CN114606142A - 一株具有高生产效率的l-苹果酸产生菌、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一株具有高生产效率的L‑苹果酸产生菌，所述菌的分类命名为：黑曲霉（Aspergillus niger），名称为：38，菌种保藏编号：CGMCC NO.40146，保藏日期为：2022年3月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明菌株是以黑曲霉ATCC 1015为出发菌株，采用本发明所述的诱变方法筛选的生产菌突变株黑曲霉38，缩短了发酵周期，提高了L‑苹果酸的生产效率，降低了生产发酵成本，拓展了微生物发酵生产L‑苹果酸的应用领域。

Description

一株具有高生产效率的L-苹果酸产生菌、方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一株具有高生产效率的L-苹果酸产生菌、方法及应用。

背景技术

L-苹果酸是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收。L-苹果酸的酸味接近天然苹果的酸味，味道柔和，后味延续时间长，被认为是未来最具增长潜力的酸味剂。

苹果酸的生产方法主要有直接提取法、化学合成法、生物合成法以及微生物直接发酵法。苹果酸早期的生产方法是直接从含有苹果酸的水果和蔬菜中提取，但由于原料中苹果酸含量少，导致生产成本高，所以一般不适用于工业化生产苹果酸；化学合成法是以石油产品（反丁烯二酸或顺丁烯二酸）为原料，经高温高压催化加水等方法，得到DL-苹果酸，由于产物含有D型苹果酸，不能被直接用于食品和医药中。生物合成法是利用具有高水平富马酸的微生物细胞或富马酸酶，采用固定化酶或细胞反应器，将富马酸转化成L-苹果酸，所采用的原料富马酸多来自于化学法生产。随着人民对健康生活的日益追求，经直接发酵法获得的全天然L-苹果酸被认为是未来食品、医药领域消费的主要方向。

菌株的选育是发酵工业的关键技术，而目前现有技术中对L-苹果酸生产菌株的选育仍集中在提高菌株的产酸上，少有缩短发酵周期，提高L-苹果酸生产效率的选育方法。若能通过诱变育种的方法缩短菌株的发酵周期，提高生产效率，则有利于降低微生物发酵L-苹果酸的生产成本，在微生物发酵产L-苹果酸工业中将具有较好的应用前景。

通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、L-苹果酸高产菌株及其应用（ CN110684673B），其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）L01，保藏编号为CCTCC NO.M 2019458。本发明以购买自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）的黑曲霉Aspergillus niger CICC NO.40567为出发菌株，采用ARTP物理诱变结合自然筛选得到高产L-苹果酸的突变株Aspergillus nigerL01，该突变株L-苹果酸的产量高，不仅能解决黄曲霉菌株发酵过程中产生黄曲霉毒素的问题，而且黑曲霉产柠檬酸的工艺目前在工业上已经成熟，可直接利用现有过剩的柠檬酸生产装置，助推企业的转型升级。

2、一种产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用（CN101649300A），本发明通过对L-苹果酸涉及的关键酶酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸酶(FumC)进行改造,构建得到基因工程菌。本发明将fumC进行灭活性突变,致使代谢流在苹果酸向富马酸转化处中断,从而积累目的产物L-苹果酸;将在mdh前加上内源pepck基因的启动子使代谢流偏向苹果酸生成;此外,通过单氟乙酸钠诱导,使得PEPCK活性增强,并使产物反馈抑制大为减弱。将本发明菌株应用于L-苹果酸的发酵生产,能显著提高L-苹果酸产量,所用技术简单,效果明显,投入成本低,能够满足市场需求。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株具有高生产效率的L-苹果酸产生菌、方法及应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一株具有高生产效率的L-苹果酸产生菌，所述菌的分类命名为：黑曲霉（Aspergillus niger），名称为：38，菌种保藏编号：CGMCC NO. 40146，保藏日期为：2022年3月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

如上所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌的获取方法，所述菌是通过诱变的方法获得，包括以下步骤：

（1）采用常压室温等离子体对黑曲霉原始菌的孢子悬液进行诱变处理；

（2）诱变后的孢子悬液涂布于含有新霉素和溴甲酚绿的筛选平板上，其中新霉素的浓度为15-30 g/L，溴甲酚绿的浓度为0.2-1g/L；

（3）将上述获得的固体平板倒置于25-35 ℃的培养箱进行培养，挑选能够在平板上生长且变色圈与菌落直径的比值大于对照的单菌落进行摇瓶发酵；经摇瓶发酵，挑选L-苹果酸产量高、发酵周期短的突变株；

（4）将获得的突变株进行斜面传代培养，对传代后的菌株进行摇瓶发酵，考察其遗传稳定性，获得性状稳定的突变株，将其命名为黑曲霉38，即得。

进一步地，所述黑曲霉原始菌为黑曲霉ATCC 1015。

如上所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌在L-苹果酸的发酵生产方面中的应用。

利用如上所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌发酵生产L-苹果酸的方法，步骤如下：

将L-苹果酸产生菌接种在PDA培养基上，于35℃培养5天至产生足够的分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于摇瓶发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50 ml，在35℃恒温摇床中200 rpm培养5天。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明菌株是以黑曲霉ATCC 1015为出发菌株，采用本发明所述的诱变方法筛选的生产菌突变株黑曲霉38，缩短了发酵周期，提高了L-苹果酸的生产效率，降低了生产发酵成本，拓展了微生物发酵生产L-苹果酸的应用领域。

2、通过本发明方法在一定程度上缩短目标产物发酵周期，满足目前L-苹果酸的市场需求。相对于现行技术方案，增加了单位时间内发酵产品的产出，提高了生产该类产品企业的收益。

3、本发明菌株还大大减少了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物富马酸和柠檬酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中成本，为工业化发酵生产苹果酸提供了优良菌株。

4、采用本发明所述的诱变方法筛选的生产菌突变株黑曲霉38，产孢量大量提高，从而减少菌种培养成本。

附图说明

图1为本发明中菌株黑曲霉38与起始菌株黑曲霉ATCC 1015菌株菌落图；

图2为本发明中菌株黑曲霉38的发酵罐分批发酵曲线图；

图3为本发明中菌株黑曲霉38的发酵罐分批发酵杂酸丁二酸曲线图；

图4为本发明中菌株黑曲霉38的发酵罐分批发酵杂酸富马酸曲线图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

一株具有高生产效率的L-苹果酸产生菌，所述菌的分类命名为：黑曲霉（Aspergillus niger），名称为：38，菌种保藏编号：CGMCC NO. 40146，保藏日期为：2022年3月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

如上所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌的获取方法，所述菌是通过诱变的方法获得，包括以下步骤：

（1）采用常压室温等离子体对黑曲霉原始菌的孢子悬液进行诱变处理；

（2）诱变后的孢子悬液涂布于含有新霉素和溴甲酚绿的筛选平板上，其中新霉素的浓度为15-30 g/L，溴甲酚绿的浓度为0.2-1g/L；

（3）将上述获得的固体平板倒置于25-35 ℃的培养箱进行培养，挑选能够在平板上生长且且变色圈与菌落直径的比值大于对照的单菌落进行摇瓶发酵；经摇瓶发酵，挑选L-苹果酸产量高、发酵周期短的突变株；

（4）将获得的突变株进行斜面传代培养，对传代后的菌株进行摇瓶发酵，考察其遗传稳定性，获得性状稳定的突变株，将其命名为黑曲霉38，即得。

较优地，所述黑曲霉原始菌为黑曲霉ATCC 1015。

如上所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌在L-苹果酸的发酵生产方面中的应用。

利用如上所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌发酵生产L-苹果酸的方法，步骤如下：

将黑曲霉38接种在PDA培养基上，于35℃培养5天至产生足够的分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于摇瓶发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50 ml，在35℃恒温摇床中200 rpm培养5天。

具体地，相关检测及制备如下：

含有新霉素和溴甲酚绿的固体培养基组成：20% (W/ V)马铃薯的煮汁，加入20 g葡萄糖，0.2g溴甲酚绿，15g新霉素，15g琼脂（搅拌至完全溶解），蒸馏水定容至1 L并分装于广口瓶中，pH 自然无需调节。

其中，马铃薯的煮汁的制备方法为：准确称取去皮马铃薯200 g，切成约1 cm³的小块，加蒸馏水不间断搅拌煮沸30 min，用双层纱布过滤收集滤液。

发酵培养基：5~7%葡萄糖，0.02~0.04%的金属离子（磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、二水氯化钙），2~3%的细菌蛋白胨，其余为水，上述百分数均为质量百分数。115℃、30min灭菌，无菌条件下孢子的浓度为1*10⁸孢子/50 ml。

发酵液中葡萄糖浓度的测定：取适量发酵液，于 12000×g 离心 5 min，将上清液用去离子水稀释 100 倍后使用 SBA-40E 生物传感分析仪测定。

发酵液中有机酸含量的测定：充分混匀发酵液，迅速取 2 mL 于 10 mL EP 管中，缓慢加入等体积的 2 M 浓度的 HCl 充分酸解；然后 12000×g 离心 5 min，取上清液，稀释 20-50 倍后经 0.22 μm 孔径水系滤膜过滤待测。经高效液相色谱（HPLC）紫外检测法测定，使用伯乐 Aminex HPX-87H 色谱柱，流动相为 5 mM 稀硫酸，设置柱温 65°C，流动相流速 0.6 mL/min，波长 210 nm。

以下实施例更具体说明黑曲霉38的诱变和筛选方法。

出发菌株：黑曲霉ATCC 1015。

实施例1：常压室温等离子体诱变

取培养4~5 d的黑曲霉出发菌株的成熟孢子斜面一支，用无菌水洗脱孢子并经纱布过滤后，置于预先灭菌的放有玻璃珠的三角瓶中，于摇床上震荡30~60 min 至镜检为分散的单孢子。用血球计数法数并用无菌水调节孢子浓度为1×10⁷个/mL，即为单孢子悬浮液。取10 μL孢子悬浮液，均匀涂布在灭菌载片表面。然后将装有样品的载片处于气流端2mm处，气量为10 SLM，功率120 W，时间180~270 s进行处理。

实施例2：具有高生产效率的L-苹果酸产生菌的筛选

平板初筛：取100 μL上述稀释过的经常压室温等离子体诱变后所得孢子悬浮液均匀涂布于含有新霉素和溴甲酚绿的筛选平板上，倒置于35℃恒温培养箱中培养。挑选能够在平板上生长且变色圈与菌落直径比较大的单菌落转接至PDA斜面培养，以备摇瓶初筛。

摇瓶初筛：经过平板初筛，得到45株产酸可能较高，发酵周期可能较短的突变株，将突变株斜面按实施例1的方法制成孢子悬浮液，以2×10⁶个/mL的接种量接种于摇瓶培养基，置于转速为200 rpm 的恒温摇床上，35℃培养96-120 h，测定其L-苹果酸的产量，其结果如表1所示，其中9株在发酵条件下产酸较出发菌株略高，发酵周期明显缩短，分别为突变株5、13、23、30、32、33、38、43、44。

表1 突变株摇瓶初筛

实施例3：菌株遗传稳定性考察

对摇瓶初筛中产酸较高、发酵周期较短的9株菌进行斜面传代培养，考察其第二、三、五代菌株在发酵条件下的产酸及发酵周期情况。结果见表2。实验设计了三个平行，表中数据为平均值。

表2 突变株稳定性考察

从表2可以看出，对摇瓶初筛中产酸较高、发酵周期较短的9株菌进行斜面传代培养时，突变株黑曲霉38是这9株突变株中发酵条件下产酸水平和发酵周期最为稳定的菌株，而且从菌落图片观察及血球计数板计数，发现突变株黑曲霉38的产孢量也比起始菌株产孢量高（图1），故将其命名为黑曲霉38。

实施例4：突变菌株发酵特性考察

本实施例说明利用黑曲霉38在5 L罐上进行发酵产L-苹果酸小试的方法。以2×10⁶个/mL的接种量将孢子直接接种于500 mL种子罐培养基中，于温度为30 °C、 搅拌转速为200 rpm 的条件下培养，待种子成熟后按10%的接种量接入装有3 L发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵温度设置 35°C、通气量为 1 vvm、转速为 200 rpm，发酵培养至发酵液中还原糖的量低于个位数后下罐。发酵结果如图2所示，通过5L罐小试发现，黑曲霉38是一株能在发酵条件下产酸稳定、周期较出发菌株具有较大缩短的菌株。发酵罐周期为96 h，较出发菌株缩短24 h；发酵强度为0.61 g/L/h，较出发菌株提高205%。对终点发酵液进行液相检测，发现其杂酸丁二酸、富马酸的总含量也均有所降低，结果如图3、4所示。该菌株缩短发酵周期、增加单位时间内发酵产品的产出，降低了黑曲霉发酵生产苹果酸过程中积累的副产物丁二酸和富马酸，减少了下游分离纯化苹果酸过程中成本，提高了生产该类产品企业的收益，其工业化应用前景将非常广阔。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (3)

1.一株具有高生产效率的L-苹果酸产生菌，其特征在于：所述L-苹果酸产生菌的分类命名为：黑曲霉（Aspergillus niger），名称为：38，菌种保藏编号：CGMCC NO. 40146，保藏日期为：2022年3月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.如权利要求1所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌在L-苹果酸的发酵生产方面中的应用。

3.利用如权利要求1所述的具有高生产效率的L-苹果酸产生菌发酵生产L-苹果酸的方法，其特征在于：步骤如下：

将L-苹果酸产生菌接种在PDA培养基上，于35℃培养5天至产生足够的分生孢子，收集孢子并将孢子悬液接种于摇瓶发酵培养基中，孢子的浓度为1*10⁸孢子/50 ml，在35℃恒温摇床中200 rpm培养5天。

Images