CN111440807A - 高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌wp3突变菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌wp3突变菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用，以希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除oxyR基因(如SEQ ID NO:1所示)内的部分基因片段(如SEQ ID NO:6所示)，解除对过氧化氢酶基因表达的抑制作用，得到基因突变菌株ΔoxyRc；同时优化ΔoxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的工艺提高产量。相比于WP3Δ4RE，ΔoxyRc的过氧化氢酶产量提高了3098倍，其胞内酶活可达34133U/mL，比活力达19022U/mg，用于提高纺织、造纸、食品和医药领域所需低温过氧化氢酶的产量，克服野生菌株生产低温过氧化氢酶产量较低的问题。

Description

高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法 和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用，具体是以高接合转移率的希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除其oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段，获得高产低温过氧化氢酶的基因突变菌株ΔoxyRc。
背景技术
过氧化氢酶(Catalase)普遍存在于微生物，植物和动物体内。它可以快速的催化H2O2分解成为H2O和O2，是一种重要的工业酶制剂，在食品、造纸、农业、环保和医药产业中具有广阔的应用价值。目前，市场上的商品化过氧化氢酶大多是中温和高温过氧化氢酶，低温过氧化氢酶还有待进一步开发和应用。
研究发现，一株深海希瓦氏菌Shewanella piezotolerans WP3的过氧化氢酶属于低温过氧化氢酶，此酶的最适温度在4-10℃之间，通过重组大肠杆菌生产的该重组过氧化氢酶酶活力达45318U/mg；但是，大肠杆菌本身产生的热源、内毒素不易除去，产品纯化问题较多，在生产的过程中发现有包涵体的形成，对工业化高水平的生产带来一定的困难。直接利用WP3发酵生产此过氧化氢酶对酶的稳定性更为有利，且WP3为非致病菌，细胞较大肠杆菌更容易破碎，回收和纯化蛋白较为简单。然而直接利用野生菌株WP3生产过氧化氢酶产量较低，虽然可以通过育种技术对野生菌株进行筛选，但工作量较大且难以得到理想的突变菌株。因此，利用基因工程技术将野生菌株改造成高产过氧化氢酶的菌株成为一种快速而高产过氧化氢酶的途径。
发明内容
为克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种oxyR基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
根据所述oxyR基因的一些实施方式，所述oxyR基因来源于深海的希瓦氏菌株WP3Δ4RE。
根据所述oxyR基因的一些实施方式，所述oxyR基因内负责响应H2O2的序列片段如SEQ ID NO:6所示。
本发明还提供了一种高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株，所述突变菌株通过包括如下步骤的方法制得：以希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除所述WP3Δ4RE菌株的oxyR基因内负责响应H2O2的序列片段，相应获得基因突变菌株ΔoxyRc；所述基因突变菌株ΔoxyRc即为高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。
根据本发明所述希瓦氏菌WP3突变菌株的一些实施方式，所述oxyR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明所述希瓦氏菌WP3突变菌株的一些实施方式，所述被敲除的负责响应H2O2的序列片段如SEQ ID NO:6所示。
本发明还提供了所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，包括步骤：
(1)根据所述oxyR基因设计基因敲除引物；和
(2)以所述希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段，相应获得基因突变菌株ΔoxyRc，所述基因突变菌株ΔoxyRc即为所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。
根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式，步骤(1)中，所述引物包括上游引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式，步骤(2)中，所述敲除包括如下步骤：
(a)PCR扩增所述oxyR基因所敲除片段上下游同源臂，通过融合PCR获得大片段；
(b)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒，将所述重组质粒转化到供体菌E.coli WM3064；
(c)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP3Δ4RE进行细菌接合转移；
(d)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、测序鉴定，得到oxyR基因突变菌株ΔoxyRc。
根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式，所述自杀质粒为pRE112质粒。
根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式，步骤(d)中，所述鉴定具体指设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物进行PCR扩增和测序鉴定。
本发明还提供了所述oxyR基因或所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株在纺织、造纸、食品和医药领域提高低温过氧化氢酶产量中的应用。
本发明还提供了所述突变菌株ΔoxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的方法，包括步骤：(ⅰ)将所述突变菌株ΔoxyRc接种至液体培养基中活化培养至对数中后期；和(ⅱ)以对数中后期1％的接种量转接至发酵培养基中振荡发酵培养12～36h。
根据本发明所述突变菌株ΔoxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的一些实施方式，所述发酵培养时间为24h。
根据本发明所述突变菌株ΔoxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的一些实施方式，所述发酵培养基内含有0.5mM的FeCl3。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明以希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，通过敲除WP3Δ4RE菌株中抑制过氧化氢酶基因表达的oxyR基因部分片段，相应获得基因突变菌株ΔoxyRc，使其解除对过氧化氢酶基因表达的抑制作用，从而提高低温过氧化氢酶的产量；相比于出发菌株WP3Δ4RE，基因突变菌株ΔoxyRc的过氧化氢酶产量提高了3098倍，其胞内酶活可达34133U/mL，比活力达19022U/mg。
2.本发明通过基因工程构建高产低温过氧化氢酶的WP3突变菌株，并对其发酵生产过氧化氢酶的条件进行优化，为提高纺织、造纸、食品和医药领域所需低温过氧化氢酶的产量提供新的途径，克服野生菌株生产低温过氧化氢酶产量较低的问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为希瓦氏菌株WP3Δ4RE和基因突变菌株ΔoxyRc的oxyR基因序列比对图。
图2为基因突变菌株ΔoxyRc生产低温过氧化氢酶的发酵时间优化。
图3为基因突变菌株ΔoxyRc生产低温过氧化氢酶的发酵培养基优化。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1基因突变菌株ΔoxyRc的构建
构建基因突变菌株ΔoxyRc，具体步骤为：(1)设计含KpnI和SacI酶切位点的引物1(SEQ ID NO:2)和引物4(SEQ ID NO:5)，并含有互补序列的引物2(SEQ ID NO:3)和引物3(SEQ ID NO:4)，通过PCR扩增分别获得被敲基因片段的上下游侧翼序列，利用融合PCR将上下游侧翼序列融合成大片段DNA，大片段DNA经相应的限制酶处理后，通过T4DNA连接酶整合到自杀质粒pRE112相应的位点，获得重组质粒。
(2)将上述重组质粒转化至供体菌E.coli WM3064，PCR筛选阳性克隆子，通过细菌基因的接合转移将供体菌E.coli WM3064中的重组质粒转入受体菌WP3Δ4RE，由于pRE112质粒不能在WP3Δ4RE中自我复制，仅当该质粒通过同源重组整合到WP3Δ4RE基因组上后才能与基因组一起复制。
(3)质粒的整合赋予WP3对氯霉素的抗性，通过含氯霉素的抗性平板筛选，获得这些单交换克隆子，随后经松弛培养过夜后，涂布10％蔗糖板进行双交换克隆子的筛选，PCR鉴定不含氯霉素抗性基因且目的基因成功敲除的克隆子；由于所敲除的基因序列较短，电泳看不到明显差异，最后提取潜在的目的基因成功敲除的克隆子的DNA，用引物1和引物4进行PCR产物扩增后测序，测序正确的即确认为双交换成功的基因突变菌株ΔoxyRc，如图1所示。
实施例2基因突变菌株ΔoxyRc发酵生产过氧化氢酶
将基因突变菌株ΔoxyRc接种至5mL的2216E液体培养基中活化，20℃、200rpm培养至对数中后期后，以1％的接种量转接至50mL的2216E液体培养基中，20℃、200rpm振荡培养24h后，4℃、8000rpm和8min离心收集菌体。将收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬(50mMK2HPO4-KH2PO4，10％甘油，0.1mM EDTA，pH8)，再用超声破碎仪对细胞悬浮液进行细胞破碎，4℃、12000rpm和20min离心后收集上清液。
实施例3低温过氧化氢酶活的测定
酶活的测定采用紫外分光光度法。反应总体积为2mL，反应体系为磷酸钾缓冲液(50mmol/L KH2PO4/K2HPO4，0.1mM EDTA，pH8)，H2O2的终浓度为40mM。酶活性以H2O2在240nm处分解速率计算，一个酶活力单位(U)定义为1min内降解1μmolH2O2所需的酶量，H2O2摩尔吸光系数为43.6L·mol-1·cm-1；酶的比活力(U/mg)定义为每mg蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位，蛋白浓度通过考马斯亮蓝法测定(改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购自上海生工生物技术有限公司)。
实施例4基因突变菌株ΔoxyRc发酵生产过氧化氢酶的发酵时间优化
将ΔoxyRc接种至5mL的2216E液体培养基中活化，20℃、200rpm培养至对数中后期后，以1％的接种量转接至50mL的2216E液体培养基中，20℃、200rpm分别培养12、24、36小时后，按照酶活测定方法测定胞内的过氧化氢酶活，结果如图2所示，可见ΔoxyRc在24小时时过氧化氢酶产量最高。
实施例5基因突变菌株ΔoxyRc发酵生产过氧化氢酶的发酵培养基优化
将ΔoxyRc接种至5mL的2216E液体培养基中活化，20℃、200rpm培养至对数中后期后，以1％的接种量分别转接至50mL的2216E液体培养基和含有0.5mM FeCl3的2216E培养基中，20℃、200rpm培养24小时后按照酶活测定方法测定胞内的过氧化氢酶活，结果如图3所示，可见FeCl3的加入能提高低温过氧化氢酶的产量，在10℃下所测得的胞内酶活为34133U/mL或19022U/mg。
实施例6WP3Δ4RE与ΔoxyRc发酵生产过氧化氢酶产量的比较
将WP3Δ4RE与ΔoxyRc分别接种至5mL的2216E液体培养基中活化，20℃、200rpm培养至对数中后期后，以1％的接种量分别转接至含有0.5mM FeCl3的2216E培养基中，20℃、200rpm培养24小时后按照酶活测定方法测定胞内的过氧化氢酶活，得到WP3Δ4RE胞内过氧化氢酶活仅为6.14U/mg，而ΔoxyRc胞内酶活为19022U/mg，产量提高了3098倍。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Figure BDA0002440657920000061
Figure BDA0002440657920000071
Figure BDA0002440657920000081
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用
<141> 2020-04-07
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 930
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgtcattgg taatctgctt tatgaaacat cttcctagtt taaaaaacct gttttatttg 60
gttaatttac atcaagaaca aaattttaat cgcgctgcaa aaatttgtca tgttagccag 120
tcaacgctat ctagtggtat tcaaaacctc gaagagcaat taggtcacca gttgatcgaa 180
cgcgaccaca aatcttttat ctttaccgct attggcgaag aggtggtgtt acgttcacgc 240
aagttactca ctgatgtgga tgatttggtc gagcttgtta agcaccaagg tgagcctatg 300
acgggcgaaa tccgtttggg ttgtattcca actattgcgc cttttcttct cagtcgagtg 360
gttcagcatt gcaaagaggt ttatccaaat ctcactctgt tcttgaaaga ggataccact 420
gataggttgg tagacgcgct tggtaaaggt gagctggatc tgttgttgct tgccttgcca 480
gtggatacta gtggttacca cagtatgaaa gtgggtatcg acccgttcaa aatggttgtg 540
catgaagatc tcagtgatgc gattcatgaa ccgattgatt atcaagatct gccagacgaa 600
agtatctttt tattgcaggc tgaacattgt attactgggc atgctatcag tgcttgtcag 660
ttaggggaaa gtaccaagat taatccgttt gcagcaacga gtttacatac cttggtacag 720
atggtgaatt gcaaattagg aaccacattc ttgccacaaa tggcgataga tgccgggata 780
ttaaacaata cagaactgac gactatggcg cctcctagcg atacaccata tagagacatc 840
ggccttgttt ggcgtcagac ctcgagccgt attctgacat ttagaacact aggcttagag 900
atccaaaagc tgcttgaaca acataattaa 930
<210> 2
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ctaaggtacc tgttctaaat gtcagaatac ggctc 35
<210> 3
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ccaagattaa tccgtttgca gc 22
<210> 4
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
acggattaat cttggtactt tcgtctggca gatcttgat 39
<210> 5
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
ctgtgagctc tggttaattt acatcaagaa caaaatttta atcgc 45
<210> 6
<211> 69
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
tctttttatt gcaggctgaa cattgtatta ctgggcatgc tatcagtgct tgtcagttag 60
gggaaagta 69

Claims (13)

1.一种oxyR基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的oxyR基因，其特征在于，所述oxyR基因来源于希瓦氏菌株WP3Δ4RE。
3.根据权利要求2所述的oxyR基因，其特征在于，所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段如SEQ ID NO:6所示。
4.一种高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株，其特征在于，所述突变菌株通过包括如下步骤的方法制得：以希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段，相应获得基因突变菌株ΔoxyRc；所述基因突变菌株ΔoxyRc即为高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。
5.根据权利要求4所述的希瓦氏菌WP3突变菌株，其特征在于，所述oxyR基因如权利要求1～3任一项所述，和/或所述被敲除的负责响应H2O2的序列片段如权利要求3所述。
6.权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据权利要求1～3任一项所述oxyR基因设计基因敲除引物；和
(2)以所述希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段，相应获得基因突变菌株ΔoxyRc，所述基因突变菌株ΔoxyRc即为权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。
7.根据权利要求6所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物包括上游引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示、下游引物如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示。
8.根据权利要求6所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述敲除包括如下步骤：
(a)PCR扩增所述oxyR基因所敲除片段上下游同源臂，通过融合PCR获得大片段；
(b)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒，将所述重组质粒转化到供体菌E.coliWM3064；
(c)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP3Δ4RE进行细菌接合转移；
(d)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、测序鉴定，得到基因突变菌株ΔoxyRc。
9.根据权利要求8所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，所述自杀质粒为pRE112质粒。
10.根据权利要求8所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤(d)中，所述鉴定具体指设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物进行PCR扩增和测序鉴定。
11.权利要求1～3任一项所述oxyR基因、权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株在纺织、造纸、食品和医药领域提高低温过氧化氢酶产量中的应用。
12.权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株发酵生产低温过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括步骤：
(ⅰ)将所述基因突变菌株ΔoxyRc接种至液体培养基中活化培养至对数中后期；和
(ⅱ)以对数中后期1％的接种量转接至发酵培养基中振荡发酵培养12～36h。
13.根据权利要求12所述发酵生产低温过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述发酵培养时间为24h，和/或
所述发酵培养基内含有0.5mM的FeCl3。
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