CN116925933A - 一种降低l-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的基因工程菌株、方法及应用 - Google Patents

一种降低l-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的基因工程菌株、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一株降低L‑苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉工程菌株，所述黑曲霉工程菌株是敲除了产L‑苹果酸的黑曲霉菌株中特定基因ctp6的黑曲霉工程菌株。本发明克服了现有技术中的不足，现有的利用黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中，副产物琥珀酸会伴随着苹果酸的产生而积累，造成后续苹果酸纯化工艺成本的提高，本发明提供了一种ctp6基因敲除的黑曲霉工程菌株，和一种大大减少黑曲霉发酵过程中副产物琥珀酸的方法。本发明显著地减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物琥珀酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

Description

一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的基因工程菌 株、方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的基因工程菌株、方法及应用。
背景技术
L-苹果酸作为一种重要的有机酸，普遍存在于植物、动物和微生物中，是生物体内三羧酸循环的重要中间代谢产物，被普遍应用于食品、医药及化工等领域。在食品行业，苹果酸因其具有苹果的天然香味，广泛地用作食品酸味调节剂和柠檬酸共同使用，此外还被用于食品保鲜以及配合其它防腐剂共同使用等；在医药行业，因其能够直接参人体代谢，常常被用于治疗肝功能异常和高血氨，还常用于氨基酸类注射药物中帮助氨基酸的利用等；在化工行业，常被用于金属清洗、印染工业、非电解镀层以及油漆等。苹果酸最初是从苹果等水果中提取而来，此方法受到含量及原材料等的限制无法满足大规模市场的需求。
目前苹果酸工业化生产途径主要是化学合成法和生物催化法。化学合成法是以石油基化学品苯为原料，在高温高压条件下得到外消旋DL-苹果酸，而早在1970年美国FDA就禁止在婴幼儿食品中添加DL-苹果酸，此外化学合成法对设备要求高且设备折旧快，限制了其在食品及医药领域的应用。另外，此法的原料来源为石油基化学品，对日益减少的石油能源和环境问题也是极大的挑战。生物催化法主要是固定化酶或者固定化细胞转化法，固定化酶法因其提取分离纯化和固定酶的成本较高，对收益产生了一定的限制；而固定化细胞转化法的不足之处在于活细胞本身含有复杂的酶系，容易形成诸多副产物，致使产品的下游提纯纯化成本增加。综上，使得化学合成法和生物催化法制备的苹果酸难以满足苹果酸市场日益增长的需求。
相比于以上两种方法，微生物发酵法以其环境友好、可利用再生碳源等优点日益受到重视，但是目前此法面临的问题是安全菌株可选择性少，产物转化率或生产效率普遍低，杂酸副产物多且含量高，严重限制了发酵法生产L-苹果酸的工业化进程。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的基因工程菌株、方法及应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉(Aspergillus niger)工程菌株，所述黑曲霉工程菌株是敲除了产L-苹果酸的黑曲霉菌株中特定基因ctp6的黑曲霉工程菌株。
进一步地，所述菌株采用敲除产L-苹果酸的黑曲霉菌株中特定基因ctp6的方法得到的，该菌株能够降低黑曲霉菌株在发酵过程中琥珀酸的产量；
其中，所述特定基因ctp6的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ IDNO.2；
所述产L-苹果酸的黑曲霉菌株在L-苹果酸发酵过程中副产物包括琥珀酸。
如上所述的菌株的构建方法，具体包括：以黑曲霉基因组为模板，通过PCR反应分别扩增基因ctp6的上游核苷酸序列片段和下游核苷酸序列片段；将基因ctp6的上游核苷酸序列片段和下游核苷酸序列片段依次链接到载体pLH594上，构建ctp6敲除载体pLH666；将载体pLH666由农杆菌介导转化至黑曲霉中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组、基因组验证获得ctp6基因敲除菌株，即为降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的菌株。
进一步地，所述ctp6基因上游核苷酸序列片段为SEQ ID NO.3，所述ctp6基因下游核苷酸序列片段为SEQ ID NO.4。
进一步地，所述黑曲霉为黑曲霉ATCC1015及黑曲霉ATCC1015的衍生菌株。
进一步地，所述菌株能够减少琥珀酸产生。
如上所述的菌株在对L-苹果酸发酵过程中降低琥珀酸产量方面的应用。
进一步地，所述菌株能够将琥珀酸产量降低30～100％。
利用如上所述的菌株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的发酵方法，包括如下步骤：
首先，将能够降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养3-5天直至产生分生孢子；然后，将孢子接种至黑曲霉产酸发酵培养基中，孢子的浓度为1×107孢子/50ml-1×109孢子/50ml，在28℃恒温摇床中100-300rpm培养3-7天，即得L-苹果酸。
进一步地，所述黑曲霉产酸发酵培养基的成分及配制方法为：葡萄糖1-100g/L，细菌蛋白胨1-6g/L，无水磷酸二氢钾0.1-1g/L，无水磷酸氢二钾0.1-1g/L，二水氯化钙0.1-1g/L，七水硫酸镁0.1-1g/L，氯化钠0.001-1g/L，七水硫酸亚铁0.001-1g/L，无水柠檬酸0.001-1g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20min；
或者，所述发酵方法得到的L-苹果酸产量达到75-150g/L，相比出发菌株提高了5％-10％，琥珀酸含量为0.1-3g/L，相比于出发菌株降低了50-90％。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明克服了现有技术中的不足，现有的利用黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中，副产物琥珀酸会伴随着苹果酸的产生而积累，造成后续苹果酸纯化工艺成本的提高，本发明提供了一种ctp6基因敲除的黑曲霉工程菌株，和一种大大减少黑曲霉发酵过程中副产物琥珀酸的方法。本发明显著地减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物琥珀酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。
2、本发明黑曲霉工程菌株能够应用在L-苹果酸生产方面中，该菌株于摇瓶条件下发酵3-7天，L-苹果酸产量为达到75-150g/L，相比出发菌株提高了5％-10％，琥珀酸含量为0.1-3g/L，相比于出发菌株降低了50-90％。为微生物发酵法制备苹果酸提供了优良的菌株。
附图说明
图1为本发明中构建的用于敲除线粒体柠檬酸转运蛋白ctp6基因连接同源左臂的载体pLH665图谱；
图2为本发明中对敲除载体pLH665的双酶切(SacI/PstI，1527bp/9885bp)验证电泳图；其中，M为DNA Marker，1和2为双酶切验证载体；
图3为本发明中构建的用于敲除ctp6基因连接同源左右臂的载体pLH666图谱；
图4为本发明中对敲除载体pLH666的双酶切(BamHI/PstI，2585bp/9887bp)验证电泳图；其中，M为DNA Marker，1和为2双酶切验证载体；
图5为本发明中敲除基因ctp6的蛋白结构域；
图6为本发明中ctp6基因敲除php PCR验证图，引物为P607和P608；其中，M为DNAMarker，N为阴性对照，P为阳性对照，1为成功敲除ctp6基因的黑曲霉转化子基因组；
图7为本发明中ctp6基因敲除左同源臂臂-php PCR验证图，引物为P1和P641；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1为成功敲除ctp6基因的黑曲霉转化子基因组；
图8为本发明中ctp6基因敲除右同源臂臂-php PCR验证图，引物为P642和P2；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1为成功敲除ctp6基因的黑曲霉转化子基因组；
图9为本发明中ctp6基因敲除目的基因PCR验证图，引物为P3和P4；其中，M为DNAMarker，N为阴性对照，P为阳性对照，1为成功敲除ctp6基因的黑曲霉转化子基因组；
图10为本发明中构建的工程菌株于摇瓶发酵中的有机酸产量图；S895为出发菌株在第5天的有机酸产量，S3312为ctp6基因敲除菌株在第五天的有机酸产量；其中，图10-1为L-苹果酸的产量图，图10-2为琥珀酸的产量图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉(Aspergillus niger)工程菌株，所述黑曲霉工程菌株是敲除了产L-苹果酸的黑曲霉菌株中特定基因ctp6的黑曲霉工程菌株。
较优地，所述菌株采用敲除产L-苹果酸的黑曲霉菌株中特定基因ctp6的方法得到的，该菌株能够降低黑曲霉菌株在发酵过程中琥珀酸的产量；
其中，所述特定基因ctp6的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ IDNO.2；
所述产L-苹果酸的黑曲霉菌株在L-苹果酸发酵过程中副产物包括琥珀酸。
如上所述的菌株的构建方法，具体包括：以黑曲霉基因组为模板，通过PCR反应分别扩增基因ctp6的上游核苷酸序列片段和下游核苷酸序列片段；将基因ctp6的上游核苷酸序列片段和下游核苷酸序列片段依次链接到载体pLH594上，构建ctp6敲除载体pLH666；将载体pLH666由农杆菌介导转化至黑曲霉中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组、基因组验证获得ctp6基因敲除菌株，即为降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的菌株。
较优地，所述ctp6基因上游核苷酸序列片段为SEQ ID NO.3，所述ctp6基因下游核苷酸序列片段为SEQ ID NO.4。
较优地，所述黑曲霉为黑曲霉ATCC1015及黑曲霉ATCC1015的衍生菌株。
较优地，所述菌株能够减少琥珀酸产生。
如上所述的菌株在对L-苹果酸发酵过程中降低琥珀酸产量方面的应用。
较优地，所述菌株能够将琥珀酸产量降低30～100％。
利用如上所述的菌株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的发酵方法，包括如下步骤：
首先，将能够降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养3-5天直至产生分生孢子；然后，将孢子接种至黑曲霉产酸发酵培养基中，孢子的浓度为1×107孢子/50ml-1×109孢子/50ml，在28℃恒温摇床中100-300rpm培养3-7天，即得L-苹果酸。
较优地，所述黑曲霉产酸发酵培养基的成分及配制方法为：葡萄糖1-100g/L，细菌蛋白胨1-6g/L，无水磷酸二氢钾0.1-1g/L，无水磷酸氢二钾0.1-1g/L，二水氯化钙0.1-1g/L，七水硫酸镁0.1-1g/L，氯化钠0.001-1g/L，七水硫酸亚铁0.001-1g/L，无水柠檬酸0.001-1g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20min；
或者，所述发酵方法得到的L-苹果酸产量达到75-150g/L，相比出发菌株提高了5％-10％，琥珀酸含量为0.1-3g/L，相比于出发菌株降低了50-90％。
具体地，相关的制备及检测如下：
实施例1：ctp6基因基因敲除载体的构建
本实施例包括以下步骤：
(1)ctp6基因敲除载体的构建
为扩增ctp6基因上游核苷酸序列片段，以黑曲霉ATCC1015基因组为模板设计扩增引物ctp6-F-F和ctp6-F-R，通过PCR扩增回收得到ctp6基因上游序列片段，经EcoRI和SacI双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH594借助One-Step CloneKit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证(图2)，获得成功连接ctp6基因上游序列片段的载体pLH665，其图谱如图1所示。
为扩增ctp6基因下游核苷酸序列片段，以黑曲霉基因组为模板设计扩增引物ctp6-R-F和ctp6-R-R，通过PCR扩增回收得到ctp6基因下游序列片段，
经XbaI和SpeI双酶切且胶回收后与经相同限制性内切酶处理得到的载体pLH666借助One-Step Clone Kit试剂盒进行连接，将连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞中，均匀的涂布在含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR验证和提质粒双酶切验证(图4)，获得成功连接ctp6基因下游序列片段的载体pLH666，其图谱如图3所示。
所述扩增引物序列见表1。
表1本发明所用引物
引物 序列(5'-3')
P607 TAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGACGTTAA
P608 TCTAGAATAACTTCGTATAGCATACA
P641 CAATATCAGTTAACGTCGAC
P642 GGAACCAGTTAACGTCGAAT
P1 GCTGGGTGGAGGCATACTTC
P2 CTGGGTGGGAGACGAGTGTATAT
P3 TGGTTCGGTGGTTCAGCATC
P4 GTATGAGGACCGAGACGAATGA
Ctp6-F-F GTAACACCCAGAATTCAATTCGCCTTTGGTATCGGTTTGGAG
Ctp6-F-R CGAAGTTATGGATCCGAGCTCCAATCAGAGTCTCGGTTTCCG
Ctp6-R-F GCTATACGAAGTTATTCTAGAATTTGGCGAAGCATTACCG
Ctp6-R-R TGCCTGCAGGGGCCCACTAGTGCCAGCCTCATAAACTCGG
下划线序列表示酶切位点。
所述ctp6的基因序列为SEQ ID NO.1，序列长度为1192bp
所述ctp6的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，氨基酸个数为310个；蛋白功能域见图5。
所述ctp6基因上游序列为SEQ ID NO.3，长度为945bp。
所述ctp6基因下游序列为SEQ ID NO.4，长度为1060bp。
所述含有卡那霉素抗性的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L。121℃灭菌20min。灭菌冷却至50℃左右时添加卡那霉素至终浓度为100μg/mL。
实施例2：黑曲霉ctp6基因敲除菌株的获得
本实施例通过以下步骤实现：
(1)ctp6基因敲除菌株S3312的构建
将载体pLH666电转至农杆菌，之后将该农杆菌与黑曲霉宿主菌株S895(如CN111218408A公开的)在IM培养基上共培养进行农杆菌介导转化，培养2.5天后将培养产物均匀的涂布在CM培养基中进行培养直至长出转化子，将转化子转接到不同培养基上进行筛选，其在不同培养基上表型应该对潮霉素具有抗性、草铵膦敏感，对此类转化子提基因组验证，设计验证引物(表1)，扩增结果满足hph扩增呈阳性(图6(P607/P608)，左右同源臂-php扩增呈阳性(图7(P1/P641)图8(P642/P2))，挑取其中一个正确的ctp6基因敲除克隆进行抗性标记潮霉素的诱导重组从而获得不具有潮霉素抗性的ctp6基因敲除菌株S3312。
所述基因敲除的转化方法为农杆菌介导法。
所述农杆菌介导法的电转条件为：Capacitnce:25uF,Voltage:2.5kV,
Resistance:200Ω,Pulse:5msec。
所述所用农杆菌菌株为AGL-1菌株。
所述IM培养基配制方法为：15g琼脂加水定容至905.7mL，121℃灭菌20min，加入提前准备的无菌Kbuffer 0.8mL、MN buffer 20mL、1％CaCl2·2H2 O 1mL、0.01％FeSO410mL、IM Trace elements 5mL、20％NH4NO32.5 mL、50％甘油10mL、1M MES 40mL、20％葡萄糖5mL，以上百分数均为质量百分数，待温度冷却至50℃左右时加入卡那霉素并使其终浓度为100μg/mL、加入乙酰丁香酮并使其终浓度为200μM。
所述CM培养基配制方法为：20g琼脂加水定容到897mL，121℃灭菌20min，加入提前准备的无菌ASP+N 20mL、50％葡萄糖20mL、1M MgSO42 mL、CM Trace elements 1mL、10％酪蛋白水解物10mL、10％酵母浸出物50mL，待温度冷却至50℃左右时加入潮霉素并使其终浓度为250μg/mL、加入链霉素并使其终浓度为100μg/mL、加入头孢噻污纳并使其终浓度为100μg/mL、加入氨苄青霉素并使其终浓度为100μg/mL。以上百分数均为质量百分数。
所述验证引物序列见表1。
所述抗性标记潮霉素的诱导重组的方法为：将大约300个ctp6基因敲除克隆的孢子均匀的涂布到含有15mg/mL木糖的MM培养基上，28℃培养至长出单克隆，随机挑选200个单克隆转接到PDA培养基上28℃培养24h，随后将克隆一一对应地转接到含有潮霉素的PDA培养基上28℃培养24h，最后进行表型观察筛选抗性标记诱导重组的转化子，即在PDA培养基上正常生长在含有潮霉素的PDA培养基上不能生长的为成功诱导重组的转化子。
所述PDA培养基的配制方法为：准确称取去皮马铃薯500g，切成约1cm3的小块，加蒸馏水不间断搅拌煮沸30min，用双层纱布过滤收集滤液，加入50g葡萄糖搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至2.5L并分装于广口瓶中，加入1.5％的琼脂，121℃高压灭菌20min。
实施例3：工程菌株发酵产生L-苹果酸的应用
利用本发明构建的黑曲霉ctp6基因敲除工程菌株S3312于摇瓶中发酵生产苹果酸的方法，其具体步骤如下：
首先，将获得的工程菌株S3312接种在PDA培养基上并置于28℃培养箱中倒置培养5天至产生足够的分生孢子；
然后，收集菌株S3312的分生孢子并接种于苹果酸发酵培养基中，其中孢子的终浓度为1*108个/mL，将摇瓶放置于28℃、200rpm条件下培养5天。
所述苹果酸发酵培养基的组成为：葡萄糖100g/L，细菌蛋白胨6g/L，无水磷酸二氢钾0.15g/L，无水磷酸氢二钾0.15g/L，氯化钙二水0.1g/L，硫酸镁七水0.1g/L，氯化钠0.005g/L，硫酸亚铁七水0.005g/L，无水柠檬酸0.001g/L。115℃高压灭菌20min。
最后，收集发酵产物，制备检测样品，样品经HPLC测定其中主要有机酸的含量。结果显示，主要有机酸为苹果酸，敲除ctp6基因的工程菌株S3312副产物琥珀酸含量减少至出发菌株的46.4％，结果见图10。
所述检测样品制备方法：吸取振荡均匀的发酵液2mL，加入等体积的2M HCl，充分反应，离心取上清液，稀释5倍，经0.22μm滤膜过滤后存放于液相小瓶中待HPLC分析。
所述HPLC检测有机酸的方法为：安捷伦高效液相色谱仪UV检测器，AminexHPX-87H色谱柱(300mm*7.8mm)，5mM H2 SO4流动相，0.6mL/min流速，65℃色谱柱温，210nm检测波长，20μL进样体积。
本发明的研究成果大大减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物琥珀酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中的成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。
本发明中使用到的序列如下：
SEQ ID NO.1：
Atggccagcggcgcgaagttggaggcgtcgcatcctcccaaggcggcgaatgctgcagcccctgcaaaaaaagttcattatcctttctggttcggtggttcagcatcatgctttgcggctgccgttactcaccctctggatctcggtaagctctaattcggccaacaaaaaaataaaaaagcatgtgctggaactgaagctaatccccgtctatagtgaaggtaatttctgcctcctggactttttataggaactcctgaattttccctccgcgtgcttattcctatacttcgttgtctcaccggaacgctgatcgatgtgcgttttgaaaatttataggtccgcttgcagacccgcgggcctggcgccccctcgactatggtcggcacattcgtgcatgtattcaagaatgacggattcttcggtctttacagcggggtatgtagtatccaccaatgctccagatcgtgtcgattctattacagggtgctaaagttacttcctgtagttgtccgccgcaattctgcgccaactgacctactccaccacacgattcggtatctacgaggaactgaaaaaccacttcacctctcccgactcgcctcctggcctcttcaccctaattggtatggcctctgcctctggcttcatcggtggcatggctggtaaccccgccgacgtcctgaacgtgcggatgcaatccgacgctgctcttcctcccgctcaacgccgtaactaccgcaacgcgatacacggattggtgaccatgacgcgcaccgaaggtcccgccagcttgttccgcggagtgtggccgaactcgacccgtgctgttcttatgacgacgtcgcaattggcctcgtacgataccttcaagcgtctgtgtctggagaacctcggcatgtccgataacatgggaacgcatttcactgcctccttcatggctggatttgtggctactactgtctgtagtcctgtcgatgttatcaagactcgtgtcatgaccgcttctccggctgaaggccgcagtcagagcatcattggactgctccgcgacatcactaggaaggagggcctcgcgtgggctttccgtggttgggtgccgagcttcattcgtctcggtcctcataccattgccacgtttatcttccttgaggagcataagaagctctatcgcttgttgaaggggctttga
SEQ ID NO.2：
MASGAKLEASHPPKAANAAAPAKKVHYPFWFGGSASCFAAAVTHPLDLVKVRLQTRGPGAPSTMVGTFVHVFKNDGFFGLYSGLSAAILRQLTYSTTRFGIYEELKNHFTSPDSPPGLFTLIGMASASGFIGGMAGNPADVLNVRMQSDAALPPAQRRNYRNAIHGLVTMTRTEGPASLFRGVWPNSTRAVLMTTSQLASYDTFKRLCLENLGMSDNMGTHFTASFMAGFVATTVCSPVDVIKTRVMTASPAEGRSQSIIGLLRDITRKEGLAWAFRGWVPSFIRLGPHTIATFIFLEEHKKLYRLLKGL
SEQ ID NO.3：
GcctttggtatcggtttggagcgtattgcaatgcttctcttcaacatcccggatatccgcttgttctggtcgcgtgacgagcgattcctttcccagttccgcgcgggtgagatcacccgcttcgagccattctccaagcaccccgcctgttacaaggatgtcgccttctggcttccctctgcgtctgtcagcggtggcagtgcagcgggcggagctgcgcccgtgcacgagaatgatatcatggagatcgttcgtggggaggcaggagacctggtggaagacgtccagctgattgatgaattcacccaccccaagacacaccggaagagcatgtgctaccgtatcaattaccggagtctagagcgcacgttgacgaatgaagaaacaaatgacctgcatgagaaggtccgacaaaagcttgtgggcttgctgggagtcgaactccgctgattacagcgactgtgactgtgaatgctcgcgatgtactatatgccagttactgttggcgagttcatatgtacaacaactgtgtattaccatgttcagatgaaatcacctatcctccaggtttatccgggcgtttaggctagggaagatctagccgcggctggcatcatgtaccttaatctagtctacggcatgggacgcatgcagcgtgacgtagtggcgatccaagcagggtctatactttgtagtcaaatgggtttgtcgagaccagctgagaagctgccaaacagctatggcctagcatgcgagctattctccgtcctcggaggtaattcaggcaccgagtgcatcagcagaattaccccaagcgaggctatctttgatggaggcgccccgcgggtatcgaaggactcagagaaaggctacttgaaatacgcgcattaccgaggattaccgctcggcctccgtctgcccgccggaaaccgagactctgattgSEQ ID NO.4：
Atttggcgaagcattaccgggaggacaaaagtcttgcgcatttttcttgtgatcatacccttgtatatatcttatagattacttacgtttcctttatcttttactttcatctctcttttcgtccctcttcacttttatttttggcttattcgttgtctcttcgagctggctaaagcgacttctgtcctccagtttctcctctttcttcgcctacatctcccctctttccacatgtatctgctcatgttttcgagactaattgacctagaacaacacgtttctctgaggcatatatgtctcctctcttggcatctgatacacaagacgtggtcctcttggaacatgactaattcagagcccttctctagccactgcgattgacctcagattctgaaagccttcaatctccagctgagattaccgttcttatacggtgccttggtcgaacagtgcatttttgctatacactacaattcatacagcatatatcctttgcaatttagattagataagactgaaatgccatgaagttctttatacaatgtaatgttatatatggacacattgtagttgctagttgagcattctattgtattgtattgatcgaattggtcaagtttctcgaggacatatgctctgattgtactattactagtaacttaaccatatcatgcttgctggtttgattctacttttagacagtagtaagaacatactagtagtagtaactagtgagctttgcaatgtacatagtgaggtaagcagttgcataaatgggataatcggttatcagctgtcgtgaaagatttgattttggggtaggtgattggttggttgctatcggacatcgtatgatctttcgacgatgttgctggtgagcagtagtagttatcattgaatactaaataagctttatgaggtgacatgtgagagaagggaagatttatacggctgcctatttgatataaaaatcaaggtggtagacggaacatgacacgaattgatgaagatggatttgacttaaagctacaaatttataccgagtttatgaggctggc
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的黑曲霉(Aspergillus niger)工程菌株，其特征在于：所述黑曲霉工程菌株是敲除了产L-苹果酸的黑曲霉菌株中特定基因ctp6的黑曲霉工程菌株。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述菌株采用敲除产L-苹果酸的黑曲霉菌株中特定基因ctp6的方法得到的，该菌株能够降低黑曲霉菌株在发酵过程中琥珀酸的产量；
其中，所述特定基因ctp6的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
所述产L-苹果酸的黑曲霉菌株在L-苹果酸发酵过程中副产物包括琥珀酸。
3.如权利要求1或2所述的菌株的构建方法，其特征在于：具体包括：以黑曲霉基因组为模板，通过PCR反应分别扩增基因ctp6的上游核苷酸序列片段和下游核苷酸序列片段；将基因ctp6的上游核苷酸序列片段和下游核苷酸序列片段依次链接到载体pLH594上，构建ctp6敲除载体pLH666；将载体pLH666由农杆菌介导转化至黑曲霉中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组、基因组验证获得ctp6基因敲除菌株，即为降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的菌株。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述ctp6基因上游核苷酸序列片段为SEQ ID NO.3，所述ctp6基因下游核苷酸序列片段为SEQ ID NO.4。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述黑曲霉为黑曲霉ATCC1015及黑曲霉ATCC1015的衍生菌株。
6.根据权利要求3至5任一项所述的构建方法，其特征在于：所述菌株能够减少琥珀酸产生。
7.如权利要求1或2所述的菌株在对L-苹果酸发酵过程中降低琥珀酸产量方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述菌株能够将琥珀酸产量降低30～100％。
9.利用如权利要求1或2任一项所述的菌株降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
首先，将能够降低L-苹果酸发酵过程中副产物琥珀酸的菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养3-5天直至产生分生孢子；然后，将孢子接种至黑曲霉产酸发酵培养基中，孢子的浓度为1×107孢子/50ml-1×109孢子/50ml，在28℃恒温摇床中100-300rpm培养3-7天，即得L-苹果酸。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于：所述黑曲霉产酸发酵培养基的成分及配制方法为：葡萄糖1-100g/L，细菌蛋白胨1-6g/L，无水磷酸二氢钾0.1-1g/L，无水磷酸氢二钾0.1-1g/L，二水氯化钙0.1-1g/L，七水硫酸镁0.1-1g/L，氯化钠0.001-1g/L，七水硫酸亚铁0.001-1g/L，无水柠檬酸0.001-1g/L，溶剂为水，115℃高压灭菌20min；
或者，所述发酵方法得到的L-苹果酸产量达到75-150g/L，相比出发菌株提高了5％-10％，琥珀酸含量为0.1-3g/L，相比于出发菌株降低了50-90％。
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