CN103451163A

CN103451163A - 一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体

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Publication number: CN103451163A
Application number: CN2013104107893A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 堵国成; 康振; 曹汶龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: CN103451163B

Abstract

本发明公开了一种酶活及热稳定提高的过氧化氢酶突变体，属于生物工程领域。将来源于枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）的过氧化氢酶进行基因进行定点突变，使其编码的氨基酸序列在第114位由赖氨酸K分别突变为酪氨酸Y、缬氨酸V、蛋氨酸M或异亮氨酸I。本发明所述的过氧化氢酶突变体的表达量分别是突变之前的2.23、2.41、1.46、1.38倍，在温度耐受性方面突变之后的酶的半衰期分别是突变前的2.17、1.5、2、1.67倍。本发明所得过氧化氢酶突变体更加适合工业化的生产需求，具有广阔的应用前景。

Description

一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体

技术领域

本发明涉及一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术

过氧化氢酶(catalase)简称CAT，其系统名称是：H₂O₂氧化还原酶，以H₂O₂为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气。过氧化氢酶在纺织、食品、医药、临床等行业都有着广泛的用途。过氧化氢酶在食品加工工业中可使食品保鲜，并作为消除啤酒、饮料中活性氧和自由基的抗氧化剂。与葡萄糖氧化酶并用作氧的去除剂，牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌；在医药行业常用于器械消毒；在临床分析中，过氧化氢酶对研究自由基代谢失衡，抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值，对某些疾病的诊断，鉴别诊断亦具有重要意义上等行业有着广泛的用途。迄今CAT已经成为农业，以及与之相关的食品与乳制品业、纸浆和造纸业、以及农业环保产业中有应用价值的酶之一。近年来随着过氧化氢酶在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求大幅增长。

近年来嗜热子囊菌，粘质沙雷氏菌，苹果炭疽菌、芽孢杆菌等微生物菌种均有用于过氧化氢酶的生产研究。但利用野生菌株生产过氧化氢酶，资源消耗大、原料利用率低、产量较低，难以满足日益增长的市场需求；通过传统方法育种，工作量大、盲目性大、回复突变率高，难以筛选得到理想的突变菌株。有通过重组大肠杆菌生产过氧化氢酶，但大肠杆菌本身产生的热源、内毒素不易除去，产品纯化问题较多；蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性困难，易出现肽链的不正确折叠等问题。生物安全性要求我们的宿主菌最好具有非致病性。而绝大多数芽孢杆菌恰恰能满足这一要求，而且还具备了一些其他菌株所没有的优良特性。事实表明，芽孢杆菌可以作为一些原核生物、真核生物和哺乳动物等的外源蛋白的表达宿主。芽孢杆菌表达系统具有的非致病性；细胞壁的组成简单；能够大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单等优点，使之成为CAT的良好表达宿主。

过氧化氢酶活性可被苯酚类、尿素、氰化合物、叠氮化物、碱等物质所抑制，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WSHDZ-01）具有耐热耐碱的特性，且已用于工业化生产，利用该菌株作为宿主过量表达CAT，发酵条件易于控制，可大幅度提高CAT的产量。

江南大学的郭娅琼从枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）基因组中获得编码过氧化氢酶（CAT）的基因katA带有自身信号肽和启动子序列，与质粒pSTOP1622上具有的木糖启动子构成了双启动子表达系统，在一定程度上增加了过氧化氢酶mRNA的转录量，促使CAT的表达，很大程度地提高了CAT的产量。但该过氧化氢酶也存在着一定的缺陷，尤其是其对温度比较敏感，使得其在工业应用中有一定的局限性。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体(CAT)。是对氨基酸序列如NCBI登录号BAB21251.1所示的过氧化氢酶第114位的赖氨酸K进行定点突变，将含突变后基因的重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WSHDZ-01进行表达，得到酶活及热稳定性均增强的过氧化氢酶突变体。

编码所述亲本过氧化氢酶的核苷酸序列如NCBI登录号为AB046412的序列所示。

所述突变是将第114位的赖氨酸K分别变为酪氨酸Y、缬氨酸V、蛋氨酸M或异亮氨酸I。

获得所述突变体的方法，是以pSTOP1622-katA质粒（一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，申请号：201110328753.1）为模版，设计引物，通过PCR进行定点突变得到含有突变后基因的重组质粒pSTOP1622-katKX，将pSTOP1622-katKX转化枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）发酵生产CAT。

所述枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）购买于武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M206062。

获得所述突变体的方法，具体地是：

（1）突变表达载体的构建

通过分析过氧化氢酶的3D结构，确定114位的赖氨酸K为目的突变为点，设计突变实验，将该位点的赖氨酸分别突变为酪氨酸Y、缬氨酸V、蛋氨酸M或异亮氨酸I。

以pSTOP1622-katA质粒为模版，设计引物，通过PCR进行定点突变得到含有突变后基因的重组质粒pSTOP1622-katKX（X为突变后的氨基酸）；将该质粒利用DpnI核酸内切酶进行酶切消化DNA模板，酶切反应温度为37℃，反应时间为30分钟，然后将酶切产物直接转化到E.coli JM109菌株，提取质粒进行测序。

（2）含突变体的基因工程菌的获得

制备枯草芽孢杆菌WSHDZ-01感受态，将pStop1622-katAKX的连接液加入500μL的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选转化子，并提取质粒测序验证。

（3）重组枯草芽孢杆菌发酵生产突变CAT

将产CAT重组枯草芽孢杆菌活化后制备种子液，以1%～5%的接种量转接入装有20～50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，每间隔4h取样。

活化培养基：质量百分比为6%的麦芽汁。

重组枯草芽孢杆菌的发酵条件为：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～250rpm，发酵时间36h～72h。发酵培养基组成为（g/L）：葡萄糖10～20，NaNO₃5～10，MgSO₄·7H₂O0.5，Na₂HPO₄9.52，KH₂PO₄0.6，FeSO₄·7H₂O0.0025，pH自然；木糖诱导浓度为0.1～1.0%（w/w）。

发酵条件优选：温度设为37℃，摇床转速设为200rpm，发酵时间48h～56h。发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，NaNO₃5，MgSO₄·7H₂O0.5，Na₂HPO₄9.52，KH₂PO₄0.6，FeSO₄·7H₂O0.0025，pH自然；木糖诱导浓度为0.5%（w/w）。

本发明通过定点突变改造过氧化氢酶基因，将过氧化氢酶第114位由赖氨酸K分别突变为酪氨酸Y、缬氨酸V、蛋氨酸M或异亮氨酸I，所得过氧化氢酶突变体的表达量分别是突变之前的2.23、2.41、1.46、1.38倍，在温度耐受性方面突变之后的酶的半衰期分别是突变前的2.17、1.5、2、1.67倍；CAT的产量和酶学性质都有有大幅度提高，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。

附图说明

图1为本发明构建的突变株以及原始菌株发酵胞外酶活情况。

图2为本发明构建的突变体以及原始酶在60℃的半衰期。

具体实施方式

CAT发酵检测：取1mL发酵液于5mL离心管中，10000rpm，4℃下离心10min，取上清液为胞外CAT测定样品；沉淀以50mmol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(pH7.0)洗涤2次，以1mL缓冲液重悬后置冰浴预冷，超声波间歇破碎9min，10000rpm离心15min，上清液作为胞内CAT测定样品。

过氧化氢酶总酶活=胞内酶活＋胞外酶活，总酶活用紫外分光光度计在240nm下测定。

过氧化氢酶热稳定性检测：在不同温度下按照标准方法测定酶活力，以酶活力最高者为100%.，将酶液分别在30、37、42、50、60℃下保温60min，利用冰浴迅速冷却后，按上述方法测残余酶活力，考察其热稳定性。

实施例1突变表达质粒的构建及重组枯草芽孢杆菌的获得

1.突变表达载体的构建

以枯草芽孢杆菌pSTOP1622-katA质粒（一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，申请号：201110328753.1；Plasmid system for the intracellular production andpurification of affinity-tagged proteins in Bacillus megaterium,Biedendieck R,Yang Y,DeckwerWD,Malten M,Jahn D）为模板，利用PCR体外扩增含突变基因的质粒。

用于定点突变的引物为：

katAKY primer1：5'-ACCCGCGCGGATTTGCTGTTTATTTTTATACTGAAGAAGGAAA-3'

katAKY primer2：5'-TTTCCTTCTTCAGTATAAAAATAAACAGCAAATCCGCGCGGGT-3'

katAKV primer1：5'-CCCGCGCGGATTTGCTGTTGTATTTTATACTGAAGAAGG-3'

katAKV primer2：5'-CCTTCTTCAGTATAAAATACAACAGCAAATCCGCGCGGG-3'

katAKM primer1：5'-CCCGCGCGGATTTGCTGTTATGTTTTATACTGAAGAAGGAAA-3'

katAKM primer2：5'-TTTCCTTCTTCAGTATAAAACATAACAGCAAATCCGCGCGGG-3'

katAKI primer1：5'-CCGCGCGGATTTGCTGTTATATTTTATACTGAAGAAGG-3'

katAKI primer2：5'-CCTTCTTCAGTATAAAATATAACAGCAAATCCGCGCGG-3'；

PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，68℃延伸120s,30个循环后72℃延伸5min，4℃保存。将通过PCR得到含有突变基因的质粒pSTOP1622-katAKX利用DpnI核酸内切酶进行酶切消化DNA模板，酶切反应温度为37℃，反应时间为30分钟，然后将酶切产物直接转化到E.coli JM109菌株，提取质粒进行测序。

2.突变表达载体的转化

(1)感受态细胞的制备

挑枯草芽孢杆菌WSHDZ-01单菌落至2mL SPI培养基中，37℃，200rpm培养过夜。次日上午取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长末期(约4～5h)，取0.2mL培养液至2mL SPII培养基中，37℃，200rpm培养90min，加入20uL10mmol/L EGTA，再于37℃，200rpm培养10分钟。

(2)突变表达载体的验证扩增

将测序正确的重组质粒pSTOP1622-katAKX加入500μL的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，混匀；于37℃，100rpm培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。将转化液涂布于含有质量百分比为2.0%的琼脂并加有终浓度为20ug/mL的四环素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养16h，挑取单菌落筛选转化子。

将单菌落挑取转入LB液体培养基中，37℃，200转/分钟下培养过夜（培养基中添加四环素至终浓度为20μg/mL）。离心菌体，利用质粒提取试剂盒(购买于TakaRa公司)提取重组质粒pSTOP1622-katAKX，并验证质粒的正确性。

实施例2突变CAT的表达

活化培养基：6%（w/w）麦芽汁，pH7.0～7.5。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖10，NaNO₃5，MgSO₄·7H₂O0.5，Na₂HPO₄9.52，KH₂PO₄0.6，FeSO₄·7H₂O0.0025，pH自然；木糖诱导浓度为0.5%（w/w）。

挑取LB平板中筛选后的产CAT重组枯草芽孢杆菌,在无菌条件下用接种环接1～2环于25mL并加有终浓度为20ug/mL的四环素的活化培养基中，37℃条件下，200rpm摇床振荡培养16h，制得种子液；以5%的接种量转接入装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中。发酵条件为37℃，200rpm。发酵56h，每间隔4h取样，原菌株枯草芽孢杆菌（B.subtilisWSHDZ-01/pSTOP1622-katA）作为对照。

实施例3突变前后CAT的酶学性质

按照实施例2所述的方法分别对原枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01/pSTOP1622-katA，一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，申请号：201110328753.1）及其他突变株进行发酵，测定胞外酶活，得到结果如附图1所示，通过附图1可以看出，突变之后的菌株的酶活相比突变之前明显有了提高，最高的katAKV的酶活是突变之前的2.41倍。过氧化氢酶突变体的表达量分别是突变之前的2.23、2.41、1.46、1.38倍。

通过检测发现突变前酶在30℃-50℃比较稳定，而在60℃比较容易失活，通过测定突变前后的酶在60℃的稳定性，得到结果如附图2所示，突变之后的菌株所产的过氧化氢酶在60℃的热稳定性有了显著提高，相比突变之前的酶活减少到一半的时间，突变之后的酶液有了明显的提高。过氧化氢酶突变体在温度耐受性方面（半衰期）分别是突变前的2.17、1.5、2、1.67倍。

katA基因在枯草芽孢杆菌（B.subtilis WSHDZ-01）中过量表达，获得的转化株的CAT产量可达5485U/mL，本发明所述的突变之后的菌株所产的酶液相比突变之前酶活和热稳定性有了明显的提高，最高的酶活能够达到之前的2.41倍，在60℃的半衰期是突变前的2.17倍。结果表明，在关键位点突变氨基酸，可以使该酶的表达和酶学性质发生变化，这种策略可以广泛应用于酶学性质的改进。

实施例4

在枯草芽孢杆菌WB600和巨大芽孢杆菌中进行突变体表达及构建过程同实施例1、2和3。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种酶活及热稳定性提高的过氧化氢酶突变体，其特征在于，是对氨基酸序列如NCBI登录号BAB21251.1所示的过氧化氢酶进行定点突变得到。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，是对过氧化氢酶第114位的赖氨酸K进行突变。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，是将过氧化氢酶第114位的赖氨酸K突变为酪氨酸Y、缬氨酸V、蛋氨酸M或异亮氨酸I。

4.编码权利要求1所述突变体的基因。

5.含有权利要求4所述基因的质粒或细胞。

6.获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，是以质粒pStop1622-katA为模版，设计引物，通过PCR获得编码突变体的基因及质粒，以枯草芽孢杆菌为宿主表达过氧化氢酶突变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，是以质粒pStop1622-katA为模版，设计引物，通过PCR获得编码突变体的重组质粒，将含有重组质粒的枯草芽孢杆菌种子培养液接种到发酵培养基，在30～40℃、150～250rpm条件下发酵时间36h～72h；所述发酵培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，NaNO₃5～10g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，Na₂HPO₄9.52g/L，KH₂PO₄0.6g/L，FeSO₄·7H₂O0.0025g/L，pH自然；木糖诱导浓度为0.1～1.0%（w/w）。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，表达宿主优选枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）WSHDZ-01、B.subtilis WB600或巨大芽孢杆菌。

9.权利要求1所述突变体在纺织、造纸、食品、医药中的应用。