CN114644987B

CN114644987B - 一种提高l-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株、方法及应用

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Publication number: CN114644987B
Application number: CN202210559264.5A
Authority: CN
Inventors: 刘浩; 徐晴
Original assignee: Nanjing Haohe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Haohe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-05-23
Also published as: CN114644987A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种提高L‑苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株、方法及应用，所述黑曲霉菌株为过表达超氧化物歧化酶sodA的黑曲霉菌株。本发明克服了现有技术中的不足，现有的利用黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中因氧化还原反应而积累了一部分氧自由基，会对细胞本身造成一定的损害进而使得生产水平和发酵强度发生退化，导致发酵工艺成本提高，本发明提供了一种sodA基因过表达的黑曲霉菌株及增强了黑曲霉在发酵过程中抵抗氧自由基带来的损伤的方法。本发明显著地提高了黑曲霉发酵苹果酸的生产水平和发酵强度，减少了发酵生产苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

Description

一种提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株、方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株、方法及应用。

背景技术

苹果酸作为重要的平台基础化合物之一，被广泛地应用于食品、化工和医药等领域。全球苹果酸需求量大约在15万吨，且呈现逐年上涨趋势，苹果酸最初是从苹果等水果中提取而来，此方法受到含量及原材料等的限制无法满足大规模市场的需求。目前苹果酸工业化生产途径主要是化学合成法和生物催化法，这两种方法因其自身的缺陷限制了其不能持续高效的发展。

化学合成法首先是以石油基化学品苯为原料，这对日益减少的石油能源和环境问题是极大的挑战；其次该法是在高温高压条件下得到外消旋DL-苹果酸，而早在1970年美国FDA就禁止在婴幼儿食品中添加DL-苹果酸；最后化学合成法对设备要求高且设备折旧快，限制了其在食品及医药领域的应用。生物催化法主要是固定化酶或者固定化细胞转化法，首先固定化酶法因其提取分离纯化和固定酶的成本较高，会对收益产生一定的限制；其次固定化细胞转化法的不足之处在于活细胞本身含有复杂的酶系，容易形成诸多副产物的形成，致使产品的下游提纯纯化成本增加。

相比于以上两种方法，微生物发酵法以其环境友好、可利用再生碳源等优点日益受到重视，且近年来越来越多的微生物被开发用来发酵生产L-苹果酸。其中氧化还原反应是微生物最重要的代谢途径，不仅为其提供能量，还决定着生命体的衰老和死亡。这是由于氧参与的代谢通常会产生一些对细胞有毒害作用的副产物—氧自由基，也就是通常所说的活性氧，它们会通过氧化应激损伤细胞大分子，引起一系列有害的生化反应，造成诸如蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA突变和酶失活等，进而影响微生物发酵的生产水平和发酵强度，会严重限制微生物发酵法生产L-苹果酸的工业化进程。而超氧化物歧化酶(SOD)几乎存在于所有生物细胞中，通过把氧自由基转化为过氧化氢，过氧化氢再被细胞中的过氧化氢酶和氧化物酶转化为无害的水，从而达到了清除细胞内氧自由基，保护细胞的目的。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株、方法及应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一株提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，所述黑曲霉菌株为过表达超氧化物歧化酶sodA的黑曲霉菌株；

所述超氧化物歧化酶sodA的基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2；所述超氧化物歧化酶基因sodA为NCBI-locus_tag为ANI_1_470064；

如上所述的提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株的构建方法，步骤如下：

(1)构建超氧化物歧化酶基因sodA表达载体

以提取的野生型黑曲霉CBS513.88的RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR反应扩增超氧化物歧化酶基因sodA，回收PCR产物获得目的片段；将基因sodA片段克隆到载体pLH509上，构建超氧化物歧化酶基因sodA过表达载体pLH1032；

(2)黑曲霉超氧化物歧化酶基因sodA过表达菌株的获得

将载体pLH1032化转至黑曲霉苹果酸高产菌株中，经转化子筛选获得黑曲霉超氧化物歧化酶基因sodA过表达菌株。

进一步地，所述黑曲霉菌株的出发菌株为黑曲霉苹果酸高产菌株S575和/或黑曲霉苹果酸高产菌株S1662。

进一步地，所述黑曲霉苹果酸高产菌株S1662为L-苹果酸高产菌株S1149成功诱导抗性标记基因后获得的转化子；

所述菌株S1149抗性标记诱导重组方法为：将菌株S1149的孢子均匀地涂布到含有30μg/mL四环素的MM培养基上，28℃培养至长出单克隆，随机挑选多个单克隆转接到PDA培养基上并于28℃培养24h，随后将克隆一一对应地转接到含有潮霉素的PDA培养基上并于28℃培养24h，最后进行表型观察筛选抗性标记诱导重组的转化子，即在PDA培养基上正常生长、在含有潮霉素的PDA培养基上不能生长的为成功诱导重组的转化子。

利用如上所述的黑曲霉菌株发酵L-苹果酸的方法，步骤如下：

将黑曲霉菌株接种在PDA培养基上，于28℃培养5天，至产生分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于发酵培养基中，孢子的添加终浓度为1×10⁸孢子/50ml，在28℃恒温200rpm培养5天，即得L-苹果酸。

进一步地，所述发酵培养基的成分及配制方法为：

蔗糖0～100g/L，细菌蛋白胨0～6g/L，无水磷酸二氢钾0～0.15g/L，无水磷酸氢二钾0～0.15g/L，二水氯化钙0～0.1g/L，七水硫酸镁0～0.1g/L，氯化钠0～0.005g/L，七水硫酸亚铁0～0.005g/L，无水柠檬酸0～0.001g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20min即得；其中，所有组分的取值均不为0；

每1LPDA培养基的制备方法为：准确称取去皮马铃薯200g，切成1cm³的小块，加蒸馏水不间断搅拌煮沸30min，用双层纱布过滤收集滤液，加入20g葡萄糖搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至1L并分装于广口瓶中，121℃高压灭菌20min；其中，固体培养基加入质量终浓度为1.5％的琼脂。

进一步地，所述方法得到的L-苹果酸生产水平和发酵强度与出发高产苹果酸菌株S575相比提高了4.7％-8.1％，与另外一株出发高产苹果酸菌株S1662相比提高了5.5％-9.7％。

如上所述的黑曲霉菌株在L-苹果酸生产方面中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明克服了现有技术中的不足，现有的利用黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中因氧化还原反应而积累了一部分氧自由基，会对细胞本身造成一定的损害进而使得生产水平和发酵强度发生退化，导致发酵工艺成本提高，本发明提供了一种sodA基因过表达的黑曲霉菌株及增强了黑曲霉在发酵过程中抵抗氧自由基带来的损伤的方法。本发明显著地提高了黑曲霉发酵苹果酸的生产水平和发酵强度，减少了发酵生产苹果酸过程中的原材料及能源动力成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

2、本发明黑曲霉菌株能够应用在L-苹果酸生产方面中，该菌株于摇瓶条件下发酵5天，得到的L-苹果酸生产水平和发酵强度与出发菌株S575相比提高了4.67％-8.12％，与另外一株生产苹果酸菌株S1662相比提高了5.52％-9.68％。为微生物发酵法制备苹果酸提供了优良的菌株。

3、本发明所用的出发菌株是黑曲霉苹果酸高产菌株S575和S1662，所述黑曲霉菌株是分别在S575和S1662的基础上过表达超氧化物歧化酶基因sodA的黑曲霉菌株，其中黑曲霉菌株S575及S1662均为高产L-苹果酸菌株。

附图说明

图1为本发明中构建的用于过表达超氧化物歧化酶基因sodA的载体pLH1032图谱；

图2为本发明中对过表达载体pLH1032的双酶切验证图；其中，M为DNAMarker，N为阴性对照，S为EcoR I和Xba I双酶切验证载体；

图3为本发明中对载体pLH1032中超氧化物歧化酶基因sodA的测序对比结果；

图4为本发明中sodA基因在菌株S575中过表达的转化子基因组PCR验证图，其中，M为DNAMarker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-4为成功过表达sodA基因的黑曲霉转化子基因组；

图5为本发明中S575及以S575为出发菌株成功构建的sodA基因过表达工程菌株Oes-1、Oes-2、Oes-3、Oes-4于摇瓶发酵中第5天的L-苹果酸产量及生产效率图；

图6为本发明中sodA基因在菌株S1662中过表达的转化子基因组PCR验证图，其中，M为DNAMarker，N为阴性对照，P为阳性对照，5-8为成功过表达sodA基因的黑曲霉转化子基因组；

图7为本发明中S1662及以S1662为出发菌株成功构建的sodA基因过表达工程菌株Oes-5、Oes-6、Oes-7、Oes-8于摇瓶发酵中第5天的L-苹果酸产量及生产效率图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

(1)构建超氧化物歧化酶基因sodA表达载体

(2)黑曲霉超氧化物歧化酶基因sodA过表达菌株的获得

较优地，所述黑曲霉苹果酸高产菌株S1662为L-苹果酸高产菌株S1149成功诱导抗性标记基因后获得的转化子；

较优地，所述发酵培养基的成分及配制方法为：

较优地，所述方法得到的L-苹果酸生产水平和发酵强度与出发高产苹果酸菌株S575相比提高了4.7％-8.1％，与另外一株出发高产苹果酸菌株S1662相比提高了5.5％-9.7％。

如上所述的黑曲霉菌株在L-苹果酸生产方面中的应用。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1：sodA基因过表达载体的构建

本实施例包括以下步骤：

为扩增超氧化物歧化酶基因sodA序列片段，以提取的野生型黑曲霉CBS513.88的RNA反转录得到的cDNA为模板设计扩增引物sodA-F和sodA-R，通过PCR扩增回收得到sodA基因序列片段，胶回收后与经EcoR I和Xba I双酶切处理得到的载体pLH509借助One-StepClone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞中，均匀地涂布在含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证(图2)，获得成功连接sodA基因序列片段的载体pLH1032，其图谱如图1所示。

通过扩增获得的载体pLH1032中sodA基因序列测序结果与已知sodA基因序列对比结果如图3所示。

所述扩增引物序列见表1：

表1引物序列

表1中下划线序列表示酶切位点。

所述sodA基因序列为SEQ NO.1，长度为465bp；氨基酸序列为SEQ NO.2，氨基酸个数为155个。

所述含有卡那霉素抗性的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L。121℃灭菌20min。灭菌冷却至50℃左右时添加卡那霉素至终浓度为100μg/mL。

实施例2：L-苹果酸高产菌株S575过表达超氧化物歧化酶基因sodA菌株的获得

本实施例包括以下步骤：

将载体pLH1032电转至农杆菌，之后将含有相应载体的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S575在IM培养基上共培养进行农杆菌介导转化，培养2.5天后将培养产物均匀地涂布在CM培养基中进行培养直至长出转化子，对转化子进行筛选，转化子表型为潮霉素抗性不敏感，对此类转化子提基因组验证，设计验证引物(表1)，扩增结果满足引物P1和引物P2扩增呈阳性(图4)，此类转化子为成功过表达超氧化物歧化酶基因sodA的菌株。

所述基因过表达的转化方法为农杆菌介导法。

所述农杆菌介导法的电转条件为：Capacitance:25μF,Voltage:2.5kV,Resistance:200Ω,Pulse:5msec。

所述所用农杆菌菌株为AGL-1菌株。

所述IM培养基配制方法为：15g琼脂加水定容至905.7mL，121℃灭菌20min，加入提前准备的无菌K buffer 0～0.8mL、MN buffer 0～20mL、1％CaCl₂·2H₂O 0～1mL、0.01％FeSO₄ 0～10mL、IM Trace elements 0～5mL、20％NH₄NO₃ 0～2.5mL、50％甘油0～10mL、1MMES 0～40mL、20％葡萄糖0～5mL，待温度冷却至50℃左右时加入卡那霉素并使其终浓度为0～100μg/mL、加入乙酰丁香酮并使其终浓度为0～200μM。其中，所有组分的取值均不为0。

所述CM培养基配制方法为：20g琼脂加水定容到897mL，121℃灭菌20min，加入提前准备的无菌ASP+N 0～20mL、50％葡萄糖0～20mL、1M MgSO4 0～2mL、CM Trace elements 0～1mL、10％酪蛋白水解物0～10mL、10％酵母浸出物0～50mL，待温度冷却至50℃左右时加入潮霉素并使其终浓度为250μg/mL、加入链霉素并使其终浓度为100μg/mL、加入头孢噻污纳并使其终浓度为100μg/mL、加入氨苄青霉素并使其终浓度为100μg/mL。其中，所有组分的取值均不为0。

所述验证引物序列见表1。

实施例3：摇瓶发酵提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的方法

本实施例具体详见表2：

表2

由表2所示，在培养基、培养条件和发酵时间完全相同的情况下，对照组S575生产L-苹果酸的产量为105.21g/L，而在S575基础上过表达超氧化物歧化酶基因获得的转化子1-4的L-苹果酸产量分别为110.13g/L、113.76g/L、112.78g/L和112.10g/L，生产水平和发酵强度分别提高了4.7％、8.1％、7.2％和6.5％。

以上实施例结果表明，在L-苹果酸高产菌株S575上过表达超氧化物歧化酶基因可显著提高其L-苹果酸的生产水平和发酵强度。

实施例4：菌株S1662过表达超氧化物歧化酶基因sodA菌株的获得

本实施例包括以下步骤：

将载体pLH1032电转至农杆菌，之后将含有相应载体的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1662在IM培养基上共培养进行农杆菌介导转化，培养2.5天后将培养产物均匀地涂布在CM培养基中进行培养直至长出转化子，对转化子进行筛选，转化子表型为潮霉素抗性不敏感，对此类转化子提基因组验证，设计验证引物(表1)，扩增结果满足引物P1和引物P2扩增呈阳性(图6)，此类转化子为成功过表达超氧化物歧化酶基因sodA的菌株。

所述基因过表达的转化方法为农杆菌介导法。

所述所用农杆菌菌株为AGL-1菌株。

所述验证引物序列见表1。

所述菌株S1662的来源为L-苹果酸高产菌株S1149成功诱导抗性标记基因后获得的转化子。

所述S1149抗性标记诱导重组方法为：将大约400个S1149菌株的孢子均匀地涂布到含有30μg/mL四环素的MM培养基上，28℃培养至长出单克隆，随机挑选100个单克隆转接到PDA培养基上28℃培养24h，随后将克隆一一对应地转接到含有潮霉素的PDA培养基上28℃培养24h，最后进行表型观察筛选抗性标记诱导重组的转化子，即在PDA培养基上正常生长在含有潮霉素的PDA培养基上不能生长的为成功诱导重组的转化子。

实施例5：摇瓶发酵提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的方法

本实施例具体详见表3：

表3

由表3所示，在培养基、培养条件和发酵时间完全相同的情况下，对照组S1662生产L-苹果酸的产量为126.76g/L，而在S1662基础上过表达超氧化物歧化酶基因获得的转化子5-8的L-苹果酸产量分别为136.44g/L、139.03g/L、133.76g/L和134.09g/L，生产水平和发酵强度分别提高了7.6％、9.7％、5.5％和5.8％。

以上实施例结果表明，在L-苹果酸高产菌株S1662上过表达超氧化物歧化酶基因可显著提高其L-苹果酸的生产水平和发酵强度。

实施例6：菌株发酵生产L-苹果酸的检测

利用本发明构建的黑曲霉sodA基因过表达菌株于摇瓶中发酵生产苹果酸的方法，其具体步骤如下：

首先，将获得的工程菌株接种在PDA培养基上，并置于28℃培养箱中倒置培养5天至产生足够的分生孢子；

所述PDA培养基的制备方法：准确称取去皮马铃薯200g，切成约1cm³的小块，加蒸馏水不间断搅拌煮沸30min，用双层纱布过滤收集滤液，加入20g葡萄糖搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至1L并分装于广口瓶中，121℃高压灭菌20min。固体培养基加入1.5％琼脂。

然后，收集菌株的分生孢子并接种于苹果酸发酵培养基中，其中孢子的浓度为1×10⁸个/50mL，将摇瓶放置于28℃、200rpm条件下培养5天。

所述苹果酸发酵培养基的组成为：蔗糖0～100g/L，细菌蛋白胨0～6g/L，无水磷酸二氢钾0～0.15g/L，无水磷酸氢二钾0～0.15g/L，氯化钙二水0～0.1g/L，硫酸镁七水0～0.1g/L，氯化钠0～0.005g/L，硫酸亚铁七水0～0.005g/L，无水柠檬酸0～0.001g/L，溶剂为水。115℃高压灭菌20min。其中，所有组分的取值均不为0。

最后，收集发酵产物，制备检测样品，样品经HPLC测定其中L-苹果酸的含量。结果显示，得到的L-苹果酸生产水平和发酵强度与出发苹果酸高产菌株S575相比提高了4.7％-8.1％(图5)，与出发苹果酸高产菌株S1662相比提高了5.5％-9.7％(图7)。

所述检测样品的制备方法为：吸取振荡均匀的发酵液2mL，加入等体积的2M HCl，充分反应，离心取上清液，稀释50倍，经0.22μm滤膜过滤后存放于液相小瓶中待HPLC分析。

所述HPLC检测有机酸的方法为：安捷伦高效液相色谱仪UV检测器，AminexHPX-87H色谱柱(300mm*7.8mm)，5mM H₂SO₄流动相，0.6mL/min流速，65℃色谱柱温，210nm检测波长，20μL进样体积。

本发明的研究成果显著提高了黑曲霉发酵生产苹果酸的生产水平和发酵强度，减少了发酵生产苹果酸过程中成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

本发明中使用到的序列如下：

SEQ ID NO.1：

ATGGTCAAGGCTGTCGCTGTTATCCGTGGAGACTCTAAGGTCTCCGGCACTGTCACTTTCGAGCAGGCCAACGAGAACACCCCCACCACCATCTCCTGGAACATCACTGGCCACGACGCCAACGCTGAGCGTGGCTTCCACGTCCACCAGTTCGGTGACAACACCAACGGCTGCACCTCCGCTGGCCCTCACTTCAACCCCTTCGGCAAGACCCACGGTGCTCCCGAGGACGACGAGCGTCACGTCGGTGACCTTGGCAACTTCAAGACCGATGCCGAGGGTAACGCCGTTGGTTCCAAGCAGGACAAGCTGGTGAAGCTCATCGGTGCTGAGAGCGTCCTGGGCCGGACCCTGGTCGTCCACGCTGGTACTGATGACCTTGGCCGTGGTGGCAACGAGGAGTCCAAGAAGACCGGTAACGCTGGTCCTCGTCCCGCTTGCGGTGTCATTGGCATTGCTGCTTAA

SEQ ID NO.2：

MetValLysAlaValAlaValIleArgGlyAspSerLysValSerGlyThrValThrPheGluGlnAlaAsnGluAsnThrProThrThrIleSerTrpAsnIleThrGlyHisAspAlaAsnAlaGluArgGlyPheHisValHisGlnPheGlyAspAsnThrAsnGlyCysThrSerAlaGlyProHisPheAsnProPheGlyLysThrHisGlyAlaProGluAspAspGluArgHisValGlyAspLeuGlyAsnPheLysThrAspAlaGluGlyAsnAlaValGlySerLysGlnAspLysLeuValLysLeuIleGlyAlaGluSerValLeuGlyArgThrLeuValValHisAlaGlyThrAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGluGluSerLysLysThrGlyAsnAlaGlyProArgProAlaCysGlyValIleGlyIleAlaAla*

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 南京昊禾生物科技有限公司

<120> 一种提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉菌株、方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 465

<212> DNA

<213> 超氧化物歧化酶sodA的基因序列(Unknown)

<400> 1

atggtcaagg ctgtcgctgt tatccgtgga gactctaagg tctccggcac tgtcactttc 60

gagcaggcca acgagaacac ccccaccacc atctcctgga acatcactgg ccacgacgcc 120

aacgctgagc gtggcttcca cgtccaccag ttcggtgaca acaccaacgg ctgcacctcc 180

gctggccctc acttcaaccc cttcggcaag acccacggtg ctcccgagga cgacgagcgt 240

cacgtcggtg accttggcaa cttcaagacc gatgccgagg gtaacgccgt tggttccaag 300

caggacaagc tggtgaagct catcggtgct gagagcgtcc tgggccggac cctggtcgtc 360

cacgctggta ctgatgacct tggccgtggt ggcaacgagg agtccaagaa gaccggtaac 420

gctggtcctc gtcccgcttg cggtgtcatt ggcattgctg cttaa 465

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> 超氧化物歧化酶sodA的氨基酸序列(Unknown)

<400> 2

Met Val Lys Ala Val Ala Val Ile Arg Gly Asp Ser Lys Val Ser Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Phe Glu Gln Ala Asn Glu Asn Thr Pro Thr Thr Ile Ser

20 25 30

Trp Asn Ile Thr Gly His Asp Ala Asn Ala Glu Arg Gly Phe His Val

35 40 45

His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His

50 55 60

Phe Asn Pro Phe Gly Lys Thr His Gly Ala Pro Glu Asp Asp Glu Arg

65 70 75 80

His Val Gly Asp Leu Gly Asn Phe Lys Thr Asp Ala Glu Gly Asn Ala

85 90 95

Val Gly Ser Lys Gln Asp Lys Leu Val Lys Leu Ile Gly Ala Glu Ser

100 105 110

Val Leu Gly Arg Thr Leu Val Val His Ala Gly Thr Asp Asp Leu Gly

115 120 125

Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Lys Lys Thr Gly Asn Ala Gly Pro Arg

130 135 140

Pro Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Ala

145 150

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> sodA-F(Unknown)

<400> 3

tcatccgtca agatggaatt cgtcaaggct gtcgctgtta tcc 43

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> sodA-R(Unknown)

<400> 4

tccagatctc tgcagggtac cttaagcagc aatgccaatg acac 44

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> P1(Unknown)

<400> 5

tcatccgtca agatggaatt cgtcaaggct gtcgctgtta tc 42

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> P2(Unknown)

<400> 6

gatcggtgcg ggcctcttcg 20

Claims

1.一株提高L-苹果酸生产水平和发酵强度的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其特征在于：

所述黑曲霉菌株为过表达超氧化物歧化酶sodA的黑曲霉菌株；

所述超氧化物歧化酶sodA的基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

所述超氧化物歧化酶基因sodA的基因序列的NCBI-locus_tag为ANI_1_470064；

(1)构建超氧化物歧化酶基因sodA表达载体

(2)黑曲霉超氧化物歧化酶基因sodA过表达菌株的获得

将载体pLH1032化转至黑曲霉苹果酸高产菌株中，经转化子筛选获得黑曲霉超氧化物歧化酶基因sodA过表达菌株；

所述黑曲霉菌株的出发菌株为黑曲霉苹果酸高产菌株S575和/或黑曲霉苹果酸高产菌株S1662；

所述黑曲霉苹果酸高产菌株S1662为L-苹果酸高产菌株S1149成功诱导抗性标记基因后获得的转化子；

2.利用如权利要求1所述的黑曲霉菌株发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：步骤如下：

3.根据权利要求2所述的发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的成分及配制方法为：

蔗糖100g/L，细菌蛋白胨6g/L，无水磷酸二氢钾0.15g/L，无水磷酸氢二钾0.15g/L，二水氯化钙0.1g/L，七水硫酸镁0.1g/L，氯化钠0.005g/L，七水硫酸亚铁0.005g/L，无水柠檬酸0.001g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20min即得；

每1L PDA培养基的制备方法为：准确称取去皮马铃薯200g，切成1cm³的小块，加蒸馏水不间断搅拌煮沸30min，用双层纱布过滤收集滤液，加入20g葡萄糖搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至1L并分装于广口瓶中，121℃高压灭菌20min；其中，固体培养基加入质量终浓度为1.5％的琼脂。

4.根据权利要求2所述的发酵L-苹果酸的方法，其特征在于：所述方法得到的L-苹果酸生产水平和发酵强度与出发高产苹果酸菌株S575相比提高了4.7％-8.1％，与另外一株出发高产苹果酸菌株S1662相比提高了5.5％-9.7％。

5.如权利要求1所述的黑曲霉菌株在L-苹果酸生产方面中的应用。