CN114752576A

CN114752576A - 过氧化氢酶突变体及其应用

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Publication number: CN114752576A
Application number: CN202210362566.3A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 冯志彬
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Priority date: 2022-04-06
Filing date: 2022-04-06
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2042-04-06
Also published as: CN114752576B

Abstract

本发明公开了一种过氧化氢酶突变体及其应用，所述突变体至少在初始型过氧化氢酶氨基酸序列的下列位置之一发生了突变：第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第102位蛋氨酸突变为亮氨酸、第200位缬氨酸突变为苯丙氨酸、第251位丙氨酸突变为丝氨酸，所述初始型过氧化氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与初始过氧化氢酶BmCAT相比，过氧化氢酶突变体氨基酸序列发生了替换，形成的突变体显著提高了催化过氧化氢的能力。在利用乳酸氧化酶生物合成丙酮酸的过程中，采用表达该过氧化氢酶突变体的全细胞催化消除反应过程中产生的过氧化氢，酶的用量少，过氧化氢的消除率显著提高，产物丙酮酸的摩尔转化率最高达为99.7％，具有很高的工业化应用前景。

Description

过氧化氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及过氧化氢酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

在生物体内，细胞在代谢过程中由于物质的氧化分解和电子的传递，会伴随过氧化氢的产生。过氧化氢对细胞存在毒害作用，而体内的过氧化氢酶就是负责分解过氧化氢，消除其对细胞毒害的关键酶。生物体内的过氧化氢常常产生于一些氧化酶催化的反应，因此工业上在利用一些氧化酶作为催化剂生产化合物的过程中，通常需要过氧化氢酶的参与，以消除反应过程过氧化氢的产生，降低过氧化氢对酶活的抑制。另外在印染工业，过氧化氢被用作漂白剂。在食品、医用、工业过程中，过氧化氢是很好的消毒液。然而由于过氧化氢对人体有害，其残留物污染环境，所以过氧化氢使用后残留药物的去除就需要过氧化氢酶的使用。

在自然界，过氧化氢酶是生物防御系统的重要组成部分，能够催化过氧化氢产生水和氧气，使细胞免受过氧化氢的毒害，消除逆境带来的伤害。由于其催化特性，过氧化氢酶被广泛应用于食品、环保、造纸、防治等工业生产中消除残余过氧化氢。为了防止食物氧化，过氧化氢酶也常被用于食品包装。造纸、纺织等工业生产常常产生大量含有过氧化氢工业废水。利用过氧化氢酶可以有效地、环保地消除残余过氧化氢，避免废水处理的二次污染。而且过氧化氢酶还能降解芳香环化合物和脂肪族化合物。然而，在工业领域中常常存在强酸、强碱、高温等极端环境，因此寻找稳定性强，催化活性高的过氧化氢酶是目前研究的热点。

过氧化氢酶也称触酶，是广泛存在于动植物中一类末端氧化酶。按照其催化中心的结构差异可以分为两大类，一类是含铁卟啉结构的过氧化氢酶，又称铁卟啉酶；另一类是含锰离子卟啉结构的过氧化氢酶，锰离子代替了铁离子，又称锰过氧化氢酶。铁卟啉酶能够与血红素结合，分布广泛，但是该酶容易失活，工业利用存在制约。锰过氧化氢酶存在于少数生物体内，研究发现，锰过氧化氢酶的的热稳定性优于铁卟啉酶，催化活性稳定，因此越来越多的锰过氧化氢酶被挖掘出来，用于工业生产。但是目前发现的锰过氧化氢酶较少，因此它们的酶学特点和催化活性并没有太多的研究。所以利用生物技术获得热稳定性好，且催化活性高的锰过氧化氢酶将为未来过氧化氢酶的应用打下坚实的基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供过氧化氢酶突变体。

本发明通过随机突变、半理性设计等技术对Bacillus mojavensis LDFZ001来源的初始型过氧化氢酶(BmCAT，CP063276.1，基因序列如SEQ ID NO.2所示)进行改造，获得催化活性提高的过氧化氢酶突变体，以便提高L-乳酸氧化酶催化L-乳酸生成丙酮酸的产物转化效率。

本发明的目的之二在于提供编码上述过氧化氢酶突变体的基因。

本发明的目的之三在于提供包含上述基因的重组质粒、表达载体。

本发明的目的之四在于提供转化了上述重组质粒的微生物。

本发明的目的之五在于提供上述过氧化氢酶突变体或微生物在生产L-丙酮酸中的用途。利用该过氧化氢酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，催化过氧化氢分解成水和氧气，其目的在于延长L-乳酸氧化酶的反应时间，提高产物的转化效率。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

过氧化氢酶突变体，至少在初始型过氧化氢酶氨基酸序列的下列位置之一发生了突变：第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(I67F)、第102位蛋氨酸突变为亮氨酸(M102L)、第200位缬氨酸突变为苯丙氨酸(V200F)、第251位丙氨酸突变为丝氨酸(A251S)，所述初始型过氧化氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码权利上述过氧化氢酶突变体的基因，所述突变体的基因至少在初始型过氧化氢酶基因核苷酸序列的下列位置之一发生了突变：第199位的碱基A突变为T、第304位的碱基A突变为C、第598位的碱基G突变为T、第751位的碱基G突变为T，所述初始型过氧化氢酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述基因的重组质粒、表达载体以及包含重组质粒的重组细胞均落入本发明的保护范围之内。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是pET系列，如pET28a，但并不受限于此。

还包括转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述过氧化氢酶突变体。

优选地，上述微生物选自谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、芽孢杆菌、大肠杆菌，更加优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述过氧化氢酶突变体或者微生物在生产丙酮酸中的应用，其可以用于生产L-丙酮酸。

在生产L-丙酮酸中，以L-乳酸为底物，利用L-乳酸氧化酶为催化L-乳酸生成L-丙酮酸，用过氧化氢酶突变体作为生物催化剂清除反应过程中产生的过氧化氢。

作为一种可选的实施方式，上述微生物可以以湿菌体或者其细胞破碎物形式，做为催化过氧化氢形成水和氧气的催化剂。

生产L-丙酮酸可采用常规的工艺条件，比如，反应体系中L-乳酸的浓度可选择1.0M；反应温度选择25-37℃，优选30℃；反应体系pH为7.0-8.0；反应过程通无菌空气。

本发明提供的过氧化氢酶突变体可以应用于生产丙酮酸，但并不局限于此，其他需要催化去除过氧化氢的反应工艺均可应用。

本发明的优点：

相较初始型过氧化氢酶，本发明构建的过氧化氢酶突变体催化过氧化氢的酶活性有明显提高；在生产L-丙酮酸中，以L-乳酸为底物，利用L-乳酸氧化酶为催化剂催化L-乳酸，用过氧化氢酶突变体作为生物催化剂清除反应过程中产生的过氧化氢，催化合成丙酮酸的过程中，本发明提供的过氧化氢酶突变体所在体系，无底物残留，产物摩尔转化率显著提高，最高达99.7％。而初始型过氧化氢酶所在体系存在大量底物L-乳酸的残留，产物摩尔转化率为68.4％。因此本发明提供的过氧化氢酶突变体具有很高的工业化和应用前景。

附图说明

图1是过氧化氢酶及其突变体的活性比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明构建的过氧化氢酶突变体是Bacillus mojavensis LDFZ001来源的初始型过氧化氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，是SEQ ID NO.1序列中氨基酸发生替换后形成的新蛋白质。初始型过氧化氢酶编码基因是序列表中的SEQ ID NO.2。

为了获得酶活性更高的过氧化氢酶，本发明在初始型过氧化氢酶基因序列(SEQID NO.2)基础上利用易错PCR进行碱基突变。获得过氧化氢酶突变体。

本实验还采用来源于Bacillus subtilis R5的过氧化氢酶Cat_Bsu作为阳性对照，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该基因的序列如SEQ ID NO.4(LC602265.1)所示。Cat_Bsu在文献(Abeera Shaeer，et al.，Structural and functional analyses of anovel manganese-catalase from Bacillus subtilis R5.Int J Biol Macromol，180(2021)：222-233)中有报道。来源于Bacillus subtilis R5的过氧化氢酶Cat_Bsu的酶活性与初始型过氧化氢酶的酶活相近。

经过实验验证，本发明提供的过氧化氢酶突变体的酶活性均明显高于上述二者。具体实验过程如下。

以下实验中的全基因合成、引物合成均由华大基因公司完成，实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞的制备、基因转化、培养基配制等根据供应商提供的反应条件或者试剂盒的说明书进行。必要时可以进行简单调整。

实验使用的材料和仪器如下：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，用1M氢氧化钠调节至pH7.0，121℃高温灭菌20min。(LB固体培养基在此基础上加入15g/L的琼脂粉)。

TB培养基：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5，121℃高温灭菌20min。(TB固体培养基在此基础上加入15g/L的琼脂粉)。

底物L-乳酸和产物L-丙酮酸的HPLC测定：

L-乳酸：色谱柱C₁₈；流动相：2.5mM磷酸二氢氨水溶液(用磷酸调节pH至2.0)；流速0.5mL/min；柱温：30℃；进样量1μL；检测波长210nm。L-乳酸标样购置sigma公司(Sigma，L7022)。

L-丙酮酸：色谱柱C₁₈；流动相：乙腈/0.02M磷酸二氢钾(30/70，pH 3.0)：流速1.0mL/min；柱温：30℃；进样量1μL；检测波长210nm。丙酮酸标样购置sigma公司(Sigma，P2256)。

L-乳酸和L-丙酮酸的分离：5000rpm，4℃冷冻离心15min，收集上清，采用上述HPLC方法检测底物乳酸和产物丙酮酸的含量。

实施例1初始过氧化氢酶基因重组大肠杆菌的构建

1.对于来源于Bacillus mojavensis LDFZ001的过氧化氢酶基因，前期本实验室已经构建完成一个来源于Bacillus mojavensis LDFZ001的过氧化氢酶基因的重组载体pET28a-BmCAT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.对于来源于Bacillus subtilis R5的过氧化氢酶Cat_Bsu，根据文献(AbeeraShaeer，et al.，Structural and functional analyses of a novel manganese-catalase from Bacillus subtilis R5.Int J Biol Macromol，180(2021)：222-233)公布的氨基酸序列即SEQ ID NO.3，以此为基础进行由华大公司全基因合成，合成基因序列为SEQ ID NO.4，并在基因两端引入限制性内切酶位点BamH I和Xho I，过氧化氢酶Cat_Bsu的酶切片段后与载体pET28a的酶切片段连接，获得重组质粒pET28a-CAT_Bsu。

3.通过热激转化分别将质粒pET28a-BmCAT和pET28a-CAT_Bsu转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到表达初始过氧化氢酶BmCAT和对照过氧化氢酶CAT_Bsu的重组大肠杆菌。

实施例2易错PCR构建初始过氧化氢酶BmCAT的随机突变体库

1.以初始型过氧化氢酶重组质粒pET28a-BmCAT为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。易错PCR试剂盒购自宝生物公司(Clontech，PT3393-1)；单点突变试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司(诺维赞，C214)

2.利用宝生物易错PCR试剂盒(Clontech，PT3393-1)，以质粒pET28a-BmMnCAT为模板，以BmCAT-F和BmCAT-R为引物进行易错PCR扩增。引物序列如下：

BmCAT-F：acagcaaatgggtcgcggatccATGTTTAAACATACGAAAATGC

BmCAT-R：gtggtggtggtggtggtgctcgagTTACTCACGCCCAGGAAGCG

其中小写字母为同源臂序列。

PCR反应体系为50μL，模板DNA(终浓度约为1ng/μL)1μL，正向引物(10nM)和反向引物(10nM)各1μL，50×Diversify dNTP Mix 1μL，dGTP(2mM)1μL，MnSO4(8mM)2μL，10XTITANIUM Taq Buffer 5μL，TITANIUM Taq Polym.1μL，ddH₂O 37μL。

易错PCR的程序为：94℃预变性30sec，然后进行25个循环的如下程序，94℃30sec，68℃2min。最后68℃总延伸1min结束反应。结果：成功获得大小约为868bp扩增条带。

利用DNA凝胶回收试剂盒回收扩增条带和载体pET28a双酶切(BamH I和Xho I)片段，利用诺维赞单突变试剂盒进行同源重组，反应体系20μL直接进行热激转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到过氧化氢酶突变体库。

重组大肠杆菌的构建：将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞放置冰上融化，然后加入上述20μL融合反应体系，轻轻混匀后冰上放置30min，42℃水浴热激30sec，立即置于冰上2min，加入800μL液体LB培养基，37℃，180rpm培养1h；涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃倒置培养14-16h，获得含有重组质粒的过氧化氢酶突变体工程菌。

实施例3突变体库的高通量筛选

1.突变体粗酶液湿菌的制备

将实施例2获得的突变体重组大肠杆菌单克隆挑取到无菌的96深孔板中，每孔有1mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，180rpm过夜培养8h，再以1∶1的比例吸取500μL菌液转接至另一每孔有500μL含有50μg/mL卡那霉素和终浓度为0.2mM IPTG的LB液体培养基中，20℃，180rpm继续培养16h，然后常温8000rpm离心5min收集菌体，获得543含有突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体，即突变体湿菌。

2.初筛

过氧化氢酶活检测采用过氧化氢酶测试盒(生工生物，D7995598-0100)进行。

标准酶活检测体系：分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm处，蒸馏水调零。测定前过氧化物酶检测工作液放置37℃预热10min。在96孔板中加入10μL样本和190μL检测工作液，立即混匀并计时，记录240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA＝A1-A2。

按照上述标准酶活检测体系配置反应溶液，测定过氧化氢酶突变体库中的每一个单克隆的ΔA，筛选ΔA大于野生型过氧化氢酶BmCAT原始菌株ΔA的突变体菌株。

3.复筛

将初筛获得的菌株的粗酶液作为催化剂进行复筛，复筛方法除了反应体系增加，其他与初筛相同，将野生型过氧化氢酶BmCAT原始菌株的ΔA定义为相对酶活100％，通过对约1500个突变体克隆筛选，共筛选到8个优势突变体，其相对酶活均高于100％，分别命名为BmCATm-1、BmCATm-2、BmCATm-3、BmCATm-4、BmCATm-5、BmCATm-6、BmCATm-7、BmCATm-8。结果如图1所示。对照菌株CAT_Bsu的相对酶活为102％，与初始型菌株BmCAT没有显著差异。

4.过氧化氢酶突变体核苷酸序列测定

挑取上述获得的含有过氧化物酶突变体BmCATm-1、BmCATm-2、BmCATm-3、BmCATm-4、BmCATm-5、BmCATm-6、BmCATm-7、BmCATm-8菌株接种到3mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，180rpm下培养14-16h。常温下，12,000rm离心1min收集菌体，按照质粒提取试剂盒所述方法进行质粒提取，本实验使用了艾科瑞生物的质粒纯化试剂盒(AG21001)，但不局限于该生物公司的质粒提纯试剂盒，任何商业化质粒提取试剂盒均可。提取的质粒送测序公司进行序列测定。

测序结果表明，本发明的过氧化物酶突变体BmCATm-1、BmCATm-2、BmCATm-3、BmCATm-4、BmCATm-5、BmCATm-6、BmCATm-7、BmCATm-8的氨基酸序列在不同的位置发生了突变，其中BmMnCATm-1和BmCATm-3突变位点相同，均在第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸；BmCATm-2、BmCATm-5和BmCATm-7的突变位点相同，均在第251位丙氨酸突变为丝氨酸；BmCATm-4在第102位蛋氨酸突变亮氨酸；BmCATm-6和BmCATm-8均在第第200位缬氨酸突变为苯丙氨酸。由此得到4个过氧化氢酶突变体，分别为：BmCATmI67F、BmCATmM102L、BmCATmV200F、BmCATmA251S，其中第200位缬氨酸突变为苯丙氨酸对过氧化氢酶活性影响最大，其次为第102位蛋氨酸突变为亮氨酸，第251位丙氨酸突变为丝氨酸，第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸。

实施例4过氧化氢酶多位点突变体的融合和工程菌构建

由于过氧化氢酶突变体BmCATm-8即BmCATmV200F催化过氧化氢的活性最高，因此在BmCATm-8即BmCATmV200F基础上构建多位点突变。

过氧化氢酶多位点定点突变通过诺维赞公司单点突变试剂盒(诺维赞，C214)完成，引物设计如表1。

表1过氧化氢酶定点突变引物

以载体pET28a-BmCATmV200F为模板，以表1中102F和102R为引物，经定点突变，将过氧化氢酶突变体BmCATmV200F氨基酸序列第102位蛋氨酸突变为亮氨酸，获得pET28a-BmCATmV200F-M102L。

以载体pET28a-BmCATmV200F为模板，以表1中251F和251R为引物，经定点突变，将过氧化氢酶突变体BmCATmV200F氨基酸序列第251位丙氨酸突变为丝氨酸，获得pET28a-BmCATmV200F-A251S。

以载体pET28a-BmCATmV200F为模板，以表1中67F和67R为引物，经定点突变，将过氧化氢酶突变体BmCATmV200F氨基酸序列第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，获得pET28a-BmCATmV200F-I67F。

以载体pET28a-BmCATmV200F-M102L为模板，以表1中251F和251R为引物，经定点突变，将过氧化氢酶突变体pET28a-BmCATmV200F-M102L氨基酸序列第251位丙氨酸突变为丝氨酸，获得pET28a-BmCATmV200F-M102L-A251S。

以载体pET28a-BmCATmV200F-M102L为模板，以表1中67F和67R为引物，经定点突变，将过氧化氢酶突变体pET28a-BmCATmV200F-M102L氨基酸序列第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，获得pET28a-BmCATmV200F-M102L-I67F。

以载体pET28a-BmCATmV200F-M102L-A251S为模板，以表1中67F和67R为引物，经定点突变，将过氧化氢酶突变体pET28a-BmCATmV200F-M102L-A251S氨基酸序列第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，获得pET28a-BmCATmV200F-M102L-A251S-I67F。

突变PCR体系(50μL)为：25μL 2×Max buffer，1μL dNTP(10mM each)，模板质粒终浓度为1ng/μL，2μL正向引物，2μL反向引物，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，最后用ddH₂O补齐50μL。

PCR反应程序：95℃预变性30sec；30个循环，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸6min；最后72℃总延伸5min。

扩增片段直接加入1μL Dpn I，37℃消化1h后进行琼脂糖凝胶电泳。片段回收后进行重组反应。反应体系为：50-400ng上述Dpn I消化产物，4μL 5×CE IIBuffer，2μL ExaseII，用ddH₂O补齐20μL。混匀后37℃，融合30min，立即置于冰上冷却10min，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态。涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养箱中倒置培养14-16h。获得含有多位点突变的重组菌。

经测序验证正确的重组菌保存，并用于继续检测催化过氧化氢的活性。

实施例5原始过氧化氢酶及其突变体动力学参数测定

1.目的蛋白的纯化

将实施例4中获得的优势过氧化氢酶突变体和初始型过氧化氢酶菌株BmCAT，根据实施例3步骤1获得湿菌体，分别用50mM pH 8.0的磷酸缓冲液洗涤两遍，然后重悬在含有0.3M NaCl、30mM咪唑的50mM pH 8.0的磷酸缓冲液，超声波破碎10min，4℃，12,000rpm离心10min，取上清。使用His标签纯化色谱柱(Roche，COHISC-RO，6781535001)纯化蛋白。

收集的过氧化氢酶突变体pET28a-BmCATmV200F、pET28a-BmCATmV200F-M102L、pET28a-BmCATmV200F-A251S、pET28a-BmCATmV200F-I67F、pET28a-BmCATmV200F-M102L-A251S、pET28a-BmCATmV200F-M102L-I67F、pET28a-BmCATmV200F-M102L-A251S-I67F，以及初始型过氧化氢酶菌株BmCAT的纯酶液用生工生物的改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(生工生物，C503041)测定浓度，具体方法可以参照生工生物网站，并用50mM pH8.0的磷酸缓冲液将所有蛋白稀释为相同浓度。

2.分析过氧化氢酶及其优势突变体的动力学参数

以过氧化氢为底物，浓度设置为2-20mM(2、4、8、16、20mM)，加入终浓度为0.2mMMnSO₄，以50mM pH 8.0磷酸缓冲液为反应液，分别加入一定量上述1中纯化的过氧化氢酶突变体和初始型过氧化氢酶菌株BmCAT。反应体系为500μL，反应液混匀后37℃，200rpm反应10min取样，取反应液立即测定其中过氧化氢的含量。

具体的，过氧化氢含量检测采用过氧化氢(H₂O₂)含量检测试剂盒(生工生物，D799774-0100)，具体方法可参照生工生物网站。用96孔板进行测定。过氧化氢含量按照以下公式计算：

H₂O₂含量(μmol/mg prot)＝2×ΔA测定÷ΔA标准÷C_pr

其中，ΔA测定为测定的过氧化氢酶突变体吸光值的变化值，ΔA标准为标准溶液吸光值的变化值，C_pr为蛋白质浓度。

根据过氧化氢酶催化反应机制，利用双倒数作图法计算野生型过氧化氢酶及其突变体酶的Km值，结果显示如表2所示。突变体BmCATmV200F-M102L-A251S对过氧化氢的催化效率Kcat/Km达到1515.65mM/s，较原始菌株提高11.6倍，其余突变体菌株对过氧化氢的催化效率较原始菌株也有很大的提高。

表2过氧化氢酶及其突变体的动力学参数比较

实施例5过氧化氢酶突变体发酵与应用

1.挑取含有BmCATmV200F-M102L-A251S、BmCATmV200F-A251S、BmCATmV200F-M102L-I67F和BmCATmV200F-M102L-A251S-I67F重组质粒的菌株，接种至3mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜，按照1％(V/V)的体积比接种至150mL TB培养基中，30℃，180rpm培养至OD600为0.4-0.6时，加入0.2mM IPTG，继续诱导培养6小时，然后10,000rpm离心10min收集菌体，放置-80℃冰箱保存。

2.按照实施例3步骤1中的方法，对初始型过氧化氢酶BmCAT菌株进行摇瓶发酵，收集菌体，放置-80℃冰箱保存。

3.分别将上述步骤1、2中所得的湿菌体按照10g/L的终浓度加入1L的发酵体系中，底物L-乳酸约为1.0M(购自生工生物，A604046)，EDTA二钠含量为10mM，L-乳酸氧化酶100U/L(Sigma，L9795)。

具体地，将反应催化剂和底物加入至2L发酵罐，反应体系为1L，通无菌空气3vvm，搅拌转速500r/min，用氢氧化钠控制pH在7.5，温度控制在37℃，待溶氧DO值升至100％，转化完毕。6000rpm离心收集上清，用HPLC检测乳酸和丙酮酸的含量。

结果如表3所示，所有突变体所在体系其产物丙酮酸的摩尔转化率都高于90％，最高达到的99.7％，从突变体的Km值与野生型比较可以得知，过氧化氢酶突变体中氨基酸的替换明显增加了酶与底物的亲和力，保护了乳酸氧化酶免受过氧化氢的抑制，同时也防止了产物丙酮酸被过氧化物分解，相较于初始型过氧化氢酶，其丙酮酸的摩尔转化率得到很大提高，因此在实际生产中，具有非常高的应用前景。

表3不同过氧化氢酶突变体在反应体系中的转化效率比较

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 过氧化氢酶突变体及其应用

<130> 2022

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> Bacillus mojavensis

<400> 1

Met Phe Lys His Thr Lys Met Leu Gln His Pro Ala Lys Pro Asp Arg

1 5 10 15

Pro Asp Pro Leu Phe Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Leu Gly Gly Gln

20 25 30

Phe Gly Glu Ile Ser Val Ala Met Gln Tyr Leu Phe Gln Gly Trp Asn

35 40 45

Thr Arg Gly Asn Glu Lys Tyr Lys Asp Leu Leu Met Asp Thr Ala Thr

50 55 60

Glu Glu Ile Gly His Val Glu Met Ile Ala Thr Met Ile Ala Arg Leu

65 70 75 80

Leu Glu Asp Ala Pro Leu Asp Glu Gln Glu Lys Ala Ala Asp Asp Pro

85 90 95

Val Ile Gly Ser Ile Met Gly Gly Met Asn Pro His His Ala Ile Val

100 105 110

Ser Gly Leu Gly Ala Met Pro Glu Ser Ser Thr Gly Val Pro Trp Ser

115 120 125

Gly Gly Tyr Ile Val Ala Ser Gly Asn Leu Leu Ala Asp Phe Arg Ala

130 135 140

Asn Leu Asn Ala Glu Ser Gln Gly Arg Leu Gln Val Ala Arg Leu Phe

145 150 155 160

Glu Met Thr Asp Asp Lys Gly Val Lys Asp Met Leu Ser Phe Leu Leu

165 170 175

Ala Arg Asp Thr Met His Gln Asn Gln Trp Leu Ala Ala Ile Lys Glu

180 185 190

Leu Glu Ala Gln Glu Gly Pro Val Val Pro Gly Thr Phe Pro Lys Ala

195 200 205

Leu Glu Lys Gln Glu Phe Ser His Gln Leu Ile Asn Phe Ser Glu Gly

210 215 220

Glu Glu Ser Ala Glu Gln Asn Trp Leu Lys Glu Lys Ala Pro Asp Gly

225 230 235 240

Glu Ala Phe Glu Tyr Val Ser Glu Ala Lys Ala Phe Gly Glu Lys Pro

245 250 255

Glu Leu Lys Pro Ala Pro Pro Phe Val His Asn Thr Leu Pro Gly Arg

260 265 270

Glu

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> Bacillus mojavensis

<400> 2

atgtttaaac atacgaaaat gctgcagcat cctgctaagc cagatcgtcc agatccatta 60

ttcgctaaaa aaatgcaaga aattttaggc gggcaattcg gagaaatttc tgttgccatg 120

cagtacttat ttcaaggctg gaatacaaga ggaaatgaaa aatacaagga tttgctgatg 180

gatacggcaa ctgaagaaat tgggcacgtt gaaatgatcg ctaccatgat cgccagactt 240

cttgaggatg ccccgcttga tgaacaggaa aaagcggctg atgatccagt catcggttcc 300

atcatgggag gcatgaatcc tcaccatgcc attgtatcag gactaggcgc catgccagaa 360

agcagtacag gcgtaccatg gagcggaggc tacatcgtag cgagcggaaa cctgctggca 420

gacttccgcg ccaatctgaa tgcggaatca caaggccgtc tacaggttgc acgcctgttt 480

gaaatgacgg atgacaaagg cgtcaaggac atgctcagct tcctgctggc gcgtgacaca 540

atgcaccaaa accaatggct ggccgccatt aaagaattag aagcacagga aggtccggtt 600

gtgccgggta cattcccgaa agcgcttgag aaacaggaat tctctcatca gcttatcaat 660

ttctctgaag gtgaagaaag cgccgagcaa aactggctga aggagaaagc cccggacgga 720

gaagcgtttg aatatgtgag cgaagcaaaa gcttttggag aaaagccgga attgaagcca 780

gctcctcctt ttgttcataa tacgcttcct gggcgtgagt aa 822

<210> 3

<211> 273

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

Met Phe Lys His Thr Lys Met Leu Gln His Pro Ala Lys Pro Asp Arg

1 5 10 15

Pro Asp Pro Leu Phe Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Leu Gly Gly Gln

20 25 30

Phe Gly Glu Ile Ser Val Ala Met Gln Tyr Leu Phe Gln Gly Trp Asn

35 40 45

Thr Arg Gly Asn Glu Lys Tyr Lys Asp Leu Leu Met Asp Thr Ala Thr

50 55 60

Glu Glu Leu Gly His Val Glu Met Ile Ala Thr Met Ile Ala Arg Leu

65 70 75 80

Leu Glu Asp Ala Pro Leu Asp Gln Gln Glu Lys Ala Ala Glu Asp Pro

85 90 95

Val Ile Gly Ser Ile Leu Gly Gly Met Asn Pro His His Ala Ile Val

100 105 110

Ser Gly Leu Gly Ala Met Pro Glu Ser Ser Thr Gly Val Pro Trp Ser

115 120 125

Gly Gly Tyr Ile Val Ala Ser Gly Asn Leu Leu Ala Asp Phe Arg Ala

130 135 140

Asn Leu Asn Ala Glu Ser Gln Gly Arg Leu Gln Val Ala Arg Leu Phe

145 150 155 160

Glu Met Thr Asp Asp Lys Gly Val Lys Asp Met Leu Ser Phe Leu Leu

165 170 175

Ala Arg Asp Thr Met His Gln Asn Gln Trp Leu Ala Ala Ile Lys Glu

180 185 190

Leu Glu Ala Gln Glu Gly Pro Val Val Pro Gly Thr Phe Pro Lys Ala

195 200 205

Leu Glu Lys Gln Glu Phe Ser His Gln Leu Ile Asn Phe Ser Glu Gly

210 215 220

Glu Glu Ser Ala Lys Gln Asn Trp Leu Asn Glu Lys Ala Pro Asp Gly

225 230 235 240

Glu Ala Phe Glu Tyr Val Lys Glu Ala Lys Thr Phe Gly Glu Lys Pro

245 250 255

Glu Leu Lys Pro Ala Pro Pro Cys Val His Asn Thr Leu Pro Gly Arg

260 265 270

Glu

<210> 4

<211> 822

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 4

atgtttaagc acacaaaaat gctgcagcat cctgctaaac cagatcgtcc agatccatta 60

ttcgctaaaa aaatgcaaga aattttaggc gggcaattcg gagaaatttc agttgccatg 120

cagtacttat ttcaaggctg gaacacaaga ggaaatgaaa aatacaagga cttgctgatg 180

gatacggcaa ctgaggaact cgggcatgtt gaaatgatcg caacgatgat tgccagactt 240

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atcctgggcg gcatgaaccc tcaccatgcg attgtatcag gacttggcgc catgccggaa 360

agcagtacag gcgtaccttg gagcggcggt tatatcgtag caagcggaaa cctgctggca 420

gacttccgcg ccaacctgaa tgcggaatct cagggccgtc tgcaggtcgc acgcctgttt 480

gaaatgacgg atgacaaagg cgtcaaagat atgctcagct tcctgctggc gcgtgacaca 540

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gtgccgggta cattcccgaa agcgctcgaa aaacaagagt tctcacatca gcttatcaat 660

ttctctgaag gcgaagaaag cgccaagcaa aactggctga atgaaaaagc gccggacgga 720

gaagcctttg aatatgtgaa agaagcaaaa acgtttggag aaaaaccgga gttaaaacca 780

gcaccgcctt gtgttcataa tacacttccg ggacgcgagt aa 822

Claims

1.过氧化氢酶突变体，其特征在于，所述突变体至少在初始型过氧化氢酶氨基酸序列的下列位置之一发生了突变：第67位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第102位蛋氨酸突变为亮氨酸、第200位缬氨酸突变为苯丙氨酸、第251位丙氨酸突变为丝氨酸，所述初始型过氧化氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述过氧化氢酶突变体的基因，其特征在于，所述突变体的基因至少在初始型过氧化氢酶的基因序列的下列位置之一发生了突变：第199位的碱基A突变为T、第304位的碱基A突变为C、第598位的碱基G突变为T、第751位的碱基G突变为T，所述初始型过氧化氢酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求2所述基因的重组质粒、表达载体。

4.包含权利要求3所述重组质粒的重组细胞。

5.一种微生物，其通过转化权利要求3所述重组质粒得到。

6.根据权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述微生物是谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、芽孢杆菌、大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌BL21。

8.权利要求1所述的过氧化氢酶突变体或者权利要求5-7任一项所述的微生物在生产丙酮酸中的应用。

9.一种丙酮酸生产方法，其特征在于，所述方法包括以L-乳酸为底物，利用L-乳酸氧化酶催化L-乳酸合成丙酮酸，用权利要求1所述的过氧化氢酶突变体清除反应过程中产生的过氧化氢。

10.根据权利要求9所述的丙酮酸生产方法，其特征在于，反应温度为25-37℃，pH为7.0-8.0。