CN113846024A

CN113846024A - 一种降低l-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的方法、菌种及应用

Info

Publication number: CN113846024A
Application number: CN202111445683.8A
Authority: CN
Inventors: 刘浩; 徐晴
Original assignee: Nanjing Haohe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Haohe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2041-12-01
Also published as: US20230167471A1; CN113846024B; US11732279B2

Abstract

本发明公开了一株降低L‑苹果酸发酵过程中副产物富马酸的黑曲霉（Aspergillus niger）工程菌株，所述黑曲霉工程菌株为敲除了延胡索酸水合酶基因fum的黑曲霉工程菌株。本发明克服了现有技术中的不足，现有的利用黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中，副产物富马酸会伴随着苹果酸的产生而积累，造成后续苹果酸纯化工艺成本的提高，本发明提供了一株fum基因敲除的黑曲霉工程菌株，和一种大大减少黑曲霉发酵过程中副产物富马酸的方法。本发明显著地减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物富马酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

Description

一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的方法、菌种及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的方法、菌株及应用。

背景技术

L-苹果酸作为一种重要的有机酸，普遍存在于植物、动物和微生物中，是生物体内三羧酸循环的重要中间代谢产物，被普遍应用于食品、医药及化工等领域。在食品行业，苹果酸因其具有苹果的天然香味，广泛地用作食品酸味调节剂和柠檬酸共同使用，此外还被用于食品保鲜以及配合其它防腐剂共同使用等；在医药行业，因其能够直接参人体代谢，常常被用于治疗肝功能异常和高血氨，还常用于氨基酸类注射药物中帮助氨基酸的利用等；在化工行业，常被用于金属清洗、印染工业、非电解镀层以及油漆等。苹果酸最初是从苹果等水果中提取而来，此方法受到含量及原材料等的限制无法满足大规模市场的需求。

目前苹果酸工业化生产途径主要是化学合成法和生物催化法。化学合成法是以石油基化学品苯为原料，在高温高压条件下得到外消旋DL-苹果酸，而早在1970年美国FDA就禁止在婴幼儿食品中添加DL-苹果酸，此外化学合成法对设备要求高且设备折旧快，限制了其在食品及医药领域的应用。另外，此法的原料来源为石油基化学品，对日益减少的石油能源和环境问题也是极大的挑战。生物催化法主要是固定化酶或者固定化细胞转化法，固定化酶法因其提取分离纯化和固定酶的成本较高，对收益产生了一定的限制；而固定化细胞转化法的不足之处在于活细胞本身含有复杂的酶系，容易形成诸多副产物的形成，致使产品的下游提纯纯化成本增加。综上，使得化学合成法和生物催化法制备的苹果酸难以满足苹果酸市场日益增长的需求。

相比于以上两种方法，微生物发酵法以其环境友好、可利用再生碳源等优点日益受到重视，但是目前此法面临的问题是安全菌株可选择性少，产物转化率或生产效率普遍偏低，杂酸副产物多且含量高，严重限制了发酵法生产L-苹果酸的工业化进程。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的方法、菌种及应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一株降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的黑曲霉（Aspergillus niger）工程菌株，所述黑曲霉工程菌株为敲除了延胡索酸水合酶基因fum的黑曲霉工程菌株。

进一步地，所述延胡索酸水合酶基因fum的基因序列为SEQ NO.1，氨基酸序列为SEQ NO.2。

进一步地，所述延胡索酸水合酶基因fum为NCBI-locus_tag为ANI_1_952104。

如上所述的降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的黑曲霉工程菌株的构建方法，步骤如下：

（1）构建延胡索酸水合酶基因fum敲除载体

以野生型黑曲霉ATCC1015基因组为模板，通过PCR反应分别扩增基因fum的上游和下游序列片段，回收PCR产物分别获得目的片段；将基因fum的上下游序列片段克隆到载体pLH594上，构建延胡索酸水合酶基因fum敲除载体pLH804；

其中，所述fum基因上游序列为SEQ NO.3，所述fum基因下游序列为SEQ NO.4；

（2）黑曲霉延胡索酸水合酶基因fum敲除菌株的获得

将载体pLH804化转至黑曲霉苹果酸高产菌株S1149中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组，获得黑曲霉延胡索酸水合酶基因fum敲除菌株M1。

利用如上所述的黑曲霉工程菌株发酵L-苹果酸的方法，步骤如下：

将黑曲霉基因工程菌株接种在PDA培养基上，于28℃培养5天，至产生分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50 ml，在28℃恒温200 rpm培养5天，即得L-苹果酸。

进一步地，所述发酵培养基的成分及配制方法为：

葡萄糖 100g/L，细菌蛋白胨 6 g/L，无水磷酸二氢钾 0.15 g/L，无水磷酸氢二钾0.15 g/L，二水氯化钙 0.1 g/L，七水硫酸镁 0.1 g/L，氯化钠 0.005 g/L，七水硫酸亚铁0.005 g/L，无水柠檬酸 0.001 g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20 min。

进一步地，所述方法得到的L-苹果酸产量为93.56 ~ 98.16 g/L，相比出发菌株提高了1.97%，富马酸含量为0.07 ~ 0.14 g/L，相比于出发菌株降低了93.9%。

如上所述的黑曲霉基因工程菌株在L-苹果酸生产方面中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明克服了现有技术中的不足，现有的利用黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中，副产物富马酸会伴随着苹果酸的生成而积累，造成后续苹果酸纯化工艺成本的提高，本发明提供了一种fum基因敲除的黑曲霉菌株及大大减少黑曲霉发酵过程中副产物富马酸的方法。本发明大大减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物富马酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

2、本发明黑曲霉菌株能够应用在L-苹果酸生产方面中，该菌株于摇瓶条件下发酵5天，L-苹果酸产量为93.56 ~ 98.16 g/L，相比出发菌株提高了1.97%，富马酸含量为0.07~ 0.14 g/L，相比于出发菌株降低了93.9%。为微生物发酵法制备苹果酸提供了优良的菌株。

3、本发明所用的出发菌株是黑曲霉苹果酸高产菌株S1149。所述黑曲霉菌株是在S1149的基础上敲除了延胡索酸水合酶基因fum的黑曲霉菌株。

附图说明

图1为本发明中构建的用于敲除fum基因连接同源左臂的载体pLH803图谱；

图2为本发明中对敲除载体pLH803的双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，S为Sac I和Xba I双酶切验证载体；

图3为本发明中构建的用于敲除fum基因连接同源左右臂的载体pLH804图谱；

图4为本发明中对敲除载体pLH804的双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，S为Hind III酶切验证载体；

图5为本发明中fum基因的蛋白功能域；

图6为本发明中fum基因敲除左同源臂PCR验证图，引物P1和P2验证左同源臂，引物P1和P641验证左同源臂-php，其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-4为成功敲除fum基因的黑曲霉转化子基因组；

图7为本发明中fum基因敲除右同源臂PCR验证图，引物P3和P4验证右同源臂，引物P642和P4验证右同源臂-php，其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-4为成功敲除fum基因的黑曲霉转化子基因组；

图8为本发明中构建的工程菌株于摇瓶发酵中的有机酸产量图；其中，S489为出发菌株在第5天的有机酸产量，M1为fum基因敲除菌株在第5天的有机酸产量。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

较优地，所述延胡索酸水合酶基因fum的基因序列为SEQ NO.1，氨基酸序列为SEQNO.2。

较优地，所述延胡索酸水合酶基因fum为NCBI-locus_tag为ANI_1_952104。

（1）构建延胡索酸水合酶基因fum敲除载体

（2）黑曲霉延胡索酸水合酶基因fum敲除菌株的获得

将黑曲霉基因工程菌株M1接种在PDA培养基上，于28℃培养5天，至产生足够的分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于摇瓶发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50ml，在28℃恒温摇床中200 rpm培养5天，即得L-苹果酸。

较优地，所述发酵培养基的成分及配制方法为：

较优地，所述方法得到的L-苹果酸产量为93.56 ~ 98.16 g/L，相比出发菌株提高了1.97%，富马酸含量为0.07 ~ 0.14 g/L，相比于出发菌株降低了93.9%。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1：黑曲霉fum基因敲除菌株的构建

本实施例包括以下步骤：

（1）fum基因敲除载体的构建

为扩增fum基因上游序列片段，以黑曲霉基因组为模板设计扩增引物fum-F-F和Fum-F-R，通过PCR扩增回收得到fum基因上游序列片段，经EcoR I和Sac I双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH594借助One-Step Clone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E. coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100 µg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证（图2），获得成功连接fum基因上游序列片段的载体pLH803，其图谱如图1所示。

为扩增fum基因下游序列片段，以黑曲霉基因组为模板设计扩增引物fum-R-F和fum-R-R，通过PCR扩增回收得到fum基因下游序列片段，经Xba I和Spe I双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH803借助One-Step Clone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E. coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100 µg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证（图4），获得成功连接fum基因下游序列片段的载体pLH804，其图谱如图3所示。

fum基因的蛋白功能域如图5所示。

所述扩增引物序列见表1：

所述fum基因序列为SEQ NO.1，长度为2384 bp；氨基酸序列为SEQ NO.2，氨基酸个数为547个；蛋白功能域见图5。

所述fum基因上游序列为SEQ NO.3，长度为1443 bp。

所述fum基因下游序列为SEQ NO.4，长度为1379 bp。

所述含有卡那霉素抗性的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸出物5g/L、氯化钠10 g/L、琼脂粉15 g/L。121℃灭菌20 min。灭菌冷却至50℃左右时添加卡那霉素至终浓度为100 µg/mL。

（2）黑曲霉fum基因敲除菌株的获得

将载体pLH804电转至农杆菌，之后将含有相应载体的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S489在IM培养基上共培养进行农杆菌介导转化，培养2.5天后将培养产物均匀的涂布在CM培养基中进行培养直至长出转化子，对转化子进行筛选，转化子表型为潮霉素抗性不敏感、草铵膦抗性敏感，对此类转化子提基因组验证，设计验证引物（表1），扩增结果满足左右同源臂扩增呈阴性（图6）、左右同源臂-php扩增呈阳性（图7），挑取其中一个正确的fum基因敲除克隆进行抗性标记潮霉素的诱导重组从而获得不具有潮霉素抗性的fum基因敲除菌株M1。

所述基因敲除的转化方法为农杆菌介导法。

所述农杆菌介导法的电转条件为：Capacitnce: 25 uF, Voltage: 2.5 kV,Resistance: 200 Ω, Pulse: 5 msec。

所述所用农杆菌菌株为AGL-1菌株。

所述IM培养基配制方法为：15 g琼脂加水定容至905.7 mL，121℃灭菌20 min，加入提前准备的无菌K buffer 0.8 mL、MN buffer 20 mL、1% CaCl₂·2H₂O 1 mL、0.01%FeSO₄ 10 mL、IM Trace elements 5 mL、20% NH₄NO₃ 2.5 mL、50%甘油 10 mL、1M MES 40mL、20%葡萄糖 5 mL，待温度冷却至50℃左右时加入卡那霉素并使其终浓度为100 µg/mL、加入乙酰丁香酮并使其终浓度为200 µM。

所述CM培养基配制方法为：20 g琼脂加水定容到897 mL，121℃灭菌20 min，加入提前准备的无菌ASP+N 20 mL、50%葡萄糖20 mL、1M MgSO₄ 2 mL、CM Trace elements 1mL、10%酪蛋白水解物10 mL、10%酵母浸出物50 mL，待温度冷却至50℃左右时加入潮霉素并使其终浓度为250 µg/mL、加入链霉素并使其终浓度为100 µg/mL、加入头孢噻污纳并使其终浓度为100 µg/mL、加入氨苄青霉素并使其终浓度为100 µg/mL。

所述验证引物序列见表1。

所述抗性标记诱导重组方法为：将大约400个fum基因敲除克隆的孢子均匀的涂布到含有30 µg/mL四环素的MM培养基上，28℃培养至长出单克隆，随机挑选100个单克隆转接到PDA培养基上28℃培养24 h，随后将克隆一一对应地转接到含有潮霉素的PDA培养基上28℃培养24 h，最后进行表型观察筛选抗性标记诱导重组的转化子，即在PDA培养基上正常生长在含有潮霉素的PDA培养基上不能生长的为成功诱导重组的转化子。

实施例2：工程菌株发酵生产L-苹果酸的应用

利用本发明构建的黑曲霉fum基因敲除工程菌株M1于摇瓶中发酵生产苹果酸的方法，其具体步骤如下：

首先，将获得的工程菌株M1接种在PDA培养基上并置于28℃培养箱中倒置培养5天至产生足够的分生孢子；

所述PDA培养基的制备方法：准确称取去皮马铃薯200 g，切成约1 cm³的小块，加蒸馏水不间断搅拌煮沸30 min，用双层纱布过滤收集滤液，加入20 g葡萄糖搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至1 L并分装于广口瓶中，121℃高压灭菌20 min。固体培养基加入1.5%琼脂。

然后，收集菌株M1的分生孢子并接种于苹果酸发酵培养基中，其中孢子的浓度为1*10⁸个/50 mL，将摇瓶放置于28℃、200 rpm条件下培养5天。

所述苹果酸发酵培养基的组成为：葡萄糖 100g/L，细菌蛋白胨 6 g/L，无水磷酸二氢钾 0.15 g/L，无水磷酸氢二钾 0.15 g/L，氯化钙二水 0.1 g/L，硫酸镁七水 0.1 g/L，氯化钠 0.005 g/L，硫酸亚铁七水 0.005 g/L，无水柠檬酸 0.001 g/L。115℃高压灭菌20 min。

最后，收集发酵产物，制备检测样品，样品经HPLC测定其中主要有机酸的含量。结果显示，主要有机酸为苹果酸，副产物富马酸含量大大减少，结果见图8。

所述检测样品制备方法：吸取振荡均匀的发酵液2 mL，加入等体积的2 M HCl，充分反应，离心取上清液，稀释50倍，经0.22 µm滤膜过滤后存放于液相小瓶中待HPLC分析。

所述HPLC检测有机酸的方法为：安捷伦高效液相色谱仪UV检测器，AminexHPX-87H色谱柱（300mm*7.8mm），5 mM H₂SO₄流动相，0.6 mL/min流速，65℃色谱柱温，210 nm检测波长，20 µL进样体积。

本发明的研究成果大大减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物富马酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

本发明中使用到的序列如下：

SEQ NO.1：

ttgccgtcccccaggttttgggtagaattggaatatcattagatctgtcgtcttatattgtttattttagagagataaagtacgaccaatcccttgcacacatcctcgacaggatgtgaattgtttcccaaaaaatggcaccattggttagccagccacacacagtgactaacgcgcgtgatgatgaatagatccagaagccggtcgtcatgttgacatctgcccacacttcccgagccgcggtgcgctcgatggcctccttgacacatgctgcatctcgagcttcggcttcccccgcagttgcccgcactgccgtcgctttcacccccgcctcgttcagttgccgtcgtcttctgagctccaatagccgacctgttcaacacttcccccgtcttcagaccttgacttccacctccagcaagagagcctttggcaccaccgtcaagatggtatgctctatcctttccattgaatcgcatctatcatatggatgacttcgctatggggaaagagccccaactgcgagacgttgctaatcggttattgttttagtcttcggctacccgcattgagaccgatgccttcggtgagatcgaggtatgtgctacactgatgcacacgatgcgtatagaatgcgaatgctgactgcttttcttttctaggtccccgccgacaagtactggggtgcccagacccagcggtaagaccccgatttcaacaatcgctgccacactgcaaactggctatgcgaccgatacacgaagtgagcagatgctgactggcgcgacaatagctccctgggcaacttcgacatcaaccagccccaggaccgcatgcctgagcccgttgtcaaggctttcggtatcctcaagggtgctgctgctgaagtgaacatgaagttcggccttggtaagccgctatcgattaaagcagcacagctccggcgaagttaacaccaggaaattagaccccaagatcggcgaggccatcaagcaggctgccgccgaggttgcggagggcaagctgatggaccacttccccctcgtcgtctggcagaccggttccggtacccagtccaacatgaactcgaacgaggtcatctccaaccgcgccattgagatcctgggcggcgagaagggctccaagaagcccgtccaccccaacgaccacgtcaacatgtccgcctcctccaatgactccttcccgaccgctatgcacattgctgccgttgtggagctggagaacaccctcctgccttccctgaggagcctgcgcgatgctctccaggtcaaggttgagaagttcgacaagatcatcaagatcggtcgtactcacctgcaggacgccacccctctcaccctcggtcaggagttctccggctacgtcgctcagctcgaccgcaacattgagcgtgtcgagactagcatcccccacctccgctacctggctcagggtggtaccgccgtcggtactggtctgaacaccttcaagggcttcgacgaggctatcgctgctgaggtcaccaagttgaccggcaccgagttcaagactgcccccaacaagttcgaggttctggccgcccacgactcgattgtcgaggcttccggtgccctgaacaccctggcctgctctctgttcaagattgcccaggacatccgttaccttggatccggtccccgctgcggtcttggtgaactggtcctccccgagaacgagcctggctcttccatcatgcccggcaaggttaaccccactcagtgcgagtcccttaccatggtctgctcccaggtcatgggtaaccacgtcgctgccactgtcggcggcatgaacggtcagttcgagctcaacgtgttcaagcccctcatgatccgcaacctgctgcacagcgtgcgcatcctggccgatggcatggccagcttcgagaagaacctggtgcacggtctggaggccaacgagccccgcatcaactctctcctccacgagaggtatgtatttccctaaaaaatcggacctttgtaaagaagacaactaacggtggtgtagtctgatgttggtcacctgcctgaaccccgtcattggctacgacatggcctccaaggtcgccaagaacgcccacaagaagggcctcactctgaagcagagtgctatggagctgaaggctctgagcgaggaggactttgacaagtacgtccgcccggagctgatgctgagccccaaggagaagaaataaatgtatagcgggacgagagatgttttggcttagcttggaggagtcatctagcgaagactagcttttgcctaggagatatttgtatactcaggaatactactgtactattcttcttgttcagcttattgcttggatagagttcttcgctgtacgg

SEQ NO.2：

MetLeuThrSerAlaHisThrSerArgAlaAlaValArgSerMetAlaSerLeuThrHisAlaAlaSerArgAlaSerAlaSerProAlaValAlaArgThrAlaValAlaPheThrProAlaSerPheSerCysArgArgLeuLeuSerSerAsnSerArgProValGlnHisPheProArgLeuGlnThrLeuThrSerThrSerSerLysArgAlaPheGlyThrThrValLysMetSerSerAlaThrArgIleGluThrAspAlaPheGlyGluIleGluValProAlaAspLysTyrTrpGlyAlaGlnThrGlnArgSerLeuGlyAsnPheAspIleAsnGlnProGlnAspArgMetProGluProValValLysAlaPheGlyIleLeuLysGlyAlaAlaAlaGluValAsnMetLysPheGlyLeuAspProLysIleGlyGluAlaIleLysGlnAlaAlaAlaGluValAlaGluGlyLysLeuMetAspHisPheProLeuValValTrpGlnThrGlySerGlyThrGlnSerAsnMetAsnSerAsnGluValIleSerAsnArgAlaIleGluIleLeuGlyGlyGluLysGlySerLysLysProValHisProAsnAspHisValAsnMetSerAlaSerSerAsnAspSerPheProThrAlaMetHisIleAlaAlaValValGluLeuGluAsnThrLeuLeuProSerLeuArgSerLeuArgAspAlaLeuGlnValLysValGluLysPheAspLysIleIleLysIleGlyArgThrHisLeuGlnAspAlaThrProLeuThrLeuGlyGlnGluPheSerGlyTyrValAlaGlnLeuAspArgAsnIleGluArgValGluThrSerIleProHisLeuArgTyrLeuAlaGlnGlyGlyThrAlaValGlyThrGlyLeuAsnThrPheLysGlyPheAspGluAlaIleAlaAlaGluValThrLysLeuThrGlyThrGluPheLysThrAlaProAsnLysPheGluValLeuAlaAlaHisAspSerIleValGluAlaSerGlyAlaLeuAsnThrLeuAlaCysSerLeuPheLysIleAlaGlnAspIleArgTyrLeuGlySerGlyProArgCysGlyLeuGlyGluLeuValLeuProGluAsnGluProGlySerSerIleMetProGlyLysValAsnProThrGlnCysGluSerLeuThrMetValCysSerGlnValMetGlyAsnHisValAlaAlaThrValGlyGlyMetAsnGlyGlnPheGluLeuAsnValPheLysProLeuMetIleArgAsnLeuLeuHisSerValArgIleLeuAlaAspGlyMetAlaSerPheGluLysAsnLeuValHisGlyLeuGluAlaAsnGluProArgIleAsnSerLeuLeuHisGluSerLeuMetLeuValThrCysLeuAsnProValIleGlyTyrAspMetAlaSerLysValAlaLysAsnAlaHisLysLysGlyLeuThrLeuLysGlnSerAlaMetGluLeuLysAlaLeuSerGluGluAspPheAspLysTyrValArgProGluLeuMetLeuSerProLysGluLysLys

SEQ NO.3：

CCCAGCCAAGTATGCCATTGCCTACGGCCGTGCTCAAGGTCCTGATGTCTTCCGCATCACGGAGCAGAAATGTCCCGTGCAAGGGGGCGAGATAACCATCCGTATCTTCGAGCCTGCCCCGAAAGCGGATGAGCATGGCAAGGCCAAAAAGAGGGCTGCGTTTGTCAACTTCCATGGGGGAGGCTGGGTGTTCGGCGATCTCTCAGTTGATCACGATTTCTGCAAGACACTCGTCGATGGCCTGGACGGGCACTTGGTCGCGTTTGATGTCGACTACCGGCTAGCTCCTGAGCACAAGTACCCGATCCCCGTTGACGACTGCTGGACCGCTTTCAATTGGGTCAGCTACAACTCCCTGTCTACATCGACCGGTATGGTCAATACTAACTGACATCCCGTGCAGATCCGCTCCCAGAAAGCAGAGGAGTTCAACGTTGACCCGAATCGAATAGCTGTTGGAGGTTGTTCGGCCGGAGGCCACCTGTCAGCCGTGGTCGCTCATCTCTGCCGTAATGGCGGCATTCCGTTGCGCCTGCAGGTGCTGAACGTGCCCGTATGTGATCTACATAGCGGCTACACTCCGGATGGTGAATTCGATCGGGAGAACTGTCCCTATGAGTCCTACAGAGAGATGGAGTTCACCGCAGCTCTTCCGGTAGCACGGATGGCTTATTTCCATCGACACTTTTTGGGGGTTCCCCGGCCAGCACGTTCAGAAGAGGTAAGTAGTACCGTAATTGCTGCAGCCGGAGCTGCACACAACTGCAAGATGCTGATGTGATCCATAGGACTGGAAGATCTCCCCCATATTTGCGCCTGACTTTTCTGGACTAGCACCTGCGTTGGTCTTCACCGCCGAAATGGATCCTCTGCGGGACGAAGGGGAGGCCTACGCTGCCAAATTGAAAGCTGGCGGTTGTCGAGTGGAAATGATGCGTATGGCAGGAGCACCCCACACATTTGCCATGTTGGATGGCATCTTAGAGAGCGGCCGTATATATACCGAGAAGGTCATCGAAGCGATGAAACGGGAACTAACAGGGTAAATAATCAATTGGTTCGGTTGAAGGGATATCGAAGATGGAGAGCAGTGTTAGTGCAGAGCGACTAGAAGATGGAAATGCGGAGAGACAGCAGGATCATGGTTTATCCGACGAGAATCTTTACCGTATGATACCATTTAGGCCGGGCAGCGAAGGTGTGGCAGACGGGTAACCGGCGTCCTGAACATTACCGGGCCGGGAGATTTCGGCAGGCGGTATCGGAAACAGTTGGGGTGGATTAAATATGCGCGGCTGCTGCTGCTCTTCTTCTTCCCTTCTTTTCTGCGTGGTTTGTTTGCCGTCCCCCAGGTTTTGGGTAGAATTGGAATATCATTAGATCTGTCGTCTTATATTGTTTATTTTAGAGAGATAAAGTACGACCAATCCCTTGCACACATCC

SEQ NO.4：

GCTTGGAGGAGTCATCTAGCGAAGACTAGCTTTTGCCTAGGAGATATTTGTATACTCAGGAATACTACTGTACTATTCTTCTTGTTCAGCTTATTGCTTGGATAGAGTTCTTCGCTGTACGGAGTATAGAATTTTCTCGGGCTGATGACGGGGCTGACCCCGGGGTGTGCTATTTTTGGACCACCAAAGCGGTCCCGCCCACCGATCGAATAGTTCAAGATGCACGGATAGCAACGACTGACGGTGTGTTGCTGAGGGCCAGTCAAGTGGTGTTAAATTTAGGCATACTAACTAGTAACGTTGCTGCGCCAGTCAGGCTTGGAGGGTGATCGGCTTGACCAGTGCCAGTCGGAAAGAACCGTATGTAGTGGTAAGTAGTAAGTAGTCAGGGGCGGATTTCCAAAGTGTTTGGTGTTTCAGGCAAACCGTGGGCCCTTCTCTTACTGCTTGTTTATTACCTCCGCCTGGCCCTTTCTTTTCCATCACCGACTGACCGACTGACTCGATTGACCTGTCCTTTTTTTCCCTTCATCCCTTTCCCCCTCAAATACTCACCTTCGTTGGAAATACTCTGTCTTTCGTTCAAACACTCACTATCACTGAAGAAATCCTTCATTCCAGCGTTTCAATAATTCCCATCCGTTTTCACCACTCAATTGAACCCCGCCACTAACCAGGGGCCCTTCCTCCCTTAACTAAACTACCAAACAACCTCTTCACGAAACTCCTCAAAGCCTTTTTCTCCTCTCCAGCAAAAAGTTCAAGACGGACAAAAAACATACCACCGCCAACATGACCAACGCCTCCACCCTCACCCAACCCCCCGCCGAATCCAAGGACGACGCCCCCCTCTTCCCTACGACCCTCATCTCCCCCTCCGTCGCCGCCGAACTGCCCGAAGGCTACAAGATCCGTCCCGTCCGTCGCTCCGACTACAGCCGCGGCTACCTGGACGTGTTGCGCGTGCTGACGACCGTCGGCACCATCACCGAGGAGCAGTGGAACAAGCGCTACGACTGGATCTCGTCGCGCAATGACGAGTACTACCTGCTTGTTATCTGTGACGGGGAGGATCGTGTCGTGGGCACGGGCAGCTTGATTGTTGAGCGCAAGTTCATTCATGAGTTGGGTCTTGTGGGCCATATTGAGGACATTGCCGTCGAGAAGGGCCAGCAGGGGAAGAGGCTCGGGCTGAGGCTTATTCAGGCGTTGGATTATGTTGCGGCGCAGGTGGGATGCTACAAGGTATGTCTTCTACTTCTTATTATGGGAGTGGTGGTCGTCATGATGCTAATGGTCAATGCAGAGTATTCTCGATTGCTCCGAGGCGAATGAGGGATTCTACCTCAAGTGCGGCTTCAAGCGTGCTGGATTGGAGA

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 南京昊禾生物科技有限公司

<120> 一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的方法、菌种及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2384

<212> DNA

<213> 延胡索酸水合酶基因fum基因序列(Unknown)

<400> 1

ttgccgtccc ccaggttttg ggtagaattg gaatatcatt agatctgtcg tcttatattg 60

tttattttag agagataaag tacgaccaat cccttgcaca catcctcgac aggatgtgaa 120

ttgtttccca aaaaatggca ccattggtta gccagccaca cacagtgact aacgcgcgtg 180

atgatgaata gatccagaag ccggtcgtca tgttgacatc tgcccacact tcccgagccg 240

cggtgcgctc gatggcctcc ttgacacatg ctgcatctcg agcttcggct tcccccgcag 300

ttgcccgcac tgccgtcgct ttcacccccg cctcgttcag ttgccgtcgt cttctgagct 360

ccaatagccg acctgttcaa cacttccccc gtcttcagac cttgacttcc acctccagca 420

agagagcctt tggcaccacc gtcaagatgg tatgctctat cctttccatt gaatcgcatc 480

tatcatatgg atgacttcgc tatggggaaa gagccccaac tgcgagacgt tgctaatcgg 540

ttattgtttt agtcttcggc tacccgcatt gagaccgatg ccttcggtga gatcgaggta 600

tgtgctacac tgatgcacac gatgcgtata gaatgcgaat gctgactgct tttcttttct 660

aggtccccgc cgacaagtac tggggtgccc agacccagcg gtaagacccc gatttcaaca 720

atcgctgcca cactgcaaac tggctatgcg accgatacac gaagtgagca gatgctgact 780

ggcgcgacaa tagctccctg ggcaacttcg acatcaacca gccccaggac cgcatgcctg 840

agcccgttgt caaggctttc ggtatcctca agggtgctgc tgctgaagtg aacatgaagt 900

tcggccttgg taagccgcta tcgattaaag cagcacagct ccggcgaagt taacaccagg 960

aaattagacc ccaagatcgg cgaggccatc aagcaggctg ccgccgaggt tgcggagggc 1020

aagctgatgg accacttccc cctcgtcgtc tggcagaccg gttccggtac ccagtccaac 1080

atgaactcga acgaggtcat ctccaaccgc gccattgaga tcctgggcgg cgagaagggc 1140

tccaagaagc ccgtccaccc caacgaccac gtcaacatgt ccgcctcctc caatgactcc 1200

ttcccgaccg ctatgcacat tgctgccgtt gtggagctgg agaacaccct cctgccttcc 1260

ctgaggagcc tgcgcgatgc tctccaggtc aaggttgaga agttcgacaa gatcatcaag 1320

atcggtcgta ctcacctgca ggacgccacc cctctcaccc tcggtcagga gttctccggc 1380

tacgtcgctc agctcgaccg caacattgag cgtgtcgaga ctagcatccc ccacctccgc 1440

tacctggctc agggtggtac cgccgtcggt actggtctga acaccttcaa gggcttcgac 1500

gaggctatcg ctgctgaggt caccaagttg accggcaccg agttcaagac tgcccccaac 1560

aagttcgagg ttctggccgc ccacgactcg attgtcgagg cttccggtgc cctgaacacc 1620

ctggcctgct ctctgttcaa gattgcccag gacatccgtt accttggatc cggtccccgc 1680

tgcggtcttg gtgaactggt cctccccgag aacgagcctg gctcttccat catgcccggc 1740

aaggttaacc ccactcagtg cgagtccctt accatggtct gctcccaggt catgggtaac 1800

cacgtcgctg ccactgtcgg cggcatgaac ggtcagttcg agctcaacgt gttcaagccc 1860

ctcatgatcc gcaacctgct gcacagcgtg cgcatcctgg ccgatggcat ggccagcttc 1920

gagaagaacc tggtgcacgg tctggaggcc aacgagcccc gcatcaactc tctcctccac 1980

gagaggtatg tatttcccta aaaaatcgga cctttgtaaa gaagacaact aacggtggtg 2040

tagtctgatg ttggtcacct gcctgaaccc cgtcattggc tacgacatgg cctccaaggt 2100

cgccaagaac gcccacaaga agggcctcac tctgaagcag agtgctatgg agctgaaggc 2160

tctgagcgag gaggactttg acaagtacgt ccgcccggag ctgatgctga gccccaagga 2220

gaagaaataa atgtatagcg ggacgagaga tgttttggct tagcttggag gagtcatcta 2280

gcgaagacta gcttttgcct aggagatatt tgtatactca ggaatactac tgtactattc 2340

ttcttgttca gcttattgct tggatagagt tcttcgctgt acgg 2384

<210> 2

<211> 547

<212> PRT

<213> 延胡索酸水合酶基因fum氨基酸序列(Unknown)

<400> 2

Met Leu Thr Ser Ala His Thr Ser Arg Ala Ala Val Arg Ser Met Ala

1 5 10 15

Ser Leu Thr His Ala Ala Ser Arg Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val Ala

20 25 30

Arg Thr Ala Val Ala Phe Thr Pro Ala Ser Phe Ser Cys Arg Arg Leu

35 40 45

Leu Ser Ser Asn Ser Arg Pro Val Gln His Phe Pro Arg Leu Gln Thr

50 55 60

Leu Thr Ser Thr Ser Ser Lys Arg Ala Phe Gly Thr Thr Val Lys Met

65 70 75 80

Ser Ser Ala Thr Arg Ile Glu Thr Asp Ala Phe Gly Glu Ile Glu Val

85 90 95

Pro Ala Asp Lys Tyr Trp Gly Ala Gln Thr Gln Arg Ser Leu Gly Asn

100 105 110

Phe Asp Ile Asn Gln Pro Gln Asp Arg Met Pro Glu Pro Val Val Lys

115 120 125

Ala Phe Gly Ile Leu Lys Gly Ala Ala Ala Glu Val Asn Met Lys Phe

130 135 140

Gly Leu Asp Pro Lys Ile Gly Glu Ala Ile Lys Gln Ala Ala Ala Glu

145 150 155 160

Val Ala Glu Gly Lys Leu Met Asp His Phe Pro Leu Val Val Trp Gln

165 170 175

Thr Gly Ser Gly Thr Gln Ser Asn Met Asn Ser Asn Glu Val Ile Ser

180 185 190

Asn Arg Ala Ile Glu Ile Leu Gly Gly Glu Lys Gly Ser Lys Lys Pro

195 200 205

Val His Pro Asn Asp His Val Asn Met Ser Ala Ser Ser Asn Asp Ser

210 215 220

Phe Pro Thr Ala Met His Ile Ala Ala Val Val Glu Leu Glu Asn Thr

225 230 235 240

Leu Leu Pro Ser Leu Arg Ser Leu Arg Asp Ala Leu Gln Val Lys Val

245 250 255

Glu Lys Phe Asp Lys Ile Ile Lys Ile Gly Arg Thr His Leu Gln Asp

260 265 270

Ala Thr Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu Phe Ser Gly Tyr Val Ala Gln

275 280 285

Leu Asp Arg Asn Ile Glu Arg Val Glu Thr Ser Ile Pro His Leu Arg

290 295 300

Tyr Leu Ala Gln Gly Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Thr Phe

305 310 315 320

Lys Gly Phe Asp Glu Ala Ile Ala Ala Glu Val Thr Lys Leu Thr Gly

325 330 335

Thr Glu Phe Lys Thr Ala Pro Asn Lys Phe Glu Val Leu Ala Ala His

340 345 350

Asp Ser Ile Val Glu Ala Ser Gly Ala Leu Asn Thr Leu Ala Cys Ser

355 360 365

Leu Phe Lys Ile Ala Gln Asp Ile Arg Tyr Leu Gly Ser Gly Pro Arg

370 375 380

Cys Gly Leu Gly Glu Leu Val Leu Pro Glu Asn Glu Pro Gly Ser Ser

385 390 395 400

Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Thr Gln Cys Glu Ser Leu Thr Met

405 410 415

Val Cys Ser Gln Val Met Gly Asn His Val Ala Ala Thr Val Gly Gly

420 425 430

Met Asn Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Phe Lys Pro Leu Met Ile Arg

435 440 445

Asn Leu Leu His Ser Val Arg Ile Leu Ala Asp Gly Met Ala Ser Phe

450 455 460

Glu Lys Asn Leu Val His Gly Leu Glu Ala Asn Glu Pro Arg Ile Asn

465 470 475 480

Ser Leu Leu His Glu Ser Leu Met Leu Val Thr Cys Leu Asn Pro Val

485 490 495

Ile Gly Tyr Asp Met Ala Ser Lys Val Ala Lys Asn Ala His Lys Lys

500 505 510

Gly Leu Thr Leu Lys Gln Ser Ala Met Glu Leu Lys Ala Leu Ser Glu

515 520 525

Glu Asp Phe Asp Lys Tyr Val Arg Pro Glu Leu Met Leu Ser Pro Lys

530 535 540

Glu Lys Lys

545

<210> 3

<211> 1443

<212> DNA

<213> fum基因上游序列(Unknown)

<400> 3

cccagccaag tatgccattg cctacggccg tgctcaaggt cctgatgtct tccgcatcac 60

ggagcagaaa tgtcccgtgc aagggggcga gataaccatc cgtatcttcg agcctgcccc 120

gaaagcggat gagcatggca aggccaaaaa gagggctgcg tttgtcaact tccatggggg 180

aggctgggtg ttcggcgatc tctcagttga tcacgatttc tgcaagacac tcgtcgatgg 240

cctggacggg cacttggtcg cgtttgatgt cgactaccgg ctagctcctg agcacaagta 300

cccgatcccc gttgacgact gctggaccgc tttcaattgg gtcagctaca actccctgtc 360

tacatcgacc ggtatggtca atactaactg acatcccgtg cagatccgct cccagaaagc 420

agaggagttc aacgttgacc cgaatcgaat agctgttgga ggttgttcgg ccggaggcca 480

cctgtcagcc gtggtcgctc atctctgccg taatggcggc attccgttgc gcctgcaggt 540

gctgaacgtg cccgtatgtg atctacatag cggctacact ccggatggtg aattcgatcg 600

ggagaactgt ccctatgagt cctacagaga gatggagttc accgcagctc ttccggtagc 660

acggatggct tatttccatc gacacttttt gggggttccc cggccagcac gttcagaaga 720

ggtaagtagt accgtaattg ctgcagccgg agctgcacac aactgcaaga tgctgatgtg 780

atccatagga ctggaagatc tcccccatat ttgcgcctga cttttctgga ctagcacctg 840

cgttggtctt caccgccgaa atggatcctc tgcgggacga aggggaggcc tacgctgcca 900

aattgaaagc tggcggttgt cgagtggaaa tgatgcgtat ggcaggagca ccccacacat 960

ttgccatgtt ggatggcatc ttagagagcg gccgtatata taccgagaag gtcatcgaag 1020

cgatgaaacg ggaactaaca gggtaaataa tcaattggtt cggttgaagg gatatcgaag 1080

atggagagca gtgttagtgc agagcgacta gaagatggaa atgcggagag acagcaggat 1140

catggtttat ccgacgagaa tctttaccgt atgataccat ttaggccggg cagcgaaggt 1200

gtggcagacg ggtaaccggc gtcctgaaca ttaccgggcc gggagatttc ggcaggcggt 1260

atcggaaaca gttggggtgg attaaatatg cgcggctgct gctgctcttc ttcttccctt 1320

cttttctgcg tggtttgttt gccgtccccc aggttttggg tagaattgga atatcattag 1380

atctgtcgtc ttatattgtt tattttagag agataaagta cgaccaatcc cttgcacaca 1440

tcc 1443

<210> 4

<211> 1379

<212> DNA

<213> fum基因下游序列(Unknown)

<400> 4

gcttggagga gtcatctagc gaagactagc ttttgcctag gagatatttg tatactcagg 60

aatactactg tactattctt cttgttcagc ttattgcttg gatagagttc ttcgctgtac 120

ggagtataga attttctcgg gctgatgacg gggctgaccc cggggtgtgc tatttttgga 180

ccaccaaagc ggtcccgccc accgatcgaa tagttcaaga tgcacggata gcaacgactg 240

acggtgtgtt gctgagggcc agtcaagtgg tgttaaattt aggcatacta actagtaacg 300

ttgctgcgcc agtcaggctt ggagggtgat cggcttgacc agtgccagtc ggaaagaacc 360

gtatgtagtg gtaagtagta agtagtcagg ggcggatttc caaagtgttt ggtgtttcag 420

gcaaaccgtg ggcccttctc ttactgcttg tttattacct ccgcctggcc ctttcttttc 480

catcaccgac tgaccgactg actcgattga cctgtccttt ttttcccttc atccctttcc 540

ccctcaaata ctcaccttcg ttggaaatac tctgtctttc gttcaaacac tcactatcac 600

tgaagaaatc cttcattcca gcgtttcaat aattcccatc cgttttcacc actcaattga 660

accccgccac taaccagggg cccttcctcc cttaactaaa ctaccaaaca acctcttcac 720

gaaactcctc aaagcctttt tctcctctcc agcaaaaagt tcaagacgga caaaaaacat 780

accaccgcca acatgaccaa cgcctccacc ctcacccaac cccccgccga atccaaggac 840

gacgcccccc tcttccctac gaccctcatc tccccctccg tcgccgccga actgcccgaa 900

ggctacaaga tccgtcccgt ccgtcgctcc gactacagcc gcggctacct ggacgtgttg 960

cgcgtgctga cgaccgtcgg caccatcacc gaggagcagt ggaacaagcg ctacgactgg 1020

atctcgtcgc gcaatgacga gtactacctg cttgttatct gtgacgggga ggatcgtgtc 1080

gtgggcacgg gcagcttgat tgttgagcgc aagttcattc atgagttggg tcttgtgggc 1140

catattgagg acattgccgt cgagaagggc cagcagggga agaggctcgg gctgaggctt 1200

attcaggcgt tggattatgt tgcggcgcag gtgggatgct acaaggtatg tcttctactt 1260

cttattatgg gagtggtggt cgtcatgatg ctaatggtca atgcagagta ttctcgattg 1320

ctccgaggcg aatgagggat tctacctcaa gtgcggcttc aagcgtgctg gattggaga 1379

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> fum-F-F(Unknown)

<400> 5

gctccgtaac acccagaatt ccccagccaa gtatgccatt g 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> fum-F-R(Unknown)

<400> 6

cgaagttatg gatccgagct cggatgtgtg caagggattg g 41

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> fum-R-F(Unknown)

<400> 7

gctatacgaa gttattctag agcttggagg agtcatctag cg 42

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> fum-R-R(Unknown)

<400> 8

tgcctgcagg ggcccactag ttctccaatc cagcacgctt g 41

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> P1(Unknown)

<400> 9

ccacttcaca acagcatccc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> P2(Unknown)

<400> 10

catcatcacg cgcgttagt 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> P3(Unknown)

<400> 11

ctctgagcga ggaggactt 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> P4(Unknown)

<400> 12

cagattacct ccagccatcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> P641(Unknown)

<400> 13

caatatcagt taacgtcgac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> P642(Unknown)

<400> 14

ggaaccagtt aacgtcgaat 20

Claims

1.一株降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的黑曲霉（Aspergillus niger）工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉工程菌株为敲除了延胡索酸水合酶基因fum的黑曲霉工程菌株。

2.根据权利要求1所述的降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的黑曲霉工程菌株，其特征在于：所述延胡索酸水合酶基因fum的基因序列为SEQ NO.1，氨基酸序列为SEQNO.2。

3.根据权利要求1或2所述的降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的黑曲霉工程菌株，其特征在于：所述延胡索酸水合酶基因fum为NCBI-locus_tag ANI_1_952104。

4.如权利要求1至3任一项所述的降低L-苹果酸发酵过程中副产物富马酸的黑曲霉工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：

（1）构建延胡索酸水合酶基因fum敲除载体

其中，所述基因fum上游序列为SEQ NO.3，所述基因fum下游序列为SEQ NO.4；

（2）黑曲霉延胡索酸水合酶基因fum敲除菌株的获得

5.利用如权利要求1至3任一项所述的黑曲霉工程菌株发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：步骤如下：

将黑曲霉基因工程菌株接种在PDA培养基上，于28℃培养5天，至产生分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50 ml，在28℃恒温200rpm培养5天，即得L-苹果酸。

6.根据权利要求5所述的发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的成分及配制方法为：

7.根据权利要求5或6所述的发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：所述方法得到的L-苹果酸产量为93.56 ~ 98.16 g/L，相比出发菌株提高了1.97%，富马酸含量为0.07 ~ 0.14g/L，相比于出发菌株降低了93.9%。

8.如权利要求1至3任一项所述的黑曲霉基因工程菌株在L-苹果酸生产方面中的应用。