对象（登录号Genbank HQ877674，其编码区碱基序列和氨基酸见序列表）。本发明所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。实验步骤若无特别说明均为常规操作。

1野生型CAT蛋白的三维结构建模： 

梅花鹿过氧化氢酶蛋白质结构的同源建模采用Modeller程序包，使用UCSF的Modweb服务器进行建模工作，选择Best scoring model和Longest well scoring model，程序自动搜索PDB数据库中合适的模型作为同源建模的模板并给出目标蛋白的模拟结构。

将上述蛋白序列提交Modeller进行同源建模，可以得到该蛋白质分子的PDB模拟结构文件。 

1.1 B value的计算 

B value可以在一定程度上反映蛋白质三维结构的稳定性， B value值越大的位点，可能对稳定性的贡献度越大，通过使用计算机计算，可以得到一个蛋白质分子三维结构中各个氨基酸残基的B value值。本研究使用CASTER and B-FITTER evolution-tools软件，计算梅花鹿过氧化氢酶三维结构中各个氨基酸残基的B value值，并由大到小对它们进行排序。以下列出排名前30位的残基和其B value值（表1）。

表1 梅花鹿过氧化氢酶三维结构中排名前30位的残基和其B value值 

1.2用所有的必须氨基酸残基替换CAT蛋白质上第248位点，并进行突变体的三维结构建模

由表1可以得知，第248位的GLU残基，其B value值最高，因此，其对蛋白质整体结构的稳定性的贡献可能最大。由于蛋白质是由20种必须氨基酸构成的，我们使用除了GLU以外的其余19种必须氨基酸残基替换蛋白质序列中的248位GLU残基，得到19种突变体。使用这19种突变体的蛋白质序列，进行建模，构建出所有突变体的三维模型。蛋白质结构的同源建模采用Modeller程序包，使用UCSF的Modweb服务器进行建模工作，选择Best scoring model和Longest well scoring model，程序自动搜索PDB数据库中合适的模型作为同源建模的模板并给出目标蛋白的模拟结构。

1.3  进行分子动力学加热模拟，计算在上述20种残基情况下的RMSD值（RMSD值定义的参考文献：VMD User's Guide,Version 1.8.6,Theoretical and Computational Biophysics Group,University of Illinois and Beckman Institute,April 3, 2007） 

上述步骤共得到野生型和突变体的过氧化氢酶蛋白质三维结构20个，对这20个三维结构分别进行分子动力学加热模拟，并计算出它们各自在模拟前后的RMSD变化值。

分子模拟采用Amber程序包。主要模拟参数：温度跃迁：298.1K→368.1K，为蛋白质添加水球环境，模拟时长：10ns，分五次运行，每次2ns，记录100个frame，步长2fs，每两个frame相隔10000步，即20ps。生成*.prmtop 和*.mdcrd这两种结果文件。 

模拟结果的分析采用VMD程序，在VMD中载入*.prmtop 和*.mdcrd，采用VMD自带的RMSD计算程序计算蛋白质氨基酸主链的RMSD值。RMSD值的计算方程为： 

它表征的是体系在模拟过程中产生的结构相对于晶体结构随时间变化的均方根偏差，是衡量体系是否稳定的重要依据，也可以用于评价一组结构近似或相关的蛋白，在不同外界环境之下，对它们之间进行横向比较，得到这些情况下结构稳定性的差异。

1.4  根据RMSD值选取待突变位点 

通过上述步骤，我们得到了所有20个（1个野生型和19个突变型）蛋白质分子模型在自身模拟前与模拟后构象的RMSD变化值（表2）。

  

 表2  20个蛋白质分子模型在自身模拟前与模拟后构象的RMSD变化值

注：下述将采用表2中的第248位氨基酸残基名称来命名野生型（E）和各个突变型的CAT蛋白质分子。

根据上述RMSD变化值结果（表2），本发明选取突变型C和T（RMSD变化值最大的两个），通过分子生物学技术手段构建热稳定性降低的突变体蛋白。选取突变型P和S（RMSD变化值最小的两个），通过分子生物学技术手段构建热稳定性提高的突变体蛋白。 

本发明通过更改编码CAT蛋白质的DNA上对应位置的密码子，来达到更改蛋白质编码序列的目的。DNA序列上编码野生型CAT蛋白第248位氨基酸Glu的密码子是GAA，按照下表（表3），将GAA突变成本发明所需要的各种类型。 

表3突变型C、T、P、S第248位氨基酸对应的密码子 

2酶蛋白质分子的分子改造

2.1梅花鹿过氧化氢酶基因的表达

本实施例的供试材料为新鲜梅花鹿（Cervus nippon）肝脏，购自福州市西营里市场。（下述总RNA的提取，逆转录、连接转化等步骤均为常规操作）

提取新鲜梅花鹿（Cervus nippon）肝脏的总RNA，逆转录生成cDNA：根据Genbank报道的部分哺乳动物过氧化氢酶基因序列（NM_001035386，AB038231，NM_001752，NM_012520），通过ClastalW进行序列对位排列，查找保守区，设计如下引物

Cat+（SEQ ID NO.19）：5'  GCATCGCCACTCAGACAT  3'，

Cat-（SEQ ID NO.20）：5'  CGATCCGTGGGTACAGG  3'

PCR获得目的基因（梅花鹿过氧化氢酶基因）后，将目的基因与T载体连接转化大肠杆菌TOP10，并测序验证，获得的质粒命名为pGEM-CAT。

梅花鹿过氧化氢酶基因采用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达，选用的质粒是pPICZαC，宿主酵母菌为GS115。首先，设计以下一对PCR引物进行过氧化氢酶基因亚克隆： 

Pcat2+（SEQ ID NO.5）：CAAATCGATTATGGCGGACAACCGGGATC（Cla1）

Pcat-（SEQ ID NO.6）：TGTTTCTAGAAGATTAGCTTTCTCCCTT（Xba1）

它们分别带有Cla1和Xba1酶切位点， 以上述构建的pGEM-CAT质粒作为模板，PCR扩增之后，使用Cla1和Xba1内切酶对PCR产物进行酶切，pPICZαC质粒也用这两种酶进行双酶切，纯化回收酶切产物，电泳检测，结果如图1所示，条带分子量大小均正确，CAT基因长度约1.5Kb，线性化pPICZαC质粒长度约3.6Kb。之后，使用T4 DNA连接酶连接上述基因和质粒，再转化大肠杆菌。

2.2  菌落PCR筛选 

本研究采用了一种简便快速的方法来鉴定重组子，即菌落PCR，该方法直接以大肠杆菌单菌落或者菌液作为模板进行PCR扩增，以扩增条带的有无以及分子量大小判断重组子的正确性。菌落PCR的具体步骤如下，首先，在PCR管中配置如表4所示的反应液。

表4 菌落PCR反应液成分 

之后进行PCR扩增，扩增程序如表5所示。

表5菌落PCR反应程序 

随机挑取单菌落，使用Pcat2+和Pcat-这对引物进行菌落PCR，以验证阳性克隆，结果如图2所示，所有的菌落PCR都呈现出正确大小的DNA条带（约1.5Kb），意味着所有被检测样品均为阳性。

液体培养阳性克隆单菌落，提取质粒DNA，此质粒DNA即为野生型E的表达载体。通过以下步骤构建出C、T、P、S这4个突变体的表达载体。 

2.3  C、T、P、S 4个突变体的表达载体的构建 

2.3.1 定点突变：设计以下点突变引物，用于将野生型E的表达载体突变成C、T、P、S的表达载体。

C的点突变引物：248C+（SEQ ID NO.7）： 

 5' GGGCATCAAAAACCTTTCTGTTTGTGATGCAGCAAGACTTGCCC 3'

248C-（SEQ ID NO.8）：

5' GGGCAAGTCTTGCTGCATCACAAACAGAAAGGTTTTTGATGCCC 3'

T的点突变引物：248T+（SEQ ID NO.9）：

 5' GGGCATCAAAAACCTTTCTGTTACAGATGCAGCAAGACTTGCCC 3'

248T-（SEQ ID NO.10）：

 5' GGGCAAGTCTTGCTGCATCTGTAACAGAAAGGTTTTTGATGCCC 3'

P的点突变引物：248P+（SEQ ID NO.11）：

 5' GGGCATCAAAAACCTTTCTGTTCCAGATGCAGCAAGACTTGCCC 3'

248P-（SEQ ID NO.12）：

 5' GGGCAAGTCTTGCTGCATCTGGAACAGAAAGGTTTTTGATGCCC 3'

S的点突变引物：248S+（SEQ ID NO.13）：

 5' GGGCATCAAAAACCTTTCTGTTTCAGATGCAGCAAGACTTGCCC 3'

248S-（SEQ ID NO.14）：

 5' GGGCAAGTCTTGCTGCATCTGAAACAGAAAGGTTTTTGATGCCC 3'

定点突变的具体步骤：

使用Toyobo KOD-neo酶进行全质粒高保真点突变PCR反应。反应液配方和PCR程序如下：

KOD PCR反应液：10X PCR buffer for KOD-plus-neo  5μl；2mM dNTPs 5μl；25mM MgSO₄3μl

引物（10mM each） 1.5μl；模板 50ng；KOD-plus-neo 1μl；ddH₂O up to 50μl。

全质粒定点突变的PCR程序：94℃，2min、98℃，10s；55℃，30s；68℃，30s/kb、72℃，7min，共25个循环。 

取10μl 上述PCR反应液，加入1μl的DpnI限制性内切酶，37℃反应至少1h。之后，取上述DpnI反应液5-10μl，直接转化大肠杆菌XL1-blue感受态细胞。将转化液涂布在添加有适当抗生素的LB琼脂平板上，至单菌落形成。挑取单菌落，使用液体LB培养基培养，提取质粒备用，同时测序验证突变是否成功。测序结果如图3-图6所示。 

2.4  将构建野生型和突变体载体分别转化入毕赤酵母并表达目标蛋白 

用于毕赤酵母转化的穿梭质粒必须使用适当的限制性内切酶进行切割，核酸电泳验证后，以乙醇沉淀法纯化，之后溶解于高纯水中，用于毕赤酵母的转化。毕赤酵母的转化步骤如下：

a. 将毕赤酵母宿主菌株于100ml YPD培养基中振荡培养至OD600约1.1-1.3。

b. 1500g－1700g离心5min收集菌体，将离心管倒置在吸水纸上轻拍数下，充分弃上清。 

c. 加入100ml 冰浴的高纯水，于振荡器上振荡混匀。 

d. 离心，弃上清，再加100ml 高纯水洗涤一次。 

e. 离心，弃上清，加20ml冰浴的1M山梨醇洗涤一次。 

f. 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200μl山梨醇，并混匀。 

g. 吸取100－150μl感受态细胞添加到线性化的DNA中，用移液器吹吸混匀。 

h. 将上述样品于冰浴中静置5min，转移入2mm电转化杯中，放置于Biorad Micropluser电转仪上，使用仪器内嵌的预设毕赤酵母电转化程序“Pic”电击一次。 

i. 立即向电击杯中加入1ml山梨醇，将全部液体转入10ml离心管中，30度静置1小时，然后加入1ml YPD培养基，30度，200rpm振荡培养1小时，取50－200μl菌液涂布于添加有终浓度100μg/mL的Zeocin抗生素的YPD培养基平板。培养3天，至单菌落形成。 

（YPD培养基配方：1%酵母浸膏， 2%蛋白胨，2%葡萄糖。） 

对抗生素抗性平板上的毕赤酵母阳性克隆进行分子鉴定的时候，需要使用裂解液提取其基因组，裂解液配方： 2%（v/v）Triton X-100， 1%（w/v）SDS， 100mM NaCl， 10mM Tris base（pH8.0）， 1mM EDTA（pH8.0）。具体实验操作步骤如下：

a. 过夜培养10ml重组毕赤酵母菌液至饱和（OD600值为2-3）。 

b. 离心沉降细胞（2000rpm），然后以冷的、等体积的无菌蒸馏水洗涤。 

c. 将细胞沉淀在200μl 裂解缓冲液中重悬，然后加入约200μl的1：1苯酚/氯仿混和液。[0067] d. 漩涡震荡1-2min。 

e. 加入200μl的 TE缓冲液，倒置混合6-10次。注意：从这步开始漩涡摇匀可能会剪切DNA。[0069] f. 在微型离心机中以13000rpm的速度离心样品5min。 

g. 将上层的水相转移到干净的微量离心管中。[0071] h. 加入1体积（400μl）氯仿。 

i. 同步骤f离心。 

j. 将上层的水相转移到新的微量离心管中。 

k. 加1ml乙醇，翻转混匀。 

l. 在微型离心机中以13000rpm的速度离心2min。 

m. 弃上清液，用1ml的70%乙醇洗涤沉淀。 

n. 完全弃去上清液，并将沉淀在室温下干燥。在干燥过程中沉淀颜色会发白但无酒精味 。 

o. 在 400μl 含有终浓度为2μg/ml的核糖核酸酶的TE缓冲液中重悬浮沉淀。 

p. 37℃孵育10min。 

q. 重复步骤i—l。 

r. 在 50μl TE缓冲液中重悬沉淀。 

随机挑取一个单菌落，使用液体YPD培养基培养，收集菌体，提取基因组，之后采用Pcat2+和Pcat-这对引物进行PCR扩增以验证阳性与否。 

重组毕赤酵母的小规模发酵过程如下所述： 

a. 将Zeocin抗性平板上的毕赤酵母单克隆接种于5mL的YPD培养基中，于恒温摇床上30℃，220rpm振荡培养12—16h。

b. 将上述培养液接种于50mL的YP培养基中，30℃，220rpm振荡培养2h。 

c. 向培养物中添加100%的甲醇，使其终浓度达到0.5%。甲醇每隔24h添加一次。 

d. 每隔24小时取出1mL的培养液，冷冻于-80℃冰箱，用于日后的分析。 

e. 发酵培养96h后，结束发酵，取出培养液，离心，去除沉淀，分析上清液。 

（YP培养基配方：1%酵母浸膏， 2%蛋白胨。） 

使用YP培养基培养pPICZαC-cat-GS115，以甲醇诱导表达，发酵96h后，结束发酵，同时，设置对照组。

使用市售双氧水进行活性的定性检测。重组子使用YP培养基发酵并添加甲醇诱导。表达后的发酵上清液，滴加入双氧水中，能够使其产生大量的气泡，而不添加甲醇（未诱导）的重组子发酵上清液、毕赤酵母GS115（空宿主）的发酵上清液以及空白的YP液体培养基（未接种培养），均不能够使双氧水产生气泡。 

2.5  使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标酶蛋白分子 

2.5.1试剂：

1，包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）：Na₂CO₃ 0.16g；NaHCO₃ 0.29g； 补水到100mL

2，稀释液（pH7.4 PBS-Tween 20）：KH₂PO₄ 0.2g；Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g；NaCl 8g；KCl 0.2g；Tween20 0.5mL；  BSA 2%；补水到1000mL

3，洗涤液（0.01mol/L pH7.4 Tris-HCl-Tween20）：Tris 2.42g；0.1mol/L HCl 13mL；Tween20 0.5mL，补水到1000mL

4，终止液（2mol/L H₂SO₄）:浓H₂SO₄ 22.4mL ，加水177.6mL

5，封闭液（往包被液中添加3% （w/v）的脱脂牛奶即可） 

由于野生型和突变体的CAT蛋白质均采用pPICZαC质粒和GS115表达，因此，表达产物带有His-tag标签，并且表达产物能够分泌到细胞外。使用抗His-tag标签鼠单克隆抗体（以下简称Anti-His），可以特异性地吸附这些目标蛋白质。

具体步骤： 

1，用包被液：Anti-His = 1：1混合（各100μl），加于酶标板，每孔200ul。4℃过夜。

2，弃上清，加封闭液，200ul/孔，37℃，静置2h。 

3，加入洗涤液，100ul/孔，静止3min，弃上清，重复3次。 

4，加入发酵上清液，37℃，静置1h。 

5，弃上清，洗3次（方法同步骤3）。 

此时，酶标板上每个孔中均吸附有相同数量的过氧化氢酶蛋白质分子。可以直接使用Beyotime过氧化氢酶活性测定试剂盒测定每个孔中吸附的酶分子的活性。具体操作步骤按照试剂盒说明书实施。 

2.6  测定热稳定性 

将E、C、P、S、T各个样品分别以上述步骤吸附于多块（偶数）酶标板上，然后，将50%的酶标板置于75℃培养箱中保温10min，另外50%的酶标板置于4℃中保藏以保持其活性。之后，将所有酶标板取出，使用Beyotime过氧化氢酶活性测定试剂盒测定活性。活性数据如表6所示。

表6  CAT活性数据 

根据上述数据，可以得知，通过上述试验步骤得到的突变体C（其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示）和T（其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示）的热稳定性低于野生型E，而突变体P（其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示）和S（其氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示）的热稳定性高于野生型E。

本实施例首先通过生物信息学和分子动力学模拟计算，寻找到CAT蛋白的第248位氨基酸残基位点是对热稳定性贡献最大的位点。据此设计出对第248位点进行19种必须氨基酸残基替换的突变体，并通过分子动力学计算，预测出CAT蛋白的突变体C和T的热稳定性要低于野生型E，突变体P和S的热稳定性要高于野生型E。之后，通过分子生物学试验步骤，在实验室构建出了E和C、T、P、S共5种酶蛋白分子。通过测定其热稳定性，得知：C和T的热稳定性要低于野生型E，突变体P和S的热稳定性要高于野生型E。至此，获得了热稳定提高的突变体P和S，获得了热稳定性降低的突变体C和T。同时，这一结论与前期的分子动力学计算预测结果相一致，证明了基于上述理性设计的技术流程对酶分子热稳定性的改造是有效和成功的。 

  

<110>福州大学

<120>一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法

<160> 14

<210> 1

<211> 1584

<212> DNA

<213>梅花鹿（Cervus nippon）

<400> 1

atggcggaca accgggatcc agccagcgac cagatgaaac actggaagga ggagagggcc 60

gcgcagaaac ctgatgtcct gaccactgga gccggtaatc cagtaggaga caaactcaat 120

attcttacgg tagggccccg agggcccctt cttgttcagg atgtggtttt cactgatgaa 180

atggctcact ttgaccggga gagaattcct gagagagttg tgcacgccaa aggagcaggg 240

gcttttggct actttgaggt cacacatgac attaccagat actccaaggt gaaggtgttt 300

gagcatgtgg gaaagaggac gcctattgca gttcgcttct ccactgttgc tggagaatcg 360

ggctcagctg acacagtgcg tgaccctcgt ggctttgcag tgaaatttta cacagaagat 420

ggtaattggg atcttgttgg aaataacacc cctattttct tcatcaggga tgccctattg 480

tttccgtcct ttatccacag ccagaagaga aaccctcaaa cacacctgaa ggatccggac 540

atggtctggg acttctggag cctgcgtcct gagtctctgc atcaggtttc cttcctgttc 600

agtgatcgag ggattccaga tggacacagg cacatgaatg gatatggatc gcatactttc 660

aagctggtta atgcaaatgg agaggcagtt tattgcaaat tccattataa gactgaccag 720

ggcatcaaaa acctttctgt tgaagatgca gcaagacttg cccacgaaga tcctgactat 780

ggcctccgcg atcttttcaa tgccattgcc acaggcaact acccatcctg gactttatac 840

atccaggtca tgacatttag ggaggcagaa aattttccat ttaatccatt tgatcttacc 900

aaggtttggc ctcacggcga ctaccctctt atcccagttg gtaaactggt cttaaaccgg 960

aacccagtta attactttgc tgaggttgaa cagttggctt ttgacccaag caacatgccg 1020

cccggcatcg agcccagccc tgacaaaatg cttcagggcc gccttttcgc ctatcctgac 1080

actcaccgcc accgcctggg acccaactat ctccagatcc ctgtgaactg tccctaccgt 1140

gctcgagtgg ccaactacca acgtgacggc cccatgtgca tgatggacaa tcagggtggg 1200

gctccaaatt actaccccaa tagctttagt gctcccgagc atcagccttc tgccctggaa 1260

cataggaccc acttttctgg ggatgtacag cgcttcaaca gtgccagtga tgacaatgtc 1320

actcaggtgc gggatttcta tttgaaagta ctgaatgagg agcagaggaa acgcctgtgt 1380

gagaacattg caggccatct caaagatgca caacttttta tccagaagaa agcggttaag 1440

aacttcagtg atgtccatcc tgaatatggc tcgcgcatcc aggctctttt ggacaaatac 1500

aatgaggaga aacctaagaa cgcagttcac acctatgtgc agcatgggtc tcacttgtct 1560

gcaagggaga aagctaatct ctga 1584

 

<210> 2

<211> 527

<212>PRT

<213>人工序列

<400> 2

Met Ala Asp Asn Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Lys His Trp Lys

1               5                   10                  15     

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Lys Pro Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly

            20                  25                  30         

Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Ile Leu Thr Val Gly Pro Arg Gly

        35                  40                  45             

Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe

    50                  55                  60                 

Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly

65                  70                  75                  80 

Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Arg Tyr Ser Lys

                85                  90                  95     

Val Lys Val Phe Glu His Val Gly Lys Arg Thr Pro Ile Ala Val Arg

            100                 105                 110        

Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp

        115                 120                 125            

Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp

    130                 135                 140                

Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Ala Leu Leu

145                 150                 155                 160

Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu

                165                 170                 175    

Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser

            180                 185                 190        

Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly

        195                 200                 205            

His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn

    210                 215                 220                

Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln

225                 230                 235                 240

Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Glu Asp Ala Ala Arg Leu Ala His Glu

                245                 250                 255    

Asp Pro Asp Tyr Gly Leu Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly

            260                 265                 270        

Asn Tyr Pro Ser Trp Thr Leu Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Arg Glu

        275                 280                 285             

Ala Glu Asn Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro

    290                 295                 300                

His Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg

305                 310                 315                 320

Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Leu Ala Phe Asp Pro

                325                 330                 335    

Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Pro Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln

            340                 345                 350        

Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro

        355                 360                 365            

Asn Tyr Leu Gln Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala

    370                 375                 380                 

Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Met Asp Asn Gln Gly Gly

385                 390                 395                 400

Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Ser Ala Pro Glu His Gln Pro

                405                 410                 415    

Ser Ala Leu Glu His Arg Thr His Phe Ser Gly Asp Val Gln Arg Phe

            420                 425                 430        

Asn Ser Ala Ser Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Asp Phe Tyr Leu

        435                 440                 445            

Lys Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala

    450                 455                 460                

Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Leu Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys

465                 470                 475                 480

Asn Phe Ser Asp Val His Pro Glu Tyr Gly Ser Arg Ile Gln Ala Leu

                485                 490                 495    

Leu Asp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Pro Lys Asn Ala Val His Thr Tyr

            500                 505                 510        

Val Gln His Gly Ser His Leu Ser Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu

        515                 520                 525        

 

<210> 3

<211> 18

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 3

gcatcgccac tcagacat 18

 

<210> 4

<211> 17

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 4

cgatccgtgg gtacagg 17 

 

<210> 5

<211> 29

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 5

caaatcgatt atggcggaca accgggatc 29

 

<210> 6

<211> 28

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 6

tgtttctaga agattagctt tctccctt 28

 

<210> 7

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 7

gggcatcaaa aacctttctg tttgtgatgc agcaagactt gccc 44

<210> 8

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 8

gggcaagtct tgctgcatca caaacagaaa ggtttttgat gccc 44

<210> 9

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 9

gggcatcaaa aacctttctg ttacagatgc agcaagactt gccc 44

 

<210> 10

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 10

gggcaagtct tgctgcatct gtaacagaaa ggtttttgat gccc 44

 

<210> 11

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 11

gggcatcaaa aacctttctg ttccagatgc agcaagactt gccc 44

 

<210> 12

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 12

gggcaagtct tgctgcatct ggaacagaaa ggtttttgat gccc 44

 

<210> 13

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 13

gggcatcaaa aacctttctg tttcagatgc agcaagactt gccc 44

 

<210> 14

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 14

gggcaagtct tgctgcatct gaaacagaaa ggtttttgat gccc  44

 

<210> 15

<211> 527

<212>PRT

<213>人工序列

<400> 15

Met Ala Asp Asn Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Lys His Trp Lys

1               5                   10                  15     

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Lys Pro Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly

            20                  25                  30          

Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Ile Leu Thr Val Gly Pro Arg Gly

        35                  40                  45             

Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe

    50                  55                  60                  

Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly

65                  70                  75                  80 

Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Arg Tyr Ser Lys

                85                  90                  95     

Val Lys Val Phe Glu His Val Gly Lys Arg Thr Pro Ile Ala Val Arg

            100                 105                 110        

Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp

        115                 120                 125            

Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp

    130                 135                 140                

Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Ala Leu Leu

145                 150                 155                 160

Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu

                165                 170                 175    

Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser

            180                 185                 190        

Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly

        195                 200                 205            

His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn

    210                 215                 220                

Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln

225                 230                 235                 240

Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Cys Asp Ala Ala Arg Leu Ala His Glu

                245                 250                 255    

Asp Pro Asp Tyr Gly Leu Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly

            260                 265                 270        

Asn Tyr Pro Ser Trp Thr Leu Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Arg Glu

        275                 280                 285            

Ala Glu Asn Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro

    290                 295                 300                

His Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg

305                 310                 315                 320

Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Leu Ala Phe Asp Pro

                325                 330                 335    

Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Pro Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln

            340                 345                 350        

Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro

        355                 360                 365            

Asn Tyr Leu Gln Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala

    370                 375                 380                

Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Met Asp Asn Gln Gly Gly

385                 390                 395                 400

Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Ser Ala Pro Glu His Gln Pro

                405                 410                 415    

Ser Ala Leu Glu His Arg Thr His Phe Ser Gly Asp Val Gln Arg Phe

            420                 425                 430        

Asn Ser Ala Ser Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Asp Phe Tyr Leu

        435                 440                 445            

Lys Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala

    450                 455                 460                

Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Leu Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys

465                 470                 475                 480

Asn Phe Ser Asp Val His Pro Glu Tyr Gly Ser Arg Ile Gln Ala Leu

                485                 490                 495    

Leu Asp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Pro Lys Asn Ala Val His Thr Tyr

            500                 505                 510        

Val Gln His Gly Ser His Leu Ser Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu

        515                 520                 525        

 

<210> 16 

<211> 527

<212>PRT

<213>人工序列

<400> 16

Met Ala Asp Asn Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Lys His Trp Lys

1               5                   10                  15     

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Lys Pro Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly

            20                  25                  30         

Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Ile Leu Thr Val Gly Pro Arg Gly

        35                  40                  45             

Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe

    50                  55                  60                 

Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly

65                  70                  75                  80 

Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Arg Tyr Ser Lys

                85                  90                  95     

Val Lys Val Phe Glu His Val Gly Lys Arg Thr Pro Ile Ala Val Arg

            100                 105                 110        

Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp

        115                 120                 125             

Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp

    130                 135                 140                

Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Ala Leu Leu

145                 150                 155                 160

Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu

                165                 170                 175    

Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser

            180                 185                 190        

Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly

        195                 200                 205            

His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn

    210                 215                 220                 

Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln

225                 230                 235                 240

Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Thr Asp Ala Ala Arg Leu Ala His Glu

                245                 250                 255    

Asp Pro Asp Tyr Gly Leu Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly

            260                 265                 270        

Asn Tyr Pro Ser Trp Thr Leu Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Arg Glu

        275                 280                 285            

Ala Glu Asn Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro

    290                 295                 300                

His Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg

305                 310                 315                 320

Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Leu Ala Phe Asp Pro

                325                 330                 335    

Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Pro Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln

            340                 345                 350        

Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro

        355                 360                 365            

Asn Tyr Leu Gln Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala

    370                 375                 380                

Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Met Asp Asn Gln Gly Gly

385                 390                 395                 400

Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Ser Ala Pro Glu His Gln Pro

                405                 410                 415    

Ser Ala Leu Glu His Arg Thr His Phe Ser Gly Asp Val Gln Arg Phe

            420                 425                 430        

Asn Ser Ala Ser Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Asp Phe Tyr Leu

        435                 440                 445            

Lys Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala

    450                 455                 460                

Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Leu Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys

465                 470                 475                 480

Asn Phe Ser Asp Val His Pro Glu Tyr Gly Ser Arg Ile Gln Ala Leu

                485                 490                 495    

Leu Asp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Pro Lys Asn Ala Val His Thr Tyr

            500                 505                 510        

Val Gln His Gly Ser His Leu Ser Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu

        515                 520                 525        

 

 

<210> 17  

<211> 527

<212>PRT

<213>人工序列

<400> 17

Met Ala Asp Asn Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Lys His Trp Lys

1               5                   10                  15     

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Lys Pro Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly

            20                  25                  30         

Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Ile Leu Thr Val Gly Pro Arg Gly

        35                  40                  45             

Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe

    50                  55                  60                 

Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly

65                  70                  75                  80 

Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Arg Tyr Ser Lys

                85                  90                  95     

Val Lys Val Phe Glu His Val Gly Lys Arg Thr Pro Ile Ala Val Arg

            100                 105                 110        

Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp

        115                 120                 125            

Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp

    130                 135                 140                

Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Ala Leu Leu

145                 150                 155                 160

Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu

                165                 170                 175    

Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser

            180                 185                 190        

Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly

        195                 200                 205            

His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn

    210                 215                 220                

Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln

225                 230                 235                 240

Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Pro Asp Ala Ala Arg Leu Ala His Glu

                245                 250                 255    

Asp Pro Asp Tyr Gly Leu Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly

            260                 265                 270        

Asn Tyr Pro Ser Trp Thr Leu Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Arg Glu

        275                 280                 285             

Ala Glu Asn Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro

    290                 295                 300                

His Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg

305                 310                 315                 320

Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Leu Ala Phe Asp Pro

                325                 330                 335    

Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Pro Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln

            340                 345                 350        

Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro

        355                 360                 365            

Asn Tyr Leu Gln Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala

    370                 375                 380                 

Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Met Asp Asn Gln Gly Gly

385                 390                 395                 400

Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Ser Ala Pro Glu His Gln Pro

                405                 410                 415    

Ser Ala Leu Glu His Arg Thr His Phe Ser Gly Asp Val Gln Arg Phe

            420                 425                 430        

Asn Ser Ala Ser Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Asp Phe Tyr Leu

        435                 440                 445            

Lys Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala

    450                 455                 460                

Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Leu Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys

465                 470                 475                 480

Asn Phe Ser Asp Val His Pro Glu Tyr Gly Ser Arg Ile Gln Ala Leu

                485                 490                 495    

Leu Asp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Pro Lys Asn Ala Val His Thr Tyr

            500                 505                 510        

Val Gln His Gly Ser His Leu Ser Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu

        515                 520                 525        

 

<210> 18 

<211> 527

<212>PRT

<213>人工序列

<400> 18

Met Ala Asp Asn Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Lys His Trp Lys

1               5                   10                  15     

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Lys Pro Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly

            20                  25                  30         

Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Ile Leu Thr Val Gly Pro Arg Gly

        35                  40                  45             

Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe

    50                  55                  60                 

Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly

65                  70                  75                  80 

Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Arg Tyr Ser Lys

                85                  90                  95     

Val Lys Val Phe Glu His Val Gly Lys Arg Thr Pro Ile Ala Val Arg

            100                 105                 110        

Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp

        115                 120                 125            

Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp

    130                 135                 140                

Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Ala Leu Leu

145                 150                 155                 160

Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu

                165                 170                 175    

Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser

            180                 185                 190        

Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly

        195                 200                 205            

His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn

    210                 215                 220                

Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln

225                 230                 235                 240

Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Ser Asp Ala Ala Arg Leu Ala His Glu

                245                 250                 255    

Asp Pro Asp Tyr Gly Leu Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly

            260                 265                 270        

Asn Tyr Pro Ser Trp Thr Leu Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Arg Glu

        275                 280                 285            

Ala Glu Asn Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro

    290                 295                 300                

His Gly Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg

305                 310                 315                 320

Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Leu Ala Phe Asp Pro

                325                 330                 335    

Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Pro Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln

            340                 345                 350        

Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro

        355                 360                 365            

Asn Tyr Leu Gln Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala

    370                 375                 380                

Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Met Asp Asn Gln Gly Gly

385                 390                 395                 400

Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Ser Ala Pro Glu His Gln Pro

                405                 410                 415    

Ser Ala Leu Glu His Arg Thr His Phe Ser Gly Asp Val Gln Arg Phe

            420                 425                 430        

Asn Ser Ala Ser Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Asp Phe Tyr Leu

        435                 440                 445             

Lys Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala

    450                 455                 460                

Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Leu Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys

465                 470                 475                 480

Asn Phe Ser Asp Val His Pro Glu Tyr Gly Ser Arg Ile Gln Ala Leu

                485                 490                 495    

Leu Asp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Pro Lys Asn Ala Val His Thr Tyr

            500                 505                 510        

Val Gln His Gly Ser His Leu Ser Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu

        515                 520                 525        

 

<210> 19 

<211> 18

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 19

GCATCGCCAC TCAGACAT 18

 

<210> 20 

<211> 17

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 20

CGATCCGTGG GTACAGG 17

 

Claims (10)

1.一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：野生型蛋白质分子的三维结构的获得、B value值的计算、蛋白质突变体分子的三维结构建模、利用分子动力学模拟的方法理性设计改造蛋白质分子的热稳定性的策略、确定所需的突变类型、进行蛋白质分子的热稳定性改造；所述野生型蛋白质分子是指作为起点出发的待改造的蛋白质分子，是自然界已有的蛋白质分子或是已经经过人工改造的蛋白质分子。

2.根据权利要求1所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：

所述野生型蛋白质分子的三维结构的获得是通过蛋白质三维结构建模方法模拟获得或是通过实验测定方法获得。

3.根据权利要求2所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述蛋白质三维结构建模方法为同源建模法或重头计算法或其它任何蛋白质分子三维结构建模方法；所述B value值的计算是通过软件计算或人工笔算的方法；所述软件是指任何能计算B value值的软件。

4.根据权利要求1所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述方法包括以下具体步骤：

a、野生型蛋白质分子的三维结构的获得：采用蛋白质三维结构建模方法模拟获得蛋白质分子的三维结构或是通过实验测定方法获得蛋白质分子的三维结构，即为野生型蛋白质的三维结构；

b、B value值的计算：使用能计算B value值的软件，计算步骤a中获得的野生型的蛋白质分子三维结构中各个氨基酸残基的B value值；选取B value值从大到小位于前五位的任一氨基酸残基位点作为突变位点；

c、突变体三维结构建模：用除该突变位点本身的氨基酸残基以外的19种必须氨基酸残基替换该突变位点的氨基酸残基，得到19种突变体的蛋白质分子序列，对19种突变体蛋白质分子序列进行蛋白质三维结构建模，获得19种突变体的蛋白质分子的三维结构；

d、利用分子动力学模拟的方法理性设计改造蛋白质分子的热稳定性的策略：上述步骤得到1种野生型和19种突变体的蛋白质三维结构共20种，使用分子动力学模拟程序包对这20种三维结构分别进行分子动力学加热过程或冷却过程模拟，计算模拟结束后产生的结构的RMSD值相对于起始晶体结构的RMSD值的变化值；所述RMSD值是指模拟过程中产生的结构相对于晶体结构随时间变化的均方根偏差；

e、确定所需的突变类型：根据步骤d中所述的RMSD变化值，选取所需要的突变类型；如果需要热稳定性提高的蛋白质分子，选取RMSD变化值比野生型小的突变型；如果需要热稳定性降低的蛋白质分子，则选取RMSD变化值比野生型大的突变型；

f、进行蛋白质分子的热稳定性改造：对需要热稳定性改造的蛋白质分子，分别构建野生型和所需的突变型的表达载体，并使用相应的蛋白质表达系统进行蛋白的表达，之后使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标蛋白分子，再进行热稳定性的测定，最终获得热稳定性提高或降低的蛋白分子。

5.根据权利要求4所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述步骤d中进行分子动力学加热模拟：模拟过程中需要设置一个温度跃迁的过程，包括升温过程或者降温过程；分子模拟体系中的蛋白质分子需要添加溶液环境，如水环境。

6.根据权利要求1所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述方法包括以下具体步骤：

a、野生型蛋白质分子的三维结构的获得：采用同源建模技术模拟蛋白质分子的三维结构；所述同源建模工作使用UCSF的Modweb服务器进行，选择Best scoring model和Longest well scoring model，程序自动搜索PDB数据库中合适的模型作为同源建模的模板并给出目标蛋白的模拟结构，即为野生型的蛋白质分子的三维结构；

b、B value值的计算：使用CASTER and B-FITTER evolution-tools软件，计算野生型的蛋白质分子三维结构中各个氨基酸残基的B value值；选取B value值从大到小位于前五位的任一氨基酸残基位点作为突变位点；

c、突变体三维结构建模：用除该突变位点本身的氨基酸残基以外的19种必须氨基酸残基替换该突变位点的氨基酸残基，得到19种突变体的蛋白质分子序列，对19种突变体蛋白质分子序列进行同源建模，获得19种突变体的蛋白质分子的三维结构；同源建模方法同步骤a；

d、利用分子动力学模拟的方法理性设计改造蛋白质分子的热稳定性的策略：上述步骤得到1种野生型和19种突变体的蛋白质三维结构共20种，使用分子动力学模拟程序包对这20种三维结构分别进行分子动力学加热模拟，计算模拟结束后产生的各自结构的RMSD值相对于各自起始晶体结构的RMSD值的变化值，所述RMSD值是指模拟过程中产生的结构相对于晶体结构随时间变化的均方根偏差；所述分子动力学加热模拟采用Amber程序包，模拟结果的分析采用VMD程序包；

e、确定所需的突变类型：根据步骤d中的RMSD变化值，选取所需要的突变类型；对于需要热稳定性提高的蛋白，选取RMSD变化值比野生型小的突变型；对于需要热稳定性降低的蛋白则选取RMSD变化值比野生型大的突变型；

f、进行蛋白质分子的热稳定性改造：对需要热稳定性改造的蛋白分子，分别构建野生型和所需的突变型的表达载体，并使用相应的蛋白质表达系统进行蛋白的表达，之后使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标蛋白分子，再进行热稳定性的测定，最终获得热稳定性提高或降低的蛋白分子。

7.根据权利要求1所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述方法包括以下具体步骤：

a、野生型蛋白质分子的三维结构的获得：采用同源建模技术构建野生型梅花鹿过氧化氢酶的三维结构；所述同源建模工作使用UCSF的Modweb服务器进行；选择Best scoring model和Longest well scoring model，程序自动搜索PDB数据库中合适的模型作为同源建模的模板并给出目标蛋白的模拟结构，即为野生型梅花鹿过氧化氢酶的三维结构；

b、B value值的计算：使用CASTER and B-FITTER evolution-tools软件，计算野生型梅花鹿过氧化氢酶三维结构中各个氨基酸残基的B value值；选取B value值最大的氨基酸残基位点作为突变位点；

c、突变体三维结构建模：用除该突变位点本身的氨基酸残基以外的19种必须氨基酸残基替换该突变位点的氨基酸残基，得到19种突变体的梅花鹿过氧化氢酶蛋白序列，对19种突变体的梅花鹿过氧化氢酶蛋白序列进行同源建模，获得19种突变体的梅花鹿过氧化氢酶蛋白分子的三维结构；同源建模方法同步骤a；

d、利用分子动力学模拟的方法理性设计蛋白质分子的热稳定性：分子动力学模拟采用Amber程序包，模拟结果的分析采用VMD程序包，并计算20种梅花鹿过氧化氢酶蛋白氨基酸序列主链模拟前后的RMSD变化值；所述20种梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子包括1种野生型和19种突变型；所述RMSD值是指模拟过程中产生的结构相对于晶体结构随时间变化的均方根偏差；

e、确定所需要的突变类型：根据步骤d中的RMSD变化值，选取所需要的突变类型；选取RMSD变化值比野生型小且最小的两种突变型，即热稳定性提高的两种梅花鹿过氧化氢酶蛋白；选取RMSD变化值比野生型大且最大的两种突变型，即热稳定性降低的两种梅花鹿过氧化氢酶蛋白；

f、进行蛋白质分子的热稳定性改造：对需要热稳定性改造的梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子，分别构建野生型和步骤e中所述的4种突变型的表达载体，并转化毕赤酵母发酵诱导酶蛋白的表达，之后使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标酶蛋白分子，再进行热稳定性的测定，最终获得热稳定性提高的两个酶蛋白质分子和热稳定性降低的两个酶蛋白质分子；

步骤e中所述表达载体采用pPICZαC质粒构建，毕赤酵母为GS115；

步骤e中所述的4种突变型的表达载体的构建是将构建好的野生型蛋白表达载体进行定点突变所获得的；所述定点突变的具体步骤如下：使用Toyobo KOD-neo酶进行全质粒高保真定点突变PCR反应；反应液配方和PCR程序如下：

KOD PCR反应液：10 X PCR buffer for KOD-plus-neo  5μl；2mM dNTPs   5μl；

25mM MgSO₄  3μl；  10mM的引物1.5μl；模板 50ng；KOD-plus-neo   1μl；ddH₂O补足至 50μl；

全质粒定点突变的PCR程序：94℃，2min；98℃ 10s，55℃ 30s，68℃ 30s/kb、25个循环；72℃，7min；

取上述PCR反应液，向其中加入DpnI限制性内切酶，37℃反应至少1h；之后，取上述DpnI反应液，直接转化大肠杆菌感受态细胞；将转化液涂布在添加有适当抗生素的培养基平板上，至单菌落形成；挑取单菌落，使用液体培养基培养，提取质粒备用，同时测序验证突变是否成功。

8.根据权利要求4或6或7所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述抗体吸附法是当所表达的蛋白质分子带有标签时，使用等量的特异性识别该标签的抗体吸附住来自于不同样品的目标蛋白质分子，由于使用的抗体等量，所吸附住的来自于不同样品的目标蛋白质分子也等量，这些等量的目标蛋白质分子用于后续测定，避免在测定蛋白质分子活性和蛋白质分子的热稳定性时，由于蛋白质分子数量的不同，造成测定结果的不同；所述标签为His-tag或GST-tag或MBP-tag或其它蛋白质融合表达标签；

所述使用抗体吸附法获得相同摩尔量的目标蛋白质分子的具体步骤为：

1、用包被液:抗对应标签的抗体= 1:1混合，加于酶标板，每孔200μl，4℃过夜；

2、弃上清，加封闭液，200μl/孔，37℃，静置2h；

3、加入洗涤液，100μl/孔，静止3min，弃上清，重复3次；

4、加入发酵上清液，37℃，静置1h；

5、弃上清，洗3次，方法同步骤3；

所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，其制备为：Na₂CO₃ 0.16g；NaHCO₃ 0.29g； 补水到100mL

所述洗涤液为0.01mol/L pH7.4 Tris-HCl-Tween20，其制备为：Tris 2.42g；0.1mol/L HCl 13mL；Tween20 0.5mL，补水到1000mL；

所述终止液为2mol/L H₂SO₄，其制备为：浓H₂SO₄ 22.4mL ，加水177.6mL；

所述封闭液，按质量体积比计，为向包被液中添加3% 的脱脂牛奶，即为封闭液。

9.根据权利要求7所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述热稳定性提高的两个梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

10.根据权利要求7所述的一种基于理性设计的蛋白质分子热稳定性改造方法，其特征在于：所述热稳定性降低的两个梅花鹿过氧化氢酶蛋白质分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。

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