CN110734865B - 一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及应用 - Google Patents

一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，步骤如下：获得pexG基因敲除菌株S914；获得表达苹果酸合酶基因mas*菌株S1016；过表达黑曲霉苹果酸转运蛋白基因dct1，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得无筛选标记的过表达dct1菌株S1140，即为低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。本菌株基于黑曲霉耐酸且产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性而获得的，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低pH下生产苹果酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备苹果提供了优良菌种。

Description

一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株及应用。
背景技术
苹果酸在食品、保健、医药、日化和化工等方面都有非常广泛的应用。由于L-苹果酸味道柔和、酸度大，且不损害口腔牙齿、不积累脂肪，成为一种低热量的国际食品界公认的安全性食品酸味剂，是目前世界食品行业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。在医药行业，L-苹果酸被用于治疗肝病、贫血、尿毒症等多种疾病。而且由于L-苹果酸在代谢上利于氨基酸的吸收，常被配入复合氨基酸注射液中。因此，国际市场上对L-苹果酸的需求量与日俱增。
黑曲霉作为GRAS(generally recognized as life)安全菌株，具有强耐酸性、可以利用广泛的廉价碳源等优势，在工业酶制剂、有机酸发酵等方面都有广泛的应用。
在低pH下(＜2.5)，黑曲霉所生产的有机酸大都为柠檬酸，苹果酸的生产需要将pH维持在6左右，这就需要加入CaCO3或其他试剂来维持pH，这不仅增加了生产成本，而且形成的苹果酸盐也增加了下游分离提取获得苹果酸的工艺难度和纯化成本。因此，探索构建一种在低pH下的苹果酸生产菌株是十分有必要的。
在黑曲霉(Aspergillus niger)中，乙醛酸循环位于过氧化物酶体中，异柠檬酸在异柠檬酸裂解酶的作用下生成琥珀酸和乙醛酸，乙醛酸与乙酰辅酶A在苹果酸合酶的作用下生成苹果酸，整个过程无需固定二氧化碳。
因此，通过在细胞质中重构乙醛酸代谢通路构建低pH条件下苹果酸高产菌株可以解决苹果酸发酵过程中必须用碳酸钙来维持pH的问题。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术环境压力胁迫问题的不足之处，提供一种高耐性低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株及应用，该菌株基于黑曲霉耐酸且产生有机酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性而获得的，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低pH下生产苹果酸的能力显著提升，为无碳酸钙微生物发酵法制备苹果提供了优良菌种。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，所述基因工程菌株的构建步骤如下：
步骤1：敲除过氧化物酶体上与负责异柠檬酸裂解酶定位的Peroxins蛋白基因pexG，该蛋白负责将新合成的异柠檬酸裂解酶转运至过氧化物酶体基质。首先，以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉pexG基因上下游同源臂序列片段，所述上下游同源臂序列片段的核苷酸序列分别为SEQ NO.1，SEQ NO.2，长度分别为1207bp、1139bp；然后分步将上下游同源臂序列片段经过EcoR I、BamH I和Xba I、Pst I双酶切回收并克隆到载体pLH594，构建基因pexG敲除质粒pLH692；将所述质粒pLH692转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pexG基因敲除菌株S914；
步骤2：过表达苹果酸合酶基因mas*。首先通过设计引物将苹果酸合酶基因mas的过氧化物酶体定位序列，即其C-端三个氨基酸突变为终止密码子TAA(记为mas*)，使苹果酸合酶蛋白定位于细胞质，用该引物以黑曲霉cDNA为模板进行扩增，获得mas*基因序列片段，所述基因mas*序列片段的核苷酸序列为SEQ NO.3，长度为1797bp；然后将该片段经过EcoRI和BamH I双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因mas*表达质粒pLH695；所述基因mas*序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA控制转录，将所述质粒pLH695转化至黑曲霉S914宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达mas*基因菌株S1016；
步骤3：过表达黑曲霉苹果酸转运蛋白dct1，将表达黑曲霉转运蛋白基因dct1表达质粒pLH455转化至黑曲霉S1016宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达dct1基因菌株S1140，即为低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。
如上所述的低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株在制备苹果酸方面中的应用。
利用如上所述的低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株发酵产生苹果酸的方法，步骤如下：
首先，将黑曲霉基因工程菌株接种在PDA培养平板上，在28℃条件下培养6天直至产生足够的新鲜分生孢子；
然后，将孢子粉接种至发酵培养基中，孢子的终浓度为2×106个孢子/mL，在28℃，200rpm条件下发酵5天，即得苹果酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L蔗糖，2.5g/L NH4NO3，1g/L MgSO4·7H2O，1g/L KH2PO4，500mg/L酵母提取物。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明基于黑曲霉产生苹果酸的天然特性，通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性，获得了一种黑曲霉基因工程菌株，经过实验证实，该黑曲霉基因工程菌株在低pH情况下生产苹果酸的能力显著提升，为微生物发酵法制备苹果酸提供了优良菌种。经过5天低pH摇瓶发酵，苹果酸的产量由出发菌的2g/L提高到30.5g/L，为苹果酸的工业化生产提供了优良的菌株。
2、本发明克服了现有技术中的不足，现有黑曲霉发酵生产苹果酸的过程中需要额外添加CaCO3或其他试剂维持pH，这不仅增加了生产成本，而且形成的苹果酸盐也增加了下游分离提取获得苹果酸的工艺难度和纯化成本。本发明提供了一种低pH状态下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，通过挖掘与在细胞质中重构乙醛酸代谢通路相关的酶，构建包含这些酶的表达载体，转化到宿主菌株，经筛选获得低pH下高产苹果酸的工程菌株S1140。
3、本发明所用的宿主菌株是在基因组内整合了cre基因，该基因受Tet-on系统的调控表达，当以所述菌株为出发菌进行遗传改造，并以loxP-hph-loxP为筛选标记时，可通过四环素启动Tet-on系统表达Cre重组酶，实现对loxP-hph-loxP元件的重组切除，从而实现应用一个hph筛选标记进行连续的基因编辑，最终实现目的工程菌株基因组内无外源抗性基因的残留。
附图说明
图1为本发明中构建的pexG敲除质粒pLH692图谱；
图2为本发明中对pexG敲除质粒pLH692的双酶切验证图(EcoR I/Pst I，7544bp/3194bp)，其中M为DNA Marker，1-4为EcoR I和Pst I双酶切验证质粒；
图3为本发明中构建的dct1基因表达质粒pLH654图谱；
图4为本发明中对dct1基因表达质粒pLH654双酶切验证图(EcoR I/Pst I，9972bp/1259bp)，其中M为DNA Marker，1-3为EcoR I和Pst I双酶切验证质粒；
图5为本发明中构建的mas*基因表达质粒pLH695图谱；
图6为本发明中对mas*基因表达质粒pLH695双酶切验证图(Spe I/Xba I，310bp/3463bp)，其中M为DNA Marker，1-4为Spe I和Xba I双酶切验证质粒；
图7为本发明中筛选获得的转化子在低pH条件下进行苹果酸发酵培养基摇瓶发酵筛选的检测结果图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，所述基因工程菌株的构建步骤如下：
步骤1：敲除过氧化物酶体上负责与异柠檬酸裂解酶定位的Peroxins蛋白基因pexG，该蛋白负责将新合成的异柠檬酸裂解酶转运至过氧化物酶体基质；首先，以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉pexG基因上下游同源臂序列片段，所述上下游同源臂序列片段的核苷酸序列分别为SEQ NO.1，SEQ NO.2，长度分别为1207bp、1139bp；然后分步将上下游同源臂序列片段经过EcoR I、BamH I和Xba I、Pst I双酶切回收克隆到载体pLH594，构建基因pexG敲除质粒pLH692；将所述质粒pLH692转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pexG基因敲除菌株S914；
步骤2：过表达苹果酸合酶基因mas*，首先通过设计引物将苹果酸合酶基因mas的过氧化物酶体定位序列即其C-端三个氨基酸突变为终止密码子TAA(记为mas*)，用该引物以黑曲霉cDNA为模板进行扩增，获得mas*基因序列片段，所述基因mas*序列片段的核苷酸序列为SEQ NO.3，长度为1797bp；然后将该片段经过EcoR I和BamH I双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因mas*表达质粒pLH695；所述基因mas*序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，将所述质粒pLH695转化至黑曲霉S914宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达mas*基因菌株S1016；
步骤3：过表达黑曲霉苹果酸转运蛋白dct1，将表达黑曲霉苹果酸转运蛋白基因dct1表达质粒pLH455转化至黑曲霉S1016宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达dct1基因菌株S1140，即为低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。
如上所述的低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株在制备苹果酸方面中的应用。
利用如上所述的低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株发酵产生苹果酸的方法，步骤如下：
首先，将黑曲霉基因工程菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；
然后，将孢子粉接种至发酵培养基中，孢子的终浓度为2×106个孢子/mL，在28℃，200rpm发酵5天，即得苹果酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100g/L蔗糖，2.5g/L NH4NO3，1g/L MgSO4·7H2O，1g/L KH2PO4，500mg/L酵母提取物。
具体地，所述耐低pH条件高产苹果酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株的构建步骤如下：
一、质粒的构建
pexG敲除质粒的构建：
质粒pLH692(如图1所示)是由pLH594(已公开)载体改造而来。改造过程如下：以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板，PpexG-L-F、PpexG-L-R和PpexG-R-F、PpexG-R-R为引物进行PCR扩增pexG上下游同源臂片段pexG-L和pexG-R，然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将pexG-L和pexG-R依次与经EcoR I/BamH I、Xba I/Pst I双酶切线性化后的出发载体pLH594进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(如图2所示)获得质粒pLH692。为扩增pexG-L和pexG-R设计引物PpexG-L-F、PpexG-L-R和PpexG-R-F、PpexG-R-R(如表1所示)。
mas*表达质粒的构建：
质粒pLH695(如图5所示)是由pLH454(pLH454已公开)载体经改造而来。改造过程如下：以黑曲霉(Aspergillus niger)cDNA为模板，mas*-F、mas*-R为引物进行PCR扩增mas*基因序列片段，然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将mas*基因序列片段与经EcoR I/BamH I双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(如图6所示)获得质粒pLH695。为扩增mas*基因序列片段设计引物mas*-F、mas*-R(如表1所示)。
dct1表达质粒的构建：
质粒pLH654(如图3所示)是由pLH454(pLH454已公开)载体经改造而来。改造过程如下：以黑曲霉(Aspergillus niger)cDNA为模板，dct1-F、dct1-R为引物进行PCR扩增dct1基因序列片段，然后应用诺唯C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将dct1基因序列片段与经EcoR I/Pst I双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(如图4所示)获得质粒pLH654。为扩增dct1基因序列片段设计引物dct1-F、dct1-R(如表1所示)。
表1所用引物序列
Figure BDA0002297968800000071
其中，上述LB培养基组分为：
胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸出物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％(W/V)的琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/mL。
二、农杆菌介导黑曲霉转化及克隆筛选
本发明所述过表达，是将相关基因的表达盒整合到黑曲霉基因组中进行表达。较优地，本发明所述表达基因的转化方法为农杆菌介导法。所述农杆菌为AGL-1菌株。本发明所述表达基因在农杆菌介导转化黑曲霉之前，需将所述表达质粒和敲除质粒电转化至农杆菌。所述电转条件是：电容：25μF，电压：2.5kV，电阻：200Ω，脉冲：5ms。
(1)敲除pexG基因菌株的获得
将质粒pLH692电转至农杆菌，然后将含有质粒pLH692的农杆菌与黑曲霉宿主菌株在IM平板共培养进行农杆菌介导转化，共培养两天后将转化子转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中进行培养直至形成单克隆，然后分别点接含有潮霉素B的PDA平板和含有1.0mg/mL草铵膦的MM平板进行筛选，进而提基因组验证获得正确转化子进行hphmarker诱导重组，获得潮霉素敏感的pexG基因敲除菌株S914。
(2)过表达mas*基因菌株的获得
将质粒pLH695电转至农杆菌，然后将含有质粒pLH695的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S914在IM平板共培养进行农杆菌介导转化，共培养两天后将转化子转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中进行培养直至形成单克隆，然后经过含有潮霉素B的PDA平板进行筛选，进而提基因组验证获得正确转化子进行hph marker诱导重组，获得潮霉素敏感的mas*基因过表达菌株S1016。
(3)表达dct1基因菌株的获得
将质粒pLH455电转至农杆菌，然后将含有质粒pLH455的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1016在IM平板共培养进行农杆菌介导转化，共培养两天后将转化子转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中进行培养直至形成单克隆，然后经过含有潮霉素B的PDA平板进行筛选，进而提基因组验证获得正确转化子进行hph marker诱导重组，获得潮霉素敏感的dct1基因表达菌株S1140。
所述诱导重组方法为：将约300个转化子孢子均匀涂布与含有10μg/mL四环素的MM平板中至长出克隆，然后随机挑取100个克隆同时转接至PDA平板和含有潮霉素B的PDA平板中，在含潮霉素的PDA平板中不能生长而在PDA能正常生长的克隆即为hph marker诱导重组菌株，表现为潮霉素敏感。
将筛选获得的在细胞质内重构乙醛酸代谢菌株S1140进行苹果酸发酵培养基摇瓶发酵5天后，苹果酸产量显著提高(如图7所示)。
(5)上述PDA培养基组分为:马铃薯200g，切成小块，加1000mL水煮沸30min，用双层纱布滤成清液。然后加入20g葡萄糖完全溶解，加水定容至1L。固体培养基加琼脂20g。121℃，20min高压灭菌。
(6)上述IM培养基组分为:
15g琼脂，加水至905.7mL，121℃灭菌20min，微波加热待琼脂完全溶解后，加入：Kbuffer 0.8mL，MN buffer 20mL，1％CaCl2·2H2O 1mL，0.01％FeSO4 10mL，IM Traceelements 5mL，20％NH4NO3 2.5mL，50％甘油10mL，1M MES 40mL，20％葡萄糖5mL。
所述IM培养基中所需试剂的配制：
1)K buffer：将1.25M K2HPO4加入到1.25M KH2PO4使得pH为4.8。
(a)：1.25M KH2PO4：KH2PO4 17.01g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
(b)：1.25M K2HPO4：K2HPO4 21.77g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
2)MN buffer：MgSO4·7H2O 3g，NaCl 1.5g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
3)1％CaCl2：CaCl2·2H2O 1g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
4)0.01％FeSO4：FeSO4·7H2O 0.01g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
5)IM Trace elements：ZnSO4·7H2O 10mg，CuSO4·5H2O 10mg，H3BO3 10mg，MnSO4·H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 10mg，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
6)20％NH4NO3：加入NH4NO3 20g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
7)50％甘油：甘油50mL，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
8)1M MES：MES 19.524g，加入去离子水定容至100mL，加入NaOH调节pH为5.5，过滤除菌。黑暗下保存一个月，或分装后与-20℃下保存。
9)20％葡萄糖：葡萄糖20g，加入ddH2O定容至100mL，115℃灭菌20min。
(4)上述CM培养基组分为:
20g琼脂，加水到897mL，121℃灭菌20min。微波加热待琼脂完全溶解后，加入：ASP+N20mL，50％葡萄糖20mL，1M MgSO4 2mL，CM Trace elements 1mL，10％酪蛋白水解物10mL，10％酵母浸出物50mL。
所述CM培养基中所需试剂的配制：
1)ASP+N：KCl(350mM)2.61g，KH2PO4(550mM)7.48g，NaNO3(3.5M)29.75g，加入去离子水定容至100mL，pH5.5(5MKOH)，121℃灭菌20min。
2)50％葡萄糖：葡萄糖50g，加入ddH2O定容至100mL，115℃灭菌20min。
3)1M MgSO4：MgSO424.648g，加入ddH2O定容至100mL，121℃灭菌20min。
4)CM Trace elements：ZnSO4·7H2O(76mM)2.1g，H3BO3(178mM)1.1g，MnCl2·4H2O0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.17g，CuSO4·5H2O 0.16g，Na2MoO4·2H2O 0.15g，EDTA 5.1g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。
5)10％酪蛋白水解物：酪蛋白水解物10g，加入ddH2O定容至100mL，121℃灭菌20min。
6)10％酵母浸出物：酵母浸出物10g，加入ddH2O定容至100mL，121℃灭菌20min。
(5)上述MM培养基组分:Vogel's Salts 20mL，葡萄糖15g，琼脂15g，蒸馏水溶解并定容至1000mL。121℃灭菌20min。
所述MM培养基中所需试剂的配制：
1)Vogel's 50×salts：柠檬酸钠150g，KH2PO4 250g，NH4NO3 100g，MgSO4·7H2O10g，CaCl2·2H2 0.5g。微量元素溶液5mL，生物素溶液2.5mL，蒸馏水溶解并定容至1000mL，加0.2mL氯仿作为防腐剂，室温下保存。
2)微量元素溶液：柠檬酸·H2O 5.00g，ZnSO4·7H2O 5.00g，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O1.00g，CuSO4·5H2O 0.25g，MnSO4·H2O 0.05g，H3BO3 0.05g，Na2MoO4·2H2O 0.05g，蒸馏水溶解并定容至100mL，加1mL氯仿作为防腐剂，室温下保存。
3)生物素溶液：生物素5.0mg，蒸馏水溶解并定容至50mL，-20℃保存。
本发明低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌株的相关应用检测：
在细胞质内重构乙醛酸代谢黑曲霉基因工程菌株发酵生产L-苹果酸：
苹果酸样品制备：摇匀发酵液，取1mL发酵液离心取上清，稀释5倍，经0.22μm滤膜过滤后滤液用于HPLC检测。
苹果酸的测定方法：Aminex HPX-87H柱(300mm×7.8mm)，UV检测器。流动相：5mMH2SO4。流速0.6mL/min，柱温65℃，波长210nm，进样体积为20μL。
分别将出发菌株和获得的黑曲霉基因工程菌株S1140的分生孢子接种于含有50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，在28℃，200rpm条件下进行发酵测试。经过5天苹果酸摇瓶发酵，与野生型菌株相比，S1140苹果酸产量明显提高(如图7所示)，苹果酸浓度为30.5g/L。
序列表
1.pexG基因上游同源臂的核苷酸序列
TTCACACCCAGATTTGTTGCGCAGAGACATCGCTGAGCCGCTCGCTAAGTAGGCGAGCGGCATCTTCTTTGGTTTCCACAGTGTCTGGCAATGCGCGCAGACGAAAGACTATCTTGGACCAGTCCATTGCAGCCGATTAGAGTGATCGCAGCTTGGTTGGCCTTGCAAAGGGGTCTGTAATCACAAAGTTTGAAGAACACAGACTCTACAAATAAGGAAGTCAGGAATCGGCTTGAATGAGTACTTCCTAGAGTGACTCTTCGTAGGTATTGAAGACGAGTATGTAGAATGCGAGCAAGAAAATCAAAACGACTAAGAATACGACAAATAGAATCGATAGTAACTAGATAAAATGGCTCTGACGAGAGCGTACTGATTGAATATGGGGTCATTAGAAGGAGGAGGAGAAGATCAGGACGTTGGCTAAGCATCGGGCACTGGCGCCTGCCTCATCGGGTATCCAGGTACATCTTCCCAAAAAGGCAATGGCTTTCGTGGCCGACAAGAGTCATGTGATTTATCACGTGTATAGGTCCCCTGGGGCTTGAAGAAATTCATTTCAAGGGCGGTGCCATGAACTAGTCCACTTACGGTCATAGTGCATCACTGACCTGTGACAGCCAATCACGACCTGAATCTGGCCTGCGGCCTATGTTCTACACTGTTAATCTGAGGCTCTTGATCTGGGCACGGCAGATTTTGCCAGGGTTTCGGGCGAACTAAAACAGGTTGTAGTTTAGTGCCTGAGGCATTCAATATTTGCCTCAGGCCACAATAATAACCCAGATAGTGACCGAACCTCGGCACGTTGACTCCCCGCAGTCAGTCCATCTGCATCTCCATCATCTACTAATCTCTCCATCTCAACACCAACACCAACAATCAACCCACCACTCCTCCCCTCACTTTCATAGCGCCATGATCCCTTACCCCAACTAATTCCCCCCTCTCACTTCTTCAACCATCTCCACTCCATTTCCGATACCCTTCAAAAATGCTCCACTTCCGCACGGAAGGCTTCAACGGCTGCGCAGTCAAGTACTCACCCTTCTTCGATAACCGCCTCGCCGTCGCCTCATCCGCCAATTTCGGCCTAGTCGGCAATGGCCGTCTCTACATTCTTGAACTGACTCCGAACGGAATAGTTCCCTACAAATGGTATCCCTTCCCCCATCCCCCACCTATCCCCAACCAAACTAACCAACCCACCG
2.pexG基因下游同源臂的核苷酸序列
AGACATCCCTCCACGAGCAAACCGGGTATATCATCCTCTCCAAAACCCAACTATATCATCCACCCAAACAAAATGAAAGAGAGAAAGAGAACAAACAGACTATTTCGCCAACCTCGCCTCAACCTTCTTCCTCTCCGCCTCCTTCACAGCCGCAATCTCCTCCCGACTAGCATCAAATGCCACATGCGCCTGGTTGAACGGATTCTCCTCACTCTTCTCAAACTCCTTCTTACAGATCTCAATGCGCTGGTTACGTCTCAGTCCAGGATTCTCAGCCTCAATCTCAGGTAACCGTCTCTCCTCAAATGCCGCATACGCCGCCTTGAACCGTCTCTCGGGATGCCGATCGATCTTGCCGCTATCCTTGCCCGTAAGTGACAGTGCATCGAGCGCATTGTCGATACCGGAGGCATTGAGCGCAGAAGCCTTCTTGCTCCCTGGTGTATCGTCGAGCTGCGACAAATCCAATGTGCCTCGGCTGGGTCCCGCGTTCTTCTTCGCTGCGGCTTTGTTGTTCTTGGGTTTGCTGGGCTGGGAGGCTTCTTCGGCGGCGAGGAGGGCGTCGCGTTCGGCCTTCTTGCGCGCGGCTTCGGCTTTTTTGGCTTCGGCGTCGTCGCTGTTGTTTTTATCAAAAAAGACTATGTTAGTGGGTGCTTTTTTGGTTTTGGAGGGGATATGTTGATAACTTGGGTCTGCATACCGCTTGCTACCACCCTTCGCGCCCTTGGACCACTTAGCGTCCTCCTCGGCGGCGCGCTTGGCGTCCTCGGCGGCCTTTTTGTTGGCGGCTGCTTCGGCTTTCTACACCCATATAGAGGATCTGGTCAGCTTTTGCCTATACTCCTGTAGTTGTGGTTGAGAATATGGTTCTGGTGGTGATGGAGCGGGGGCGGGGTAATATTTTGCAGAGAGAAGATAGATCAGTATAGAGGTGGTACGCACACGAGCATTACCCGCAGCCTTCTTGGAGTTCTCGCCGGCGGCTTTCTTGCCTCCCATTTTTGCGGCTAGTATATACAGTAGCTTTTTCACGGGGGAAAAAGGAAAAAAGAGTGTGTGGAAGTAGTTGGAGAGTAGCTAGGAAGCAAGAAGAAAGAGGAAGAAAAAGAGCAACGATGTCATCCTATGGCGGGAGTTGATGGCTGCA
3.苹果酸合酶基因mas*的核苷酸序列
TTCATGGTGCAAGTCGACACCCAACTCAAAGACGTCGTCATCCTCGGCAATGTGAGCTCGGAGGCTCGCAAGATCCTCACCAAGGACGCATGTGCCTTCCTCGCCATCCTCCACCGCACCTTCAACCCTACTCGCAAGGCCCTCCTCCAGCGCCGCATCGACCGCCAGGCCGAGATTGACAAGGGTCACCTTCCCGACTTCCTGCCCGAGACAAAGCACATTCGTGAGAACGATGCCTGGAAGGGTGCTCCCCCGGCTCCGGGACTCGTCGACCGCCGTGTGGAAATCACGGGTCCCACAGATCGCAAGATGGTCGTCAACGCGTTGAACTCCGATGTCTGGACATACATGGCTGATTTCGAGGGTAAGTCCCTTTCTATTACCCCAGATTCTCCCCGAAAAGAATAGCATCTAACAACAGACAGATTCCAGCGCCCCCACCTGGGAAAACATGATCAACGGCCAAGTCAACCTCTACGACGCCATCCGCCGCCAGGTCGACTTCACCCAAGGCGGCAAGGAATACAAGCTGCGGACGGACCGCGTGCTCCCCACCCTCATTGCTCGCGCTCGTGGCTGGCACCTCGACGAGAAGCACTTCACTGTCGACGGCACCCCCATCTCCGGCAGTCTGTTTGACTTCGGTCTGTACTTCTACCACAATGCCAAGGAGCTCGTTGCGCGCGGCTTCGGCCCGTACTTCTACCTCCCCAAGATGGAGTCGCATCTGGAGGCGCGTCTATGGAACGACGTCTTCAACCTGGCTCAGGATTACATTGGTATGCCGCGCGGAACGATCCGTGGTACGGTGCTGATCGAGACCATCTCGGCGGCGTTTGAGATGGATGAGATCATCTACGAGTTGCGCGAACACAGCTCCGGATTGAACTGTGGACGCTGGGATTACATCTTCTCCTTCATCAAGAAGTTCCGCAAGCACCCCAACTTTGTGTTGCCGGACCGCTCGGACGTTACTATGACGGTGCCGTTCATGGATGCGTATGTGAAGTTGTTGATTAAGACGTGTCACCGCAGAGGAGTCCATGCTATGGTAGGCCAACCATTCCCCATTATACTTGATGACGATGCTAATAAACTTGTAGGGAGGCATGGCCGCTCAAATTCCCATCAAGAACGACCCCGCCGCCAACGACAAGGCCATGGAGAGCGTGCGCGCCGACAAGCTGCGTGAAGTGCGCGCCGGACACGACGGCACCTGGGTTGCGCACCCTGCGCTGGCCTCCATCGCCTCGGAGATCTTCAACACCTACATGCCCACTCCCAACCAGCTGTTCGTCCGCCGCGAGGACGTTCACATCACCGCCAACGATCTCCTGAACACCAACGTCCCCGGCAAGATCACCGAGGACGGCATCCGCAAGAACCTGAACATCGGCCTGTCCTACATGGAGGGATGGCTCCGCGGTGTGGGCTGCATTCCGATCAACTTCCTGATGGTACGCTCCATCTCTATTCCAAATATCCCAAGAATAACATATACTAATAAAGAAATAGGAGGACGCCGCCACCGCCGAAGTCTCCCGCAGTCAGCTCTGGCAATGGACGCATCACGGCATCACCACCTCGGACGGCAAGAAGGTCGACAAGGCGTACGCCCTGCGTCTCTTGCAAGAGCAGGCGGACAGTCTCGCGGCCAAGGGTCCCCAGGGTAACAAGTTCCAGCTTGCAGCGCGGTATTTTGCCGGCCAGGTGACGGGCGAGGACTATGCCGATTTCCTGACGAGTTTGTTGTATAACGAGATTTCGTCGGCGGGCAAGGCGGAGCCGGCTGCTAAGTAAG
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学，南京师范大学
<120> 一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1211
<212> DNA/RNA
<213> pexG基因上游同源臂的核苷酸序列(Unknown)
<400> 1
ttcacaccca gatttgttgc gcagagacat cgctgagccg ctcgctaagt aggcgagcgg 60
catcttcttt ggtttccaca gtgtctggca atgcgcgcag acgaaagact atcttggacc 120
agtccattgc agccgattag agtgatcgca gcttggttgg ccttgcaaag gggtctgtaa 180
tcacaaagtt tgaagaacac agactctaca aataaggaag tcaggaatcg gcttgaatga 240
gtacttccta gagtgactct tcgtaggtat tgaagacgag tatgtagaat gcgagcaaga 300
aaatcaaaac gactaagaat acgacaaata gaatcgatag taactagata aaatggctct 360
gacgagagcg tactgattga atatggggtc attagaagga ggaggagaag atcaggacgt 420
tggctaagca tcgggcactg gcgcctgcct catcgggtat ccaggtacat cttcccaaaa 480
aggcaatggc tttcgtggcc gacaagagtc atgtgattta tcacgtgtat aggtcccctg 540
gggcttgaag aaattcattt caagggcggt gccatgaact agtccactta cggtcatagt 600
gcatcactga cctgtgacag ccaatcacga cctgaatctg gcctgcggcc tatgttctac 660
actgttaatc tgaggctctt gatctgggca cggcagattt tgccagggtt tcgggcgaac 720
taaaacaggt tgtagtttag tgcctgaggc attcaatatt tgcctcaggc cacaataata 780
acccagatag tgaccgaacc tcggcacgtt gactccccgc agtcagtcca tctgcatctc 840
catcatctac taatctctcc atctcaacac caacaccaac aatcaaccca ccactcctcc 900
cctcactttc atagcgccat gatcccttac cccaactaat tcccccctct cacttcttca 960
accatctcca ctccatttcc gatacccttc aaaaatgctc cacttccgca cggaaggctt 1020
caacggctgc gcagtcaagt actcaccctt cttcgataac cgcctcgccg tcgcctcatc 1080
cgccaatttc ggcctagtcg gcaatggccg tctctacatt cttgaactga ctccgaacgg 1140
aatagttccc tacaaatggt atcccttccc ccatccccca cctatcccca accaaactaa 1200
ccaacccacc g 1211
<210> 2
<211> 1147
<212> DNA/RNA
<213> pexG基因下游同源臂的核苷酸序列(Unknown)
<400> 2
agacatccct ccacgagcaa accgggtata tcatcctctc caaaacccaa ctatatcatc 60
cacccaaaca aaatgaaaga gagaaagaga acaaacagac tatttcgcca acctcgcctc 120
aaccttcttc ctctccgcct ccttcacagc cgcaatctcc tcccgactag catcaaatgc 180
cacatgcgcc tggttgaacg gattctcctc actcttctca aactccttct tacagatctc 240
aatgcgctgg ttacgtctca gtccaggatt ctcagcctca atctcaggta accgtctctc 300
ctcaaatgcc gcatacgccg ccttgaaccg tctctcggga tgccgatcga tcttgccgct 360
atccttgccc gtaagtgaca gtgcatcgag cgcattgtcg ataccggagg cattgagcgc 420
agaagccttc ttgctccctg gtgtatcgtc gagctgcgac aaatccaatg tgcctcggct 480
gggtcccgcg ttcttcttcg ctgcggcttt gttgttcttg ggtttgctgg gctgggaggc 540
ttcttcggcg gcgaggaggg cgtcgcgttc ggccttcttg cgcgcggctt cggctttttt 600
ggcttcggcg tcgtcgctgt tgtttttatc aaaaaagact atgttagtgg gtgctttttt 660
ggttttggag gggatatgtt gataacttgg gtctgcatac cgcttgctac cacccttcgc 720
gcccttggac cacttagcgt cctcctcggc ggcgcgcttg gcgtcctcgg cggccttttt 780
gttggcggct gcttcggctt tctacaccca tatagaggat ctggtcagct tttgcctata 840
ctcctgtagt tgtggttgag aatatggttc tggtggtgat ggagcggggg cggggtaata 900
ttttgcagag agaagataga tcagtataga ggtggtacgc acacgagcat tacccgcagc 960
cttcttggag ttctcgccgg cggctttctt gcctcccatt tttgcggcta gtatatacag 1020
tagctttttc acgggggaaa aaggaaaaaa gagtgtgtgg aagtagttgg agagtagcta 1080
ggaagcaaga agaaagagga agaaaaagag caacgatgtc atcctatggc gggagttgat 1140
ggctgca 1147
<210> 3
<211> 1801
<212> DNA/RNA
<213> 苹果酸合酶MAS*的核苷酸序列(Unknown)
<400> 3
ttcatggtgc aagtcgacac ccaactcaaa gacgtcgtca tcctcggcaa tgtgagctcg 60
gaggctcgca agatcctcac caaggacgca tgtgccttcc tcgccatcct ccaccgcacc 120
ttcaacccta ctcgcaaggc cctcctccag cgccgcatcg accgccaggc cgagattgac 180
aagggtcacc ttcccgactt cctgcccgag acaaagcaca ttcgtgagaa cgatgcctgg 240
aagggtgctc ccccggctcc gggactcgtc gaccgccgtg tggaaatcac gggtcccaca 300
gatcgcaaga tggtcgtcaa cgcgttgaac tccgatgtct ggacatacat ggctgatttc 360
gagggtaagt ccctttctat taccccagat tctccccgaa aagaatagca tctaacaaca 420
gacagattcc agcgccccca cctgggaaaa catgatcaac ggccaagtca acctctacga 480
cgccatccgc cgccaggtcg acttcaccca aggcggcaag gaatacaagc tgcggacgga 540
ccgcgtgctc cccaccctca ttgctcgcgc tcgtggctgg cacctcgacg agaagcactt 600
cactgtcgac ggcaccccca tctccggcag tctgtttgac ttcggtctgt acttctacca 660
caatgccaag gagctcgttg cgcgcggctt cggcccgtac ttctacctcc ccaagatgga 720
gtcgcatctg gaggcgcgtc tatggaacga cgtcttcaac ctggctcagg attacattgg 780
tatgccgcgc ggaacgatcc gtggtacggt gctgatcgag accatctcgg cggcgtttga 840
gatggatgag atcatctacg agttgcgcga acacagctcc ggattgaact gtggacgctg 900
ggattacatc ttctccttca tcaagaagtt ccgcaagcac cccaactttg tgttgccgga 960
ccgctcggac gttactatga cggtgccgtt catggatgcg tatgtgaagt tgttgattaa 1020
gacgtgtcac cgcagaggag tccatgctat ggtaggccaa ccattcccca ttatacttga 1080
tgacgatgct aataaacttg tagggaggca tggccgctca aattcccatc aagaacgacc 1140
ccgccgccaa cgacaaggcc atggagagcg tgcgcgccga caagctgcgt gaagtgcgcg 1200
ccggacacga cggcacctgg gttgcgcacc ctgcgctggc ctccatcgcc tcggagatct 1260
tcaacaccta catgcccact cccaaccagc tgttcgtccg ccgcgaggac gttcacatca 1320
ccgccaacga tctcctgaac accaacgtcc ccggcaagat caccgaggac ggcatccgca 1380
agaacctgaa catcggcctg tcctacatgg agggatggct ccgcggtgtg ggctgcattc 1440
cgatcaactt cctgatggta cgctccatct ctattccaaa tatcccaaga ataacatata 1500
ctaataaaga aataggagga cgccgccacc gccgaagtct cccgcagtca gctctggcaa 1560
tggacgcatc acggcatcac cacctcggac ggcaagaagg tcgacaaggc gtacgccctg 1620
cgtctcttgc aagagcaggc ggacagtctc gcggccaagg gtccccaggg taacaagttc 1680
cagcttgcag cgcggtattt tgccggccag gtgacgggcg aggactatgc cgatttcctg 1740
acgagtttgt tgtataacga gatttcgtcg gcgggcaagg cggagccggc tgctaagtaa 1800
g 1801
<210> 4
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> PpexG-L-F(Unknown)
<400> 4
gctccgtaac acccagaatt cacacccaga tttgttgcg 39
<210> 5
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> PpexG-L-R(Unknown)
<400> 5
attatacgaa gttatggatc cggtgggttg gttagtttgg 40
<210> 6
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> PpexG-R-F(Unknown)
<400> 6
gctatacgaa gttattctag acatccctcc acgagcaaa 39
<210> 7
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> PpexG-R-R(Unknown)
<400> 7
gccaagcttg catgcctgca gccatcaact cccgccata 39
<210> 8
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> PMAS*-F(Unknown)
<400> 8
cacatctaaa caatggaatt catggtgcaa gtcgacaccc aac 43
<210> 9
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> PMAS*-R(Unknown)
<400> 9
acttaacgtt actgaggatc cttacttagc agccggctcc gc 42
<210> 10
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> PDCT1-F(Unknown)
<400> 10
agacacatct aaacaatgga attcatgaac gttgaaacga gcctcc 46
<210> 11
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> PDCT1-R(Unknown)
<400> 11
gtaacgttaa gtggatccct gcagagacac atcctcatct tgacccg 47

Claims (4)

1.一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的构建步骤如下：
步骤1：敲除过氧化物酶体上与异柠檬酸裂解酶相对应的Peroxins蛋白基因pexG，该蛋白能将定位于过氧化物酶体的异柠檬酸裂解酶转运至过氧化物酶体基质；首先，以黑曲霉（Aspergillus niger）基因组为模板，经PCR扩增黑曲霉pexG基因上下游同源臂序列片段，所述上下游同源臂序列片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，长度分别为1207 bp、1139 bp；然后分步将上下游同源臂序列片段经过EcoR I、BamH I和Xba I、Pst I双酶切回收克隆到载体pLH594，构建基因pexG敲除质粒pLH692；将所述质粒pLH692转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pexG基因敲除菌株S914；
步骤2：过表达苹果酸合酶基因mas*，首先通过设计引物将苹果酸合酶基因mas*的过氧化物酶体定位序列即其C-端三个氨基酸突变为终止密码子TAA，用该引物以黑曲霉cDNA为模板进行扩增，获得mas*基因序列片段，所述基因mas*序列片段的核苷酸序列为SEQ IDNO.3，长度为1797 bp；然后将该片段经过EcoR I和BamH I双酶切回收克隆到载体pLH454，构建基因mas*表达质粒pLH695；所述基因mas*序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制，将所述质粒pLH695转化至黑曲霉S914宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达mas*基因菌株S1016；
步骤3：过表达黑曲霉苹果酸转运蛋白dct1，将表达黑曲霉转运蛋白基因dct1表达质粒pLH654转化至黑曲霉S1016宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达dct1基因菌株S1140，即为低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株；
其中，低pH为pH＜2.5；
所述黑曲霉宿主菌株在基因组内整合了cre基因，该基因受Tet-on系统的调控表达，当以所述菌株为出发菌进行遗传改造，并以loxP-hph-loxP为筛选标记时，能够通过四环素启动Tet-on系统表达Cre重组酶，实现对loxP-hph-loxP元件的重组切除，实现应用一个hph筛选标记进行连续的基因编辑，最终实现目的工程菌株基因组内无外源抗性基因的残留；
所述表达黑曲霉转运蛋白基因dct1表达质粒pLH654的构建步骤如下：
以黑曲霉cDNA为模板，dct1-F、dct1-R为引物进行PCR扩增dct1基因序列片段，然后应用诺唯C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将dct1基因序列片段与经EcoRI/Pst I双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得质粒pLH654；所述dct1-F的基因序列为SEQ ID NO.10，所述dct1-R的基因序列为SEQ ID NO.11。
2.根据权利要求1所述的低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株，其特征在于：所述步骤2中引物为：mas*-F、mas*-R；
所述mas*-F的基因序列为SEQ ID NO.8，所述mas*-R的基因序列为SEQ ID NO.9。
3.如权利要求1或2所述的低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株在制备苹果酸方面中的应用。
4.利用如权利要求1或2所述的低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株发酵产生苹果酸的方法，其特征在于：步骤如下：
首先，将黑曲霉基因工程菌株接种在PDA培养平板上，在28℃培养6天直至产生分生孢子；然后，将孢子粉接种至发酵培养基中，孢子的终浓度为2×106个孢子/mL，在28℃，200rpm发酵5天，即得苹果酸；
其中，所述发酵培养基的组成为：100 g/L 蔗糖，2.5 g/L NH4NO3，1 g/L MgSO4·7H2O，1g/L KH2PO4，500 mg/L 酵母提取物。
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